CN102405279B - 改善单细胞克隆的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在无血清细胞培养基中培养细胞群的方法，其中所述细胞群的细胞浓度小于100个细胞/ml，其中使用了含有重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基。

Description

改善单细胞克隆的方法
本发明涉及在无血清细胞培养基中培养细胞群的方法，其中所述细胞群的细胞浓度小于100个细胞/ml，其中使用了含有重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基。本发明还涉及含有重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基用于培养细胞浓度小于100个细胞/ml的细胞群的用途。本发明还涉及在含重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基中培养的细胞浓度小于100个细胞/ml的细胞群。常规的细胞培养基通常补充有不确定的添加剂，例如胎牛血清(FBS)。这种添加物为载体提供了不稳定或水不溶性成分，提供了生长因子并保护细胞免受物理应力。另一方面，使用血清具有一些缺点。血清是未表征的物质的混合物，其可能随批次变化。然而，来自动物或人来源的血清或其它补充物的主要缺点是外源因子污染的风险，例如支原体、朊病毒和病毒污染。
为了克服与血清有关的病原性污染的风险，过去已经开发了无血清培养基。无血清培养基通常补充有血清替代物，例如生长因子、细胞因子、白蛋白、胰岛素和转铁蛋白。这些蛋白通常分离自动物来源，因此培养基受病原体污染的潜在风险依然存在。例如，利用分离自动物或人来源的牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)或转铁蛋白可便于细胞培养(US6733746)。这种方法仍然存在向细胞培养物中引入外来病原体，例如来自HSA的HIV、克雅氏病因子(Creutzfeld Jakob agent)或肝炎病毒的风险。病原体不利于培养基在动物和人治疗剂的生产中的应用。已经描述了仅含有重组产生的蛋白质并因此降低了病原性污染的风险的培养基。已经公开了包含重组白蛋白和另外的源自动物的成分的培养基(WO2008009642)和含有重组白蛋白和重组胰岛素的培养基(US20060115901)。
通常向无血清培养基中加入的常规添加剂是转铁蛋白。转铁蛋白通常分离自动物或人来源，并且加入至无血清培养基中以为细胞提供铁。Qian，Z.M.和Tang，P.L.，1995，Biochim.Biophys.Acta，1269：205-214已经综述了哺乳动物细胞摄取铁的机制。进一步的出版物表明转铁蛋白可能是支持细胞增殖的生长因子。另一方面，已经表明转铁蛋白受体缺陷型细胞可以以与野生型细胞相当的速率增殖，这表明该受体不属于生长因子受体家族(Chan，R.等，1992，Experimental cell research 202：326-336)。在缺乏转铁蛋白受体的情况下，细胞可以通过非特异性受体非依赖机制摄取铁。通常，细胞可以摄取铁的机制有三种：1.从转铁蛋白经由受体依赖性途径，2.从转铁蛋白经由受体非依赖性途径(非特异性)，3.从无机铁盐，例如FeSO4(Chan，R.等，1992，Experimental cell research 202：326-336)。后一铁摄取途径是向培养基中加入许多无机铁螯合剂的基础，其向细胞提供铁并忽略转铁蛋白的其它作用(EP1210410)。由于细胞从无机铁盐的非特异性铁摄取，已经开发了许多完全不含任何蛋白质的细胞培养基。有趣的是，细胞在不含蛋白的培养基中生长得非常好，从而使目前本领域的培养基不含任何蛋白质。总之，已公开的数据证明转铁蛋白能够在哺乳动物细胞中介导铁的摄取。然而，由于细胞还可以从无机铁螯合剂摄取铁，因此补充铁并不一定需要转铁蛋白。截至目前，还不清楚转铁蛋白除了其作为铁提供者的作用外是否还对细胞具有生长因子样作用。
在利用动物细胞培养物生产治疗性蛋白的过程中，证明生产细胞系的克隆性很重要。这表示，在遗传上经过修饰的生产细胞系应起源自单个前体细胞，所述前体细胞是通过在培养皿中每个孔仅接种一个细胞而克隆的单个细胞。使单细胞状态的细胞暴露于快速变化的环境条件，如pH变化、温度变化或聚集的氧化介质产物的有害作用。相比之下，细胞群中共培养的细胞从其相邻细胞接受诸如细胞因子的支持增殖和存活的成分。当在单细胞培养过程中省略该支持时，许多克隆不能应付提高的培养应力。当将单克隆接种至培养皿，例如96孔板中时，克隆不能从周围接受刺激性支持。这常常导致细胞死亡或非增殖行为。为了避免这些难题，通常在培养基中存在胎牛血清(FBS)的条件下进行单细胞克隆。因此，由于血清的上述缺点，开发不含血清的单细胞克隆培养基意义重大。
已经开发了在不含血清的培养基中以非常低的细胞密度培养CHO细胞的方法。除此之外，所述培养基包含重组白蛋白和重组胰岛素(US20060115901)。通常向不含血清的单细胞克隆培养基中加入条件培养基。条件培养基包含由同一细胞群产生的细胞因子并因此应促进单细胞的克隆生长(WO2005014799)。然而，条件培养基中细胞因子的浓度低并且条件培养基还包含抑制生长的细胞毒性代谢物，从而使这种培养基的促生长作用受到限制。
另一种方法是实际生产克隆和母细胞的共培养。为了除去所谓的饲养细胞的生长能力，可以使该细胞接受辐射。不生长的饲养细胞将释放刺激生长克隆分裂的生长因子(EP1176194，US2005/0059146)。利用饲养细胞培养的缺点是难以从饲养细胞分离生产克隆。必须证明饲养细胞没有附着至生产克隆。
总之，公开的数据证明，需要用于在无血清培养基中进行细胞的单细胞克隆的简单的新方法。
本发明的技术问题是提供克服现有技术的缺点的方法和细胞培养基。
本发明的进一步技术问题是提供尤其在无血清培养基中进行细胞的单细胞克隆的更简单的方法。
本发明的进一步技术问题是提供在培养基中(尤其在无血清培养基中)以低细胞浓度进行细胞群培养的更简单的方法。
本发明通过提供独立权利要求的教导而解决了上述问题。
具体地，本发明提供了一种在无血清细胞培养基中培养细胞群的方法，其中所述细胞群的细胞浓度小于100个细胞/ml，所述方法包括如下步骤：a)在第一无血清细胞培养基中以大于约100个细胞/ml，尤其大于100个细胞/ml的细胞浓度培养细胞群，b)降低所述细胞浓度至小于约100个细胞/ml，尤其小于100个细胞/ml，和c)在第二无血清细胞培养基中培养所述细胞，其中所述第二无血清细胞培养基包含重组白蛋白和重组转铁蛋白。
具体地，本发明提供了一种在无血清细胞培养基中培养细胞群的方法，其中所述细胞群的细胞浓度小于100个细胞/ml，所述方法包括如下步骤：a)在第一无血清细胞培养基中以大于约100个细胞/ml，尤其大于100个细胞/ml的细胞浓度培养细胞群，b)降低细胞浓度至小于约100个细胞/ml，尤其小于100个细胞/ml，和c)使所述细胞接触第二无血清细胞培养基，其中所述第二无血清细胞培养基包含重组白蛋白和重组转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于200个细胞。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于约200个细胞。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于500个细胞。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于约1000个细胞。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于1000个细胞。在本发明的优选的实施方式中，在步骤b)中将所述细胞浓度降低至小于50个细胞/ml。在本发明的优选的实施方式中，在步骤b)中将所述细胞浓度降低至小于10个细胞/ml。在本发明的优选的实施方式中，在步骤b)中将细胞浓度降低至1个细胞/ml。
在本发明的优选的实施方式中，在步骤b)中将细胞群降低至1个细胞。因此，在本发明的优选的实施方式中，在步骤c)开始时所述细胞群包含1个细胞。
在本发明的优选的实施方式中，在步骤b)中将所述细胞群降低至1个细胞/培养皿。因此，在本发明的优选的实施方式中，在步骤c)开始时所述细胞群包含1个细胞/培养皿。
在本发明的优选的实施方式中，在步骤b)中将所述细胞群降低至1个细胞/培养孔。因此，在本发明的优选的实施方式中，在步骤c)开始时所述细胞群包含1个细胞/培养孔。本领域技术人员知晓适合培养细胞，尤其是培养细胞群的数种培养皿和培养孔。本领域技术人员还知晓适合培养细胞浓度小于100个细胞/ml的细胞群的数种培养皿和培养孔。本领域技术人员还知晓适合培养细胞浓度总共小于100个细胞的细胞群，尤其是仅有一个单细胞组成的细胞群的数种培养皿和培养孔。
此外，本发明还提供了一种在无血清细胞培养基中培养单细胞的方法，所述方法包括如下步骤：a)在第一无血清细胞培养基中以大于约100个细胞/ml、尤其大于100个细胞/ml的细胞浓度培养，细胞群，b)从所述细胞群分离出单细胞，和c)在第二无血清细胞培养基中培养所述单细胞，其中所述第二细胞培养基包含重组白蛋白和重组转铁蛋白
此外，本发明还提供了一种在无血清细胞培养基中培养单细胞的方法，所述方法包括如下步骤：a)在第一无血清细胞培养基中以大于约103个细胞/ml、尤其大于103个细胞/ml的细胞浓度培养细胞群，b)从所述细胞群分离出单细胞，和c)使所述单细胞与第二无血清细胞培养基接触，其中所述第二细胞培养基包含重组白蛋白和重组转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于100个细胞。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于约200个细胞。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于500个细胞。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于约1000个细胞。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于10000个细胞。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于约100000个细胞。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于1000000个细胞。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于100个细胞/ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于约200个细胞/ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于500个细胞/ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于约1000个细胞/ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于10000个细胞/ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于约100000个细胞/ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于1000000个细胞/ml。
在本发明的优选的实施方式中，当以大于约100个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于100个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于约200个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于200个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于约500个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于500个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于约103个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于103个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于约104个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于105个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于约106个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长。
在本发明的优选的实施方式中，当以大于约100个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于约100个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于100个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于100个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于约1000个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于约1000个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组白蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于1000个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组转铁蛋白用于生长。在本发明的优选的实施方式中，当以大于1000个细胞/ml的细胞浓度培养细胞时，所述细胞群的细胞不需要重组白蛋白用于生长。
在本发明的优选实施方式中，所述细胞群的细胞是能够在无血清培养基中生长的细胞。在本发明的优选的实施方式中，所述细胞群的细胞是适应在无血清培养基中生长的细胞。
在本发明的优选的实施方式中，所述细胞群的细胞是能够在不含动物成分的培养基中生长的细胞。在本发明的优选的实施方式中，所述细胞群的细胞是适应在不含动物成分的培养基中生长的细胞。在本发明的优选的实施方式中，所述细胞群的细胞是能够以小于100个细胞/ml的浓度在不含动物成分的培养基中生长的细胞。在本发明的优选的实施方式中，所述细胞群的细胞是适应以小于100个细胞/ml的浓度在不含动物成分的培养基中生长的细胞。
在本发明的优选的实施方式中，所述方法在步骤a)之前包括另外的步骤，其中使所述细胞群的细胞适应在不含动物成分的培养基中生长。在本发明的可选的实施方式中，使所述细胞群的细胞适应在不含动物成分的培养基中生长。
还可以通过，例如使用商业化的细胞而提供适应在不含动物成分的培养基中生长的细胞，以在步骤a)中使用。
使细胞适应在不含动物成分的培养基中生长的合适方法，即获得适应在不含动物成分的培养基中生长的细胞的方法是本领域熟知的。
在本发明的优选的实施方式中，所述不含动物成分的培养基是不含蛋白的培养基。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度小于0.1％(按重量)的白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多0.09％(按重量)的白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多0.05％(按重量)的白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多0.01％(按重量)的白蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度小于0.1％(按重量)的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多0.09％(按重量)的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多0.05％(按重量)的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多0.01％(按重量)的重组白蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度小于5μg/ml的转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多4.9μg/ml的转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多4μg/ml的转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多1μg/ml的转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多0.5μg/ml的转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度小于5μg/ml的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多4.9μg/ml的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多4μg/ml的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多1μg/ml的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基包含浓度至多0.5μg/ml的重组转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基不含重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基不含重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基不含重组白蛋白和重组转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的所述第一无血清培养基不含白蛋白和转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含大于2g/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少2.1g/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少2.5g/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少3g/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少5g/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少10g/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少20g/升的重组白蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含大于10mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少10.1mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少11mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少20mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少50mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少100mg/升的重组转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含小于2g/升的重组白蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含大于2g/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含小于1g/升的重组白蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含大于1g/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含小于2g/升的重组白蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含大于1g/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含小于1g/升的重组白蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含大于2g/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含至多0.5g/升的重组白蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含至少2.5g/升的重组白蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含小于5μg/ml的重组转铁蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含大于5μg/ml的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含小于10μg/ml的重组转铁蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含大于10μg/ml的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含小于5μg/ml的重组转铁蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含大于10μg/ml的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含小于10μg/ml的重组转铁蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含大于5μg/ml的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含至多4μg/ml的重组转铁蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含最少6μg/ml的重组转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含小于2g/升的重组白蛋白和小于5μg/ml的重组转铁蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含大于2g/升的重组白蛋白和大于5μg/ml的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含小于1g/升的重组白蛋白和小于10μg/l的重组转铁蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含大于1g/升的重组白蛋白和大于10μg/ml的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含小于1g/升的重组白蛋白和小于5μg/ml的重组转铁蛋白，并且其中步骤c)中使用的细胞培养基包含大于2g/升的重组白蛋白和大于10μg/ml的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含至多0.5g/升的重组白蛋白和最多4μg/ml的重组转铁蛋白，并且步骤c)中使用的细胞培养基包含至少3g/升的重组白蛋白和最少15μg/ml的重组转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含比步骤c)中使用的细胞培养基少的重组白蛋白，尤其是白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含比步骤c)中使用的细胞培养基少的重组转铁蛋白，尤其是转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含比步骤c)中使用的细胞培养基少的重组白蛋白(尤其是白蛋白)和重组转铁蛋白(尤其是转铁蛋白)。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基是不含动物成分的培养基，更优选不含蛋白的培养基。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基是不含动物成分的培养基。
在本发明的优选的实施方式中，所述方法还包括步骤d)在第三无血清细胞培养基中培养所述细胞，所述第三无血清细胞培养基包含浓度比步骤c)的细胞培养基低的重组转铁蛋白和/或重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，所述方法还包括步骤d)在第三无血清细胞培养基中培养所述细胞，所述第三无血清细胞培养基包含浓度比步骤c)的细胞培养基低的重组转铁蛋白和重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，所述方法还包括步骤d)在第三无血清细胞培养基中培养所述细胞，所述第三无血清细胞培养基包含浓度比步骤c)的细胞培养基低的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，所述方法还包括步骤d)在第三无血清细胞培养基中培养所述细胞，所述第三无血清细胞培养基包含浓度比步骤c)的细胞培养基低的重组白蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，所述方法还包括步骤d)在第三无血清细胞培养基中培养所述细胞，所述第三无血清细胞培养基所包含的重组转铁蛋白和重组白蛋白的浓度为步骤c)的细胞培养基中重组转铁蛋白和重组白蛋白的80％或更低，优选50％或更低。
在本发明的优选的实施方式中，所述方法还包括步骤d)在第三无血清细胞培养基中培养所述细胞，所述第三无血清细胞培养基包含浓度比步骤c)的细胞培养基低至少2倍的重组转铁蛋白和浓度比步骤c)的细胞培养基低至少2倍的重组白蛋白。
根据优选的实施方式，步骤d)在步骤c)之后进行。
在本发明的优选实施方式中，步骤d)的细胞培养基不含重组转铁蛋白和重组白蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，所述无血清细胞培养基是不含动物成分的细胞培养基。在本发明的优选的实施方式中，所述无血清细胞培养基是不含蛋白的细胞培养基。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)的无血清细胞培养基是不含动物成分的细胞培养基。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)的无血清细胞培养基是不含蛋白的细胞培养基。
在本发明的优选的实施方式中，步骤c)的无血清细胞培养基是不含动物成分的细胞培养基。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)的无血清细胞培养基是不含蛋白的细胞培养基。
在本发明的优选的实施方式中，步骤d)的无血清细胞培养基是不含动物成分的细胞培养基。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)的无血清细胞培养基是不含蛋白的细胞培养基。
在本发明的优选的实施方式中，步骤c)的细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度(osomlality)为280-320mOsmol/kg H2O。
在本发明的优选的实施方式中，步骤c)的细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度为280-300mOsmol/kg H2O。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)的细胞培养基的pH为6.0-8.0。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)的细胞培养基的pH为6.8-7.1。
在本发明的优选的实施方式中，步骤c)的细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度为280-320mOsmol/kg H2O，pH为6.8-7.1。
在本发明的优选的实施方式中，步骤c)的细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度为280-300mOsmol/kg H2O，pH为6.8-7.0。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和/或c)和/或d)使用的细胞培养基包含L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和/或c)和/或d)使用的细胞培养基包含浓度小于6mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和/或c)和/或d)使用的细胞培养基包含浓度小于4mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和/或c)和/或d)使用的细胞培养基包含浓度小于2mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和/或c)和/或d)使用的细胞培养基不含L-谷氨酰胺。
在本发明的优选的实施方式中，细胞培养基包含L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中使用的细胞培养基包含L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和c)中使用的细胞培养基包含L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)、c)和d)中使用的细胞培养基包含L-谷氨酰胺。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)使用的细胞培养基包含浓度小于50mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)使用的细胞培养基包含浓度小于50mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)使用的细胞培养基包含浓度小于50mM的L-谷氨酰胺。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)使用的细胞培养基包含浓度小于6mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)使用的细胞培养基包含浓度小于6mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)使用的细胞培养基包含浓度小于6mM的L-谷氨酰胺。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)使用的细胞培养基包含浓度小于4mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)使用的细胞培养基包含浓度小于4mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)使用的细胞培养基包含浓度小于4mM的L-谷氨酰胺。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和c)使用的细胞培养基包含浓度小于50mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和c)使用的细胞培养基包含浓度小于6mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和c)使用的细胞培养基包含浓度小于4mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)、c)和d)使用的细胞培养基包含浓度小于4mM的L-谷氨酰胺。
在本发明的优选的实施方式中，所使用的所有细胞培养基都包含相同浓度的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，所使用的所有细胞培养基都包含浓度小于50mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，所使用的所有细胞培养基都包含浓度小于20mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，所使用的所有细胞培养基都包含浓度小于6mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，所使用的所有细胞培养基都包含浓度小于4mM的L-谷氨酰胺。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和/或c)中使用的细胞培养基包含铁。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和/或c)和/或d)中使用的细胞培养基包含铁。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含铁。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含铁。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中使用的细胞培养基包含铁。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和c)中使用的细胞培养基包含铁。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基包含非转铁蛋白结合铁。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含非转铁蛋白结合铁。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中使用的细胞培养基包含非转铁蛋白结合铁。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和/或c)中使用的细胞培养基包含非转铁蛋白结合铁。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和/或c)和/或d)中使用的细胞培养基包含非转铁蛋白结合铁。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和c)中使用的细胞培养基包含非转铁蛋白结合铁。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)、c)和d)中使用的细胞培养基包含非转铁蛋白结合铁。
在本发明的优选的实施方式中，在步骤a)中培养细胞至少1天而不亚培养所述细胞。在本发明的优选的实施方式中，在步骤a)中培养细胞至少2天而不亚培养所述细胞。在本发明的优选的实施方式中，在步骤a)中培养细胞至少3天而不亚培养所述细胞。
在本发明的优选的实施方式中，在步骤c)中培养细胞至少5天。在本发明的优选的实施方式中，在步骤c)中培养细胞至少10天。在本发明的优选的实施方式中，在步骤c)中培养细胞至少5天而不亚培养所述细胞。在本发明的优选的实施方式中，在步骤c)中培养细胞至少10天而不亚培养所述细胞。
在本发明的优选的实施方式中，在步骤d)中培养细胞至少3天。在本发明的优选的实施方式中，在步骤d)中培养细胞至少6天。
在本发明的优选的实施方式中，在步骤d)中培养细胞至少3天而不亚培养所述细胞。在本发明的优选的实施方式中，在步骤d)中培养细胞至少6天而不亚培养所述细胞。
在本发明的优选的实施方式中，在步骤c)和d)中总共培养细胞至少3天。在本发明的优选的实施方式中，在步骤c)和d)中总共培养细胞至少6天。
在本发明的优选的实施方式中，在步骤c)和d)中总共培养细胞至少3天而不亚培养所述细胞。在本发明的优选的实施方式中，在步骤c)和d)中总共培养细胞至少6天而不亚培养所述细胞。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的培养体积为0.1ml，更优选0.5ml，更优选3ml，更优选15ml，更优选100ml。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的培养体积为至少0.1ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的培养体积为至少0.5ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的培养体积为至少3ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的培养体积为约3ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的培养体积为至少15ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的培养体积为约15ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的培养体积为至少100ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的培养体积为约100ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的培养体积为至多1升。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中的培养体积为至多0.5升。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至多约5ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至多2ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至多约2ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至多约1ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至多450μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至多150μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至多100μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至多约100μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为30μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至多10μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至多约10μl。
在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至少1μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至少5μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至少约5μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至少约10μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至少100μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至少约100μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至少约0.5ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至少0.5ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中的培养体积为至少约1ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至多20μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至多60μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至多200μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至多600μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为1.8ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至多5ml。
在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至少1μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至少约1μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至少10μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至少约10μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至少50μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至少100μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至少300μl。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至少约1.5ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至少约3ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中的培养体积为至少3ml。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少50mg/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少200mg/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少1000mg/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少2000mg/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少5000mg/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至多50000mg/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少0.1mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少1mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少5mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少50mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少250mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至多2500mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少50mg/升的重组白蛋白和至少0.1mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少1000mg/升的重组白蛋白和至少1mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少2000mg/升的重组白蛋白和至少5mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基包含至少5000mg/升的重组白蛋白和至少50mg/升的重组转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中使用的细胞培养基包含小于5000mg/升的重组白蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中使用的细胞培养基包含小于50mg/升的重组转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中使用的细胞培养基包含小于5000mg/升的重组白蛋白和小于50mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中使用的细胞培养基包含小于2000mg/升的重组白蛋白和小于5mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中使用的细胞培养基包含小于50mg/升的重组白蛋白和小于0.1mg/升的重组转铁蛋白。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中使用的细胞培养基不含重组白蛋白并且不含重组转铁蛋白。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)中使用的细胞培养基是不含动物成分的培养基。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)中使用的细胞培养基是不含动物成分的培养基。在本发明的优选的实施方式中，步骤d)中使用的细胞培养基是不含动物成分的培养基。
在本发明的优选的实施方式中，步骤a)和c)中使用的细胞培养基是不含动物成分的培养基。在本发明的优选的实施方式中，步骤c)和d)中使用的细胞培养基是不含动物成分的培养基。在本发明的优选的实施方式中，步骤a)、c)和d)中使用的细胞培养基是不含动物成分的培养基。
在本发明的优选的实施方式中，使用的所有细胞培养基都是不含动物成分的培养基。在本发明的优选的实施方式中，在步骤b)中通过自动细胞分选系统减少细胞群。
在本发明的优选的实施方式中，在步骤b)中通过自动细胞分选系统分离单细胞。在本发明的优选的实施方式中，在步骤b)中通过FACS分离单细胞。
在本发明的优选的实施方式中，细胞群的细胞不含饲养细胞。
在本发明的优选的实施方式中，细胞群的细胞是真核细胞。在本发明的优选的实施方式中，细胞群的细胞是哺乳动物细胞。在本发明的优选的实施方式中，细胞群的细胞是人细胞。在本发明的优选的实施方式中，细胞群的细胞是动物细胞。在本发明的优选的实施方式中，细胞群的细胞不是人胚胎干细胞。
在本发明的优选的实施方式中，细胞群是细胞系。在本发明的优选的实施方式中，细胞群是CHO细胞系、NS0细胞系、Per.C6细胞系、HEK293细胞系或BHK细胞系。在本发明的优选的实施方式中，细胞群是CHO细胞系。在本发明的优选的实施方式中，细胞群是细胞系。在本发明的优选的实施方式中，细胞群是NS0细胞系。在本发明的优选的实施方式中，细胞群是细胞系。在本发明的优选的实施方式中，细胞群是Per.C6细胞系。在本发明的优选的实施方式中，细胞群是细胞系。在本发明的优选的实施方式中，细胞群是HEK293细胞系。在本发明的优选的实施方式中，细胞群是细胞系。在本发明的优选的实施方式中，细胞群是BHK细胞系。在本发明的优选的实施方式中，细胞群的细胞是原核细胞。
在优选的实施方式中，本发明还涉及含重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基用于培养细胞浓度小于约100个细胞/ml的细胞群的用途。在优选的实施方式中，本发明还涉及含重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基用于培养细胞浓度小于100个细胞/ml的细胞群的用途。
在优选的实施方式中，本发明还涉及含重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基用于培养单细胞的用途。
涉及本发明方法的优选实施方式也是优选用于本发明的用途的实施方式。
在优选的实施方式中，本发明还涉及在含重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基中培养的细胞浓度小于约100个细胞/ml的细胞群。
在优选的实施方式中，本发明还涉及在含重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基中培养的细胞浓度小于100个细胞/ml的细胞群。
在优选的实施方式中，本发明还涉及在含重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基中培养的单细胞。涉及本发明方法的优选的实施方式也是用于本发明的含重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基中培养的细胞群的优选实施方式。
本发明是含重组白蛋白和重组转铁蛋白的用于单细胞克隆的无血清培养基。利用已经适应在不含血清、生长因子、蛋白和蛋白胨的培养基中生长的CHO细胞系进行试验。所述培养基包含无机铁源。在该培养基中，细胞系在批饲养过程中细胞浓度达到3×107个细胞/ml。这证明了不依赖于血清和蛋白添加物的非常好的生长。然而，处于单细胞态的相同细胞在相同培养基中的克隆生长率非常低。
意外地，发明人发现通过添加重组蛋白能够显著增强细胞系的克隆生长。事实证明，与细胞群中的生长相比，当以单细胞态生长时细胞系对培养基具有不同的要求。本领域技术人员认为，不依赖于血清和蛋白生长的细胞系还应在无血清和蛋白的环境中克隆生长。发明人意外地发现，当以单细胞态培养和在细胞群中培养时，同一细胞系对培养基具有不同的要求。
因此，意外地仅必须在步骤c)中具有重组白蛋白和/或重组转铁蛋白。所述细胞在步骤c)前和后不需要(至少不需要高浓度的)重组白蛋白和/或重组转铁蛋白。
根据本发明，当需要克隆细胞生长时，将使细胞系与含重组白蛋白和重组转铁蛋白的培养基接触。显然，重组白蛋白和重组转铁蛋白对细胞具有协同作用。还分开测定了两种蛋白。它们均以低水平促进细胞增殖。当组合两种蛋白时，几乎以含血清对照培养物的水平或者甚至比含血清对照培养物高的水平显著提高单细胞的细胞生长和存活。
发明人进一步检测培养基的其它参数是否在提高克隆生长中也发挥作用。发明人意外地发现，单细胞在培养培养基重量摩尔渗透压浓度和培养基pH方面也具有不同的要求。当降低培养基的重量摩尔渗透压浓度时，甚至可以更加改善克隆生长。培养基的优选重量摩尔渗透压浓度为260-360mOsmol/kg H2O，更优选270-340mOsmol/kg H2O，更优选280-320mOsmol/kg H2O，更优选290-300mOsmol/kg H2O。当培养基的pH比通常的培养基低时，甚至可以更加改善克隆生长。优选的培养基的pH为6.7-7.3，更优选6.8-7.2，更优选6.8-7.0。
重组蛋白作为培养基添加物是昂贵的。因此，在培养基中省略重组蛋白是有意义的。根据本发明的优选实施方式，促进克隆生长的简单且更具成本效益的方式是在第一步中在含低浓度重组白蛋白和重组转铁蛋白的培养基中培养细胞或者在不含重组白蛋白和重组转铁蛋白的培养基中培养细胞。在第二步中，使细胞与含浓度比第一步中采用的浓度高的重组白蛋白和重组转铁蛋白的培养基接触细胞。在第三步中，可以在具有较低浓度的重组白蛋白和重组转铁蛋白的培养基中培养细胞或者可以完全省略重组白蛋白和重组转铁蛋白。实际上通过该过程，可以仅通过降低的细胞浓度而采用重组白蛋白和重组转铁蛋白，或在单细胞克隆步骤和在所有其它细胞培养步骤中可以省略昂贵的重组蛋白并且可以建立具有成本效益且简单的方法用于单细胞克隆。
本发明的方法的另一个主要优点是，可以在所有步骤在不含动物成分的培养基中培养细胞，这对于生产治疗性蛋白的监管部门具有重大优势。
术语“重组蛋白”指由被引入至宿主细胞的核酸编码的蛋白。所述宿主细胞表达所述核酸。本文使用的“蛋白”广义上指多聚氨基酸，例如肽、多肽、蛋白、脂蛋白、糖蛋白等。
术语“无血清培养基”或“无血清细胞培养基”是不含来自任何生物的血清(例如胎牛血清(FBS)、牛血清、马血清、山羊血清、人血清等)的培养基。
术语“细胞培养”或“培养”表示细胞保持在人工的体外环境中，然而应理解，术语“细胞培养”是上位概念并且可用于不仅涵盖个体细胞或仅单细胞或仅细胞群的培养，而且还涵盖组织或器官的培养，对此，术语“组织培养”或“器官培养”有时候可与术语“细胞培养”互换使用。
术语“接触”指将体外的待培养细胞置于含有所述细胞待培养于其中的培养基的培养瓶中。术语“接触”涵盖将细胞与培养基混合，将培养基移液至培养瓶中的细胞上，并将细胞浸没在培养基中。
术语“白蛋白”指作为包含在血浆中的丰富蛋白的蛋白，其促进血液中重量摩尔渗透压浓度的保持并且可能与养分结合以将这些物质传送至细胞。存在不同形式的白蛋白，例如但不限于人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、HSA的级分或部分、BSA的级分或部分。与培养基的重量摩尔渗透压浓度调节有关和与养分结合或养分转移至细胞有关，白蛋白可以是在细胞生长、细胞存活或细胞生产力方面产生基本类似的结果的其它任何蛋白或多肽。优选地，所述白蛋白是人来源的。最优选地，所述白蛋白是人血清白蛋白。甚至更优选地，所述白蛋白是重组产生的人血清白蛋白(“重组HSA”)。所述重组HSA可以在多种生物中产生，例如原核细胞或真核细胞，例如细菌、植物或酵母等。本领域已知在多种宿主，例如大肠杆菌(EP73646)和真菌细胞(WO0044772)中产生重组白蛋白。例如但不限于，所述重组白蛋白是Sigma(A7223)描述的人重组白蛋白。
术语“转铁蛋白”指具有铁结合或螯合能力的任何生物学化合物。转铁蛋白的实例包括但不限于具有铁亲和力，例如铁结合或螯合能力的任何蛋白、多肽或肽。转铁蛋白的其它实例包括但不限于与细胞转铁蛋白受体具有任何亲和力的蛋白、多肽或肽。这种蛋白、多肽或肽可以识别、部分结合或完全结合细胞转铁蛋白受体。可以用铁使转铁蛋白饱和或者不用铁使转铁蛋白饱和。如果不用铁使转铁蛋白饱和，则培养基可含无机铁。如果用铁使转铁蛋白饱和，则所述培养基可以不含无机铁或者所述培养基可以包含另外的无机铁。优选地，用铁使转铁蛋白饱和。更优选地，转铁蛋白是铁饱和的人转铁蛋白。
术语“重组转铁蛋白”是在任何生物中重组产生的转铁蛋白。所述重组转铁蛋白可以在多种生物，例如原核细胞或真核细胞中产生。重组转铁蛋白可以在细菌、植物、真菌或酵母中产生。优选的是重组产生的人转铁蛋白。例如但不限于，重组人转铁蛋白是在产品说明书中描述的来自Millipore(9701-10)的重组人转铁蛋白。
在尤其优选的实施方式中，本发明涉及培养基，其中所述培养基中包含的重组白蛋白的浓度为至少优选大于0.1g/升，至少优选大于0.2g/升，至少优选大于0.5g/升，至少优选大于1.0g/升，至少优选大于2g/升，或者在尤其优选的实施方式中，至少优选大于3g/升，或者在进一步尤其优选的实施方式中，至少优选大于5g/升。在进一步优选的实施方式中，本发明提供了上述培养基，其中所述重组转铁蛋白的浓度为至少优选大于0.1mg/升，至少优选大于1mg/升，至少优选大于2mg/升，至少优选大于4mg/升，至少优选大于6mg/升，至少优选大于8mg/升，至少优选大于10mg/升，至少优选大于20mg/升，至少优选大于50mg/升，至少优选大于200mg/升，或者在尤其优选的实施方式中，至少优选大于1000mg/升。
术语“不含动物成分”指其中不使用起源于动物或人的成分的培养基或细胞培养方法。
术语“足以支持单细胞生长”表示所述培养基能够支持单细胞的生长，但不要求所述培养基实际用于支持单细胞生长。所述培养基可适于单细胞的生长或者用于浓度小于100个细胞/ml的细胞群的生长或者用于细胞浓度大于100个细胞/ml的细胞群的生长。在能够持续克隆生长，即以非常低的细胞密度，例如小于约100个细胞/ml的密度生长的生长条件下，使本发明的培养基与包括单细胞的细胞群接触。
术语“细胞培养基”、“组织培养基”、“培养基”、“储备培养基”“克隆培养基”指用于培养细胞或组织的营养溶液，并且可以互换使用。培养基是适合培养或者适合温育一个细胞或数个细胞的介质。这种培养基可以包含用于保持细胞完整性或细胞活力或者细胞生长或者细胞生产力的养分。优选液体培养基。尤其优选的培养基描述在WO 2007/036291中并且可以用于本发明。尤其优选的培养基包含用于细胞生长、细胞活力和细胞生产力的所有必需物质。尤其优选的培养基可以包含，例如但不限于葡萄糖、氨基酸、盐、微量元素和脂肪酸。
哺乳动物细胞的细胞培养目前是科学教科书和手册中详细描述的常规操作。详细见于，例如R.lan Fresney，Culture of Animal cells，a manual，4thedition，Wiley-Liss/N.Y.，2000。与本发明的培养添加物组合使用的培养基和培养方法(例如用于哺乳动物细胞系)本身是本领域熟知的。这种培养基优选由溶剂(例如水)、碳源、氮源、氨基酸、pH调节剂、微量元素、脂肪酸、核苷酸组成。用于本发明的优选的培养基是标准的细胞培养基，其也可以适应特定细胞类型的需要，并且包括但不限于Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基、L-15培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′smodified Eagle′s medium，DMEM)、伊格尔最少必需培养基(MEM)、哈姆F12培养基(Ham′s F12medium)或伊思考夫改良DMEM。其它优选培养基是，例如特别设计用于CHO细胞培养的哈姆F10或F12培养基。用于本发明的其它优选的培养基特别适应于CHO细胞培养，并且描述在例如EP 0 481 791。用于本发明的优选的培养基还可以是可商购的培养基，例如但不限于CD CHO(Gibco，10743)、ProCHO5(BioWhittaker，BE 12-766Q)、HyQSFM4CHO(HyClone，SH30548.02)。
在本发明的进一步优选的实施方式中，所述培养基可以包含L-谷氨酰胺，谷氨酰胺可以完全或部分用谷氨酰胺替代物，例如GLUTAMAX(GIBCO Cat.Nr：35050-061)代替。在本发明的进一步优选的实施方式中，所述培养基可以包含低浓度的L-谷氨酰胺。L-谷氨酰胺的浓度可以最大为900mg/升，优选600mg/升，更优选300mg/升，更优选100mg/升，更优选50mg/升，更优选20mg/升。所述培养基可以不含L-谷氨酰胺。当培养基不含L-谷氨酰胺时，尤其适用于用谷氨酰胺合成酶选择基因转化的细胞。
在本发明的进一步优选的实施方式中，所述培养基包含至少一种碳水化合物来源。优选使用浓度为0-10g/升的葡萄糖。可以用其它碳水化合物，例如但不限于果糖、甘露糖、半乳糖完全或部分取代葡萄糖。
在本发明的进一步优选的实施方式中，所述培养基可以不含任何无机铁源和/或不含任何铁螯合化合物。
可选地，在一个实施方式中，本发明的优选的培养基还可以包含来自动物来源、来自植物来源或来自酵母的碳水化合物。优选来自植物来源的水解产物，例如大豆蛋白胨或酵母水解产物。
在特别优选的实施方式中，本发明的培养基不含血清。在特别优选的实施方式中，本发明的培养基不含直接或间接分离自动物来源的产物。在本发明的特别优选的实施方式中，所述培养基不含动物成分。在本发明的特别优选的实施方式中，所述培养基不含水解产物。
在本发明的进一步优选的实施方式中，所述培养基可以包含无机铁。
在本发明的进一步优选的实施方式中，所述培养基可以包含一种或多种铁螯合化合物。
术语“铁”意在表示原子量为55,845的过渡金属Fe。术语铁是上位概念，其包括含一种或多种铁离子(例如Fe3+和/或Fe2+离子)的所有分子。Fe3+和/或Fe2+离子可以以铁盐形式存在。铁盐可以水合和或脱水。在特别优选的实施方式中，所述铁源包含Fe(II)和/或Fe(III)离子。在特别优选的实施方式中，用于本发明中的铁源选自由以下组成的组：磷酸铁(III)、焦磷酸铁(III)、硝酸铁(III)、硫酸铁(II)、氯化铁(III)、乳酸铁(II)、柠檬酸铁(III)、柠檬酸铵铁(III)、右旋糖酐铁和乙二胺四乙酸铁钠盐或其水合或脱水形式。
铁还可以与另一种分子(例如载体或螯合剂)络合。用螯合剂的络合铁的一些特别优选的非限制性实例是乳酸亚铁(II)水合物、柠檬酸铁(III)、柠檬酸铵铁(III)、右旋糖酐铁和乙二胺四乙酸铁钠盐。所述铁还可以可选地与以下其它分子络合：例如US 6,048,728中描述的分子，即吡哆醛基异烟腙、柠檬酸盐、乙酰丙酮化物和多种其它有机酸，如苹果酸、琥珀酸、延胡索酸和α-酮戊二酸。用于本发明的另外的铁螯合剂示于WO 2001/016294中。
本发明不限于任何类型的细胞。细胞类型的实例包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌细胞和酵母细胞。所述细胞还可以是原代细胞或干细胞。所述细胞可以是没有被转化或转染的天然存在的细胞。所述细胞还可以是用一个或多个用于重组基因表达的载体转染或转化的重组细胞。可以用用于产生任何产物(例如病毒产物)的病毒转化所述细胞。所述细胞可以起源于仓鼠、小鼠、人或任何其它动物。所述细胞还可以是细胞系，例如但不限于CHO细胞、CHO K1细胞、CHO DUKX细胞、CHO DG44细胞、NS0细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞。
本发明的进一步优选的实施方式是从属权利要求的主题。
以下实施例和附图更详细地描述本发明。
图1显示在条件培养基和rHSA中克隆率的比较。
图2显示利用有或没有添加重组人转铁蛋白的重组人血清白蛋白的克隆率的比较。
图3显示了单独利用rHSA和rHTR和它们的组合的克隆率的比较。
图4显示了添加和没有添加重组人血清白蛋白的重组人转铁蛋白的滴定以及所产生的克隆率。
图5显示rHSA和rHTR的组合添加在促进FACS所沉积的单细胞的细胞生长中的作用。另外，这些结果表明了该培养基配方对不同CHO细胞系的有效性。
实施例
细胞
对于所有实验均使用以下三种CHO细胞系：
1)DHFR(二氢叶酸还原酶)缺陷型CHO DG44宿主细胞系(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.，1980，77：4216)。
2)由1)中提及的细胞系产生同时表达DHFR和重组单克隆抗体的转化CHODG44亚克隆(命名为clone23)。该克隆是通过用荷载有DHFR和IgG抗体基因的载体转化CHO DG44宿主细胞系而产生的。利用MTX在培养基中扩增转染子。
3)CHO K1宿主细胞系(Puck TT等，J.Exp.Med.，1958，108：945-956)。本发明采用的所有细胞都不要求培养基中具有用于生长和存活的任何蛋白。所有细胞系都不依赖于血清、蛋白、生长因子、水解产物、白蛋白和转铁蛋白而生长。
细胞培养条件
将用于单细胞克隆的储备培养细胞保持在摇瓶或旋转瓶中。以3×105个细胞/ml的细胞浓度将细胞接种在摇瓶中，并且在2-4天的生长期后每批细胞浓度达到5×105个细胞/ml至100×105个细胞/ml。每2-4天将储备培养物分至新鲜培养基中。这表示利用少量细胞培养物作为接种物并转移至新瓶中且补充有新鲜培养基。当细胞没有达到高浓度时，在分细胞的过程中对其离心。将细胞在培养箱中于37℃、7.5％CO2气氛下培养。以这种方式培养数代。将一代定义为2-4天的培养期。从处于指数生长期的这些储备培养物取出用于单细胞克隆实验的细胞。
培养基
储备培养基
在所述实验中使用两种不同的储备培养基。第一，具有未知配方的可商购储备培养基(CD CHO，Gibco，10743)，第二，具有以下特征的私有储备培养基：所述私有储备培养基含有用于细胞生长、细胞存活和细胞生产力的所有必需物质，例如但不限于葡萄糖、氨基酸、盐、微量元素和脂肪酸。所述私有储备培养基不含血清、蛋白、生长因子和蛋白胨。所述私有储备培养基不含动物成分。所述私有储备培养基包含用于为细胞补充铁的无机铁源。所述私有储备培养基不含重组白蛋白且不含重组转铁蛋白。所述私有储备培养基在使用前补充有6mM L-谷氨酰胺。所述私有培养基的重量摩尔渗透压浓度为330mOsmol/kg H2O，pH为7.2。
在不依赖于所采用的储备培养基的克隆培养基中促进克隆细胞生长，这证明所述储备培养基配方对于克隆细胞生长不起作用。
克隆培养基
采用两种不同的克隆培养基。第一，具有未知配方的可商购培养基(CDCHO，Gibco，10743)，第二，具有以下特征的私有克隆培养基：所述私有克隆培养基含有用于细胞生长、细胞存活和细胞生产力的所有必需物质，例如但不限于葡萄糖、氨基酸、盐、微量元素和脂肪酸。所述私有克隆培养基不含血清、蛋白、生长因子和和蛋白胨。所述私有克隆培养基不含动物成分。所述私有克隆培养基包含浓度为2mg/升的无机铁源磷酸铁(III)(Sigma，F1523)。所述私有克隆培养基不含重组白蛋白且不含重组转铁蛋白。所述私有克隆培养基在使用前补充有2mM L-谷氨酰胺。所述私有克隆培养基的重量摩尔渗透压浓度为290mOsmol/kg H2O，pH为6.9。
在两种克隆培养基中促进克隆细胞生长，这证明所述储备培养基配方对克隆细胞生长不起作用。然而，如下文所述，对克隆细胞生长重要的是创造性步骤，例如使用重组蛋白补充克隆培养基。
通过限制性稀释进行单细胞克隆
通过从大于3×105个细胞/ml的细胞密度至4个细胞/ml(＝0.6个细胞/150μl)的细胞密度稀释储备培养物的细胞悬浮液，进行人工限制性稀释(LD)。以1∶10的梯度将细胞稀释在克隆培养基中，在各补充克隆培养基中的最终稀释梯度为1∶20。以每孔0.6个细胞抽吸在每孔含150μl培养基的96-孔U底板中。数字0.6个细胞/孔是统计学上的接种细胞密度。实际上，当在接种后用显微镜监测培养板时，一些孔不含细胞而一些孔含2个或更多细胞。
通过FACS进行单细胞克隆
通过将每孔1个细胞直接分选至96-孔U底板中而进行通过FACS(荧光活化的细胞分选)的单细胞克隆(SCC)。已经向平板提供了每孔150μl克隆培养基。在细胞分选前，将具有培养基的平板在培养箱中温育。利用装备有自动化细胞沉积单元(ACDU)的(BD Biosciences)以单细胞分选模式进行FACS分选。
温育和评价
在进行SCC后，立即将平板转移至培养箱中(37℃，7.5％CO2)。通过肉眼和通过显微镜在单细胞接种后14天评价成功扩增的克隆数。结果用％克隆率表示。将各实验的100％克隆率设定为在补充有10％FBS(热灭活)的平行进行的阳性对照中生长的克隆数。由于当用于SCC时细胞不总是处于相同生长阶段，在不同实验之间具有克隆率的差异。然而，实验内部的差异并没有扭曲通过所述研究获得的整个观察结果。
实施例1：条件培养基和作为促进单细胞生长的培养基添加物的rHSA的比较
实验的目的是评价当以极低的细胞浓度(例如单细胞态)接种细胞培养物时，条件培养基或作为培养基中的添加物的重组人血清白蛋白是否能够促进细胞生长。
CHO Clone23细胞是通过材料和方法部分所描述的限制性稀释人工克隆的单细胞。对于每种培养基组合，均铺两个96孔板。按照以下进行实验：
阳性对照(FBS)：所述克隆培养基补充有10％的来自(10100-147)的热灭活合格胎牛血清(FBS)。这表示40ml克隆培养基补充有4ml FBS(100％储备溶液)。
条件培养基K1：由CHO-K1培养物制备条件培养基。将CHO-K1细胞成批培养在摇瓶中。通过两个离心步骤从CHO-K1细胞分离条件培养基。最初，在室温下以190×g离心细胞悬浮液3分钟。然后将上清转移至新瓶中，并在室温下以3000×g再次离心10分钟。随后，使通过0.2μm滤器(PALL)过滤培养基。利用50％所制备的条件培养基稀释新鲜的克隆培养基。这表示，使20ml新鲜克隆培养基与20ml条件培养基混合。
重组人血清白蛋白(rHSA)的添加：利用重组人血清白蛋白(rHSA)储备溶液补充所述克隆培养基至终浓度为2g/升。这表示，40ml新鲜克隆培养基补充有1.6ml rHSA的50g/升储备溶液(A7223)。
按照在材料和方法部分的描述温育平板并计数所产生的克隆。
结果证明(图1)条件培养基不足以支持克隆生长。rHSA支持克隆生长，但当与对照细胞比较时克隆率不足。
实施例2：添加或没有添加重组人转铁蛋白的重组人血清白蛋白的测试
实验的目的是评价是否可能通过添加重组人转铁蛋白而提高克隆率。
CHO Clone23细胞是通过材料和方法部分所描述的限制性稀释人工克隆的单细胞。对于每种培养基组合，均铺两个96孔板。按照以下进行实验：
阳性对照(FBS)：所述克隆培养基补充有10％的来自(10100-147)的热灭活的合格胎牛血清(FBS)。这表示40ml克隆培养基补充有4ml FBS(100％储备溶液)。
阴性对照(没有补充)：利用没有任何进一步补充的40ml纯克隆培养基。
重组人血清白蛋白(rHSA)的添加：利用重组人血清白蛋白(rHSA)补充所述新鲜的克隆培养基至终浓度为2g/升。这表示，40ml新鲜克隆培养基补充有1.6ml rHSA的50g/升储备溶液(A7223)。
重组人血清白蛋白和重组人转铁蛋白的添加(rHSA+rHTR)：利用重组人血清白蛋白(rHSA)补充所述新鲜的克隆培养基至终浓度为2g/升，并且用重组人转铁蛋白(rHTR)进一步补充至终浓度为5mg/升。这表示，40ml新鲜的克隆培养基补充有1.6ml rHSA的50g/升储备溶液和10μl rHTR的20g/升储备溶液((9701-10))。
按照在材料和方法部分的描述温育平板并计数所产生的克隆。
结果证明(图2)，没有任何补充(阴性对照)，没有看到克隆。当新鲜的克隆培养基补充至终浓度为2g/升rHSA时，生长的克隆为对照的约20％。意外地，当用rHSA和rHTR补充所述克隆培养基时，生长的克隆的数量提高至阳性对照的80％。有趣的是，在储备培养过程中，该实验中使用的CHOClone23细胞系培养在没有任何蛋白的培养基中。所述储备培养基包含无机铁源，并且在储备培养中的良好生长是细胞不依赖于蛋白的证据。数据表明，即使所述细胞在细胞群中不需要rHSA和rHTR，但在单细胞态其需要这些重组蛋白以更好生长。这些结果表明，高克隆生长可仅仅因为rHTR的添加。因此，有趣的是，观察到rHSA不影响rHTR的唯一添加(参见实施例3)。
实施例3：分别评价rHSA和rHTR的影响
实验的目的是分别和组合测试重组人血清白蛋白(rHSA)和重组人转铁蛋白(rHTR)以分别观察各蛋白的作用。进一步的目的是评价两种蛋白是否确实存在协同作用。
CHO Clone23细胞是通过材料和方法部分所描述的限制性稀释人工克隆的单细胞。对于每种培养基组合，均铺两个96孔板。按照以下进行实验：
阳性对照(FBS)：所述克隆培养基补充有10％的来自(10100-147)的热灭活的合格胎牛血清(FBS)。这表示40ml克隆培养基补充有4ml FBS(100％储备溶液)。
重组人血清白蛋白(rHSA)的添加：利用rHSA补充所述新鲜的克隆培养基至终浓度为2g/升。这表示，40ml新鲜克隆培养基补充有1.6ml rHSA的50g/升储备溶液(A7223)。
重组人转铁蛋白(rHTR)的添加利用重组人转铁蛋白(rHTR)补充所述新鲜克隆培养基至5mg/升的终浓度。这表示，40ml新鲜克隆培养基补充有10μl rHTR的20g/升储备溶液((9701-10))。
重组人血清白蛋白和重组人转铁蛋白的添加(rHSA+rHTR)：利用重组人血清白蛋白(rHSA)补充所述新鲜的克隆培养基至终浓度为2g/升，并且用重组人转铁蛋白(rHTR)进一步补充至终浓度为5mg/升。这表示，40ml新鲜的克隆培养基补充有1.6ml rHSA的50g/升储备溶液和10μl rHTR的20g/升储备溶液((9701-10))。
按照在材料和方法部分的描述温育平板并计数所产生的克隆。
结果证明(图3)，如果分开使用rHSA和rHTR，则其对克隆率没有改善或仅少量改善。意外地，当将两种蛋白组合在同一培养基中时，克隆率显著提高达含FBS培养基的90％。
实施例4：添加或没有添加重组人血清白蛋白的重组人转铁蛋白的滴定
实验的目的是两种蛋白的生长促进作用是否是浓度依赖性的。
Clone23细胞是通过如在材料和方法部分所描述的限制性稀释而人工克隆的单细胞。对于每种培养基组合，均铺两个96孔板。按照以下进行实验：
阳性对照(FBS)：所述克隆培养基补充有10％的来自(10100-147)的热灭活合格胎牛血清(FBS)。这表示40ml克隆培养基补充有4ml FBS(100％储备溶液)。
重组人转铁蛋白(rHTR)的添加：利用浓度提高的重组人转铁蛋白(rHTR)补充所述新鲜克隆培养基。通过加入rHTR的20g/升储备溶液((9701-10))至新鲜克隆培养基中，已经调整了rHTR的以下终浓度：5mg/升、50mg/升、100mg/升和200mg/升。
重组人转铁蛋白和重组人血清白蛋白的添加(rHTR+rHSA)：利用重组人血清白蛋白(rHSA)补充所述新鲜的克隆培养基至终浓度为2g/升。在所有这种实验中都将rHSA的浓度保持恒定。用各种量的重组人转铁蛋白(rHTR)进一步补充补充有rHSA的培养基。通过加入rHTR的20g/升储备溶液(9701-10)至新鲜克隆培养基中，已经调整了rHTR的以下终浓度：2g/升rHSA+5mg/升rHTR；2g/升rHSA+50mg/升rHTR；2g/升rHSA+100mg/升rHTR；2g/升rHSA+200mg/升rHTR。
按照在材料和方法部分的描述温育平板并计数所产生的克隆。
结果清楚地证明(图4)了两种蛋白的协同作用。rHTR单独不能促进细胞生长。在之前的试验中已经显示，仅rHSA促进细胞生长约达对照的20％。通过两种蛋白的组合可观察到最佳促细胞生长作用。有趣的是，非常低浓度(5mg/升)的rHTR足以实现细胞生长达对照培养物的90％。
实施例5：通过装备有自动细胞沉积单元的FACS利用不同CHO细胞系进行的单细胞克隆实验
实验的目的是测试重组人血清白蛋白(rHSA)和重组人转铁蛋白(rHTR)与不同的CHO细胞系组合。进一步的目的是评价当细胞为通过FACS克隆的单细胞并通过自动化单元沉积时，该培养基配方是否成功地扩增了这些细胞。
CHO Clone23、CHO K1和CHO DG44细胞是通过材料和方法部分所描述的FACS自动克隆的单细胞。对于每种培养基组合，均铺两个96孔板。按照以下进行实验：
阳性对照(FBS)：所述克隆培养基补充有10％的来自(10100-147)的热灭活的合格胎牛血清(FBS)。这表示40ml克隆培养基补充有4ml FBS(100％储备溶液)。
重组人血清白蛋白和重组人转铁蛋白的添加(rHSA+rHTR)：利用重组人血清白蛋白(rHSA)补充所述新鲜的克隆培养基至终浓度为2g/升，并且用重组人转铁蛋白(rHTR)进一步补充至终浓度为5mg/升。这表示，40ml新鲜的克隆培养基补充有1.6ml rHSA的50g/升储备溶液和10μl rHTR的20g/升储备溶液((9701-10))。
按照在材料和方法部分的描述温育平板并计数所产生的克隆。
结果证明rHSA和rHTR的组合添加在促进通过FACS沉积的单细胞的细胞生长中的作用(图5)。另外，这些结果表明了该培养基配方对不同CHO细胞系的有效性。由于CHO K1细胞的强健生长，当与CHO clone23或CHODG44细胞相比时，rHSA和rHTR的作用并不显著。显著地，当通过FACS接种细胞时，细胞在补充有rHSA和rHTR的培养基中的生长甚至优于通过限制性稀释人工接种生长的细胞。

Claims (9)

1.一种在无血清细胞培养基中培养单细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
a)在第一无血清细胞培养基中培养细胞浓度大于100个细胞/ml的哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞系的细胞是能够在不含动物成分的培养基中生长的细胞，其中当以大于100个细胞/ml的细胞浓度培养时，所述哺乳动物细胞系的细胞不需要重组转铁蛋白和/或重组白蛋白用于生长，其中所述第一无血清细胞培养基包含小于1g/升重组白蛋白，并且其中所述第一无血清细胞培养基包含至多0.5mg/升重组转铁蛋白；
b)从所述哺乳动物细胞系分离出单细胞；和
c)在第二无血清细胞培养基中培养所述单细胞，其中所述第二细胞培养基包含大于1g/升重组白蛋白和至少1mg/升重组转铁蛋白；
d)在第三无血清细胞培养基中培养所述细胞，所述第三无血清细胞培养基中重组转铁蛋白和重组白蛋白的浓度是步骤c)的所述细胞培养基中重组转铁蛋白和重组白蛋白的浓度的至多50％；
其中所述哺乳动物细胞系是CHO细胞系、NS0细胞系、Per.C6细胞系、HEK293细胞系或BHK细胞系，其中在步骤c)中培养所述细胞至少5天，在步骤d)中培养所述细胞至少3天。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞系的细胞是适应在不含动物成分的培养基中生长的细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述不含动物成分的培养基是不含蛋白的培养基。
4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤a)和/或步骤c)中使用的所述细胞培养基是不含动物成分的培养基。
5.如权利要求1所述的方法，其中，步骤d)的第三无血清细胞培养基不含重组转铁蛋白和重组白蛋白。
6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤a)和c)使用的所述细胞培养基包含浓度小于4mM的L-谷氨酰胺。
7.如权利要求1所述的方法，其中，步骤a)和c)中使用的所述细胞培养基包含非转铁蛋白结合铁。
8.如权利要求1所述的方法，其中，步骤c)中使用的所述细胞培养基包含至少2000mg/升重组白蛋白和至少5mg/升重组转铁蛋白。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞系是CHO细胞系。
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