CN112063578B - 适应全悬浮细胞培养的培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

适应全悬浮细胞培养的培养基及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112063578B
CN112063578B CN202010848480.2A CN202010848480A CN112063578B CN 112063578 B CN112063578 B CN 112063578B CN 202010848480 A CN202010848480 A CN 202010848480A CN 112063578 B CN112063578 B CN 112063578B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
culture medium
culture
nutrients
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010848480.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112063578A (zh
Inventor
朱绍荣
张成林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Original Assignee
SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd filed Critical SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority to CN202010848480.2A priority Critical patent/CN112063578B/zh
Publication of CN112063578A publication Critical patent/CN112063578A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112063578B publication Critical patent/CN112063578B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0684Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686Kidney cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05Inorganic components
    • C12N2500/10Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05Inorganic components
    • C12N2500/10Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05Inorganic components
    • C12N2500/10Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/16Magnesium; Mg chelators
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05Inorganic components
    • C12N2500/10Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20Transition metals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05Inorganic components
    • C12N2500/10Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20Transition metals
    • C12N2500/22Zinc; Zn chelators
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05Inorganic components
    • C12N2500/10Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20Transition metals
    • C12N2500/24Iron; Fe chelators; Transferrin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30Organic components
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30Organic components
    • C12N2500/32Amino acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30Organic components
    • C12N2500/34Sugars
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30Organic components
    • C12N2500/38Vitamins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30Organic components
    • C12N2500/40Nucleotides, nucleosides or bases
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30Organic components
    • C12N2500/46Amines, e.g. putrescine
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C12N2500/62DMSO

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

一种适用于全悬浮培养基的培养基,适用于包括基础代谢物、核苷酸、维生素、无机盐、抗细胞结团剂、剪切力保护剂、流感病毒增殖促进剂和其他化学成分明确的添加物。本发明的培养基,化学组分完全明确,不含有水解物,且不含有任何动物源成分,包括动物源蛋白(如:胰岛素和转铁蛋白)等,质量可控,重复性好,能适用于全悬浮细胞培养,还能将贴壁细胞驯化为单个悬浮细胞,显著提高细胞密度。

Description

适应全悬浮细胞培养的培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种用于生产生物制品的组合物,尤其涉及一种培养细胞的培养基,应用于全悬浮细胞培养和MDCK细胞培养。
背景技术
70多年以来,鸡胚一直是流感疫苗的传统生产基质,然而因其供应不足、安全性、批次差异性等问题,采用动物细胞培养技术来生产流感疫苗近年来得到了飞速的发展。
MDCK(Mardin-Darby canine kidney)细胞是目前公认的最适于扩增甲型和乙型流感病毒的细胞基质之一,生产工艺按照细胞性质可分为贴壁培养工艺和悬浮培养工艺。对于贴壁细胞培养工艺来说,血清的使用会造成培养工艺的复杂性和批次间不稳定性;细胞在微载体上的贴附生长易受到培养基和培养环境的影响,细胞密度也通常受到贴壁面积的制约;需要添加额外的胰酶使细胞脱离微载体,增加了操作复杂性。
因此,通过无血清悬浮培养MDCK细胞来制备流感疫苗越来越得到研究者和疫苗生产企业的青睐。目前,国内仍十分缺乏利于MDCK悬浮细胞高效生长的商业化无血清培养基,少量的现有技术所提供的MDCK无血清培养基中因培养基组分的不合理设计导致细胞结团;且组分中均含有转铁蛋白、胰岛素等动物源成分,价格昂贵。另外大多培养基中含有植物类或动物类水解物,培养基组分并不明确,安全性不佳,不利于疫苗的下游纯化工作以及人用流感疫苗的大规模开发和生产。
基于以上原因,有必要去开发一款化学组分完全明确、配制简单、安全性好、成本低的化学限定培养基,能够快速驯化MDCK贴壁细胞至单个悬浮生长且生长速率高,为基于MDCK细胞全悬浮培养的流感疫苗生产工艺提供良好的基础。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种培养基,其化学组分完全明确,能适用于全悬浮细胞培养。
本发明的另一个目的在于提供一种培养基,其化学组分完全明确,能适用于全悬浮细胞的高密度培养培养。
本发明的再一个目的在于提供一种培养基,利于将贴壁细胞驯化为单个悬浮细胞,提高细胞的培养效率。
本发明的又一个目的在于提供一种培养基,适用于对MDCK细胞实施全悬浮细胞培养,实现细胞的高密度培养。
本发明的第五个目的在于提供一种培养基,适用于采用MDCK细胞的疫苗制取。
一种培养基,包括如下组分:
第一类营养物,用于满足细胞的基础代谢,包括:但不限于
2000~10000mg/L D-葡萄糖、40~600 mg/L丙酮酸钠、5~30mg/L L-丙氨酸、L-精氨酸 100~600 mg/L、5~60 mg/L L-天冬酰胺、5~60 mg/L L-天冬氨酸、5~80 mg/L L-胱氨酸、10~150mg/L L-半胱氨酸、5~60mg/L L-谷氨酸、300~1500mg/L L-谷氨酰胺、5~100mg/L甘氨酸、10~150mg/L L-组氨酸;20~150mg/L L-异亮氨酸、40~250mg/L L-亮氨酸、40~150mg/L L-赖氨酸、10~150mg/L L-甲硫氨酸、10~250mg/L L-苯丙氨酸、10~200mg/L L-脯氨酸、40~150mg/L L-丝氨酸、40~200mg/L L-苏氨酸、10~100mg/L L-色氨酸、10~100 mg/L L-酪氨酸和40~200mg/L L-缬氨酸;
第二类营养物,系核苷酸,包括:
1~25mg/L次黄嘌呤、0.1~1mg/L胸苷、1~15mg/L腺苷、1~15mg/L尿苷、1~15mg/L胞苷和1~15mg/L鸟苷;
第三类营养物,系维生素,包括:
0.01~0.20mg/L D-生物素、1~10mg/L叶酸 、1~10mg/L烟酰胺、1~10mg/L吡哆醇、1~10mg/L硫胺素、0.1~1mg/L核黄素、10~50mg/L氯化胆碱、2~10mg/L D-泛酸钙和10~50 mg/L肌醇;
第四类营养物,系无机盐,包括:
10~50mg/L硝酸铁、0.1~1mg/L硫酸亚铁、20~100mg/L硫酸镁、100~500mg/L氯化钾、4000~9000mg/L氯化钠、50~120mg/L磷酸氢二钠、50~120mg/L磷酸二氢钠和15~120mg/L亚硒酸钠;以及
500~2500mg/L剪切力保护剂(如:Pluronic F-68)、20~150mg/L等。
另一种培养基,包括如下组分:
第一类营养物,用于满足细胞的基础代谢,包括:但不限于
5000mg/L D-葡萄糖、200mg/L丙酮酸钠、15~17mg/L L-丙氨酸、285~295mg/L L-精氨酸 、35~40mg/L L-天冬酰胺、35~40mg/L L-天冬氨酸、45~50mg/L L-胱氨酸、75~80mg/L L-半胱氨酸、30~35mg/L L-谷氨酸、840~860mg/L L-谷氨酰胺、45~55mg/L甘氨酸、70~80mg/L L-组氨酸;80~90mg/L L-异亮氨酸、130~140mg/L L-亮氨酸、100~110mg/L L-赖氨酸、80~90mg/L L-甲硫氨酸、100~110mg/L L-苯丙氨酸、90~100mg/L L-脯氨酸、70~80mg/L L-丝氨酸、120~130mg/L L-苏氨酸、50~60mg/L L-色氨酸、55~65mg/L L-酪氨酸和90~100mg/L L-缬氨酸;
第二类营养物,系核苷酸,包括:
10~15mg/L次黄嘌呤、0.3~0.6mg/L胸苷、6~9mg/L腺苷、6~9mg/L尿苷、6~9mg/L胞苷和6~9mg/L鸟苷;
第三类营养物,系维生素,包括:
0.05~0.10mg/L D-生物素、4~8mg/L叶酸、4~8mg/L烟酰胺、4~8mg/L吡哆醇、3~5mg/L硫胺素、0.4~0.6mg/L核黄素、30~4mg/L氯化胆碱、5~8mg/L D-泛酸钙和30~35mg/L肌醇;
第四类营养物,系无机盐,包括:
20~30mg/L硝酸铁、0.3~0.6mg/L硫酸亚铁、30~50mg/L硫酸镁、320~330mg/L氯化钾、6500~7500mg/L氯化钠、65~75mg/L磷酸氢二钠、60~70mg/L磷酸二氢钠和50~60mg/L亚硒酸钠;
1500~2000mg/L剪切力保护剂(如:Pluronic F-68)、50~70mg/L抗细胞结团剂(如:硫酸葡聚糖)等。
本发明的培养基,还加入第五类营养物,包括:
10~40mg/L柠檬酸铁铵、1~10mg/L乙醇胺和0.5~5mg/L谷胱甘肽。
柠檬酸铁铵用于铁的运输,保证细胞对铁的摄取。还原型谷胱甘肽参与三羧酸循环及糖代谢,促进糖、脂肪及蛋白质代谢,且可加速自由基的排泄,使细胞免受损。乙醇胺作为细胞脂类合成(如:磷脂和磷脂酰乙醇胺等)的前体物质加入到细胞培养基中。
另一种第五类营养物,包括:
20~30mg/L柠檬酸铁铵、3.0~5.0mg/L乙醇胺和1.0~2.0mg/L谷胱甘肽。
本发明的培养基还包括第六类营养物,系流感病毒增殖促进剂,包括:
1~10mg/L胆固醇、0.4~4mg/L DL-α-生育酚醋酸酯、0.04~0.6mg/L豆蔻酸、0.04~0.6mg/L棕榈酸、0.04~0.6 mg/L硬脂酸、500~5000mg/L氯化镁、25~250mg/L氯化钙、1~20mg/L二甲基亚砜、0.2~2.0mg/L硫酸锌、5~25mg/L硫酸铜、0.0001~0.001mg/L硫酸锰和0.001~0.005mg/L偏钒酸铵。
另一种第六类营养物,包括:
3~5mg/L胆固醇、1.0~2.0mg/L DL-α-生育酚醋酸酯、0.1~0.3mg/L豆蔻酸、0.3~0.4mg/L棕榈酸、0.2~0.4mg/L硬脂酸、3000~3300mg/L氯化镁、170~180mg/L氯化钙、10~15mg/L二甲基亚砜、1.0~1.3mg/L硫酸锌、15~20mg/L硫酸铜、0.0003~0.0005mg/L硫酸锰和0.001~0.003mg/L偏钒酸铵。
本发明的培养基,能适用于全悬浮细胞培养,利于将贴壁细胞驯化为单个悬浮细胞,提高细胞的培养密度,尤其是应用于采用MDCK细胞的疫苗制取中。
一种制取本发明培养基的方法,包括:
先将各组分混合后磨成干粉,于30℃下溶解,并充分混合20分钟后得到混合液;
然后,调节混合液的pH至6.3~6.7,继续搅拌混匀;
最后,加入NaHCO3粉末(如:3g/L),利于形成在培养基中形成缓冲液体系,即得。
制得的培养基还应过滤除菌和避光保存。
本发明技术方案实现的有益效果:
本发明的培养基化学组分完全明确,不含有水解物,且不含有任何动物源成分,包括动物源蛋白(如:胰岛素和转铁蛋白)等,质量可控,重复性好,能适用于全悬浮细胞培养,还能将贴壁细胞驯化为单个悬浮细胞,显著提高细胞密度。
本发明培养基以小分子物质代替,实现了相同功能,因此安全性高,成本低,利于下游纯化工作。在培养基中加入流感病毒增殖促进剂后,则能适用于对MDCK细胞实施全悬浮细胞培养,以及人用疫苗的开发和大规模制取。
与现有技术相比,本发明的培养基可快速将MDCK贴壁细胞驯化为悬浮细胞,所获细胞呈单个悬浮生长,生长速率高。
与现有技术相比,本发明的培养基配制方法简单快速,大大缩短了配制时间,适用于人用疫苗产品的大规模生产。
附图说明
图1为本发明制取的RS-2培养基驯化8代以后的MDCK细胞活细胞密度和活率结果图;
图2为本发明制取的RS-2培养基驯化8代以后的MDCK细胞形态图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明以下实施例采用的MDCK细胞来自华东理工大学赠与,其原始来源为ATCCMDCK CCL-34贴壁细胞株。
本发明以下实施例的培养基,其制取方法如下:
(1)将各原料混合后磨成干粉,然后将其在30℃温度下溶解,并充分混合20分钟后得到混合液;
(2)用NaOH固体调节培养基混合液的pH至6.3~6.7,继续搅拌混合(如:20分钟),料液变澄清;
(3)加入NaHCO3粉末形成培养基缓冲液体系,并定容得到用于MDCK细胞全悬浮培养的化学限定培养基。
本发明以下实施例对细胞进行观察的方法如下:
吸取20μL混合均匀的细胞悬液,轻轻滴于干净的载玻片上,用盖玻片轻压盖住细胞液,于显微镜下合适放大倍数下观察细胞形态。
实施例1
按组分和用量制取用于MDCK全悬浮培养的培养基,并记为RS-1。
基础代谢营养物:D-葡萄糖 3500mg/L;丙酮酸钠92mg/L;L-丙氨酸 10.7mg/L;L-精氨酸207.4mg/L;L-天冬酰胺 24.5mg/L;L-天冬氨酸 23.4mg/L;L-胱氨酸 23.54mg/L;L-半胱氨酸 55.44mg/L;L-谷氨酸 22.44mg/L;L-谷氨酰胺 536mg/L;甘氨酸 19.86mg/L;L-组氨酸 35.48mg/L;L-异亮氨酸 42.13mg/L;L-亮氨酸 75.59mg/L;L-赖氨酸 84.51mg/L;L-甲硫氨酸 42.33mg/L;L-苯丙氨酸 50.87mg/L;L-脯氨酸 46.67mg/L;L-丝氨酸60.06mg/L;L-苏氨酸80.67mg/L;L-色氨酸 33.73mg/L;L-酪氨酸 48.95mg/L;L-缬氨酸53.01mg/L。
核苷酸:次黄嘌呤 6.2 mg/L;胸苷 0.22 mg/L;腺苷 3.5 mg/L;尿苷 3.5 mg/L;胞苷 3.5 mg/L;鸟苷 3.5 mg/L。
维生素:D-生物素 0.034 mg/L;叶酸 2.40 mg/L;烟酰胺 1.55 mg/L;吡哆醇1.66mg/L;硫胺素 1.62 mg/L;核黄素 0.24 mg/L;氯化胆碱 13.51 mg/L;D-泛酸钙 2.14 mg/L;肌醇 13 mg/L。
无机盐:硝酸铁 25.64 mg/L;硫酸亚铁 0.456 mg/L;硫酸镁 24.5 mg/L;氯化钾324.4 mg/L;氯化钠 5000 mg/L;磷酸氢二钠 71 mg/L;磷酸二氢钠 62.5 mg/L;亚硒酸钠24.53 mg/L。
剪切力保护剂:1000 mg/L。
抗细胞结团剂:30 mg/L。
流感病毒增殖促进剂:胆固醇 1.59 mg/L;DL-α-生育酚醋酸酯 0.61 mg/L;豆蔻酸 0.1314 mg/L;棕榈酸 0.128 mg/L;硬脂酸 0.135 mg/L;氯化镁 1897 mg/L;氯化钙112.3 mg/L;二甲基亚砜 6.5 mg/L;硫酸锌 0.56 mg/L;硫酸铜 7.33 mg/L;硫酸锰0.000165 mg/L;偏钒酸铵 0.00129 mg/L。
其它添加物: 柠檬酸铁铵 15 mg/L;乙醇胺 3.5 mg/L;谷胱甘肽 0.7 mg/L。
实施例2
按组分和用量制取用于MDCK全悬浮培养的培养基,并记为RS-2。
基础代谢营养物;D-葡萄糖 5000 mg/L;丙酮酸钠200 mg/L;L-丙氨酸 15.7mg/L;L-精氨酸287.4 mg/L;L-天冬酰胺 37.5 mg/L;L-天冬氨酸 39.4mg/L;L-胱氨酸 46.54mg/L;L-半胱氨酸 75.44 mg/L;L-谷氨酸 32.54mg/L;L-谷氨酰胺 856 mg/L;甘氨酸49.86 mg/L;L-组氨酸 77.88mg/L;L-异亮氨酸 86.33 mg/L;L-亮氨酸 132.39 mg/L;L-赖氨酸 102.21 mg/L;L-甲硫氨酸 85.35 mg/L;L-苯丙氨酸 106.62 mg/L;L-脯氨酸 93.77mg/L;L-丝氨酸 75.56mg/L;L-苏氨酸 123.47 mg/L;L-色氨酸 53.33 mg/L;L-酪氨酸58.65mg/L;L-缬氨酸 93.41 mg/L。
核苷酸:次黄嘌呤 11.2 mg/L;胸苷 0.52 mg/L;腺苷 7.5 mg/L;尿苷 7.5 mg/L;胞苷 7.5 mg/L;鸟苷 7.5 mg/L。
维生素:D-生物素 0.084 mg/L;叶酸 5.40 mg/L;烟酰胺 4.65 mg/L;吡哆醇4.56mg/L;硫胺素 3.65 mg/L;核黄素 0.54 mg/L;氯化胆碱 33.51 mg/L;D-泛酸钙 6.44 mg/L;肌醇 32 mg/L。
无机盐:硝酸铁 25.64 mg/L;硫酸亚铁 0.456 mg/L;硫酸镁 40.5 mg/L;氯化钾324.4 mg/L;氯化钠 7000 mg/L;磷酸氢二钠 71 mg/L;磷酸二氢钠 62.5 mg/L;亚硒酸钠54.33 mg/L。
剪切力保护剂:1500 mg/L;
抗细胞结团剂:60 mg/L;
流感病毒增殖促进剂:胆固醇 3.89 mg/L;DL-α-生育酚醋酸酯 1.51 mg/L;豆蔻酸 0.2334 mg/L;棕榈酸 0.2864 mg/L;硬脂酸 0.299 mg/L;氯化镁 3244mg/L;氯化钙178.3 mg/L;二甲基亚砜 12.5 mg/L;硫酸锌 1.12 mg/L;硫酸铜 17.33 mg/L;硫酸锰0.00045 mg/L;偏钒酸铵 0.00199 mg/L;
其它添加物:
柠檬酸铁铵 25 mg/L;乙醇胺 3.5 mg/L;谷胱甘肽 1.5 mg/L。
实施例3
按组分和用量制取用于MDCK全悬浮培养的培养基,并记为RS-3。
基础代谢营养物:D-葡萄糖 8500mg/L;丙酮酸钠450mg/L;L-丙氨酸 23.7mg/L;L-精氨酸582.4mg/L;L-天冬酰胺 47.5mg/L;L-天冬氨酸 49.3mg/L;L-胱氨酸 67.24 mg/L;L-半胱氨酸 105.34 mg/L;L-谷氨酸 52.64mg/L;L-谷氨酰胺 1656mg/L;甘氨酸 50.86mg/L;L-组氨酸 139.67mg/L;L-异亮氨酸 137.90mg/L;L-亮氨酸 299.34 mg/L;L-赖氨酸143.21 mg/L;L-甲硫氨酸 110.35 mg/L;L-苯丙氨酸 206.62 mg/L;L-脯氨酸 146.41 mg/L;L-丝氨酸 115.86 mg/L;L-苏氨酸 113.47 mg/L;L-色氨酸 75.32 mg/L;L-酪氨酸78.95 mg/L;L-缬氨酸 143.41 mg/L。
核苷酸:次黄嘌呤 21.2 mg/L;胸苷 0.52 mg/L;腺苷 10.5mg/L;尿苷 10.5 mg/L;胞苷 10.5 mg/L;鸟苷 10.5 mg/L。
维生素:D-生物素 0.144 mg/L;叶酸 7.48 mg/L;烟酰胺 6.66 mg/L;吡哆醇6.86mg/L;硫胺素 6.05 mg/L;核黄素 0.74 mg/L;氯化胆碱 38.51 mg/L;D-泛酸钙 8.44 mg/L;肌醇 32 mg/L。
无机盐:硝酸铁 25.64 mg/L;硫酸亚铁 0.456 mg/L;硫酸镁 70.5 mg/L;氯化钾324.4 mg/L;氯化钠 8000 mg/L;磷酸氢二钠 71 mg/L;磷酸二氢钠 62.5 mg/L;亚硒酸钠74.33 mg/L。
剪切力保护剂:2200 mg/L。
抗细胞结团剂:90 mg/L。
流感病毒增殖促进剂:胆固醇 6.29 mg/L;DL-α-生育酚醋酸酯 2.11mg/L;豆蔻酸0.3334 mg/L;棕榈酸 0.384 mg/L;硬脂酸 0.419 mg/L;氯化镁 4244mg/L;氯化钙248.3mg/L;二甲基亚砜 15.5 mg/L;硫酸锌 1.52 mg/L;硫酸铜 17.33 mg/L;硫酸锰0.00045mg/L;偏钒酸铵 0.00299 mg/L;
其它添加物: 柠檬酸铁铵 40 mg/L;乙醇胺 10.5 mg/L;谷胱甘肽 1.9 mg/L。
实施例4
将实施例1~实施例3获得的培养基RS-1、RS-2和RS-3进行细胞培养验证。采用的细胞为已适应全悬浮培养的MDCK悬浮细胞。以1.0×106个细胞/mL的细胞密度接种细胞至摇瓶中,在37℃、5% CO2条件下进行批培养,每隔24小时进行取样计数。所用对照培养基为商业话无血清培养基Ex-cell。结果如表1所示。
表1批培养不同培养基中的细胞生长情况
时间(h) RS-1 RS-2 RS-3 Ex-cell
0 1.0 1.0 1.0 1.0
24 2.13 2.34 2.03 1.73
48 4.53 4.76 4.29 4.02
72 8.32 9.32 8.05 5.32
96 9.46 9.89 9.01 6.21
120 8.43 9.01 8.34 5.34
最大比生长速率(h<sup>-1</sup>) 0.029 0.031 0.029 0.023
与商业化培养基Ex-cell相比,本发明所提供的化学限定培养基RS-1、RS-2和RS-3均能支持MDCK悬浮细胞的高密度生长,最大密度均超过8×106个细胞/mL,高于对照组中Ex-cell中的最大细胞密度6×106个细胞/mL。此外,在对数生长期RS-1、RS-2和RS-3三个培养基中的细胞最大比生长速率约为0.030 h-1,大于对照组中的0.023 h-1
实施例5
用实施例2中的化学限定培养基RS-2驯化MDCK贴壁细胞为无血清悬浮培养,具体操作如下:
(1)当在含10%胎牛血清的DMEM中培养的贴壁MDCK细胞生长至汇合度80%时,弃去原有培养基并用PBS润洗细胞表面两遍后,加入适量胰酶,使其正好覆盖所有MDCK贴壁细胞,消化15分钟。
(2)至细胞变圆后加入少量血清终止消化,并加适量所述化学限定培养基重悬并1000 rpm离心5 min后弃上清。将剩余的细胞团用所述化学限定培养基RS-2重悬至细胞密度约1.0×106个细胞/mL,并转移到摇瓶中,在转速130rpm、温度37℃、5%CO2的条件下置于培养箱中培养。
(3)每隔48 h取样计数,并用所述化学限定培养基将细胞密度稀释至约1.0×106个细胞/mL,进行传代,直至获得适应所述化学限定培养基生长的悬浮MDCK细胞,结果如图1和图2所示。
由图1可知,细胞生长稳定,每次传代至1.0×106个细胞/mL后48小时内可生长至5~6×106个细胞/mL。经计算,该MDCK细胞的比生长速率在0.030h-1左右。此外,细胞活率高,传代过程中均高于96.5%。
由图2所示,在RS-2培养基中驯化8代以后的MDCK细胞呈单个分散,细胞大小均一,细胞饱满且透亮。

Claims (1)

1.一种适用于全悬浮细胞培养的培养基在将MDCK贴壁细胞驯化为单个悬浮细胞中的应用,其特征在于所述培养基由下列组成:
第一类营养物,用于满足细胞的基础代谢,为:
5000mg/L D-葡萄糖、200mg/L丙酮酸钠、15.7mg/L L-丙氨酸、287.4mg/L L-精氨酸、37.5mg/L L-天冬酰胺、39.4mg/L L-天冬氨酸、46.54mg/L L-胱氨酸、75.44mg/LL-半胱氨酸、32.54mg/L L-谷氨酸、856mg/L L-谷氨酰胺、49.86mg/L甘氨酸、77.88mg/L L-组氨酸;86.33mg/L L-异亮氨酸、132.39mg/L L-亮氨酸、102.21mg/L L-赖氨酸、85.35mg/L L-甲硫氨酸、106.62mg/L L-苯丙氨酸、93.77mg/L L-脯氨酸、75.56mg/L L-丝氨酸、123.47mg/LL-苏氨酸、53.33mg/L L-色氨酸、58.65mg/L L-酪氨酸和93.41mg/L L-缬氨酸;
第二类营养物,系核苷酸,为:
11.2mg/L次黄嘌呤、0.52mg/L胸苷、7.5mg/L腺苷、7.5mg/L尿苷、7.5mg/L胞苷和7.5mg/L鸟苷;
第三类营养物,系维生素,为:
0.084mg/L D-生物素、5.40mg/L叶酸、4.65mg/L烟酰胺、4.56mg/L吡哆醇、3.65mg/L硫胺素、0.54mg/L核黄素、33.51mg/L氯化胆碱、6.44mg/L D-泛酸钙和32mg/L肌醇;
第四类营养物,系无机盐,为:
25.64mg/L硝酸铁、0.456mg/L硫酸亚铁、40.5mg/L硫酸镁、324.4mg/L氯化钾、7000mg/L氯化钠、71mg/L磷酸氢二钠、62.5mg/L磷酸二氢钠和54.33mg/L亚硒酸钠;
1500mg/L剪切力保护剂和60mg/L抗细胞结团剂;
第五类营养物,为25mg/L柠檬酸铁铵、3.5mg/L乙醇胺和1.5mg/L谷胱甘肽;
流感病毒增殖促进剂,为3.89mg/L胆固醇、1.51mg/L DL-α-生育酚醋酸酯、0.2334mg/L豆蔻酸、0.2864mg/L棕榈酸、0.299mg/L硬脂酸、3244mg/L氯化镁、178.3mg/L氯化钙、12.5mg/L二甲基亚砜、1.12mg/L硫酸锌、17.33mg/L硫酸铜、0.00045mg/L硫酸锰和0.00199mg/L偏钒酸铵。
CN202010848480.2A 2020-08-21 2020-08-21 适应全悬浮细胞培养的培养基及其制备方法和应用 Active CN112063578B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010848480.2A CN112063578B (zh) 2020-08-21 2020-08-21 适应全悬浮细胞培养的培养基及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010848480.2A CN112063578B (zh) 2020-08-21 2020-08-21 适应全悬浮细胞培养的培养基及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112063578A CN112063578A (zh) 2020-12-11
CN112063578B true CN112063578B (zh) 2023-01-31

Family

ID=73659024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010848480.2A Active CN112063578B (zh) 2020-08-21 2020-08-21 适应全悬浮细胞培养的培养基及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112063578B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108384747A (zh) * 2018-03-05 2018-08-10 安徽省农业科学院园艺研究所 表达狂犬抗体的cho细胞无血清悬浮培养方法
CN113684175A (zh) * 2021-09-14 2021-11-23 山东恒业生物技术有限公司 一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555659A (zh) * 2013-11-11 2014-02-05 乔自林 一种mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基
CN106119186A (zh) * 2016-06-24 2016-11-16 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种用于全悬浮培养mdck细胞的无血清培养基及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555659A (zh) * 2013-11-11 2014-02-05 乔自林 一种mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基
CN106119186A (zh) * 2016-06-24 2016-11-16 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种用于全悬浮培养mdck细胞的无血清培养基及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Evaluation of insulin-mimetic trace metals as insulin replacements in mammalian cell cultures;Victor V. T. Wong;《Cytotechnology》;20040731;Abstract、Introduction 、Materials and methods、Discussion *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112063578A (zh) 2020-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112063578B (zh) 适应全悬浮细胞培养的培养基及其制备方法和应用
CN102858953B (zh) 改进的细胞培养基
CN109337861B (zh) 一种支持产物高表达的cho细胞无血清培养基
US20060115901A1 (en) Method and media for single cell serum-free culture of CHO cells
US20170369836A1 (en) Serum-free medium for full suspension culture of mdck cells and preparation method of serum-free medium
CN111944741B (zh) Mdck细胞系的悬浮培养驯化方法
CN101974481A (zh) 一种用于多种肾脏组织来源细胞生长的无血清培养基
CN101418330B (zh) 适于nso细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基
CN111996161B (zh) 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途
CN113930382B (zh) 一种用于cho细胞表达抗狂犬病毒单克隆抗体的培养基
CN107841482A (zh) Mdck细胞无血清悬浮培养技术生产h9亚型流感疫苗
AU662491B2 (en) Medium for culture of mammalian cells
CN112322577B (zh) 一种用于cho细胞大规模培养的无血清培养基及应用
CN108103003B (zh) 一种适应pk-15全悬浮生长的无血清培养基及其制备方法和应用于pk-15细胞的全悬浮驯化方法
CN114480286A (zh) 无血清悬浮型lmh细胞系及其制备方法和应用
CN112442486A (zh) 一种维持体外培养cho dg44细胞后期活率的培养基及其应用
CN102405279B (zh) 改善单细胞克隆的方法
CN110564670A (zh) 一种昆虫细胞无血清培养基及其制备工艺
JP2007075102A (ja) 昆虫細胞培養用培地
CN114250191B (zh) 适用于昆虫细胞高密度培养和产物高表达的无血清培养基
CN107119017B (zh) 一种骨肉瘤细胞的无血清培养基及其制备方法
JP2021503290A (ja) 液体培地を作製するための合理化された方法
EP0550678B1 (en) Media for culture of drosophila cells
CN116751737B (zh) 无血清无蛋白培养基和制备方法及其应用
CN116478903B (zh) 一种昆虫细胞无血清培养基及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 201108 No. 888 Xiangyang Road, Shanghai, Minhang District

Applicant after: Shanghai Rongsheng Biological Pharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 201108 No. 888 Xiangyang Road, Shanghai, Minhang District

Applicant before: SHANGHAI RONGSHENG BIOTECH CO.,LTD.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant