CN114807009A - 一种不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株、筛选方法及应用 - Google Patents

一种不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株、筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞筛选，为了解决sf9细胞株中的弹状病毒污染，提供了一种不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株，该细胞株命名为sf9‑RF细胞株，其生物保藏编号为：CGMCC No.45028。还提供了不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株的筛选方法，其通过无血清条件进行筛选。还提供了不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株应用于基于杆状病毒表达系统的外源蛋白表达或AAV生产。本发明的不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株，在整个细胞培养以及筛选过程中均使用无血清的昆虫细胞培养基，不会引入任何外源病毒，因此该细胞系的各项指标均符合生产用细胞基质的要求，将其应用于杆状病毒的表达系统中，可有效地保证生物制品的安全性。

Description

一种不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株、筛选方法及 应用
技术领域
本发明涉及细胞筛选的技术领域，具体而言，涉及一种不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株、筛选方法及应用。
背景技术
20世纪60年代Vaughn团队从雌性草地夜蛾蛹的卵巢组织中分离到细胞株，建立了昆虫细胞株，后提供给英国牛津大学的NERC无脊椎动物病毒学部，在含牛血清的培养基中进一步驯化得到细胞株IPLB-Sf-21-AE。随后又供给美国德克萨斯A&M大学研究并将其克隆化，应用于蛋白表达体系。
sf9细胞株是由G.E.Smith和C.L.Cherry从IPLB-Sf-21-AE克隆得来，细胞状态更加稳定，对杆状病毒敏感，可用于蛋白表达与病毒扩增。但Ma等发现，所有sf细胞系(包括两个商业化sf21和sf9细胞)，均被一种弹状病毒Sf-rhabdovirus(Sf-RV)污染，这给以上细胞的产业化应用带来了潜在的安全隐患和审批难度。
杆状病毒表达系统是被广泛应用于生产的表达系统之一，利用杆状病毒作为外源基因的载体，并感染昆虫细胞，通过昆虫细胞加工表达外源蛋白以及杆状病毒的增殖。通过昆虫细胞表达外源蛋白可进行正确的折叠与修饰更加接近于蛋白的天然结构。已经被广泛应用于基因工程疫苗以及抗体生产等生物制品的生产中。然而，在Sf细胞系中发现的新弹状病毒(Sf-RV)引起了人们对昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统生产的生物制剂安全性的担忧。虽然截止目前，并没有证据表明Sf-RV病毒对人类或动物构成威胁，然而，在生物制品制备过程中一旦发现了任何外源病毒污染，都必须采取一切办法将它去除，保证生物制品的安全性。
因此，筛选出未经弹状病毒污染的sf9细胞株能够有效的保证杆状病毒表达系统的生物制品的安全性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株，该细胞株命名为sf9-RF细胞株，其生物保藏编号为：CGMCC No.45028，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2021年12月27日。
本发明还提供了上述sf9-RF细胞株的筛选方法，包括如下步骤：
(1)使用无血清昆虫培养基将sf9细胞重悬、离心并去除上清后，用无血清昆虫培养基重悬并转移培养，连续传代3次，取第3代细胞悬液进行细胞筛选；
(2)使用无血清昆虫细胞培养基来稀释步骤(1)中获得的sf9细胞，将稀释后的细胞铺于孔板中，并进行恒温培养；
(3)定期观察孔板中细胞的生长情况，并换液，直到有明显集落形成或培养至第10天；
(4)将步骤(3)中获得的细胞集落重悬后转移至新的孔板中，补加培养基后进行恒温培养；
(5)对步骤(4)中获得的细胞上清液进行弹状病毒检测，并向弹状病毒阴性孔中加入无血清昆虫细胞培养基，重悬后转移至新孔板中继续进行恒温培养；
(6)对步骤(5)中获得的细胞上清液进行弹状病毒检测，并向弹状病毒阴性孔中加入无血清昆虫细胞培养基，重悬并转移至方瓶中进行恒温培养；
(7)对步骤(6)中获得的细胞上清液进行弹状病毒检测，将弹状病毒阴性瓶中的原培养基弃去，并加入无血清昆虫细胞培养基，重悬后转移至方瓶中进行恒温培养；
(8)将步骤(7)中方瓶中的原培养基去除，加入无血清昆虫细胞培养基并重悬后转移至摇瓶中进行恒温培养，并以此重复5次以进行传代后，进行弹状病毒基因检测；
(9)建立种子库，将步骤(8)中摇瓶细胞进行无血清昆虫细胞培养基扩大培养后冻存；
(10)对步骤(9)中的留种继续传至20代，将筛选出的单克隆细胞进行弹状病毒基因检测、毒种扩增能力检测以及蛋白表达能力检测。
更为具体地，步骤(2)中，将细胞密度调整至0.8-1.2×106个/ml，按10倍倍比稀释5次，使细胞密度为8-12个/ml，终细胞悬液体积为10ml，铺设于96孔板，每孔接种0.1ml，置于恒温培养箱中静止培养。
更为具体地，步骤(9)中，摇瓶细胞进行无血清昆虫细胞培养基扩大培养，至细胞密度达到4～6×106个/ml，活率为95％以上时，100g离心4-6min，加入细胞冻存液(10％DMSO+90％新鲜无血清培养基)重悬，使细胞密度为1.5-2.5×107个/ml，分装至冻存管中，放于梯度降温冻存盒中，于-80℃冻存，3天后转移至液氮罐中长期保存。
进一步地，步骤(1)-步骤(10)中，细胞恒温培养的温度为27℃。
进一步地，步骤(1)-步骤(10)中的无血清昆虫细胞培养基为GIBCO Sf-900TM III。
本发明还提供了上述不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株应用于基于杆状病毒表达系统的外源蛋白表达或AAV生产。
本发明实施例的技术方案至少具有如下优点和有益效果：本发明的不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株，在整个细胞培养以及筛选过程中均使用无血清的昆虫细胞培养基，不会引入任何外源病毒，因此该细胞系的各项指标均符合生产用细胞基质的要求，将其应用于杆状病毒的表达系统中，可有效地保证生物制品的安全性。
附图说明
图1为本发明实验例1提供的sf9-RF细胞株与sf9细胞株的第5代、10代、15代、20代弹状病毒检测图；
图2为本发明实验例2提供的sf9-RF细胞株与sf9细胞株的细胞增殖特性图；
图3为本发明实验例3提供的sf9-RF细胞株与sf9细胞株病毒增殖能力比较结果，A图为两株细胞扩增Bac-GFP重组病毒曲线图，B图为两株细胞扩增Bac-cap重组病毒曲线图；
图4为本发明实验例4提供的sf9-RF细胞株与sf9细胞株外源蛋白表达能力对比图，A图为两株细胞表达PCV2-cap蛋白的SDS-PAGE图，1：sf9；2：sf9-RF，B图为两株细胞表达PCV2-cap蛋白的定量结果图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株的筛选方法，包括如下步骤：
1sf9细胞复苏并调整状态
1.1将商业来源的sf9细胞从液氮罐中取出一支，快速放于37℃水浴锅不断摇晃使其快速融化，将快速融化的细胞用无血清昆虫细胞培养基重悬后100g离心5min，弃去上清试用15ml昆虫细胞培养基重悬后放于125摇瓶中培养，培养温度27℃120rpm培养。
1.2步骤1.1中的细胞密度增长至4×106个/ml时，对细胞传代，无血清昆虫细胞培养基将细胞密度调整至1×106个/ml，27℃120rpm培养。
1.3步骤1.2中的细胞密度增长至4×106个/ml时，对细胞传代，无血清昆虫细胞培养基将细胞密度调整至1×106个/ml，27℃120rpm培养。连续传代3次保证其活力恢复；取第3代细胞悬液进行细胞筛选。
2细胞悬液制备并铺板
步骤1.3中的细胞密度增长至4×106个/ml，细胞活率不低于95％时，取细胞悬液将细胞密度调整至1×106个/ml后按10倍倍比稀释，最终的细胞密度为10个/ml，终细胞悬液体积为10ml；细胞稀释完成后铺96孔板，每孔接种0.1ml，观察单个细胞的孔，并拍照，27℃恒温培养箱中静置培养。
3单细胞培养并传代
3.1每间隔3天观察步骤2中的96孔板中细胞生长情况，并换液，至有明显集落形成或至第10天。将96孔板长出的单细胞集落轻轻吹吸，重悬后转移至24孔板中，并补加200μL培养基，27℃静置培养4天。
3.2取步骤3.1中的24孔板中细胞上清液200μL，提取RNA，并反转录后使用特异性弹状病毒鉴定引物，扩增反转录产物，记录弹状病毒阳性孔和阴性孔，并对弹状病毒阴性孔进行传代。
3.3取步骤3.2中的24孔板中无弹状病毒污染细胞，弃去培养基加入无血清昆虫细胞培养基300μL轻轻吹吸重悬，转移至6孔板补加培养基至1ml，于27℃静置培养4天。
3.4取步骤3.3中的6孔板中细胞上清液200μL，提取RNA，并反转录后使用特异性弹状病毒鉴定引物，扩增反转录产物，记录弹状病毒阳性孔和阴性孔，并对弹状病毒阴性孔进行传代。
3.5取步骤3.4中的6孔板中无弹状病毒污染细胞，弃去培养基加入无血清昆虫细胞培养基1000μL轻轻吹吸重悬，转移至T25方瓶补加培养基至5ml，于27℃静置培养4天。
3.6取步骤3.5中的T25方瓶中细胞上清液200μL，提取RNA，并反转录后使用特异性弹状病毒鉴定引物，扩增反转录产物，记录弹状病毒阳性细胞瓶和阴性细胞瓶，并对弹状病毒阴性细胞瓶进行传代。
3.7取步骤3.6中的T25方瓶中无弹状病毒污染细胞，弃去培养基轻拍细胞瓶侧面，加入无血清昆虫细胞培养基5ml重悬，移液器轻轻吹打，转移至T75方瓶，于27℃静置培养3天。
3.8取步骤3.7中的T75方瓶中无弹状病毒污染细胞，弃去培养基轻拍细胞瓶侧面，加入无血清昆虫细胞培养基15ml重悬，移液器将细胞轻轻吹打，转移至125摇瓶中220rpm27℃摇瓶培养。如此进行5次稳定传代，进行弹状病毒基因检测。
3.9建立种子库，摇瓶细胞无血清扩大培养，细胞密度达到4～6×106个/ml，活率为95％以上时，100g离心5min，加入细胞冻存液(10％DMSO+90％新鲜无血清培养基)重悬，使细胞密度为2×107个/ml，分装至冻存管中，命名为sf9-RF细胞株，放于梯度降温冻存盒中，于-80℃冻存，3天后转移至液氮罐中长期保存。
3.10对留种继续传代至20代，将筛选出的单克隆细胞进行弹状病毒基因检测、毒种扩增能力检测以及蛋白表达能力检测。
实验例1
对sf9细胞和通过实施例1的步骤筛选出的sf9-RF细胞株进行诺达病毒检测，分别收集第10代、第15代、20代培养48小时左右的细胞悬液，根据RNA提取试剂盒提取全基因组RNA，以RNA为模板合成cDNA，cDNA加入至PCR预混液，加入引物RV-FP/RV-RP后进行PCR扩增，PCR产物琼脂糖电泳鉴定是否存在诺达病毒污染。
本试验中用的引物根据RV序列，设计引物如下：
引物RV-FP：TGGCGAGGGACTGCTTACAGAAGG
引物RV-RP：CACAGCCGGGGGTGCAATCA
具体步骤如下：
(1)RV病毒基因组提取：收集第10代、20代培养48小时左右的细胞悬液，根据RNA提取试剂盒提取全基因组，具体步骤按试剂盒说明操作；
(2)反转录：用一步合成法的试剂盒进行反转录。反应体系如下表；
Figure BDA0003568194840000081
产物用于PCR的反应条件(42℃孵育30min，85℃加热5s灭活E Mix和g DNARemover)。
(3)将反转录产物按10倍倍比稀释，进行PCR扩增，反应体系如下表：
Figure BDA0003568194840000082
Figure BDA0003568194840000091
(4)判定标准：引物对RV-FP/RP的产物大小为730bp，在琼脂糖凝胶上根据2000bp的DNALadder所指示的条带大小判断，如果PCR产物大小分布符合以上结果，则判定检出诺达病毒。
结论：如图1所示，电泳显示应用引物对RV-FP/RP，sf9细胞第5代、第10代、第15代、20代细胞悬液均检测出目的条带，sf9-RF第5代、第10代、第15代、20代细胞悬液均未检出目的条带，由此可知，sf9细胞株弹状病毒阳性(图中的阳性对照组)，筛选出的sf9-RF细胞株无弹状病毒污染。
实验例2
sf9-RF细胞增殖特性
分别培养sf9-RF细胞和sf9细胞，以1×106个/ml细胞密度，25ml细胞悬液接种于125ml摇瓶中27℃120rpm培养，每24小时取样一次利用细胞细胞计数仪检测细胞活率直至细胞死亡。
结果：从图2可以看出，两株细胞sf9-RF和sf9的生长期周期一致，细胞倍增时间均在24～36小时之间，细胞直径均在16～19μm；sf9-RF最高细胞密度与sf9细胞无差异。
实验例3
杆状病毒在sf9-RF细胞增殖特性
(1)重组转移载体构建
将合成的序列GFP(SEQ ID.No.1)，PCV2-cap(SEQ ID.No.2)，使用引物扩增出目的条带，分别为：PCR-GFP、PCR-PCV2-cap，再分别与供体质粒pFastBac-HBM-EcoR I/KpnI进行T5克隆，分别命名为pFastBac-GFP、pFastBac-cap。引物序列见表1，PCR反应条件见表2
表1引物序列
Figure BDA0003568194840000101
表2 PCR反应条件
Figure BDA0003568194840000102
(2)取步骤(1)所得的pFastBac-GFP、pFastBac-cap质粒1μL加入DH10Bac感受态细胞中，轻弹混匀，冰上孵育30min，42℃热激90s，冰上孵育3min后加入500μL的LB培养基37℃220rpm 60min，取100μL LB重悬菌液涂布于含有IPTG/Kana/tet/Gm三抗平板，37℃培养过夜，当可观察到明显的蓝白斑时，挑取白斑进行PCR鉴定，鉴定引物为M13F与Gm-R序列如表12所示，PCR扩增条件同表3。
表3引物序列
Figure BDA0003568194840000111
将阳性重组Bacmid分别命名为DH10Bac-GFP、DH10Bac-cap，并转接至10mL LB(Kana/tet/Gm)液体培养基中，37℃220rpm培养过夜，使用杆状病毒穿梭载体Bacmid小量抽提试剂盒对重组杆粒进行提取，所得重组Bacmid分别命名为Bac-GFP、Bac-cap。
(3)用步骤(2)获得的Bac-cap和Bac-GFP重组杆状病毒按0.1MOI分别接种sf9和sf9-RF两种细胞株，保证细胞株接毒时密度为2×106个/ml。
(4)从第2天开始，每天取1ml培养基上清液留存，用于病毒滴度扩增情况检测，第5天结束。
(5)将收取的病毒上清液做TCID50检测：病毒稀释并接种到96孔培养板中。27℃培养5天后，使用丙酮固定液固定，完成后加入5％脱脂牛奶37℃封闭2h，弃去封闭液并洗板3次，37℃孵育gp64单抗60分钟。洗板后孵育带FITC荧光标记二抗30min，观察：在荧光显微镜下观察并记录出现荧光的孔数，按Reed-Muench两氏法计算病毒TCID50。
结果：如图3所示，sf9与sf9-RF细胞病毒扩增峰值均为1～3×107TCID50/ml，病毒峰值时间因时间不同而略有差异。结合上述数据sf9与sf9-RF细胞病毒扩增能力无差别。
实验例4
杆状病毒在sf9-RF细胞株中cap蛋白表达量检测。
取实验例3所获得的Bac-cap重组杆状病毒，按1MOI接种sf9-RF细胞悬液和sf9细胞悬液中(25ml)，细胞密度为2.5×106个/mL，125ml摇瓶中27℃120rpm培养，悬浮培养8天后，离心弃细胞沉淀取培养上清，利用SDS-PAGE进行蛋白表达检测，使用PCV2-cap蛋白定量试剂盒对目的蛋白进行定量。步骤如下：
(1)吸取细胞培养上清样品和5×上样缓冲液以4:1的比例混合，沸水水浴5min；样品上样20ul，设置80V电压，待样品进入分离胶界面后改为120V电压，电泳过程保持电流稳定。
(2)电泳完毕后进考马斯亮蓝染色并脱色后凝胶成像系统拍照观察，PCV2 cap蛋白大小为28kD左右，根据Marker标定的分子量判定目的蛋白是否表达。
(3)使用cap蛋白定量试剂盒进行目的蛋白定量检测。
结果：如图4A所示，sf9-RF细胞余sf9细胞的cap蛋白表达对比，目的条带在28kD处，使用蛋白定量试剂盒对目的蛋白定量结果显示目的蛋白含量无差异如图4B，sf9-RF细胞与sf9细胞无明显差异。
结论：sf9-RF细胞和商品化sf9细胞在增殖水平，杆状病毒扩增能力以及外源蛋白表达能力上均无差异，故sf9-RF细胞可作为杆状病毒表达系统的替代宿主细胞，用于生物制品的生产。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都纳微金生物技术有限公司
<120> 一种不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株、筛选方法及应用
<130> 20220310
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atggagtccg acgagtccgg cctgcccgcc atggagatcg agtgccgcat caccggcacc 60
ctgaacggcg tggagttcga gctggtgggc ggcggcgagg gcacccccaa gcagggccgc 120
atgaccaaca agatgaagtc caccaagggc gccctgacct tctcccccta cctgctgtcc 180
cacgtgatgg gctacggctt ctaccacttc ggcacctacc cctccggcta cgagaacccc 240
ttcctgcacg ccatcaacaa cggcggctac accaacaccc gcatcgagaa gtacgaggac 300
ggcggcgtgc tgcacgtgtc cttctcctac cgctacgagg ccggccgcgt gatcggcgac 360
ttcaaggtgg tgggcaccgg cttccccgag gactccgtga tcttcaccga caagatcatc 420
cgctccaacg ccaccgtgga gcacctgcac cccatgggcg acaacgtgct ggtgggctcc 480
ttcgcccgca ccttctccct gcgcgacggc ggctactact ccttcgtggt ggactcccac 540
atgcacttca agtccgccat ccacccctcc atcctgcaga acggcggccc catgttcgcc 600
ttccgccgcg tggaggagct gcactccaac accgagctgg gcatcgtgga gtaccagcac 660
gccttcaaga cccccatcgc cttcgcccgc tcccgcgccc agtcctccaa ctccgccgtg 720
gacggcaccg ccggccccgg ctccaccggc tcccgctaa 759
<210> 2
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgacgtacc cgcgccgccg ctttcgccgc cgccgccacc gcccgcgcag ccacttgggc 60
caaattttgc gccgccgccc gtggttggtg cacccgcgcc accgctaccg ctggcgccgc 120
aaaaacggca tttttaacac gcgcttgagc cgcacgtttg gctacacggt gaaaaaaacg 180
acggtgcgca cgccgagctg ggcggtggac atgatgcgct ttaacattaa cgactttttg 240
ccgccgggcg gcggcagcaa cccgttgacg gtgccgtttg aatactaccg cattcgcaaa 300
gtgaaagtgg aattttggcc gtgcagcccg attacgcaag gcgaccgcgg cgtgggcagc 360
acggcggtga ttttggacga caactttgtg acgaaagcga cggcgttgac gtacgacccg 420
tacgtgaact acagcagccg ccacacgatt acgcaaccgt ttagctacca cagccgctac 480
tttacgccga aaccggtgtt ggacagcacg attgactact ttcaaccgaa caacaaacgc 540
aaccaattgt ggttgcgctt gcaaacgagc gcgaacgtgg accacgtggg cttgggcacg 600
gcgtttgaaa acagcattta cgaccaagac tacaacattc gcgtgacgat gtacgtgcaa 660
tttcgcgaat ttaacttgaa agacccgccg ttgaacccga aatga 705

Claims (8)

1.一种不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株，其特征在于，该细胞株命名为sf9-RF细胞株，其生物保藏编号为：CGMCC No.45028。
2.如权利要求1所述的不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株的筛选方法，其特征在于，通过无血清条件进行筛选。
3.根据权利要求2所述的不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：
(1)使用无血清昆虫培养基将sf9细胞重悬、离心并去除上清后，用无血清昆虫培养基重悬并转移培养，连续传代3次，取第3代细胞悬液进行细胞筛选；
(2)使用无血清昆虫细胞培养基来稀释步骤(1)中获得的sf9细胞，将稀释后的细胞铺于孔板中，并进行恒温培养；
(3)定期观察孔板中细胞的生长情况，并换液，直到有明显集落形成或培养至第10天；
(4)将步骤(3)中获得的细胞集落重悬后转移至新的孔板中，补加培养基后进行恒温培养；
(5)对步骤(4)中获得的细胞上清液进行弹状病毒检测，并向弹状病毒阴性孔中加入无血清昆虫细胞培养基，重悬后转移至新孔板中继续进行恒温培养；
(6)对步骤(5)中获得的细胞上清液进行弹状病毒检测，并向弹状病毒阴性孔中加入无血清昆虫细胞培养基，重悬并转移至方瓶中进行恒温培养；
(7)对步骤(6)中获得的细胞上清液进行弹状病毒检测，将弹状病毒阴性瓶中的原培养基弃去，并加入无血清昆虫细胞培养基，重悬后转移至方瓶中进行恒温培养；
(8)将步骤(7)中方瓶中的原培养基去除，加入无血清昆虫细胞培养基并重悬后转移至摇瓶中进行恒温培养，并以此重复5次以进行传代后，进行弹状病毒基因检测；
(9)建立种子库，将步骤(8)中摇瓶细胞进行无血清昆虫细胞培养基扩大培养后冻存；
(10)对步骤(9)中的留种继续传至20代，将筛选出的单克隆细胞进行弹状病毒基因检测、毒种扩增能力检测以及蛋白表达能力检测。
4.根据权利要求3所述的不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，将细胞密度调整至0.8-1.2×106个/ml，按10倍倍比稀释5次，使细胞密度为8-12个/ml，终细胞悬液体积为10ml，铺设于96孔板，每孔接种0.1ml，置于恒温培养箱中静止培养。
5.根据权利要求3所述的不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株的筛选方法，其特征在于，步骤(9)中，摇瓶细胞进行无血清昆虫细胞培养基扩大培养，至细胞密度达到4～6×106个/ml，活率为95％以上时，100g离心4-6min，加入细胞冻存液(10％DMSO+90％新鲜无血清培养基)重悬，使细胞密度为1.5-2.5×107个/ml，分装至冻存管中，放于梯度降温冻存盒中，于-80℃冻存，3天后转移至液氮罐中长期保存。
6.根据权利要求3所述的不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株的筛选方法，其特征在于，步骤(1)-步骤(10)中，细胞恒温培养的温度为27℃。
7.根据权利要求3所述的不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株的筛选方法，其特征在于，步骤(1)-步骤(10)中的无血清昆虫细胞培养基为GIBCO Sf-900TMIII。
8.如权利要求1所述的不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株应用于基于杆状病毒表达系统的外源蛋白表达或AAV生产。
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