CN117050928B - 无弹状病毒污染的Sf9细胞株及其高效筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞筛选技术领域，特别是涉及无弹状病毒污染的Sf9细胞株及其高效筛选方法。该细胞株命名为Sf9‑JD31细胞株，其生物保藏编号为CCTCC NO.C2023184。筛选方法：制备用于单克隆筛选的培养液，用培养液稀释细胞，得到细胞悬液；将细胞悬液进行细胞培养；将培养的细胞样品进行RT‑PCR，鉴定是否有弹状病毒，得到初步筛选无弹状病毒的Sf9细胞株；将其进行细胞培养和传代扩增，确认细胞株未感染弹状病毒且为Sf9细胞株；细胞培养扩增保存。本发明细胞培养时易于观察，能避免引入外源因子风险，耗时短，筛选效果佳，且筛选出的细胞株质量高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞筛选技术领域，特别是涉及无弹状病毒污染的Sf9细胞株及其高效筛选方法。
背景技术
昆虫杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)是基因工程四大表达系统之一，是生产重组蛋白的平台及生产疫苗抗原的有效工具。2014年，3个不同团队在不同的昆虫细胞系中发现了弹状病毒，这引起了人们对昆虫-杆状病毒表达载体系统用于生物制品的安全性担忧。目前为止，虽然尚未发现因为弹状病毒而引起细胞病变的报道。但是，生物制品尤其是疫苗的安全性最为重要。因此，筛选无弹状病毒污染昆虫细胞株是一项非常重要的工作。
当前，筛选无弹状病毒污染Sf9细胞的方法主要为有限稀释法，培养后逐个培养物提取RNA，通过RT-PCR来检测病毒基因存在与否。此类方法有两个缺点：第一，培养过程操作繁琐，周期长，单克隆成活率低。况且，为了提高单克隆成活率，还需要在培养基中添加动物血清。很显然，这样筛选出来的细胞株，仍具有潜在的外源因子风险。第二，检测病毒基因需要逐一提取每个克隆的RNA，其工作极其繁琐，成本高，筛选效率低下。
以往的细胞培养技术表明，在体外细胞培养中，单个或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须利用其它活性细胞因子或者饲养层细胞才能促使其生长繁殖。饲养层细胞可以释放出一些必要的生长因子促进单个或数量极少数细胞生长，大大提高细胞的成活率，加速细胞克隆筛选。但是，饲养层细胞的应用也存在不可忽略的缺点，即不利于观察单细胞的生长情况，尤其在筛选细胞克隆的早期会严重影响筛选的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供无弹状病毒污染的Sf9细胞株及其高效筛选方法。高效筛选方法的优点体现在以下几方面：一、细胞培养时易于观察，二、避免引入新的潜在的外源因子，三、耗时短，避免细胞分化，筛选出的细胞株质量高。
应用此高效筛选方法，本申请成功获得一株无弹状病毒污染的Sf9细胞株，该细胞株命名为Sf9-JD31细胞株，其生物保藏编号为CCTCC NO.C2023184。
无弹状病毒污染的Sf9细胞株的高效筛选方法，包括如下步骤：
制备用于单克隆筛选的培养液，用所述培养液稀释细胞，得到细胞悬液；
将所述细胞悬液进行细胞培养，得到培养的细胞样品，然后进行筛选；
筛选包括初步筛选和复筛；
初步筛选：将所述培养的细胞样品进行RT-PCR，鉴定是否有弹状病毒，得到初步筛选无弹状病毒的单克隆Sf9细胞株；
复筛：将所述初步筛选的无弹状病毒的单克隆Sf9细胞株再进行培养和传代扩增，提取RNA，通过RT-PCR的方式进一步确认细胞株是否存在弹状病毒，得到复筛确认的无弹状病毒污染的细胞株；
以所述无弹状病毒污染的细胞株细胞为模板直接PCR扩增其保守序列，确认所述无弹状病毒污染的细胞株是Sf9细胞株；
将复筛确认的无弹状病毒污染的细胞株进行细胞培养冻存。
优选的，制备用于单克隆筛选的培养液时，是将其他细胞传代培养，经离心和过滤后获得细胞上清液，所述细胞上清液为所述培养液，所述离心的转速为5000~8000 rpm，时间为20~30 min。
优选的，所述其他细胞包括H5细胞、S2细胞中的至少一种。
采用上述技术方案，本申请其他细胞包括但不限于H5细胞和S2细胞。
优选的，所述其他细胞传代培养时间为1~3天。
采用上述技术方案，在体外细胞培养中，会加入其他活性细胞因子或利用饲养层细胞来促使细胞生长繁殖，但是饲养层细胞的会干扰观察单细胞的生长情况，尤其在筛选细胞克隆的早期会严重影响筛选的准确性。因此，为了解决此技术问题，本申请不利用饲养层细胞，本申请用同为昆虫细胞的Sf9相近细胞株培养若干天，离心收集其培养上清液，再通过除菌过滤，得到培养液作为单克隆筛选前期使用的培养液，为单克隆Sf9细胞提供必要的生长因子和合适的生长环境。
优选的，用所述培养液稀释细胞时，不加入血清。
优选的，将所述初步筛选无弹状病毒的Sf9细胞株进行细胞培养和传代扩增时，先在96孔板培养18~20天，然后在24孔板培养3～4天，再转移至6孔板中培养3～4天。
优选的，将所述复筛的无弹状病毒的细胞株进行细胞培养扩增保存时，使用细胞冻存液，所述细胞冻存液包括有机溶剂和/或细胞培养基。
优选的，所述有机溶剂包括DMSO、甘油中的至少一种。
优选的，所述细胞培养基为无血清培养基。
采用上述技术方案，本申请不加入血清，避免引入潜在的外源因子风险。
本发明的有益效果是：
第一，本申请不利用饲养层细胞，本申请创新性采用同为昆虫细胞的H5细胞（也可使用S2细胞）培养1~3天，离心收集培养上清液，再用0.22 μm无菌过滤器过滤得到培养液作为培养基，为单克隆Sf9细胞提供必要的生长因子和合适的生长环境，本申请培养10块板96孔板，共得到226个克隆，细胞克隆存活率能达到23%。常规技术中一般克隆成活率为0.5%-5%，即使是较高水平的一般也只在8%，本申请相比于常规技术，克隆存活率至少能提高2.8倍。
第二，在鉴定弹状病毒的过程中，即初步筛选中，本申请直接用细胞作为RT-PCR模板，省略了提取RNA的过程，通量高、成本低，极大的提高了筛选效率。
第三，为确保检测结果的准确性，本申请在初步筛选、细胞培养、传代扩增后，加入复筛，再次确保初步筛选得到的细胞为未感染弹状病毒的，而且本申请复筛过程是提取RNA做RT-PCR，使得检测结果更准确。
第四，本申请筛选出合适的细胞株后，还进一步检测了细胞株的传代稳定性、增殖水平、杆状病毒转染扩增能力以及外源蛋白表达能力。和商品化Sf9细胞相比，本申请筛选得到的Sf9-JD31细胞并不逊色，甚至在外源蛋白表达能力上更优，所以Sf9-JD31细胞可作为昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统的替代宿主细胞，应用潜力高，如能用于生物制品的生产，以及基础研究。
综合上述，本申请细胞培养时，将培养H5细胞后培养液，离心过滤后用于单个或少量细胞培养，优于利用饲养层细胞的培养方式，便于观察。也不加入血清，避免引入潜在的外源因子风险，耗时短，筛选效果佳，且筛选出的细胞株质量高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明无弹状病毒细胞株筛选流程示意图；
图2为本发明筛选细胞过程Sf9-JD31图片；
图3为本发明无弹状病毒Sf9细胞株筛选过程PCR电泳图片；
图4为本发明Sf9-JD31细胞株与Sf9细胞株的15代/20代/25代的弹状病毒电泳检测系列图；
图5为本发明Sf9-JD31细胞株与Sf9细胞株的细胞增殖特性系列对比图；
图6为本发明Sf9-JD31细胞株与Sf9细胞株表达重组BV蛋白表达量对比图，
其中，
图3中标记为：A中，M.DL2000 DNA marker；1.GP1N引物-阴性对照；2.GP1N引物-样品40个Sf9细胞（612bp）；3.GP1N引物-样品400个Sf9细胞（612bp）；4.GP1N引物-样品4000个Sf9细胞（612bp）；5.GP1N引物-样品virus-RNA（612bp）；B中，M.DL2000 DNA marker；1.SFC1引物-Negative control；2.SFC1引物-样品28；3.SFC1引物-样品31；4.SFC1引物-样品51；5.SFC1引物-样品57；6.SFC1引物-样品59；7.SFC1引物-样品67；8.SFC1引物-样品68；9.SFC1引物-样品74；10.SFC1引物-样品75；11.SFC1引物-样品Sf9细胞；
图4中标记为：M.DL2000；1.引物GP1N Sf9细胞提取RNA RT-PCR结果（612bp）；2.引物GP1N P15细胞提取RNA RT-PCR结果；3.引物GP1N P20细胞提取RNA RT-PCR结果；4.引物GP1N P25细胞提取RNA RT-PCR结果；5.引物GP1N阴性对照；6.引物GP2P Sf9细胞提取RNART-PCR结果（728bp）；7.引物GP2P P10细胞提取RNA RT-PCR结果；8.引物GP2P P15细胞提取RNA RT-PCR结果；9.引物GP2P P20细胞提取RNA RT-PCR结果；10.引物GP2P阴性对照；11.引物GP3M Sf9细胞提取RNA RT-PCR结果（578bp）；12.引物GP3M P10细胞提取RNA RT-PCR结果；13.引物GP3M P15细胞提取RNA RT-PCR结果；14.引物GP3M P20细胞提取RNA RT-PCR结果；15.引物GP3M阴性对照；16.引物GP4G Sf9细胞提取RNA RT-PCR结果（876bp）；17.引物GP4G P10细胞提取RNA RT-PCR结果；18.引物GP4G P15细胞提取RNA RT-PCR结果；19.引物GP4G P20细胞提取RNA RT-PCR结果；20.引物GP4G阴性对照；21.引物mono-1/2 Sf9细胞提取RNA RT-PCR结果（794bp）；22.引物mono-1/2 P10细胞提取RNA RT-PCR结果；23.引物mono-1/2 P15细胞提取RNA RT-PCR结果；24.引物mono-1/2 P20细胞提取RNA RT-PCR结果；25.引物mono-1/2阴性对照；
图6中标记为：1.Marker，2.空白对照；3.Sf9-JD31 第3天表达的蛋白；4.Sf9-JD31第4天表达的蛋白；5.Sf9-JD63第3天表达的蛋白；6.Sf9-JD63 第4天表达的蛋白；7.Sf9 第3天表达的蛋白；8.Sf9第4天表达的蛋白。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
若如无特别说明，实施例中所使用的材料均可容易地从商业公司获取，其中，
Sf9细胞购自Thermo Fisher Scientific公司；
H5细胞为Trichoplusia niHigh-Five细胞，High-Five细胞购自广州华拓生物科技有限公司；无血清昆虫细胞培养基，SIM SF Expression Medium (For SF9 and SF21,Serum free)，北京义翘神州科技有限公司。
SIM SF即为前述的无血清昆虫细胞培养基。
S2细胞为DrosophilaS2细胞。
DMSO为二甲基亚砜。
本发明提供一种无弹状病毒污染的Sf9细胞株，该细胞株命名为Sf9-JD31细胞株，其生物保藏编号为CCTCC NO.C2023184。保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，中国武汉大学保藏中心，邮编430072。保藏日期：2023年08月15日。分类命名：草地贪夜蛾SF9细胞衍生系SF9-JD31（SpodopterafrugiperdaCell line SF9-JD31）。
实施例1
参照图1，一种无弹状病毒污染的Sf9细胞株的高效筛选方法，包括如下步骤：
（1） Sf9细胞复苏：从液氮罐中取出一支Sf9细胞（购自Thermo FisherScientific），于37℃水浴锅持续摇晃使其快速融化，然后用无血清昆虫细胞培养基重悬后200g离心5min，弃去上清，用20ml培养基重悬后转移至125ml摇瓶中。放入恒温震荡培养箱，设定培养温度27℃，转速120 rpm，培养4~5天。
（2） 单克隆筛选培养液准备：将传代后培养1~3天的H5细胞悬液在6000 rpm，20min条件下离心，收集上清然后用0.22μm无菌滤膜进行过滤，过滤后得到的液体置于4℃冰箱保存，作为单克隆筛选前期使用的培养液。
前述的H5细胞也可替换为S2细胞。
（3） 稀释细胞悬液：
从培养箱中取出正在培养的Sf9细胞（步骤1获得），取样计数，准备6个50 ml离心管依次标记1-6，在1号中首先将细胞悬液稀释成1×106cells/ml，稀释用培养液为上述单克隆筛选培养液。然后按照梯度稀释法最后将细胞悬液在6号管中稀释成5 cells/ml，倒入一次性加样槽中充分混匀，用排枪在96孔板中每孔加入100μl的细胞悬液，将10块96孔板都接种完毕后取一个孔进行拍照。然后将10块96孔板放入27℃培养箱中静置培养。
（4） 细胞培养：每隔3天补充培养液，每周进行一次换液并通过镜下观察来判断细胞生长状态。本申请培养10块板96孔板，共得到226个克隆，细胞克隆存活率能达到23%。
（5） 取样检测：培养至第20天，单细胞聚集成簇（见图2，单细胞生长过程）。将聚集成簇的细胞吹散重新接种到新的96孔板中让细胞均匀生长。再培养3天，吹散，取样至96孔PCR板，得到细胞样品，离心，弃除培养液。
（6） 初步筛选：将步骤（5）得到的细胞样品，作为模板直接进行RT-PCR，再对PCR产物进行电泳检测，鉴定是否有弹状病毒，得到初步筛选无弹状病毒的Sf9细胞株。此法通量高、成本低，极大提高初步筛选效率。
（7） 细胞培养、传代扩增：将步骤（6）得到初步筛选无弹状病毒的Sf9细胞株转移至24孔板，培养3～4天，然后转移至6孔板中培养3～4天。
（8） 复筛：取步骤（7）中初步筛选无弹状病毒的Sf9细胞株的部分细胞，提取RNA，用RT-PCR方式复筛确认细胞株未感染弹状病毒，得到复筛的无弹状病毒的细胞株。
（9） 筛选的细胞株分子鉴定：将步骤（8）得到的复筛的无弹状病毒的细胞株离心，收集细胞，提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增其保守序列（细胞色素C氧化酶）序列，确认步骤（8）得到的复筛的无弹状病毒的细胞株是Sf9细胞株。
（11）细胞培养冻存：将步骤（8）得到的复筛的无弹状病毒的细胞株转移至125 ml摇瓶中，置于27℃恒温震荡培养箱中，100～120 rpm培养3~4天。细胞活率大于90％，收集细胞，800 rpm室温离心5min，用细胞冻存液重悬细胞沉淀，细胞冻存液为10%DMSO+90% 细胞培养基，细胞培养基为SIM SF。细胞密度为1×107cells/ml，分装至冻存管，梯度降温至-80℃保存1天后，转移至液氮罐长期保存。
实施例2
一种无弹状病毒污染的Sf9细胞株的高效筛选方法，区别于实施例1，本实施例中步骤（6）初步筛选采用如下步骤，其余步骤和实施例1相同：
1.弹状病毒检测引物设计合成
设计合成五对弹状病毒引物，分别鉴定培养物中是否存在弹状病毒的五个蛋白基因序列。引物序列见表1。
表1 弹状病毒分子鉴定引物
注明：N、P、M、G、L分别为核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、包膜糖蛋白、RNA依赖的RNA聚合酶。
2. Sf9细胞鉴定引物设计合成
设计合成Sf9细胞中保守基因细胞色素C氧化酶的鉴定引物，鉴定所筛选得到的细胞是Sf9细胞株。引物序列见表2。
表2. Sf9细胞保守序列（细胞色素C氧化酶）序列引物
3.建立快速、高通量、低成本的鉴定方法
（1）处理方式：取培养细胞，计数，然后800g，离心10min，弃上清，用PBS将细胞浓度调整至2×105cells/ml，分别取2 ul（40个细胞），20 ul（400个细胞），200ul（4000个细胞）加入到PCR管中，800g，离心10min，吸弃上清，作为RT-PCR模板。然后按照Hiscript Ⅱ onestep RT-PCR kit（诺唯赞试剂盒）说明书进行实验。
（2）RT-PCR的方法如下表3，PCR反应程序如下述表4。
表3
表4
（3）然后，用0.7% 琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果参照图3中的A。
结果分析：用40~4000 个细胞作为模板，均可得到正确结果，此方法中用作模板的细胞数范围比较宽，因此，实际实验过程中，可以不对每孔细胞进行计数，取10~20 ul的细胞加入到96孔板中，通过800g，离心10min，去除细胞培养液作为RT-PCR模板，节约操作时间。
本实施例通过上述方式，快速初步筛选出无弹状病毒的Sf9细胞株，再配合后续的细胞培养和传代扩增，进行扩大培养和复筛，复筛的RT-PCR条件同上述相同。
实施例3
一种无弹状病毒污染的Sf9细胞株的高效筛选方法，区别于实施例2，本实施例中步骤（9）筛选的细胞株分子鉴定采用如下步骤，其余步骤和实施例2相同：
细胞处理方式参照实施例2的步骤3中（1）处理方式，PCR体系如下表5，反应程序如下表6：
表5
表6
然后，用0.7% 琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果参照图3中的B。从结果可知，筛选出的这9株细胞株都与Sf9细胞有相同的扩增条带，可判断这9株细胞株都是Sf9细胞株，分别命名为Sf9-JD28、Sf9-JD31、Sf9-JD51、Sf9-JD57、Sf9-JD59、Sf9-JD67、Sf9-JD68、Sf9-JD75、Sf9-JD76。
实施例4
一种无弹状病毒污染的Sf9细胞株的高效筛选方法，区别于实施例1~实施例3中任意一个实施例，本实施例进一步的，对筛选出Sf-JD31细胞株的第15代、20代、25代细胞进行弹状病毒检测。具体过程如下：将筛选出的Sf-JD31细胞株按照1×106cells/ml的细胞密度接种到125ml的三角摇瓶中，培养体积40ml，放置于恒温振荡培养器上，120 rpm，27℃培养4天。按照上述方式连续传代。并在第15代、20代、25代时取样进行弹状病毒检测。检测方法参照实施例2。
结果参照图4。
结果分析：1、6、11、16、21泳道都为阳性对比，即含弹状病毒的Sf9细胞，5、10、15、20、25泳道都为阴性对比，本申请用不同的引物（参照表1），做了5组平行实验，图4可以看出，2~4、7~9、12~14、17~19以及22~24泳道都未出现目的条带，所以Sf-JD31细胞株的第15代、20代、25代细胞无弹状病毒污染。
实施例5
一种无弹状病毒污染的Sf9细胞株的高效筛选方法，区别于实施例1~实施例4中任意一个实施例，本实施例进一步的，对Sf9-JD31细胞株进行增殖特性研究，具体步骤如下：
分别培养Sf9-JD31细胞和Sf9细胞，以0.8×106cells/ml细胞密度，20 ml细胞悬液接种于125 ml摇瓶中，放置于恒温振荡培养器上，120 rpm， 27 ℃培养，直至细胞衰亡。每隔24小时取样检测活细胞数、细胞活率和细胞直径，计算倍增时间。每个细胞株接种两个摇瓶，数据取平均值。
结果：参照图5，两株细胞Sf9-JD31和Sf9的培养前4天均处于对数生长期，细胞倍增时间均在28小时，细胞直径均为15～18 μm；培养至第6天两株细胞的细胞密度均达到最高，不再增长并开始凋亡，不同的是，在相同培养条件下，Sf9-JD31第9天还保持有96.46%的细胞活率，而Sf9则只有44.97%，Sf9-JD31的平台期更长。
结果分析：由上述结果可知，Sf9-JD31细胞具有作为昆虫-杆状病毒表达载体系统替代宿主的潜力，与Sf9细胞的生长特性非常相似，培养至第6天两种细胞的细胞密度均达到最高，分别是1.05×107cells/ml和1.11×107cells/ml。
实施例6
一种无弹状病毒污染的Sf9细胞株的高效筛选方法，区别于实施例1~实施例5中任意一个实施例，本实施例进一步的，进行杆状病毒在Sf9-JD31细胞株增殖水平的研究，具体步骤如下：
1. 重组BV载体构建
将合成的序列BV（SEQ ID.NO.1）连接到pFastBac载体（购自Thermo FisherScientific）上，用42℃热激法转入Top 10感受态细胞（购自天根生化科技（北京）有限公司）中。于摇床中220rpm培养45~60min，取出涂布到LB平板上，该LB平板含有终浓度为100ug/ml的Amp抗生素，于37℃生化培养箱倒置培养过夜。培养12~16小时后，挑取单克隆送通用生物公司测序。选取阳性克隆，提取质粒备用。
2. 重组BV杆粒制备：
取上述质粒10ng，42℃热激法DH10Bac感受态细胞（购自Thermo FisherScientific）中，然后涂布于含三抗的固体LB培养平板上，三抗购自索莱宝，三抗为混合液，混合液包括终浓度10ug/ml的盐酸四环素、终浓度7ug/ml的硫酸庆大霉素、终浓度50ug/ml的硫酸卡那霉素，固体LB包括40ug/ml的X-Gal和200ug/ml的IPTG。然后将平板倒置于生化培养箱37℃培养，观察平板长出蓝白斑情况。挑取白色克隆，接入含三抗的固体LB培养基中，放入摇床中，37℃，220rpm培养12~16小时。用杆状病毒穿梭载体bacmid小量抽提试剂盒（购自碧云天生物）提取杆粒。
3.将提取的BV杆粒分别转入到两个细胞株（Sf9-JD31和Sf9）中，120 rpm，27 ℃培养4天，用TakaRa杆状病毒滴度测定试剂盒对收获的杆状病毒滴度进行定量检测。
结果：Sf9-JD31细胞株扩增的杆状病毒滴度均值为3.01E+08 IFU/ml，Sf9细胞培养的细胞株扩增的杆状病毒滴度均值为2.13E+08 IFU/ml。
结果分析：由上述结果可知，使用Sf9-JD31细胞和Sf9细胞扩增杆状病毒时，二者的扩增效率相当。
实施例7
一种无弹状病毒污染的Sf9细胞株的高效筛选方法，区别于实施例3~实施例6中任意一个实施例，本实施例进一步的，检测杆状病毒在Sf9-JD31、Sf9-JD63细胞株中的BV蛋白表达量，具体步骤如下：
分别在125ml摇瓶中接种Sf9-JD31、Sf9-JD63细胞和Sf9细胞，以1.0×106cells/ml细胞密度，20 ml细胞悬液接种于125 ml摇瓶中，放置于恒温振荡培养器中，120 rpm，27℃培养。活细胞密度达到4.0×106cells/ml。接种 BV杆状病毒（来源于实施例6），MOI=0.3。培养72~96 h，每24 h取样，SDS-PAGE检测蛋白表达，Maker上样量为1μl，样品上样量为8μl，样品还原加热5min。电泳结果见图6。
结果分析：由SDS-PAGE结果可知，使用Sf9-JD31、Sf9-JD63细胞和Sf9细胞表达BV蛋白时，三者的表达量相当，蛋白表达趋势也一致。筛选出的无弹状病毒的 Sf9-JD31及Sf9-JD63细胞株蛋白表达量略高于有弹状病毒的Sf9细胞。
和商品化Sf9细胞相比，Sf9-JD31细胞在传代稳定性、增殖水平，杆状病毒转染扩增能力以及外源蛋白表达能力上并不逊色，甚至外源蛋白表达能力上更优，所以Sf9-JD31细胞可作为昆虫-杆状病毒表达载体系统的替代宿主细胞，应用潜力高，如能用于生物制品的生产，或用于基础研究。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (10)
1.无弹状病毒污染的Sf9细胞株，其特征在于，该细胞株命名为Sf9-JD31细胞株，其生物保藏编号为CCTCC NO.C2023184。
2.一种高效筛选鉴定方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
制备用于单克隆筛选的培养液，用所述培养液稀释细胞，得到细胞悬液；
将所述细胞悬液进行细胞培养，得到细胞样品，离心，弃除培养液，得到所述培养的细胞样品；
将所述培养的细胞样品进行高通量RT-PCR，鉴定是否有弹状病毒，得到初步筛选无弹状病毒的单克隆Sf9细胞株；所述高通量RT-PCR的弹状病毒分子鉴定引物包含如下5’-3’序列，
Mono-1：GGCAAGGCTGTTTGGATTACTGACC
Mono-2：ACAGGTTTGCAGCTAAGGAGGACA
GP1N-F：CAAGGGACCGTGGACATTCCAG
GP1N-R：CTGTAGGGAGCCTGTGGAATAC
GP2P-F：TTCTTCTCAAAGTCCTGGTGC
GP2P-R：TTGACTGGCGGTGTAAGCTGTG
GP3M-F：ATCCACATCTCCGCTATCACC
GP3M-R：GGAGGAGAAGGAGCGGTTGGAG
GP4G-F：ATTGACACCACTTGCTCCTGG
GP4G-R：AGCAAGATTGGGTGGACTGAG；
将所述初步筛选的无弹状病毒的单克隆Sf9细胞株再进行培养和传代扩增，进一步确认细胞株是否存在弹状病毒，确认后得到无弹状病毒的单克隆Sf9细胞株；
将所述无弹状病毒的单克隆Sf9细胞株继续培养、扩增和保存。
3.根据权利要求2所述的高效筛选鉴定方法，其特征在于，制备用于单克隆筛选的培养液时，是将其他细胞传代培养，经离心和过滤后获得上清液，所述上清液为所述培养液，所述离心的转速为5000~8000 rpm，时间为20~30 min。
4.根据权利要求3所述的高效筛选鉴定方法，其特征在于，所述其他细胞包括H5、S2细胞中的至少一种。
5.根据权利要求3或4所述的高效筛选鉴定方法，其特征在于，所述其他细胞传代培养时间为1~3天。
6.根据权利要求2所述的高效筛选鉴定方法，其特征在于，用所述培养液稀释细胞时，不加入血清。
7.根据权利要求2所述的高效筛选鉴定方法，其特征在于，将所述初步筛选无弹状病毒的Sf9细胞株进行细胞培养和传代扩增时，先在96孔板培养18~20天，然后转移至24孔板培养3～4天，再转移至6孔板中培养3～4天。
8.根据权利要求2所述的高效筛选鉴定方法，其特征在于，将所述无弹状病毒的Sf9细胞株进行培养扩增保存时，使用细胞冻存液，所述细胞冻存液包括有机溶剂和/或细胞培养基。
9.根据权利要求8所述的高效筛选鉴定方法，其特征在于，所述有机溶剂包括DMSO、甘油中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的高效筛选鉴定方法，其特征在于，所述细胞培养基为无血清培养基。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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| GR01 | Patent grant | ||
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Denomination of invention: Sf9 cell line without contamination by rhabdovirus and its efficient screening method Granted publication date: 20240305 Pledgee: Bank of Nanjing Jiangbei District branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: Jianda Biopharmaceutical (Nanjing) Co.,Ltd. Registration number: Y2024980012524 |