CN113930382B - 一种用于cho细胞表达抗狂犬病毒单克隆抗体的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种适用于CHO细胞表达抗狂犬病毒单克隆抗体的化学成分界定培养基及其配制方法。所述的化学成分界定培养基包括基础培养基和补料培养基，两种培养基在细胞培养中联合应用，采用补料培养的方法培养。本发明提供的培养基成分和含量相对明确，能提高细胞产品的质量并有利于产物的分离提纯，且制备流程简易，操作简单，成本低廉，适于工业化生产。

Description

一种用于CHO细胞表达抗狂犬病毒单克隆抗体的培养基
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种适用于CHO细胞表达抗狂犬病毒单克隆抗体的培养基及其配制方法。
背景技术
生物类制品中，很多蛋白药物都需要经过糖基化修饰，这些糖基化常常会影响蛋白药物的有效性、半衰期、免疫原性等。常用的表达载体包括植物细胞、昆虫细胞、转基因动物和哺乳动物细胞等，在哺乳动物细胞中有超过60％的单克隆抗体药物采用了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产的表达载体。CHO细胞是一种重要的工程细胞，外源基因易于在其中表达，产物为分泌型，易于分离纯化。所以已经是细胞工程中一种重要的宿主细胞。目前市场上，包括进口和国产的各大品牌培养基公司均有CHO无血清培养基产品，但是价格相对昂贵，成本较高，使得无血清培养基很难得到大规模应用。
抗狂犬病毒单克隆抗体种类较多，具有不同抗原表位的抗狂犬病毒单克隆抗体需要具有不同目的蛋白核酸编码CHO细胞，对于培养基的要求更高。
现有技术中，CHO细胞表达目的蛋白，尤其是抗狂犬病毒单克隆抗体，水平低、相关抗体规模化生产难以实现，而CHO细胞的培养基对最终抗体的产率有着重要的影响，因此对CHO细胞的培养基的优化是十分有必要的。
中国专利201811341163.0公开了一种支持产物高表达的CHO细胞无血清培养基，不含任何血清组分，无动物源成分，相比其他无血清培养基，增加了其亲和性。该培养基通过批次培养能够提高CHO细胞的生长密度及其活率，增加细胞在其中的耐受性能，延长生长平台维持时间，最重要的是提高了CHO工程细胞在其中表达外源蛋白的能力。但其蛋白产量对于工业化生产还有进步的空间。
中国专利201910617672.X中公开了一种种CHO细胞培养的补料培养基及其制备方法和应用。各组分的质量百分比为：氨基酸4.8％-19.75％，维生素0.00925％-0.13％，氢氧化钠1.25％-5.5％，余量为注射用水。该补料培养基应用于细胞培养方法能够优化CHO细胞生长，提高细胞表达目的蛋白的能力。但其培养周期为15天，周期较长。
针对表达抗狂犬病毒单克隆抗体的CHO细胞的培养基的优化，不仅能够提高抗狂犬病毒单克隆抗体的表达量，也能够缩短培养周期，对于抗狂犬病毒单克隆抗体的工业化生产具有重要的意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种适用于CHO细胞表达抗狂犬病毒单克隆抗体的化学成分界定培养基及其配制方法。CHO细胞商业化生产常用的有批次培养、补料培养和灌注培养等，使用较多的为补料批次培养，CHO细胞培养基及工艺基于此理念，对表达抗狂犬病病毒CTB012单克隆抗体的CHO细胞培养基进行了配方开发和研制，发明了用于CHO细胞培养的化学成分界定的基础培养基和补料培养基，并且在表达量上达到商业化培养基的水平。
一方面，本发明提供了一种用于表达蛋白的CHO细胞培养的基础培养基。
所述的蛋白包括但不限于抗狂犬病毒单克隆抗体。
优选地，所述的抗狂犬病毒单克隆抗体的表达载体为pHu2G11-1或pHu2G11-2。
优选地，所述的CHO细胞为CTB012细胞株或CTB011细胞株。
所述的基础培养基包括氨基酸、维生素和多胺、脂类、微量元素、无机盐类、能源和其他类成分。
所述的氨基酸包括：甘氨酸0.2-1.0g/L，L-半胱氨酸0.2-1.0g/L，L-精氨酸0.2-1.0g/L，L-脯氨酸0.2-1.0g/L，L-丝氨酸0.2-1.0g/L，L-天冬氨酸0.2-1.0g/L，L-谷氨酰胺0.2-1.0g/L，L-谷氨酸0.2-1.0g/L，L-天冬酰胺水合物0.2-1.0g/L，L-亮氨酸0.2-1.0g/L，L-甲硫氨酸0.2-1.0g/L，L-赖氨酸盐酸盐0.2-1.0g/L，L-酪氨酸0.2-1.0g/L，L-缬氨酸0.2-1.0g/L，L-苏氨酸0.2-1.0g/L，L-色氨酸0.2-1.0g/L，L-异亮氨酸0.2-1.0g/L，L-组氨酸盐酸盐0.2-1.0g/L；
所述的维生素和多胺包括：核黄素0.005-0.02g/L，叶酸0.005-0.02g/L，尼克酰胺0.005-0.02g/L，精胺0.005-0.02g/L，硫胺盐酸盐0.005-0.02g/L，D-泛酸半钙盐0.005-0.02g/L，L-抗坏血酸0.005-0.02g/L，盐酸乙醇胺0.005-0.02g/L，腐胺0.005-0.02g/L，生物素0.005-0.02g/L，氯化胆碱0.005-0.02g/L，维生素B120.005-0.02g/L；
所述的脂类包括亚油酸0.00009-0.001g/L；
所述的微量元素包括：六水硫酸镍0.00000008-0.000001g/L，醋酸钡0.00000008-0.000001g/L，硫酸锌0.00000008-0.000001g/L，碘化钾0.00000008-0.000001g/L，氟化钠0.00000008-0.000001g/L，亚硒酸钠0.00000008-0.000001g/L，溴化钾0.00000008-0.000001g/L，钼酸铵-四水0.00000008-0.000001g/L，偏硅酸钠0.00000008-0.000001g/L，硫酸铜0.00000008-0.000001g/L，三氯化铝六水0.00000008-0.000001g/L，六水氯化钴0.00000008-0.000001g/L，钒酸钠0.00000008-0.000001g/L；
所述的无机盐类包括：氯化镁六水合物0.02-0.2g/L，氯化钾0.02-0.2g/L，磷酸氢二钠0.1-1g/L，磷酸二氢钠0.1-1g/L；
所述的能源包括：葡萄糖2-6g/L，丙酮酸钠0.06-0.3g/L；
所述的其他类成分包括：还原型谷胱甘肽0.06-0.3g/L，碳酸氢钠1.0-3.5g/L，酚红钠盐0.01-0.1g/L，柠檬酸铁0.009-0.1g/L，HEPES 0.5-3g/L，P188 0.5-2g/L。
优选地，所述的氨基酸包括：甘氨酸0.2-0.4g/L，L-半胱氨酸0.25-0.5g/L，L-精氨酸0.5-1g/L，L-脯氨酸0.3-0.6g/L，L-丝氨酸0.4-0.8g/L，L-天冬氨酸0.4-0.8g/L，L-谷氨酰胺0.5-1.0g/L，L-谷氨酸0.2-0.4g/L，L-天冬酰胺水合物0.3-0.6g/L，L-亮氨酸0.2-0.4g/L，L-甲硫氨酸0.3-0.6g/L，L-赖氨酸盐酸盐0.4-0.8g/L，L-酪氨酸0.4-0.8g/L，L-缬氨酸0.3-0.6g/L，L-苏氨酸0.2-0.40g/L，L-色氨酸0.2-0.4g/L，L-异亮氨酸0.2-0.4g/L，L-组氨酸盐酸盐0.3-0.6g/L；
所述的维生素和多胺包括：核黄素0.009-0.015g/L，叶酸0.006-0.012g/L，尼克酰胺0.006-0.012g/L，精胺0.006-0.012g/L，硫胺盐酸盐0.005-0.01g/L，D-泛酸半钙盐0.006-0.012g/L，L-抗坏血酸0.007-0.013g/L，盐酸乙醇胺0.006-0.012g/L，腐胺0.005-0.01g/L，生物素0.007-0.013g/L，氯化胆碱0.006-0.012g/L，维生素B12 0.009-0.015g/L；
所述的脂类包括亚油酸0.0002-0.001g/L；
所述的微量元素包括：六水硫酸镍0.0000002-0.000001g/L，醋酸钡0.0000005-0.0000009g/L，硫酸锌0.0000003-0.0000006g/L，碘化钾0.0000002-0.0000005g/L，氟化钠0.0000004-0.0000007g/L，亚硒酸钠0.0000003-0.0000006g/L，溴化钾0.0000002-0.0000005g/L，钼酸铵-四水0.0000002-0.000001g/L，偏硅酸钠0.0000002-0.0000005g/L，硫酸铜0.0000005-0.0000009g/L，三氯化铝六水0.0000002-0.0000005g/L，六水氯化钴0.0000004-0.0000007g/L，钒酸钠0.0000003-0.0000006g/L；
所述的无机盐类包括：氯化镁六水合物0.05-0.1g/L，氯化钾0.08-0.15g/L，磷酸氢二钠0.3-0.7g/L，磷酸二氢钠0.3-0.7g/L；
所述的能源包括：葡萄糖3-5g/L，丙酮酸钠0.1-0.3g/L；
所述的其他类成分包括：还原型谷胱甘肽0.1-0.25g/L，碳酸氢钠1.5-2.5g/L，酚红钠盐0.05-0.1g/L，柠檬酸铁0.01-0.06g/L，HEPES 1-2g/L，P188 0.5-1.5g/L。
优选地，所述的培养基的pH为7.0-7.2。
优选地，所述的培养基的渗透压为270-300mOsm。
另一方面，本发明提供了一种用于表达蛋白的CHO细胞培养的补料培养基。
所述的蛋白包括但不限于抗狂犬病毒单克隆抗体。
优选地，所述的抗狂犬病毒单克隆抗体的表达载体为pHu2G11-1或pHu2G11-2。
优选地，所述的CHO细胞为CTB012细胞株或CTB011细胞株。
所述的补料培养基包括补料1和补料2。
所述的补料1包括以下成分：
氨基酸：甘氨酸0.5-5g/L，L-半胱氨酸0.5-5g/L，L-精氨酸0.5-5g/L，L-脯氨酸0.5-5g/L，L-丝氨酸0.5-5g/L，L-天冬氨酸0.5-5g/L，L-谷氨酰胺0.5-5g/L，L-谷氨酸0.5-5g/L，L-亮氨酸0.5-5g/L，L-甲硫氨酸0.5-5g/L，L-赖氨酸盐酸盐0.5-5g/L，L-缬氨酸0.5-5g/L，L-苏氨酸0.5-5g/L，L-色氨酸0.5-5g/L，L-异亮氨酸0.5-5g/L，L-组氨酸盐酸盐0.5-5g/L；
维生素和多胺：尼克酰胺0.015-0.1g/L，精胺0.015-0.1g/L，硫胺盐酸盐0.015-0.1g/L，D-泛酸半钙盐0.015-0.1g/L，L-抗坏血酸0.015-0.1g/L，盐酸乙醇胺0.015-0.1g/L，腐胺0.015-0.1g/L，生物素0.015-0.1g/L，氯化胆碱0.015-0.1g/L；
脂类：亚油酸0.0001-0.01g/L；
微量元素：六水硫酸镍0.0000004-0.00005g/L，醋酸钡0.0000004-0.00005g/L，硫酸锌0.0000004-0.00005g/L，碘化钾0.0000004-0.00005g/L，氟化钠0.0000004-0.00005g/L，亚硒酸钠0.0000004-0.00005g/L，溴化钾0.0000004-0.00005g/L，钼酸铵-四水0.0000004-0.00005g/L，偏硅酸钠0.0000004-0.00005g/L，硫酸铜0.0000004-0.00005g/L，三氯化铝六水0.0000004-0.00005g/L，六水氯化钴0.0000004-0.00005g/L，钒酸钠0.0000004-0.00005g/L；
无机盐类：氯化镁六水合物0.05-0.3g/L，氯化钾0.05-0.3g/L，磷酸氢二钠0.2-2g/L，磷酸二氢钠0.2-2g/L；
能源：葡萄糖20-80g/L，丙酮酸钠0.1-0.9g/L；
其他类成分：L-还原型谷胱甘肽0.1-0.8g/L，柠檬酸铁0.05-0.5g/L。
优选地，所述的补料1包括以下成分：
氨基酸：甘氨酸1.0-3.0g/L，L-半胱氨酸1.5-3.5g/L，L-精氨酸2.0-5.0g/L，L-脯氨酸1.5-3.5g/L，L-丝氨酸2.0-5.0g/L，L-天冬氨酸2.0-5.0g/L，L-谷氨酰胺1.5-3.5g/L，L-谷氨酸0.5-2.0g/L，L-亮氨酸0.6-2.4g/L，L-甲硫氨酸0.8-2.5g/L，L-赖氨酸盐酸盐2.0-4.5g/L，L-缬氨酸1.8-4.3g/L，L-苏氨酸0.6-2.1g/L，L-色氨酸0.9-3.7g/L，L-异亮氨酸0.8-3.4g/L，L-组氨酸盐酸盐1.1-3.3g/L；
维生素和多胺：尼克酰胺0.03-0.07g/L，精胺0.04-0.07g/L，硫胺盐酸盐0.03-0.08g/L，D-泛酸半钙盐0.04-0.08g/L，L-抗坏血酸0.04-0.1g/L，盐酸乙醇胺0.02-0.5g/L，腐胺0.02-0.6g/L，生物素0.03-0.7g/L，氯化胆碱0.04-0.9g/L；
脂类：亚油酸0.005-0.009g/L；
微量元素：六水硫酸镍0.000002-0.000008g/L，醋酸钡0.000003-0.000012g/L，硫酸锌0.000004-0.00001g/L，碘化钾0.000005-0.000015g/L，氟化钠0.000002-0.00005g/L，亚硒酸钠0.000003-0.000008g/L，溴化钾0.000002-0.000009g/L，钼酸铵-四水0.000004-0.00001g/L，偏硅酸钠0.000003-0.000008g/L，硫酸铜0.000005-0.000015g/L，三氯化铝六水0.000003-0.000012g/L，六水氯化钴0.000002-0.00005g/L，钒酸钠0.000004-0.00001g/L；
无机盐类：氯化镁六水合物0.1-0.2g/L，氯化钾0.1-0.2g/L，磷酸氢二钠0.5-1.45g/L，磷酸二氢钠0.4-1.1g/L；
能源：葡萄糖30-50g/L，丙酮酸钠0.2-0.5g/L；
其他类成分：L-还原型谷胱甘肽0.3-0.6g/L，柠檬酸铁0.1-0.3g/L。
优选地，所述的补料1的所述的补料1的pH为7.0-7.5。
所述的补料2包括L-天冬酰胺水合物0.5-5g/L，L-酪氨酸0.5-5g/L，核黄素0.015-0.1g/L，叶酸0.015-0.1g/L。
优选地，所述的补料2包括L-天冬酰胺水合0.9-2.4g/L，L-酪氨酸1.5-4.5g/L，核黄素0.04-0.09g/L，叶酸0.03-0.07g/L。
优选地，所述的补料2的pH为9.0-9.5。
再一方面，本发明提供了前述基础培养基和补料培养基在表达蛋白的CHO细胞培养中的联合应用。
所述的蛋白包括但不限于抗狂犬病毒单克隆抗体。
优选地，所述的抗狂犬病毒单克隆抗体的表达载体为pHu2G11-1或pHu2G11-2。
优选地，所述的CHO细胞为CTB012细胞株或CTB011细胞株。
所述的应用为表达蛋白的CHO细胞先接种于基础培养基培养，再使用补料培养基补料培养。
优选地，补料培养基于细胞在基础培养基接种后第3-5天添加，每1-5天补料1次，至培养结束；补料1的添加量为初始培养体积的1-10％，补料2的添加量为初始培养体积的0.1-1％。
优选地，补料培养基于细胞在基础培养基接种后第3天添加，补料1的添加量为初始培养体积的5％，补料2的添加量为初始培养体积的0.5％，每2天补料1次。
优选地，补料培养基于细胞在基础培养基接种后第5天添加，补料1的添加量为初始培养体积的3％，补料2的添加量为初始培养体积的0.3％，每天补料1次。
又一方面，本发明提供了前述用于表达蛋白的CHO细胞培养化学成分界定培养基的配制方法。
所述的化学成分界定培养基包括基础培养基。
所述的基础培养基配制方法为先配制几类浓缩液，再将浓缩液按比例混合并调试。
所述的几类浓缩液包括：
a.氨基酸类溶液配制：
L-谷氨酰胺单独配制成40×浓缩液，储存在-20℃；
L-天冬酰胺水合物和L-酪氨酸配制成20×浓缩液，使用NaOH溶解，储存在2-8℃；
甘氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸盐酸盐配成20×浓缩液，储存在2-8℃；
b.维生素和多胺溶液配制：
核黄素、叶酸配制成100×浓缩液，储存在2-8℃；
尼克酰胺、精胺、硫胺盐酸盐、D-泛酸半钙盐、L-抗坏血酸、盐酸乙醇胺、腐胺、生物素、氯化胆碱、维生素B12混合配制成100×浓缩液，储存在2-8℃；
c.脂类：
亚油酸使用1％乙醇配制成1000×浓缩液，储存在2-8℃；
d.微量元素：
六水硫酸镍、醋酸钡、硫酸锌、碘化钾、氟化钠、亚硒酸钠、溴化钾、钼酸铵-四水、偏硅酸钠、硫酸铜、三氯化铝六水、六水氯化钴、钒酸钠混合配制成10000×浓缩液，储存在2-8℃；
e.无机盐类和能源类：
氯化镁六水合物、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠混合配制成10×浓缩液，储存在2-8℃；
f.其他类：
碳酸氢钠单独配制成20×浓缩液，储存在常温；
L-还原型谷胱甘肽、酚红钠盐、HEPES、P188混合配制成20×浓缩液，储存在2-8℃；
柠檬酸铁加热至80℃以上溶解配制成100×浓缩液，储存在2-8℃。
所述的将按比例混合为按照前述基础培养基各成分的浓度计算比例，然后混合。
所述的调试为pH调至7.0-7.2，氯化钠调整渗透压至270-300mOsm，定容至规定体积，无菌过滤。
又一方面，本发明提供了前述用于表达蛋白的CHO细胞细胞培养的补料培养基的配制方法。
所述的配制方法包括补料1的配制和补料2的配制。
所述的补料1的配制包括以下步骤：
a.浓缩液的配制：
氨基酸类溶液配制：甘氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸盐酸盐配成10×浓缩液；
维生素和多胺溶液配制：尼克酰胺、精胺、硫胺盐酸盐、D-泛酸半钙盐、L-抗坏血酸、盐酸乙醇胺、腐胺、生物素、氯化胆碱、维生素B12、L-还原型谷胱甘肽混合配制成100×浓缩液；
脂类：亚油酸使用1％乙醇配制成100×浓缩液；
微量元素：六水硫酸镍、醋酸钡、硫酸锌、碘化钾、氟化钠、亚硒酸钠、溴化钾、钼酸铵-四水、偏硅酸钠、硫酸铜、三氯化铝六水、六水氯化钴、钒酸钠混合配制成10000×浓缩液；
无机盐类和能源类：氯化镁六水合物、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠混合配制成10×浓缩液；
其他类：柠檬酸铁加热至80℃以上溶解配制成100×浓缩液；
b.浓缩液按前述的补料培养基补料1的浓度计算比例，混合，调整pH至7.0-7.5，无菌过滤，储存在2-8℃。
所述的补料2的配制方法为：
L-天冬酰胺水合物、L-酪氨酸、核黄素、叶酸配制成200×浓缩液，配制时先加入少量水后，再使用1-5mol/L的NaOH溶解，pH保持在9.0-9.5，无菌过滤，储存在2-8℃。
本发明提供的培养基为化学成分界定的合成培养基，不需要添加血清及其代替物、水解物等未知成分，提高了实验的重复性、准确性和稳定性，并能够减少未知成分对细胞的损伤。本发明提供的培养基成分和含量相对明确，能提高细胞产品的质量并有利于产物的分离提纯；且制备流程简易，操作简单，成本低廉，适于工业化生产。
附图说明
图1为CTB012细胞批次培养的生长曲线及活率图。
图2为CTB012细胞补料培养的生长曲线及活率图。
图3为CTB012细胞批次培养和补料培养抗狂犬病毒单克隆抗体表达量对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种用于表达抗狂犬病毒单克隆抗体的细胞培养的基础培养基的配制
1、浓缩液的配制
a.氨基酸类溶液配制：
L-谷氨酰胺单独配制成40×浓缩液，储存在-20℃；
L-天冬酰胺水合物和L-酪氨酸配制成20×浓缩液，使用NaOH溶解，储存在2-8℃；
甘氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸盐酸盐配成20×浓缩液，储存在2-8℃；
b.维生素和多胺溶液配制：
核黄素、叶酸配制成100×浓缩液，储存在2-8℃；
尼克酰胺、精胺、硫胺盐酸盐、D-泛酸半钙盐、L-抗坏血酸、盐酸乙醇胺、腐胺、生物素、氯化胆碱、维生素B12混合配制成100×浓缩液，储存在2-8℃；
c.脂类：
亚油酸使用1％乙醇配制成1000×浓缩液，储存在2-8℃；
d.微量元素：
六水硫酸镍、醋酸钡、硫酸锌、碘化钾、氟化钠、亚硒酸钠、溴化钾、钼酸铵-四水、偏硅酸钠、硫酸铜、三氯化铝六水、六水氯化钴、钒酸钠混合配制成10000×浓缩液，储存在2-8℃；
e.无机盐类和能源类：
氯化镁六水合物、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠混合配制成10×浓缩液，储存在2-8℃；
f.其他类：
碳酸氢钠单独配制成20×浓缩液，储存在常温；
L-还原型谷胱甘肽、酚红钠盐、HEPES、P188混合配制成20×浓缩液，储存在2-8℃；
柠檬酸铁加热至80℃以上溶解配制成100×浓缩液，储存在2-8℃。
2、按比例混合
将步骤1的浓缩液按以下浓度计算比例(1L培养基)：
氨基酸：甘氨酸0.2-0.4g/L，L-半胱氨酸0.25-0.5g/L，L-精氨酸0.5-1g/L，L-脯氨酸0.3-0.6g/L，L-丝氨酸0.4-0.8g/L，L-天冬氨酸0.4-0.8g/L，L-谷氨酰胺0.5-1.0g/L，L-谷氨酸0.2-0.4g/L，L-天冬酰胺水合物0.3-0.6g/L，L-亮氨酸0.2-0.4g/L，L-甲硫氨酸0.3-0.6g/L，L-赖氨酸盐酸盐0.4-0.8g/L，L-酪氨酸0.4-0.8g/L，L-缬氨酸0.3-0.6g/L，L-苏氨酸0.2-0.40g/L，L-色氨酸0.2-0.4g/L，L-异亮氨酸0.2-0.4g/L，L-组氨酸盐酸盐0.3-0.6g/L；
维生素和多胺：核黄素0.009-0.015g/L，叶酸0.006-0.012g/L，尼克酰胺0.006-0.012g/L，精胺0.006-0.012g/L，硫胺盐酸盐0.005-0.01g/L，D-泛酸半钙盐0.006-0.012g/L，L-抗坏血酸0.007-0.013g/L，盐酸乙醇胺0.006-0.012g/L，腐胺0.005-0.01g/L，生物素0.007-0.013g/L，氯化胆碱0.006-0.012g/L，维生素B120.009-0.015g/L；
脂类：亚油酸0.0002-0.001g/L；
微量元素：六水硫酸镍0.0000002-0.000001g/L，醋酸钡0.0000005-0.0000009g/L，硫酸锌0.0000003-0.0000006g/L，碘化钾0.0000002-0.0000005g/L，氟化钠0.0000004-0.0000007g/L，亚硒酸钠0.0000003-0.0000006g/L，溴化钾0.0000002-0.0000005g/L，钼酸铵-四水0.0000002-0.000001g/L，偏硅酸钠0.0000002-0.0000005g/L，硫酸铜0.0000005-0.0000009g/L，三氯化铝六水0.0000002-0.0000005g/L，六水氯化钴0.0000004-0.0000007g/L，钒酸钠0.0000003-0.0000006g/L；
无机盐类：氯化镁六水合物0.05-0.1g/L，氯化钾0.08-0.15g/L，磷酸氢二钠0.3-0.7g/L，磷酸二氢钠0.3-0.7g/L；
能源：葡萄糖3-5g/L，丙酮酸钠0.1-0.3g/L；
其他类成分：还原型谷胱甘肽0.1-0.25g/L，碳酸氢钠1.5-2.5g/L，酚红钠盐0.05-0.1g/L，柠檬酸铁0.01-0.06g/L，HEPES 1-2g/L，P188 0.5-1.5g/L。
3、基础培养基的调试
将步骤2中混合后的溶液pH调至7.0-7.2，使用氯化钠调整渗透压至270-300mOsm，定容至1L，无菌过滤。
实施例2一种用于表达抗狂犬病毒单克隆抗体的细胞培养的补料培养基的配制
1、补料1的配制
a.浓缩液的配制：
氨基酸类溶液配制：甘氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸盐酸盐配成10×浓缩液；
维生素和多胺溶液配制：尼克酰胺、精胺、硫胺盐酸盐、D-泛酸半钙盐、L-抗坏血酸、盐酸乙醇胺、腐胺、生物素、氯化胆碱、维生素B12、L-还原型谷胱甘肽混合配制成100×浓缩液；
脂类：亚油酸使用1％乙醇配制成100×浓缩液；
微量元素：六水硫酸镍、醋酸钡、硫酸锌、碘化钾、氟化钠、亚硒酸钠、溴化钾、钼酸铵-四水、偏硅酸钠、硫酸铜、三氯化铝六水、六水氯化钴、钒酸钠混合配制成10000×浓缩液；
无机盐类和能源类：氯化镁六水合物、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠混合配制成10×浓缩液；
其他类：柠檬酸铁加热至80℃以上溶解配制成100×浓缩液；
b.浓缩液按以下的的浓度计算比例(1L)混合：
氨基酸：甘氨酸1.0-3.0g/L，L-半胱氨酸1.5-3.5g/L，L-精氨酸2.0-5.0g/L，L-脯氨酸1.5-3.5g/L，L-丝氨酸2.0-5.0g/L，L-天冬氨酸2.0-5.0g/L，L-谷氨酰胺1.5-3.5g/L，L-谷氨酸0.5-2.0g/L，L-亮氨酸0.6-2.4g/L，L-甲硫氨酸0.8-2.5g/L，L-赖氨酸盐酸盐2.0-4.5g/L，L-缬氨酸1.8-4.3g/L，L-苏氨酸0.6-2.1g/L，L-色氨酸0.9-3.7g/L，L-异亮氨酸0.8-3.4g/L，L-组氨酸盐酸盐1.1-3.3g/L；
维生素和多胺：尼克酰胺0.03-0.07g/L，精胺0.04-0.07g/L，硫胺盐酸盐0.03-0.08g/L，D-泛酸半钙盐0.04-0.08g/L，L-抗坏血酸0.04-0.1g/L，盐酸乙醇胺0.02-0.5g/L，腐胺0.02-0.6g/L，生物素0.03-0.7g/L，氯化胆碱0.04-0.9g/L；
脂类：亚油酸0.005-0.009g/L；
微量元素：六水硫酸镍0.000002-0.000008g/L，醋酸钡0.000003-0.000012g/L，硫酸锌0.000004-0.00001g/L，碘化钾0.000005-0.000015g/L，氟化钠0.000002-0.00005g/L，亚硒酸钠0.000003-0.000008g/L，溴化钾0.000002-0.000009g/L，钼酸铵-四水0.000004-0.00001g/L，偏硅酸钠0.000003-0.000008g/L，硫酸铜0.000005-0.000015g/L，三氯化铝六水0.000003-0.000012g/L，六水氯化钴0.000002-0.00005g/L，钒酸钠0.000004-0.00001g/L；
无机盐类：氯化镁六水合物0.1-0.2g/L，氯化钾0.1-0.2g/L，磷酸氢二钠0.5-1.45g/L，磷酸二氢钠0.4-1.1g/L；
能源：葡萄糖30-50g/L，丙酮酸钠0.2-0.5g/L；
其他类成分：L-还原型谷胱甘肽0.3-0.6g/L，柠檬酸铁0.1-0.3g/L。
c.混合液定容至1L后，调整pH至7.0-7.5，无菌过滤，储存在2-8℃。
2、补料2的配制
L-天冬酰胺水合物、L-酪氨酸、核黄素、叶酸制成200×浓缩液，配制过程需先添加少量水，然后用5mol/L的NaOH溶解，保持pH为9.0-9.5，无菌过滤，储存在2-8℃。
实施例3批次培养和补料培养条件下CTB012细胞的生长性能
本实施例使用的基础培养基和补料培养基通过实施例1和实施例2的制备方法制得。
CTB012细胞的制备方法为：
将表达抗狂犬病毒单克隆抗体的表达载体pHu2G11转染入CHO细胞(表达载体pHu2G11的制备方法已在中国专利201280074853.9中公开)获得表达抗狂犬病毒单克隆抗体的CTB012细胞。
批次培养的具体步骤如下：
1、将CTB012细胞接种至实施例1提供的基础培养基，接种密度为0.26×106cells/mL，常规条件培养，每天定时检测培养基中的活细胞密度和细胞活率。
补料培养的具体步骤如下：
1、将CTB012细胞接种至基础培养基扩增，接种密度为0.79×106cells/mL，接种操作为实验室常规操作，不赘述。
3、在接种第3、5、7、9、11天补加补料培养基，补料1每次添加量为初始培养体积的5％，补料2每次添加量为初始培养体积的0.5％。
4、每天定时检测培养基中的活细胞密度和细胞活率。
批次培养条件下细胞的活细胞密度变化和细胞活率见图1。
补料培养条件下细胞的活细胞密度变化和细胞活率见图2。
结果表明：补料培养比批次培养细胞的活细胞密度增长更快，且细胞活率更高。
实施例4批次培养和补料培养条件下的CTB012细胞表达量对比
批次培养和补料培养方法参考实施例3，批次培养于第11天检测CTB012细胞抗狂犬病毒单克隆抗体表达量，补料培养于第13天检测CTB012细胞抗狂犬病毒单克隆抗体表达量。
结果如图3所示。
结果表明，补料培养获得的抗狂犬病毒单克隆抗体远远高于批次培养。
实施例5批次培养和补料培养条件下CTB011细胞的生长性能与细胞表达量
CTB011细胞的制备方法为：
将表达抗狂犬病毒单克隆抗体的表达载体pHu1A9转染入CHO细胞(表达载体pHu1A9的制备方法已在中国专利201280074853.9中公开)获得表达抗狂犬病毒单克隆抗体的CTB011细胞。
其他条件参考实施例3和实施例4，结果表明补料培养比批次培养细胞的活细胞密度增长更快，且细胞活率更高，料培养获得的抗狂犬病毒单克隆抗体远远高于批次培养。
实施例6批次培养和补料培养条件下CHO细胞的生长情况
参考实施例3和实施例4的步骤，对CHO细胞进行培养，并检测生长情况。
本实施例的CHO细胞为CHO-K1细胞株，保藏编号为ATCC CCL-61。
结果表明，补料培养比批次培养细胞的活细胞密度增长更快，且细胞活率更高。
对比例1与市售CHO培养基性能对比
市售培养基来自上海研卉生物科技有限公司，货号SH30912.01。
细胞均选用CTB012细胞。批次培养和补料培养方法及检测项目参考实施例3、4。设置以下分组：
实验组1：本申请基础培养基，批次培养；
实验组2：本申请基础培养基+补料培养基，补料培养；
对比组1：市售CHO培养基，批次培养；
对比组2：市售CHO培养基，补料培养。
结果如下：
/>

Claims (3)

1.一种表达蛋白的CHO细胞的培养方法，其特征在于，所述的CHO细胞先接种基础培养基培养，再使用补料培养基补料培养；
所述的基础培养基由氨基酸、维生素和多胺、脂类、微量元素、无机盐类、能源和其他类成分组成；
所述的氨基酸为：甘氨酸0.2-0.4g/L，L-半胱氨酸0.25-0.5g/L，L-精氨酸0.5-1g/L，L-脯氨酸0.3-0.6g/L，L-丝氨酸0.4-0.8g/L，L-天冬氨酸0.4-0.8g/L，L-谷氨酰胺0.5-1.0g/L，L-谷氨酸0.2-0.4g/L，L-天冬酰胺水合物0.3-0.6g/L，L-亮氨酸0.2-0.4g/L，L-甲硫氨酸0.3-0.6g/L，L-赖氨酸盐酸盐0.4-0.8g/L，L-酪氨酸0.4-0.8g/L，L-缬氨酸0.3-0.6g/L，L-苏氨酸0.2-0.40g/L，L-色氨酸0.2-0.4g/L，L-异亮氨酸0.2-0.4g/L，L-组氨酸盐酸盐0.3-0.6g/L；
所述的维生素和多胺为：核黄素0.009-0.015g/L，叶酸0.006-0.012g/L，尼克酰胺0.006-0.012g/L，精胺0.006-0.012g/L，硫胺盐酸盐0.005-0.01g/L，D-泛酸 半钙盐0.006-0.012g/L，L-抗坏血酸0.007-0.013g/L，盐酸乙醇胺0.006-0.012g/L，腐胺0.005-0.01g/L，生物素0.007-0.013g/L，氯化胆碱0.006-0.012g/L，维生素B12 0.009-0.015g/L；
所述的脂类为亚油酸0.0002-0.001g/L；
所述的微量元素为：六水硫酸镍0.0000002-0.000001g/L，醋酸钡0.0000005-0.0000009g/L，硫酸锌0.0000003-0.0000006g/L，碘化钾0.0000002-0.0000005g/L，氟化钠0.0000004-0.0000007g/L，亚硒酸钠0.0000003-0.0000006g/L，溴化钾0.0000002-0.0000005g/L，钼酸铵-四水0.0000002-0.000001g/L，偏硅酸钠0.0000002-0.0000005g/L，硫酸铜0.0000005-0.0000009g/L，三氯化铝六水0.0000002-0.0000005g/L，六水氯化钴0.0000004-0.0000007g/L，钒酸钠0.0000003-0.0000006g/L；
所述的无机盐类为：氯化镁六水合物0.05-0.1g/L，氯化钾0.08-0.15g/L，磷酸氢二钠0.3-0.7g/L，磷酸二氢钠0.3-0.7g/L；
所述的能源为：葡萄糖3-5g/L，丙酮酸钠0.1-0.3g/L；
所述的其他类成分为：还原型谷胱甘肽0.1-0.25g/L，碳酸氢钠1.5-2.5g/L，酚红钠盐0.05-0.1g/L，柠檬酸铁0.01-0.06g/L，HEPES 1-2g/L，P188 0.5-1.5g/L；
所述的基础培养基的pH为7.0-7.2，渗透压为270-300mOsm；
所述的的补料培养基由补料1和补料2组成；
所述的补料1由以下成分组成：
氨基酸：甘氨酸1.0-3.0g/L，L-半胱氨酸1.5-3.5g/L，L-精氨酸2.0-5.0g/L，L-脯氨酸1.5-3.5g/L，L-丝氨酸2.0-5.0g/L，L-天冬氨酸2.0-5.0g/L，L-谷氨酰胺 1.5-3.5g/L，L-谷氨酸0.5-2.0g/L，L-亮氨酸0.6-2.4g/L，L-甲硫氨酸0.8-2.5g/L，L-赖氨酸盐酸盐2.0-4.5g/L，L-缬氨酸1.8-4.3g/L，L-苏氨酸0.6-2.1g/L，L-色氨酸0.9-3.7g/L，L-异亮氨酸0.8-3.4g/L，L-组氨酸盐酸盐1.1-3.3g/L；
维生素和多胺：尼克酰胺0.03-0.07g/L，精胺0.04-0.07g/L，硫胺盐酸盐0.03-0.08g/L，D-泛酸半钙盐0.04-0.08g/L，L-抗坏血酸0.04-0.1g/L，盐酸乙醇胺0.02-0.5g/L，腐胺0.02-0.6g/L，生物素0.03-0.7g/L，氯化胆碱0.04-0.9g/L；
脂类：亚油酸0.005-0.009g/L；
微量元素：六水硫酸镍0.000002-0.000008g/L，醋酸钡0.000003-0.000012g/L，硫酸锌0.000004-0.00001g/L，碘化钾0.000005-0.000015g/L，氟化钠0.000002-0.00005g/L，亚硒酸钠0.000003-0.000008g/L，溴化钾0.000002-0.000009g/L，钼酸铵-四水0.000004-0.00001g/L，偏硅酸钠0.000003-0.000008g/L，硫酸铜0.000005-0.000015g/L，三氯化铝六水0.000003-0.000012g/L，六水氯化钴0.000002-0.00005g/L，钒酸钠0.000004-0.00001g/L；
无机盐类：氯化镁六水合物0.1-0.2g/L，氯化钾0.1-0.2g/L，磷酸氢二钠0.5-1.45g/L，磷酸二氢钠0.4-1.1g/L；
能源：葡萄糖30-50g/L，丙酮酸钠0.2-0.5g/L；
其他类成分：L-还原型谷胱甘肽0.3-0.6g/L，柠檬酸铁0.1-0.3g/L；
所述的补料1的pH为7.0-7.5；
所述的补料2由以下成分组成：L-天冬酰胺水合0.9-2.4g/L，L-酪氨酸1.5-4.5g/L，核黄素0.04-0.09g/L，叶酸0.03-0.07g/L；
所述的补料2的pH为9.0-9.5；
在接种第3、5、7、9、11 天补加补料培养基，补料1每次添加量为初始培养体积的5%，补料2每次添加量为初始培养体积的0.5%。
2.一种用于表达蛋白的CHO细胞培养的化学成分界定培养基，其特征在于，所述的化学成分界定培养基由基础培养基和补料培养基组成；
所述的基础培养基由氨基酸、维生素和多胺、脂类、微量元素、无机盐类、能源和其他类成分组成；
所述的氨基酸为：甘氨酸0.2-0.4g/L，L-半胱氨酸0.25-0.5g/L，L-精氨酸0.5-1g/L，L-脯氨酸0.3-0.6g/L，L-丝氨酸0.4-0.8g/L，L-天冬氨酸0.4-0.8g/L，L-谷氨酰胺0.5-1.0g/L，L-谷氨酸0.2-0.4g/L，L-天冬酰胺水合物0.3-0.6g/L，L-亮氨酸0.2-0.4g/L，L-甲硫氨酸0.3-0.6g/L，L-赖氨酸盐酸盐0.4-0.8g/L，L-酪氨酸0.4-0.8g/L，L-缬氨酸0.3-0.6g/L，L-苏氨酸0.2-0.40g/L，L-色氨酸0.2-0.4g/L，L-异亮氨酸0.2-0.4g/L，L-组氨酸盐酸盐0.3-0.6g/L；
所述的维生素和多胺为：核黄素0.009-0.015g/L，叶酸0.006-0.012g/L，尼克酰胺0.006-0.012g/L，精胺0.006-0.012g/L，硫胺盐酸盐0.005-0.01g/L，D-泛酸 半钙盐0.006-0.012g/L，L-抗坏血酸0.007-0.013g/L，盐酸乙醇胺0.006-0.012g/L，腐胺0.005-0.01g/L，生物素0.007-0.013g/L，氯化胆碱0.006-0.012g/L，维生素B12 0.009-0.015g/L；
所述的脂类为亚油酸0.0002-0.001g/L；
所述的微量元素为：六水硫酸镍0.0000002-0.000001g/L，醋酸钡0.0000005-0.0000009g/L，硫酸锌0.0000003-0.0000006g/L，碘化钾0.0000002-0.0000005g/L，氟化钠0.0000004-0.0000007g/L，亚硒酸钠0.0000003-0.0000006g/L，溴化钾0.0000002-0.0000005g/L，钼酸铵-四水0.0000002-0.000001g/L，偏硅酸钠0.0000002-0.0000005g/L，硫酸铜0.0000005-0.0000009g/L，三氯化铝六水0.0000002-0.0000005g/L，六水氯化钴0.0000004-0.0000007g/L，钒酸钠0.0000003-0.0000006g/L；
所述的无机盐类为：氯化镁六水合物0.05-0.1g/L，氯化钾0.08-0.15g/L，磷酸氢二钠0.3-0.7g/L，磷酸二氢钠0.3-0.7g/L；
所述的能源为：葡萄糖3-5g/L，丙酮酸钠0.1-0.3g/L；
所述的其他类成分为：还原型谷胱甘肽0.1-0.25g/L，碳酸氢钠1.5-2.5g/L，酚红钠盐0.05-0.1g/L，柠檬酸铁0.01-0.06g/L，HEPES 1-2g/L，P188 0.5-1.5g/L；
所述的基础培养基的pH为7.0-7.2，渗透压为270-300mOsm；
所述的的补料培养基由补料1和补料2组成；
所述的补料1由以下成分组成：
氨基酸：甘氨酸1.0-3.0g/L，L-半胱氨酸1.5-3.5g/L，L-精氨酸2.0-5.0g/L，L-脯氨酸1.5-3.5g/L，L-丝氨酸2.0-5.0g/L，L-天冬氨酸2.0-5.0g/L，L-谷氨酰胺 1.5-3.5g/L，L-谷氨酸0.5-2.0g/L，L-亮氨酸0.6-2.4g/L，L-甲硫氨酸0.8-2.5g/L，L-赖氨酸盐酸盐2.0-4.5g/L，L-缬氨酸1.8-4.3g/L，L-苏氨酸0.6-2.1g/L，L-色氨酸0.9-3.7g/L，L-异亮氨酸0.8-3.4g/L，L-组氨酸盐酸盐1.1-3.3g/L；
维生素和多胺：尼克酰胺0.03-0.07g/L，精胺0.04-0.07g/L，硫胺盐酸盐0.03-0.08g/L，D-泛酸半钙盐0.04-0.08g/L，L-抗坏血酸0.04-0.1g/L，盐酸乙醇胺0.02-0.5g/L，腐胺0.02-0.6g/L，生物素0.03-0.7g/L，氯化胆碱0.04-0.9g/L；
脂类：亚油酸0.005-0.009g/L；
微量元素：六水硫酸镍0.000002-0.000008g/L，醋酸钡0.000003-0.000012g/L，硫酸锌0.000004-0.00001g/L，碘化钾0.000005-0.000015g/L，氟化钠0.000002-0.00005g/L，亚硒酸钠0.000003-0.000008g/L，溴化钾0.000002-0.000009g/L，钼酸铵-四水0.000004-0.00001g/L，偏硅酸钠0.000003-0.000008g/L，硫酸铜0.000005-0.000015g/L，三氯化铝六水0.000003-0.000012g/L，六水氯化钴0.000002-0.00005g/L，钒酸钠0.000004-0.00001g/L；
无机盐类：氯化镁六水合物0.1-0.2g/L，氯化钾0.1-0.2g/L，磷酸氢二钠0.5-1.45g/L，磷酸二氢钠0.4-1.1g/L；
能源：葡萄糖30-50g/L，丙酮酸钠0.2-0.5g/L；
其他类成分：L-还原型谷胱甘肽0.3-0.6g/L，柠檬酸铁0.1-0.3g/L；
所述的补料1的pH为7.0-7.5；
所述的补料2由以下成分组成：L-天冬酰胺水合0.9-2.4g/L，L-酪氨酸1.5-4.5g/L，核黄素0.04-0.09g/L，叶酸0.03-0.07g/L；
所述的补料2的pH为9.0-9.5。
3.权利要求2所述的化学成分界定培养基的配制方法，其特征在于，包括基础培养基的配制方法：
先配制几类浓缩液，再将浓缩液按比例混合并调试；
所述的几类浓缩液包括：
a.氨基酸类溶液配制：
L-谷氨酰胺单独配制成40×浓缩液，储存在-20℃；
L-天冬酰胺水合物和L-酪氨酸配制成20×浓缩液，使用NaOH溶解，储存在2-8℃；
甘氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸盐酸盐配成20×浓缩液，储存在2-8℃；
b.维生素和多胺溶液配制：
核黄素、叶酸配制成100×浓缩液，储存在2-8℃；
尼克酰胺、精胺、硫胺盐酸盐、D-泛酸半钙盐、L-抗坏血酸、盐酸乙醇胺、腐胺 、生物素、氯化胆碱、维生素B12混合配制成100×浓缩液，储存在2-8℃；
c.脂类：
亚油酸使用1%乙醇配制成1000×浓缩液，储存在2-8℃；
d.微量元素：
六水硫酸镍、醋酸钡、硫酸锌、碘化钾、氟化钠、亚硒酸钠、溴化钾、钼酸铵-四水、偏硅酸钠、硫酸铜、三氯化铝六水、六水氯化钴、钒酸钠混合配制成10000×浓缩液，储存在2-8℃；
e.无机盐类和能源类：
氯化镁六水合物、氯化钾、磷酸氢二钠 、磷酸二氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠混合配制成10×浓缩液，储存在2-8℃；
f.其他类：
碳酸氢钠单独配制成20×浓缩液，储存在常温；
L-还原型谷胱甘肽、酚红钠盐、HEPES 、P188混合配制成20×浓缩液，储存在2-8℃；
柠檬酸铁加热至80℃以上溶解配制成100×浓缩液，储存在2-8℃；
所述的按比例混合为按照权利要求2所述的浓度计算比例混合；
所述的调试为pH调至7.0-7.2，氯化钠调整渗透压至270-300mOsm，定容至规定体积，无菌过滤；
还包括补料培养基的配制；所述的补料培养基的配制包括补料1的配制和补料2的配制；
所述的补料1的配制包括以下步骤：
a.浓缩液的配制：
氨基酸类溶液配制：甘氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸盐酸盐配成10×浓缩液；
维生素和多胺溶液配制：尼克酰胺、精胺、硫胺盐酸盐、D-泛酸半钙盐、L-抗坏血酸、盐酸乙醇胺、腐胺、生物素、氯化胆碱、维生素B12、L-还原型谷胱甘肽混合配制成100×浓缩液；
脂类：亚油酸使用1%乙醇配制成100×浓缩液；
微量元素：六水硫酸镍、醋酸钡、硫酸锌、碘化钾、氟化钠、亚硒酸钠、溴化钾、钼酸铵-四水、偏硅酸钠、硫酸铜、三氯化铝六水、六水氯化钴、钒酸钠混合配制成10000×浓缩液；
无机盐类和能源类：氯化镁六水合物、氯化钾、磷酸氢二钠 、磷酸二氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠混合配制成10×浓缩液；
其他类：柠檬酸铁加热至80℃以上溶解配制成100×浓缩液；
b.浓缩液按权利要求2所述的浓度计算比例，混合，调整pH至7.0-7.5，无菌过滤，储存在2-8℃；
所述的补料2的配制方法为：
L-天冬酰胺水合物、L-酪氨酸、核黄素、叶酸等配制成200×浓缩液，配制时先加入少量水后，再使用NaOH溶解，pH保持在9.0-9.5，无菌过滤，储存在2-8℃。
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