CN116478903A - 一种昆虫细胞无血清培养基及其应用 - Google Patents

一种昆虫细胞无血清培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种昆虫细胞无血清培养基及其应用，该培养基由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，不仅能够满足各种亚型昆虫细胞的培养需求，还能够有效提高AAV的表达量并降低空壳率，且可以维持更长时间更高活率的细胞状态，从而能够提高生产效率；该培养基价格低廉，从而可以降低生产成本，具有广泛的应用前景和价值。

Description

一种昆虫细胞无血清培养基及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种昆虫细胞无血清培养基及其应用。
背景技术
昆虫细胞表达系统（杆状病毒表达系统），作为真核细胞系统，具有其独特的生物学特性，它是表达大片段DNA的理想载体，其重组蛋白也具有完整的生物学功能，相对于其他表达系统（如CHO等哺乳动物细胞），表达水平更高，能同时表达多个基因，且较低的免疫原性，不会引起炎症反应，故已应用于多个领域，如基因治疗及疫苗等方面的研究。如何快速、安全、有效且低成本开发适用性预防疫苗，成为一个阶段性的挑战。昆虫细胞表达系统能够快速获得高产的表达产物、对人体安全，并且极其适用于规模化放大生产，无疑是快速、安全且低成本生产新冠预防性疫苗的有效途径之一。
腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是基因治疗领域应用最为广泛的载体，也是经过FDA认证的，对人体极其安全的生物载体。目前生产AAV的主流工具细胞，包括人源的HEK293和各种亚型的昆虫细胞。以HEK293作为AAV病毒的生产宿主，很难实现低成本的规模化生产，其多质粒瞬转的生产方法，极大的限制了工业化的生产规模（一般在500L以下，多数为200L），造成目前AAV相关疗法成本极高，特别是对于全身性用药的病症或者患者，治疗费用无法承担，临床可及性极差。而以昆虫细胞作为AAV病毒的生产宿主，可以有效解决上述弊端，其工业化放大生产规模可至数千升，且工艺较HEK293稳定可控，极大的压缩了AAV病毒生产成本，扩大了AAV相关疗法或者药物的临床可及性，以造福社会和广大患者。
以昆虫细胞作为AAV生产宿主，一个高表达的细胞系，搭配合适的培养基，对提高AAV病毒产量和方便后期相关质量的鉴定至关重要。而目前培养昆虫细胞的培养基，大多会添加5%甚至更多含量的血清，使其增加了很多的风险，也有一些进口培养基（如Gibco的SF900 III）或者国产培养基，虽然不添加血清，但依然含有少量水解物成分，且价格昂贵。
因此，昆虫细胞无血清培养基及其应用，是本行业目前研究的热点和痛点。
发明内容
针对上述问题，发明人开发了一种无任何动物性来源成分的、无蛋白的、化学成分明确的昆虫细胞无血清培养基，不仅能够满足各种亚型昆虫细胞的培养需求，还能够有效提高AAV的表达量并降低空壳率，且价格低廉。
本发明的目的在于提供一种昆虫细胞无血清培养基及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种昆虫细胞无血清培养基，由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成；
所述氨基酸的各组分具体如下：L-精氨酸310-400mg/L、L-天冬氨酸910-1000mg/L、L-天冬酰胺600-750mg/L、L-组氨酸333-400mg/L、L-异亮氨酸535-750mg/L、L-亮氨酸621-700mg/L、L-赖氨酸452mg/L、L-蛋氨酸78-113mg/L、L-苯丙氨酸200-211mg/L、L-脯氨酸300-444mg/L、L-丝氨酸500-620mg/L、L-苏氨酸100-109mg/L、L-色氨酸300-361mg/L、L-酪氨酸420mg/L、L-缬氨酸500mg/L、L-胱氨酸200mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-谷氨酸300mg/L、L-谷氨酰胺400mg/L、甘氨酸11mg/L、还原型谷胱甘肽500mg/L；
所述维生素的各组分具体如下：生物素0.1-1mg/L、D-泛酸钙2-10mg/L、叶酸10-20mg/L、烟酰胺3-10mg/L、维生素B6 2-5mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、维生素B12 4-5mg/L、核黄素0.1-1mg/L、氯化胆碱80-100mg/L、肌醇30-40mg/L、维生素C 30-100mg/L、维生素E 13-20mg/L、维生素K1 2-10mg/L；
所述无机盐的各组分具体如下：氯化镁90-100mg/L、氯化钙110-200mg/L、氯化钾333-800mg/L、碳酸氢钠1200-2000mg/L、氯化钠1000-2000mg/L、磷酸二氢钠600-700mg/L、氯化锌20-40mg/L、柠檬酸铁铵100-200mg/L；
所述微量元素的各组分具体如下：二水氯化铜0.000124-0.00124mg/L、氯化铝0.0001683-0.000368mg/L、氯化钴0.000033-0.0003mg/L、氯化镉0.000001-0.00001mg/L、亚硒酸钠0.000001-0.00001mg/L、硫酸锰0.0000024-0.000024mg/L、醋酸钡0.0000063-0.000063mg/L、六水合硫酸镍0.0000064-0.000064mg/L；
所述碳水化合物的各组分具体如下：葡萄糖8000-9000mg/L、蔗糖5000mg/L、丙酮酸钠100mg/L、L-苹果酸100-200mg/L、α-酮戊二酸100-150mg/L；
所述其他分子化合物的各组分具体如下：乙醇胺15mg/L、腐胺1-5mg/L、精胺10-15mg/L、硫辛酸1mg/L、亚油酸0.2mg/L、花生四烯酸0.1mg/L、硫酸葡聚糖10-12mg/L、泊洛沙姆188 1000mg/L、重组人胰岛素1-2mg/L、重组表皮细胞生长因子0.1-1mg/L、胸苷2-2.5mg/L、胞苷2-2.5mg/L、鸟苷2-2.5mg/L、尿苷2-2.5mg/L和次黄嘌呤2-2.5mg/L。
优选的，所述氨基酸的各组分具体如下：L-精氨酸310mg/L、L-天冬氨酸1000mg/L、L-天冬酰胺750mg/L、L-组氨酸333mg/L、L-异亮氨酸535mg/L、L-亮氨酸621mg/L、L-赖氨酸452mg/L、L-蛋氨酸113mg/L、L-苯丙氨酸211mg/L、L-脯氨酸444mg/L、L-丝氨酸620mg/L、L-苏氨酸109mg/L、L-色氨酸361mg/L、L-酪氨酸420mg/L、L-缬氨酸500mg/L、L-胱氨酸200mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-谷氨酸300mg/L、L-谷氨酰胺400mg/L、甘氨酸11mg/L、还原型谷胱甘肽500mg/L；
所述维生素的各组分具体如下：生物素1mg/L、D-泛酸钙10mg/L、叶酸20mg/L、烟酰胺10mg/L、维生素B6 5mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、维生素B12 5mg/L、核黄素1mg/L、氯化胆碱100mg/L、肌醇40mg/L、维生素C 100mg/L、维生素E 20mg/L、维生素K1 10mg/L；
所述无机盐的各组分具体如下：氯化镁90mg/L、氯化钙110mg/L、氯化钾333mg/L、碳酸氢钠1200mg/L、氯化钠2000mg/L、磷酸二氢钠600mg/L、氯化锌20mg/L、柠檬酸铁铵100mg/L；
所述微量元素的各组分具体如下：二水氯化铜0.000124mg/L、氯化铝0.0001683mg/L、氯化钴0.000033mg/L、氯化镉0.000001mg/L、亚硒酸钠0.000001mg/L、硫酸锰0.0000024mg/L、醋酸钡0.0000063mg/L、六水合硫酸镍0.0000064mg/L；
所述碳水化合物的各组分具体如下：葡萄糖8000mg/L、蔗糖5000mg/L、丙酮酸钠100mg/L、L-苹果酸200mg/L、α-酮戊二酸150mg/L；
所述其他分子化合物的各组分具体如下：乙醇胺15mg/L、腐胺5mg/L、精胺10mg/L、硫辛酸1mg/L、亚油酸0.2mg/L、花生四烯酸0.1mg/L、硫酸葡聚糖12mg/L、泊洛沙姆1881000mg/L、重组人胰岛素1mg/L、重组表皮细胞生长因子1mg/L、胸苷2mg/L、胞苷2mg/L、鸟苷2mg/L、尿苷2mg/L和次黄嘌呤2mg/L。
优选的，所述的昆虫细胞为Sf-9、Sf-21、High Five中的任意一种。
优选的，一种昆虫细胞无血清培养基的应用，该昆虫细胞无血清培养基用于病毒生产和包装。
优选的，所述的病毒为腺相关病毒。
优选的，该昆虫细胞无血清培养基用于生物类药物的生产。
优选的，所述的生物类药物为抗体、融合蛋白、重组蛋白、酶、疫苗中的任意一种。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
1、本发明提供的昆虫细胞无血清培养基，无任何动物性来源成分的、无蛋白成分、化学成分明确。
2、本发明提供的昆虫细胞无血清培养基，不仅能够满足多种亚型昆虫细胞高密度的悬浮培养，而且可以维持更长时间更高活率的细胞状态，从而能够提高生产效率，降低生产成本，具有广泛的应用前景和价值。
3、本发明提供的昆虫细胞无血清培养基，能够显著提高病毒产量，降低病毒空壳率，有利于降低病毒规模化生产和质量检测成本。
综上，本发明的培养基弥补了现有昆虫培养基的不足，极大程度上改善了国内昆虫细胞无血清培养基在规模化应用过程中的性能不足，能够为基因治疗，特别是新冠疫苗等商业化生产提供质量稳定的高性能昆虫细胞无血清培养基。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明培养Sf-9细胞的活细胞密度变化曲线图；
图2是本发明培养Sf-9细胞的细胞活率变化曲线图；
图3是本发明培养Sf-21细胞的活细胞密度变化曲线图；
图4是本发明培养Sf-21细胞的细胞活率变化曲线图；
图5是本发明培养High Five细胞的活细胞密度变化曲线图；
图6是本发明培养High Five细胞的细胞活率变化曲线图；
图7是本发明实施例3和对照组培养Sf-9细胞的病毒滴度对照示意图；
图8是本发明实施例3和对照组培养Sf-9细胞的病毒空壳率对照示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所述的昆虫细胞培养基组成（包括氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物各成分）均采购自西格玛（Sigma）；商业化培养基Sf-900III SFM采购自赛默飞（Gibco）；细胞株Sf-9、Sf-21、High Five均购自赛默飞（Gibco）；qPCR检测试剂盒（厂家：百奥莱博，货号BTN14-62400）。
一、培养基的配置：
实施例1~7的昆虫细胞无血清培养基制备方法如下：将1L用量对应的氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组分加入800mL的注射用水中，室温搅拌30分钟后，加入一定量的氢氧化钠助溶，用盐酸调节pH到6.7~7.0，定容至1L后，用0.22µm无菌膜过滤，4℃长期保存备用，即可。
实施例1：由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，
其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：L-精氨酸310mg/L、L-天冬氨酸1000mg/L、L-天冬酰胺750mg/L、L-组氨酸333mg/L、L-异亮氨酸535mg/L、L-亮氨酸621mg/L、L-赖氨酸452mg/L、L-蛋氨酸113mg/L、L-苯丙氨酸211mg/L、L-脯氨酸444mg/L、L-丝氨酸620mg/L、L-苏氨酸109mg/L、L-色氨酸361mg/L、L-酪氨酸420mg/L、L-缬氨酸500mg/L、L-胱氨酸200mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-谷氨酸300mg/L、L-谷氨酰胺400mg/L、甘氨酸11mg/L、还原型谷胱甘肽500mg/L；
维生素是以下终浓度的各成分：生物素0.1mg/L、D-泛酸钙2mg/L、叶酸10mg/L、烟酰胺3mg/L、维生素B6 2mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、维生素B12 4mg/L、核黄素0.1mg/L、氯化胆碱80mg/L、肌醇30mg/L、维生素C 30mg/L、维生素E 13mg/L、维生素K1 2mg/L；
无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁90mg/L、氯化钙110mg/L、氯化钾333mg/L、碳酸氢钠1200mg/L、氯化钠2000mg/L、磷酸二氢钠600mg/L、氯化锌20mg/L、柠檬酸铁铵100mg/L；
微量元素是以下终浓度的各成分：二水氯化铜0.000124mg/L、氯化铝0.0001683mg/L、氯化钴0.000033mg/L、氯化镉0.000001mg/L、亚硒酸钠0.000001mg/L、硫酸锰0.0000024mg/L、醋酸钡0.0000063mg/L、六水合硫酸镍0.0000064mg/L；
碳水化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖8000mg/L、蔗糖5000mg/L、丙酮酸钠100mg/L、L-苹果酸200mg/L、α-酮戊二酸150mg/L；
其他分子化合物是以下终浓度的各成分：乙醇胺15mg/L、腐胺5mg/L、精胺10mg/L、硫辛酸1mg/L、亚油酸0.2mg/L、花生四烯酸0.1mg/L、硫酸葡聚糖12mg/L、泊洛沙姆1881000mg/L、重组人胰岛素1mg/L、重组表皮细胞生长因子1mg/L、胸苷2mg/L、胞苷2mg/L、鸟苷2mg/L、尿苷2mg/L和次黄嘌呤2mg/L。
实施例2：由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，
其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：L-精氨酸400mg/L、L-天冬氨酸910mg/L、L-天冬酰胺600mg/L、L-组氨酸400mg/L、L-异亮氨酸750mg/L、L-亮氨酸700mg/L、L-赖氨酸452mg/L、L-蛋氨酸78mg/L、L-苯丙氨酸200mg/L、L-脯氨酸300mg/L、L-丝氨酸500mg/L、L-苏氨酸100mg/L、L-色氨酸300mg/L、L-酪氨酸420mg/L、L-缬氨酸500mg/L、L-胱氨酸200mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-谷氨酸300mg/L、L-谷氨酰胺400mg/L、甘氨酸11mg/L、还原型谷胱甘肽500mg/L；
维生素是以下终浓度的各成分：生物素0.1mg/L、D-泛酸钙2mg/L、叶酸10mg/L、烟酰胺3mg/L、维生素B6 2mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、维生素B12 4mg/L、核黄素0.1mg/L、氯化胆碱80mg/L、肌醇30mg/L、维生素C 30mg/L、维生素E 13mg/L、维生素K1 2mg/L；
无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁90mg/L、氯化钙110mg/L、氯化钾333mg/L、碳酸氢钠1200mg/L、氯化钠2000mg/L、磷酸二氢钠600mg/L、氯化锌20mg/L、柠檬酸铁铵100mg/L；
微量元素是以下终浓度的各成分：二水氯化铜0.000124mg/L、氯化铝0.0001683mg/L、氯化钴0.000033mg/L、氯化镉0.000001mg/L、亚硒酸钠0.000001mg/L、硫酸锰0.0000024mg/L、醋酸钡0.0000063mg/L、六水合硫酸镍0.0000064mg/L；
碳水化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖8000mg/L、蔗糖5000mg/L、丙酮酸钠100mg/L、L-苹果酸200mg/L、α-酮戊二酸150mg/L；
其他分子化合物是以下终浓度的各成分：乙醇胺15mg/L、腐胺5mg/L、精胺10mg/L、硫辛酸1mg/L、亚油酸0.2mg/L、花生四烯酸0.1mg/L、硫酸葡聚糖12mg/L、泊洛沙姆1881000mg/L、重组人胰岛素1mg/L、重组表皮细胞生长因子1mg/L、胸苷2mg/L、胞苷2mg/L、鸟苷2mg/L、尿苷2mg/L和次黄嘌呤2mg/L。
实施例3：由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，
其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：L-精氨酸310mg/L、L-天冬氨酸1000mg/L、L-天冬酰胺750mg/L、L-组氨酸333mg/L、L-异亮氨酸535mg/L、L-亮氨酸621mg/L、L-赖氨酸452mg/L、L-蛋氨酸113mg/L、L-苯丙氨酸211mg/L、L-脯氨酸444mg/L、L-丝氨酸620mg/L、L-苏氨酸109mg/L、L-色氨酸361mg/L、L-酪氨酸420mg/L、L-缬氨酸500mg/L、L-胱氨酸200mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-谷氨酸300mg/L、L-谷氨酰胺400mg/L、甘氨酸11mg/L、还原型谷胱甘肽500mg/L；
维生素是以下终浓度的各成分：生物素1mg/L、D-泛酸钙10mg/L、叶酸20mg/L、烟酰胺10mg/L、维生素B6 5mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、维生素B12 5mg/L、核黄素1mg/L、氯化胆碱100mg/L、肌醇40mg/L、维生素C 100mg/L、维生素E 20mg/L、维生素K1 10mg/L；
无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁90mg/L、氯化钙110mg/L、氯化钾333mg/L、碳酸氢钠1200mg/L、氯化钠2000mg/L、磷酸二氢钠600mg/L、氯化锌20mg/L、柠檬酸铁铵100mg/L；
微量元素是以下终浓度的各成分：二水氯化铜0.000124mg/L、氯化铝0.0001683mg/L、氯化钴0.000033mg/L、氯化镉0.000001mg/L、亚硒酸钠0.000001mg/L、硫酸锰0.0000024mg/L、醋酸钡0.0000063mg/L、六水合硫酸镍0.0000064mg/L；
碳水化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖8000mg/L、蔗糖5000mg/L、丙酮酸钠100mg/L、L-苹果酸200mg/L、α-酮戊二酸150mg/L；
其他分子化合物是以下终浓度的各成分：乙醇胺15mg/L、腐胺5mg/L、精胺10mg/L、硫辛酸1mg/L、亚油酸0.2mg/L、花生四烯酸0.1mg/L、硫酸葡聚糖12mg/L、泊洛沙姆1881000mg/L、重组人胰岛素1mg/L、重组表皮细胞生长因子1mg/L、胸苷2mg/L、胞苷2mg/L、鸟苷2mg/L、尿苷2mg/L和次黄嘌呤2mg/L。
实施例4：由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，
其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：L-精氨酸310mg/L、L-天冬氨酸1000mg/L、L-天冬酰胺750mg/L、L-组氨酸333mg/L、L-异亮氨酸535mg/L、L-亮氨酸621mg/L、L-赖氨酸452mg/L、L-蛋氨酸113mg/L、L-苯丙氨酸211mg/L、L-脯氨酸444mg/L、L-丝氨酸620mg/L、L-苏氨酸109mg/L、L-色氨酸361mg/L、L-酪氨酸420mg/L、L-缬氨酸500mg/L、L-胱氨酸200mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-谷氨酸300mg/L、L-谷氨酰胺400mg/L、甘氨酸11mg/L、还原型谷胱甘肽500mg/L；
维生素是以下终浓度的各成分：生物素0.1mg/L、D-泛酸钙2mg/L、叶酸10mg/L、烟酰胺3mg/L、维生素B6 2mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、维生素B12 4mg/L、核黄素0.1mg/L、氯化胆碱80mg/L、肌醇30mg/L、维生素C 30mg/L、维生素E 13mg/L、维生素K1 2mg/L；
无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁100mg/L、氯化钙200mg/L、氯化钾800mg/L、碳酸氢钠2000mg/L、氯化钠1000mg/L、磷酸二氢钠700mg/L、氯化锌40mg/L、柠檬酸铁铵200mg/L；
微量元素是以下终浓度的各成分：二水氯化铜0.000124mg/L、氯化铝0.0001683mg/L、氯化钴0.000033mg/L、氯化镉0.000001mg/L、亚硒酸钠0.000001mg/L、硫酸锰0.0000024mg/L、醋酸钡0.0000063mg/L、六水合硫酸镍0.0000064mg/L；
碳水化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖8000mg/L、蔗糖5000mg/L、丙酮酸钠100mg/L、L-苹果酸200mg/L、α-酮戊二酸150mg/L；
其他分子化合物是以下终浓度的各成分：乙醇胺15mg/L、腐胺5mg/L、精胺10mg/L、硫辛酸1mg/L、亚油酸0.2mg/L、花生四烯酸0.1mg/L、硫酸葡聚糖12mg/L、泊洛沙姆1881000mg/L、重组人胰岛素1mg/L、重组表皮细胞生长因子1mg/L、胸苷2mg/L、胞苷2mg/L、鸟苷2mg/L、尿苷2mg/L和次黄嘌呤2mg/L。
实施例5：由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，
其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：L-精氨酸310mg/L、L-天冬氨酸1000mg/L、L-天冬酰胺750mg/L、L-组氨酸333mg/L、L-异亮氨酸535mg/L、L-亮氨酸621mg/L、L-赖氨酸452mg/L、L-蛋氨酸113mg/L、L-苯丙氨酸211mg/L、L-脯氨酸444mg/L、L-丝氨酸620mg/L、L-苏氨酸109mg/L、L-色氨酸361mg/L、L-酪氨酸420mg/L、L-缬氨酸500mg/L、L-胱氨酸200mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-谷氨酸300mg/L、L-谷氨酰胺400mg/L、甘氨酸11mg/L、还原型谷胱甘肽500mg/L；
维生素是以下终浓度的各成分：生物素0.1mg/L、D-泛酸钙2mg/L、叶酸10mg/L、烟酰胺3mg/L、维生素B6 2mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、维生素B12 4mg/L、核黄素0.1mg/L、氯化胆碱80mg/L、肌醇30mg/L、维生素C 30mg/L、维生素E 13mg/L、维生素K1 2mg/L；
无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁90mg/L、氯化钙110mg/L、氯化钾333mg/L、碳酸氢钠1200mg/L、氯化钠2000mg/L、磷酸二氢钠600mg/L、氯化锌20mg/L、柠檬酸铁铵100mg/L；
微量元素是以下终浓度的各成分：二水氯化铜0.00124mg/L、氯化铝0.000368mg/L、氯化钴0.0003mg/L、氯化镉0.00001mg/L、亚硒酸钠0.00001mg/L、硫酸锰0.000024mg/L、醋酸钡0.000063mg/L、六水合硫酸镍0.000064mg/L；
碳水化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖8000mg/L、蔗糖5000mg/L、丙酮酸钠100mg/L、L-苹果酸200mg/L、α-酮戊二酸150mg/L；
其他分子化合物是以下终浓度的各成分：乙醇胺15mg/L、腐胺5mg/L、精胺10mg/L、硫辛酸1mg/L、亚油酸0.2mg/L、花生四烯酸0.1mg/L、硫酸葡聚糖12mg/L、泊洛沙姆1881000mg/L、重组人胰岛素1mg/L、重组表皮细胞生长因子1mg/L、胸苷2mg/L、胞苷2mg/L、鸟苷2mg/L、尿苷2mg/L和次黄嘌呤2mg/L。
实施例6：由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，
其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：L-精氨酸310mg/L、L-天冬氨酸1000mg/L、L-天冬酰胺750mg/L、L-组氨酸333mg/L、L-异亮氨酸535mg/L、L-亮氨酸621mg/L、L-赖氨酸452mg/L、L-蛋氨酸113mg/L、L-苯丙氨酸211mg/L、L-脯氨酸444mg/L、L-丝氨酸620mg/L、L-苏氨酸109mg/L、L-色氨酸361mg/L、L-酪氨酸420mg/L、L-缬氨酸500mg/L、L-胱氨酸200mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-谷氨酸300mg/L、L-谷氨酰胺400mg/L、甘氨酸11mg/L、还原型谷胱甘肽500mg/L；
维生素是以下终浓度的各成分：生物素0.1mg/L、D-泛酸钙2mg/L、叶酸10mg/L、烟酰胺3mg/L、维生素B6 2mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、维生素B12 4mg/L、核黄素0.1mg/L、氯化胆碱80mg/L、肌醇30mg/L、维生素C 30mg/L、维生素E 13mg/L、维生素K1 2mg/L；
无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁90mg/L、氯化钙110mg/L、氯化钾333mg/L、碳酸氢钠1200mg/L、氯化钠2000mg/L、磷酸二氢钠600mg/L、氯化锌20mg/L、柠檬酸铁铵100mg/L；
微量元素是以下终浓度的各成分：二水氯化铜0.000124mg/L、氯化铝0.0001683mg/L、氯化钴0.000033mg/L、氯化镉0.000001mg/L、亚硒酸钠0.000001mg/L、硫酸锰0.0000024mg/L、醋酸钡0.0000063mg/L、六水合硫酸镍0.0000064mg/L；
碳水化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖9000mg/L、蔗糖5000mg/L、丙酮酸钠100mg/L、L-苹果酸100mg/L、α-酮戊二酸100mg/L；
其他分子化合物是以下终浓度的各成分：乙醇胺15mg/L、腐胺5mg/L、精胺10mg/L、硫辛酸1mg/L、亚油酸0.2mg/L、花生四烯酸0.1mg/L、硫酸葡聚糖12mg/L、泊洛沙姆1881000mg/L、重组人胰岛素1mg/L、重组表皮细胞生长因子1mg/L、胸苷2mg/L、胞苷2mg/L、鸟苷2mg/L、尿苷2mg/L和次黄嘌呤2mg/L。
实施例7：由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，
其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：L-精氨酸310mg/L、L-天冬氨酸1000mg/L、L-天冬酰胺750mg/L、L-组氨酸333mg/L、L-异亮氨酸535mg/L、L-亮氨酸621mg/L、L-赖氨酸452mg/L、L-蛋氨酸113mg/L、L-苯丙氨酸211mg/L、L-脯氨酸444mg/L、L-丝氨酸620mg/L、L-苏氨酸109mg/L、L-色氨酸361mg/L、L-酪氨酸420mg/L、L-缬氨酸500mg/L、L-胱氨酸200mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-谷氨酸300mg/L、L-谷氨酰胺400mg/L、甘氨酸11mg/L、还原型谷胱甘肽500mg/L；
维生素是以下终浓度的各成分：生物素0.1mg/L、D-泛酸钙2mg/L、叶酸10mg/L、烟酰胺3mg/L、维生素B6 2mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、维生素B12 4mg/L、核黄素0.1mg/L、氯化胆碱80mg/L、肌醇30mg/L、维生素C 30mg/L、维生素E 13mg/L、维生素K1 2mg/L；
无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁90mg/L、氯化钙110mg/L、氯化钾333mg/L、碳酸氢钠1200mg/L、氯化钠2000mg/L、磷酸二氢钠600mg/L、氯化锌20mg/L、柠檬酸铁铵100mg/L；
微量元素是以下终浓度的各成分：二水氯化铜0.000124mg/L、氯化铝0.0001683mg/L、氯化钴0.000033mg/L、氯化镉0.000001mg/L、亚硒酸钠0.000001mg/L、硫酸锰0.0000024mg/L、醋酸钡0.0000063mg/L、六水合硫酸镍0.0000064mg/L；
碳水化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖8000mg/L、蔗糖5000mg/L、丙酮酸钠100mg/L、L-苹果酸200mg/L、α-酮戊二酸150mg/L；
其他分子化合物是以下终浓度的各成分：乙醇胺15mg/L、腐胺1mg/L、精胺15mg/L、硫辛酸1mg/L、亚油酸0.2mg/L、花生四烯酸0.1mg/L、硫酸葡聚糖10mg/L、泊洛沙姆1881000mg/L、重组人胰岛素2mg/L、重组表皮细胞生长因子0.1mg/L、胸苷2.5mg/L、胞苷2.5mg/L、鸟苷2.5mg/L、尿苷2.5mg/L和次黄嘌呤2.5mg/L。
二、病毒表达和检测：
步骤1、细胞培养基的制备：
实施例1~7的昆虫细胞无血清培养基作为实验组；
商品化培养基Sf-900 III SFM作为对照组。
步骤2、驯化昆虫细胞：
将昆虫细胞（Sf-9、Sf-21或者High Five细胞）以0.4×106细胞数/mL的密度接种至含20mL实验组培养基和对照组培养基的125mL三角摇瓶中，将三角摇瓶置于28℃摇床中培养，转速120rpm；当细胞密度约3×106细胞数/mL时，以0.8×106细胞数/mL的密度接种传代，直至细胞传代10次以上。
步骤3、检测病毒滴度以及空壳率：
步骤3.1、将步骤2驯化并培养好的昆虫细胞（Sf-9、Sf-21或者High Five细胞）以0.8×106细胞数/mL的密度分别接种至含30mL对照组培养基和实验组培养基的125mL三角摇瓶中，将三角摇瓶置于28℃摇床中培养，转速120rpm。
步骤3.2、将步骤3.1的细胞培养2天后，此时细胞密度约为2.5~4×106细胞数/mL。以感染复数2MOI（即病毒与细胞个数比值为2）接种重组杆状病毒reAcMNPV06（申请人自行构建保有，能够稳定表达重组AAV病毒，其中AcMNPV由华南农业大学孙京臣教授赠予）至对照组培养基和实验组培养基培养的细胞中，继续28℃摇床中培养72小时，转速120rpm。其他能够表达AAV病毒的重组杆状病毒，也可进行病毒滴度以及空壳率的验证实验，并获得类似的验证结果。
步骤3.3、收集3.2步骤中培养的细胞上清，qPCR检测试剂盒检测培养上清中的病毒滴度以及病毒空壳率。
三、结果和分析：
1、根据步骤2驯化Sf-9细胞，每隔24小时取样计数，如图1所示实验组和对照组细胞培养至第6天（D06）达到密度峰值，实验组的实施例3活细胞峰值密度为11×106细胞数/mL，如图2所示，活率大于95%，明显优于对照组；
2、根据步骤2驯化Sf-21细胞，每隔24小时取样计数，如图3所示，实验组和对照组细胞培养至第6天（D06）达到密度峰值，实验组的实施例3活细胞峰值密度为13×106细胞数/mL，如图4所示，活率大于95%，明显优于对照组；
3、根据步骤2驯化High Five细胞，每隔24小时取样计数，如图5所示，实验组和对照组细胞培养至第5天（D05）达到密度峰值，实验组的实施例3活细胞峰值密度为12×106细胞数/mL，如图6所示，活率大于95%，明显优于对照组；
4、以Sf-9细胞为例，根据步骤3检测实验组的实施例3的培养基和对照组培养基表达病毒，病毒感染后培养3天取培养上清，检测上清中病毒滴度和病毒空壳率，如图7所示，实验组的实施例3上清中病毒滴度可达19×106TU/mL，如图8所示，病毒空壳率远低于5%，整体性能优于对照培养基。
上述实验结果表明：（1）本发明公开的昆虫细胞无血清培养基，是完全化学成分确定的，不含有任何动物来源性成分的无血清配方，不仅能够满足Sf-9、Sf-21和Higfh Five等多种昆虫细胞高密度的悬浮培养，而且整体性能表现优于对照的进口培养基，可以维持更长时间更高活率的细胞状态，具有广泛的应用前景和价值；（2）本发明公开的昆虫细胞无血清培养基，能够有效促进病毒的包装，提高培养病毒包装滴度，降低空壳病毒的组装概率，降低后期的质量检测和控制风险。
本发明的培养基不含血清和蛋白质，所有组分化学成分确定，能够满足多种昆虫细胞的高密度悬浮培养，并且本发明的培养基能够支持病毒的高滴度表达，降低病毒空壳率；本发明的培养基为国内研发产品，性能优于主流进口培养基，可以从整体上降低生产成本，适用于大规模生产。本发明的培养基弥补了现有昆虫细胞培养基的不足，填补了国内化学成分确定的昆虫细胞培养基的空白。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种昆虫细胞无血清培养基，其特征在于，由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成；
所述氨基酸的各组分具体如下：L-精氨酸310-400mg/L、L-天冬氨酸910-1000mg/L、L-天冬酰胺600-750mg/L、L-组氨酸333-400mg/L、L-异亮氨酸535-750mg/L、L-亮氨酸621-700mg/L、L-赖氨酸452mg/L、L-蛋氨酸78-113mg/L、L-苯丙氨酸200-211mg/L、L-脯氨酸300-444mg/L、L-丝氨酸500-620mg/L、L-苏氨酸100-109mg/L、L-色氨酸300-361mg/L、L-酪氨酸420mg/L、L-缬氨酸500mg/L、L-胱氨酸200mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-谷氨酸300mg/L、L-谷氨酰胺400mg/L、甘氨酸11mg/L、还原型谷胱甘肽500mg/L；
所述维生素的各组分具体如下：生物素0.1-1mg/L、D-泛酸钙2-10mg/L、叶酸10-20mg/L、烟酰胺3-10mg/L、维生素B6 2-5mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、维生素B12 4-5mg/L、核黄素0.1-1mg/L、氯化胆碱80-100mg/L、肌醇30-40mg/L、维生素C 30-100mg/L、维生素E 13-20mg/L、维生素K1 2-10mg/L；
所述无机盐的各组分具体如下：氯化镁90-100mg/L、氯化钙110-200mg/L、氯化钾333-800mg/L、碳酸氢钠1200-2000mg/L、氯化钠1000-2000mg/L、磷酸二氢钠600-700mg/L、氯化锌20-40mg/L、柠檬酸铁铵100-200mg/L；
所述微量元素的各组分具体如下：二水氯化铜0.000124-0.00124mg/L、氯化铝0.0001683-0.000368mg/L、氯化钴0.000033-0.0003mg/L、氯化镉0.000001-0.00001mg/L、亚硒酸钠0.000001-0.00001mg/L、硫酸锰0.0000024-0.000024mg/L、醋酸钡0.0000063-0.000063mg/L、六水合硫酸镍0.0000064-0.000064mg/L；
所述碳水化合物的各组分具体如下：葡萄糖8000-9000mg/L、蔗糖5000mg/L、丙酮酸钠100mg/L、L-苹果酸100-200mg/L、α-酮戊二酸100-150mg/L；
所述其他分子化合物的各组分具体如下：乙醇胺15mg/L、腐胺1-5mg/L、精胺10-15mg/L、硫辛酸1mg/L、亚油酸0.2mg/L、花生四烯酸0.1mg/L、硫酸葡聚糖10-12mg/L、泊洛沙姆1881000mg/L、重组人胰岛素1-2mg/L、重组表皮细胞生长因子0.1-1mg/L、胸苷2-2.5mg/L、胞苷2-2.5mg/L、鸟苷2-2.5mg/L、尿苷2-2.5mg/L和次黄嘌呤2-2.5mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种昆虫细胞无血清培养基，其特征在于，所述氨基酸的各组分具体如下：L-精氨酸310mg/L、L-天冬氨酸1000mg/L、L-天冬酰胺750mg/L、L-组氨酸333mg/L、L-异亮氨酸535mg/L、L-亮氨酸621mg/L、L-赖氨酸452mg/L、L-蛋氨酸113mg/L、L-苯丙氨酸211mg/L、L-脯氨酸444mg/L、L-丝氨酸620mg/L、L-苏氨酸109mg/L、L-色氨酸361mg/L、L-酪氨酸420mg/L、L-缬氨酸500mg/L、L-胱氨酸200mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-谷氨酸300mg/L、L-谷氨酰胺400mg/L、甘氨酸11mg/L、还原型谷胱甘肽500mg/L；
所述维生素的各组分具体如下：生物素1mg/L、D-泛酸钙10mg/L、叶酸20mg/L、烟酰胺10mg/L、维生素B6 5mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、维生素B12 5mg/L、核黄素1mg/L、氯化胆碱100mg/L、肌醇40mg/L、维生素C 100mg/L、维生素E 20mg/L、维生素K1 10mg/L；
所述无机盐的各组分具体如下：氯化镁90mg/L、氯化钙110mg/L、氯化钾333mg/L、碳酸氢钠1200mg/L、氯化钠2000mg/L、磷酸二氢钠600mg/L、氯化锌20mg/L、柠檬酸铁铵100mg/L；
所述微量元素的各组分具体如下：二水氯化铜0.000124mg/L、氯化铝0.0001683mg/L、氯化钴0.000033mg/L、氯化镉0.000001mg/L、亚硒酸钠0.000001mg/L、硫酸锰0.0000024mg/L、醋酸钡0.0000063mg/L、六水合硫酸镍0.0000064mg/L；
所述碳水化合物的各组分具体如下：葡萄糖8000mg/L、蔗糖5000mg/L、丙酮酸钠100mg/L、L-苹果酸200mg/L、α-酮戊二酸150mg/L；
所述其他分子化合物的各组分具体如下：乙醇胺15mg/L、腐胺5mg/L、精胺10mg/L、硫辛酸1mg/L、亚油酸0.2mg/L、花生四烯酸0.1mg/L、硫酸葡聚糖12mg/L、泊洛沙姆188 1000mg/L、重组人胰岛素1mg/L、重组表皮细胞生长因子1mg/L、胸苷2mg/L、胞苷2mg/L、鸟苷2mg/L、尿苷2mg/L和次黄嘌呤2mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种昆虫细胞无血清培养基，其特征在于，所述的昆虫细胞为Sf-9、Sf-21、High Five中的任意一种。
4.根据权利要求1~3中任一所述的一种昆虫细胞无血清培养基的应用，其特征在于，该昆虫细胞无血清培养基用于病毒生产和包装。
5.根据权利要求4所述的一种昆虫细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述的病毒为腺相关病毒。
6.根据权利要求1~3中任一所述的一种昆虫细胞无血清培养基的应用，其特征在于，该昆虫细胞无血清培养基用于生物类药物的生产。
7.根据权利要求6所述的一种昆虫细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述的生物类药物为抗体、融合蛋白、重组蛋白、酶、疫苗中的任意一种。
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