JPH03201981A - 細胞培養用無血清培地の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、動物細胞の組織培養用培地、更に詳細には、
細胞の長期間培養が可能な、培地成分としてトランスフ
ェリンを含まない無血清培地で仝成分が加熱殺菌可能な
動物細胞培養用培地の調製方法に関する。

〔従来の技術〕

近年の細胞工学の進歩に伴い、細胞工学の基礎技術とし
ての細胞培養技術の重要性が増してきている。例えば、
遺伝子組替え技術を応用して構築された組替え動物細胞
による有用物質の産生、細胞融合技術を応用して作製さ
れたモノクローナル抗体の産生を目的とするハイブリド
ーマの培養等が行なわれている。また、従来ウィルスの
培養等においては動物の生体内が利用されていたがこれ
に代わり、継代培養細胞を利用したインビトロでの細胞
培養技術が利用されつつある。このように動物細胞を主
とする細胞の培養に関する研究が進められている。

一般にこのような細胞をインビトロで培養する場合には
、培地に動物の血清、例えば牛胎児血清を添加する必要
がある。しかしながら、これらの血清は、高価であるこ
と、原因不明のロフト差があって再現性のよい培養が得
られないこと、また、血清は極めて多種類の成分から戒
っているために、培養物から有用物質を分離する際にこ
れらの血清由来物質を除去することが非常に面倒でまた
困難であること等の問題点がある。

このような問題を解決すべく、近年これまで必須とされ
ていた血清成分を含まない、いわゆる無血清培地が開発
されている。これらの無血清培地は、これまで添加して
いた血清の代わりに、トランスフェリン、インシュリン
等のタンパク！成分を添加することによって細胞の培養
を可能とするものである（Ｂａｒｎｅｓ、Ｄ、ａｎｄ　
５ａｔｏ、Ｇ、Ｃｅ１ｌ、２２，６４９６５５、１９８
０）。

ところで、細胞を培養する際にはまず培地を無菌化しな
ければならない。この無菌化には加熱殺菌する方法と濾
過滅菌する方法がある。濾過滅菌法では通常０．２ない
し０．５μｍのポアサイズをもつフィルターを使うが、
この濾過法ではハタテリアより小さな微生物、例えば動
物細胞の培養において障害をもたらすことが知られてい
るマイコプラズマ、ウィルスなどは除去することが困難
である。

また、濾過滅菌は、フィルターを加圧または減圧下で行
わなければならず、フィルターの材料によっては、培地
の微量有効成分が吸着して失われたり、膜にかかる圧力
や材質の不均一性のために、微量の細菌が漏出すること
も希にみられるので、濾過滅菌して調製した培地は各種
の検定をしなければならない。特に大量細胞培養では上
記の問題点は深刻で、さらに膜や装置のランニングコス
トも大きくなる。一方、加熱殺菌法はマイコプラズマ、
ウィルス等も殺菌することができるが加熱によって特に
グルタミン等の一部アミノ酸とアルブミン、トランスフ
ェリン等のタンパク質が変性してしまう。

熱に不安定でかつ必須成分であるグルタ兆ンを熱安定物
質であるグルタミンペプチド（Ｘ−Ｇｌｎ）で代替した
、アルブミン、トランスフェリン以外の培地成分が加熱
殺菌可能な無血清培地は知られている（特開昭６１−２
７１９８５号公報）。−・方、無タンパク培地にするた
めに、トランスフェリンを鉄錯体で代替した無血清培地
も知られている（特開昭６３−１４１５８４号公報、特
開昭６３−２７９７８６号公報、矢部則次、組織培養、
１３．１３−１６．１９８７　）。鉄錯体を形成させる
キレート化剤としてはエチレンシア旦ン四酢酸、ニトリ
ロ酢酸等が用いられている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、上記のグルタミンペプチドを用いた無血
清培地の場合、培地の必須な構成成分であるアルブミン
、トランスフェリン等のタンパク質成分は熱に不安定で
あって加熱殺菌ができず、またこれ等の物質の存在が依
然として有用物質の分離精製の操作を煩雑にする原因と
なっていた。

一方、トランスフェリンを鉄錯体で代替した無血清培地
は有用物質の分離精製を容易にする点では改善されたが
、加熱殺菌の導入を意図してはいない。さらに、本発明
者らが検討したところ、鉄錯体を加熱殺菌して培地に添
加すると細胞の増殖？／＋。

が低下するという問題点が見出された。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、このような細胞培養技術における無血清
培養において、培地中の有効成分の無タンパク化、全成
分加熱殺菌可能培地を目標として研究を行った結果、鉄
錯体をｔＪ！溶液に溶かして加熱殺菌する手段を案出し
、これによって上記目的を達成することができた。すな
わち、熱不安定でかつ必須成分であるグルタミンの耐熱
安定代替物であるグルタミンペプチド含有培地を用いれ
ばトランスフェリン以外は加熱殺菌可能であるので、熱
不安定であるトランスフェリンの代替として鉄錯体を培
地の成分に添加する時、鉄錯体を糖溶液に溶解し、加熱
殺菌して添加することで、従来の無血清培地に用いられ
ていたトランスフェリンを添加することなしに細胞の増
殖、維持及び産生物である抗体等の生成の維持が可能と
なることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわら、本発明は、鉄錯体を糖を含む溶液に溶解し、
加熱殺菌してから添加することを特徴とする細胞培養用
培地の調製方法に関するものである。

本発明の方法が適用される鉄錯体はトランスフェリンの
代替物となりうるものであって例えばグリシルグリシン
（ＣＧ）鉄、ベータグリセロリン酸（βＧＰ）鉄、イミ
ノジ酢酸（ＩＤＡ）鉄等である。ＣＧ鉄とβＧＰ鉄が特
に好ましい。この鉄錯体はＧＧ、βＧＰ等のキレート化
剤と第２鉄塩例えば塩化第２鉄を水に溶解するだけで形
成される。

糖はグルコース、マンノース、ガラクトース等の単糖類
、等を挙げることができる。鉄錯体を加熱殺菌する際の
キレート化剤の濃度は０．１−１００ｍＭ、好ましくは
ｌｌ−２０１１Ｉが適当である。また、第２鉄塩の添加
量としては、０．１−２００μ服好ましくは５−５０μ
門程度の添加が適当である。キレート化剤及び第二鉄塩
の溶解に用いる糖液の濃度は０．００１−１０．０ｇ／
　Ｑ、特に０．０３−１．０ｇ／　４２の濃度が望まし
い。

加熱殺菌条件は細菌、ウィルス、マイコプラズマ等が完
全に死滅するまでであり、１１０〜１４０　”Ｃで１０
〜４０分間程度、特に１２０〜１３０”ｃで１５〜２０
分間程度が適当である。

加熱殺菌した鉄錯体を添加する他の培地構成成分として
は、タンパク質成分以外の物で、通常の細胞培養に必要
と考えられる有効成分の添加が必要である。そのような
例としては、栄養酸分としてピルビン酸ナトリウム、Ｌ
−グルタミン酸ナトリウム、エタノールアミン、ビタミ
ン類（例：Ｘ１００　Ｖｉｔａｍｉｎｓ　：　Ｆｌｏｗ
　Ｌａｂｏ、社製）、亜セレン酸などを添加した上で、
さらに基本的栄養源として必要な必須アミノ酸成分を含
む基礎培地を添加する。

本発明で使用する基礎培地は、−ｉ市販されているもの
、例えば、イーグルＭＥＭ培地、ハムＦ１２培地、ダル
ベツコ変法イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地また
はＡＳＦ１０４無血清培地等を用いることができ、これ
らの基礎培地は単独または２種以上の任意の割合の組合
せにより使用することが出来る。

尚、上記培地成分のうち、糖に関しては鉄錯体の加熱殺
菌の際に使用した分を減じることができる。

本発明の培地を用いての細胞の培養は、通常の動物細胞
培養の条件下で行うことによって良好な結果を得られ、
細胞の増殖状態等は、従来のトランスフェリンを含む無
血清培地を用いて細胞培養した場合と比較して、何等劣
る事なく、また細胞の物質（抗体等）産生においても何
等問題はない。

本発明の培地は、浮遊性細胞の培養または付着性細胞の
培養のいずれにも用いることができ、動物由来の各種の
細胞の培養が可能である。そのような細胞としては、例
えば、ミエローマ細胞と融合して作製されたモノクロー
ナル抗体産生能を有する融合細胞（ハイブリドーマ）、
またはＢＡＬＬｌ、ＷＩＳＩＩ、ＨｅＬａ、　Ｘ５６２
等のヒト及び動物細胞が挙げられる。

以下、本発明を実施例に基づいて説明する。

実施例１ 表１に示す主剤成分ＩＩ！分、表２に示す緩衝剤成分１
１分を各々別々に蒸留水５００−に溶解し、１２０°Ｃ
ｌ２Ｏ分間オートクレーブし、放冷後混合して１１とし
てトランスフェリンを除去した基本培地（＾５Ｆ１０４
７ｆ−）　　とシタ。

表１　主剤成分 Ｌ−アルギニン塩酸塩 グリシン Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン グリシル−Ｌ−グルタミン Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（−水塩） Ｌ−イソロイシン Ｌ−ロイシン Ｌ−リジン塩酸塩 Ｌ−メチオニン Ｌ−フェニルアラニン ｍｇ／１ ２００．０ ３０．０ ｓｏｏ、。

５００．０ ４２．０ １０４．８ １０４．８ １４６．２ ３０．０ ６６．０ Ｌ−セリン Ｌ−スレオニン Ｌ−）リプトファン Ｌ−チロシン Ｌ−バリン Ｌ−アラニン Ｌ−アスパラギン（−水塩） Ｌ−アスパラギン酸 Ｌ−システィン塩酸塩（−水塩） Ｌ−グルタミン酸ナトリウム Ｌ−プロリン Ｌ−オルニチン グルコース マンノース ガラクトース コハク酸 コハク酸ナトリウム ピルビン酸ナトリウム ピオチン フォルニンク酸 ８０．０ ９５．２ ２５．０ ６４．０ ９３．６ ２０．０ ５６．０ ２０．０ ７０．０ ２０．０ ２０．０ １００．０ ２０００．０ ５００．０ ２００．０ １０６．０ ２７．０ ２２０．０ ０．２ ０．０１ ｉ−イノシトール アスコルビン酸ナトリウム ビタミンＢ１２ ａ−サイクロデキストリ ａ−サイクロデキストリ グルタチオン プトレッシンニ塩酸塩 ヒボキサンチン ウリジン チ旦ジン デオキシシチジン デオキシアデノシン ６．８ジハイドロオキシプυ 重酒石酸コリン 葉酸 ニコチン酸アミド パントテン酸カルシウＪ２ ピリドキサール塩酸塩 リボフラピン ヂアミン塩酸塩 ２０．０ ５．０ ０．１ ン・リノール酸　１０．０ ン　　　　　　　　　　　２２００．０１．０ ０．３ ２．０ ５．０ ０．２ ０．０３ １．０ ン　　　　　　　　　　　　０．３ ７．２ ４．０ ４．０ ４．０ ４．０ ０．４ ４．０ 塩化ナトリウム 塩化カリウム 塩化カルシウム（無水） 硫酸マグネシウム リン酸二水素ナトリウム（三水塩） 硝酸第二鉄（入水塩） 硫酸銅（五本塩） 硫酸亜鉛（上水塩） 亜セレン酸ナトリウム 結晶インシュリン ホスホエタノールアミン コレステロール 硫酸カナマイシン フェノールレッド 表２　緩衝剤成分 β−グリセロリン酸二ナトリウム ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ 重曹 ６４００．０ ４００．０ ２００．０ ９７．７ １２５．０ ０．１ ０．００１ ０．０１ ０．００４ ５．０ ２８．０ ０．１ Ｇｏ、０ ５．０ ｍｇ／１ １５００．０ １２００．０ １８００．０ 表３に示す鉄錯体を鉄として２ｍＭになるようにＩｊ！
溶液（グルコース１．０　ｇ／　ｌ　）又は水に溶解し
、０．２２μｍのポアサイズのフィルターによる濾過滅
菌、または１２０’Ｃ，２０分間オートクレーブ殺菌し
たものを夫々ＡＳＦＩ０４　Ｔｆ−に対し１／１００量
添加した。この培地にＩＦ７細胞（マウスハイブリドー
マ細胞）をＩ　Ｘｌ０５（Ｃｅｌｌｓ／ｍｆｆ１）の初
発密度に播種し、５％ＣＯ，，３７°Ｃ下で５日間培養
した。

培養後の細胞密度をエオシンＹ染色法と血球計算盤にて
生細胞密度を計測し、トランスフェリンを濾過滅菌して
八５Ｆ１０４　Ｔｆ−に添加（５＋ａｇ＃りした培地と
、通常の濾過滅菌にて調製した１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭ
１１６４０培地及び処方どうり調製したＡＳＦ１０４培
地を対照培地として用いて、細胞の増殖状態を比較した
。

結果を表３に示す。

ＧＧ；ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ　　　βＧＰ；β−
ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅＥＤＴＡ；ｅｔｈｙ
ｌｅｎｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉ
ｄＩＤＡ；１ｍ１ｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ　　ａｃｉｄ表
３に示すように鉄錯体は、水に溶解し、濾過滅菌してＡ
ＳＦ１０４　Ｔｆ−に添加した場合では、良好な細胞増
殖が認められたが、これを加熱殺菌してＡＳＦ１０４　
Ｔｆ−に添加した場合は、細胞の増殖は低下した。しか
し鉄錯体を糖液（グルコース）に溶解して、加熱殺菌し
てＡＳＦ１０４　Ｔｆ−に添加することによって良好な
細胞増殖が得られた。

実施例２ 実施例１と同様に調製したＡＳＦ１０４　Ｔｆ−にＧＧ
とβＧＰを夫々ＩＭ混合したものに、塩化第２鉄を最終
濃度が表４に示す濃度になるように加えた。１２０°Ｃ
ｌ２Ｏ分間オートクレーブした後、夫々を＾５Ｆ１０４
７ｆに対してｌ　／１００１添加した培地で、ＩＦ７細
胞を培養した。

培養法、培養後の生細胞数の計測は、実施例１と同様に
行った。

結果を表４に示す。

表４ 実施例３ 実施例１に示すＡＳＦ１０４　Ｔｆ−を調製した。これ
に塩化第２鉄の濃度を１ｍＭとし、ＧＧおよびβＧＰそ
れぞれを最終培地濃度が表５に示すようになるように加
えて１２０°Ｃ２２０分間オートクレーブした。ＡＳＦ
Ｉ０４　Ｔｆ−ニ対し１　／１００！添加して、ＩＦ７
細胞の培養を行った。細胞の培養法、培養後の生細胞数
の計測は、実施例１と同様に行った。

結果を表５に示す。

表５ 表６ １０．０ ８．８ 実施例４ ＧＧとβＧＰそれぞれＩＭおよび塩化第２鉄を２１１１
Ｍになるように表６に示す濃度のマンノース液番こ溶解
し、１２０°Ｃｌ２Ｏ分間オートクレーブした。実施例
１と同様に調製したＡＳＦ１０４　Ｔｆ−に対して各々
を１７１００量添加し、ＩＦ７細胞を培養した。

培養法、生細胞数の計測は、実施例１と同様に行った・ 結果を表６に示す。

実施例５ ＧＧとβＧＰをそれぞれがＩＭおよび塩化第２鉄を２１
１ＩＭになるように、グルコース、マンノース、ガラク
トースの各１ｇ／ｆｆｉの液に溶解して、１２０°Ｃｌ
２Ｏ分間オートクレーブした。

実施例１に示したＡＳＦ１０４　Ｔｆ−に対して夫々１
／１００量を添加した培地にＢＡＬＬ−１細胞を３　Ｘ
ＩＯ’（Ｃｅｌｌｓ／ＩＩｔｌ）の初発密度で播種し、
５％ＣＯ，，３７゛Ｃ下で５日間培養し細胞の増殖性、
抗体の産生能をＡＳＦＩＯ４およびｌＯ％ＦＢＳ添加Ｒ
ＰＭ１１６４０培地と比較した。

培養後の生細胞数は実施例１と同様に測定した。

また抗体（ＩｇＭ）量の測定は酵素免疫測定法（ＥＬＩ
ＳＡ）で行った。

結果を表７に示す。

表７ 実施例６ 実施例１に示したＡＳＦ１０４　Ｔｆ−に、ＧＧとβＧ
ＰをそれぞれＩＭおよび塩化第２鉄を２ｎ＋Ｍになるよ
うに１　ｇ／　１濃度マンノース溶液に溶解し、１２０
°Ｃｌ２Ｏ分間、オートクレーブした。ＡＳＦ１０４　
Ｔｆ−に対して各々１　／１００ｆ！添加し、全成分加
熱殺菌無血清培地を調製した。

上記培地を用いて、ＩＦ７、Ｋ５６２、ＵＭＣＬ、　Ｂ
ＡＬＬｌの浮遊細胞および付着性細胞の−ＩＳＨ１Ｉｔ
　ｅ　Ｌ　ａ細胞の増殖性を、ＡＳＦ１０４．１０％Ｆ
ＢＳ添加ＲＰＭ１１６４０培地１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭ
培地と比較した。

１Ｆ７細胞はＩ　ＸＩＯ’（Ｃｅｌｌｓ／Ｉｄ）、Ｋ５
６２細胞、ＵＭＣＬ細胞は２　ＸＩＯ’（Ｃｅｌｌｓ／
ａｆｆｉ）、ＢＡＬＬ−１細胞は３×１０’（Ｃｅｌｌ
ｓ／５ｆｆｉ）の初発播種密度で５日間、ＷＩＳＨ細胞
、１ＩｅＬａ細胞はコラーゲンコートデイツシュ（コニ
ング社製）を用いて２　ＸＩＯ’（Ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓ
ｈ）の初発播種密度で４日間、５％ＣＯ□、３７°Ｃ下
で培養した。

培養後の生細胞密度の測定を、ＩＦ７、Ｋ５６２、ＵＭ
ＣＬおよびＢＡＬＬ−１細胞は、実施例１と同様に行っ
た。

またＷＩＳＨ１ｔ！ｅＬａ細胞の場合は、０．０７５％
トリプシン液を用いて、細胞を分散し、細胞数を血球計
算盤を用いて測定した。

結果を表８、表９に示す。

表８ 表９ ＸＩＯＳ／ｄｉｓｈ　　　　Ｘｌ０Ｓ／ｄｉｓｈプラズ
マやウィルスの汚染防止が可能である。また培地全成分
を加熱殺菌することで無菌管理がしやすくなる。従来は
トランスフェリンを加熱殺菌できないため濾過滅菌や煩
雑な放射線照射による殺菌を行なっていたが本発明法で
は簡単な殺菌法で代替することができる。また、有用物
質の分離精製における操作が簡便となる点にある。さら
に、このような技術面での利点に加えて、培地のコスト
面おいても大きく低減することが可能である。

〔発明の効果〕

鉄錯体を糖溶液に溶かして加熱殺菌しこれを添加するこ
とによって従来の無血清培地に必須とされていた熱に不
安定なトランスフェリンを添加することなしに全成分加
熱殺菌した培地で培養したい細胞をこれまでと同様に培
養することが可能となる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 鉄錯体と糖を含む溶液を加熱殺菌してから添加すること
   を特徴とする細胞培養用培地の調製方法