JPS63267269A

JPS63267269A - 細胞培養のための基礎栄養培地

Info

Publication number: JPS63267269A
Application number: JP63067456A
Authority: JP
Inventors: リチヤード・エイ・ウルフ
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co
Priority date: 1987-03-24
Filing date: 1988-03-23
Publication date: 1988-11-04
Also published as: EP0283942B1; EP0283942A3; EP0283942A2; DE3871206D1; US5232848A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、一般に、哺乳動物の細胞の生体外培養のだめ
の培地に関する。さらに詳しくは、本発明は、血清不含
培養のだめの、あるいは低いレベルの血清を補充したと
きの培養のための、規定された基礎栄養培地である。血
清不合培養のため、規定された蛋白質を基礎栄養培地に
添加する。この培地は、広範な種類の細胞系および細胞
のタイプの高いまたは低い密度の培養において使用する
とき、非常に有効である。

生体外培養のため、培地は、もちろん、細胞にすべての
必須栄養を供給しなくてはならない：ビタミン、アミノ
酸、脂質、核酸前駆体、炭水化物、微量元素、およびバ
ルクイオン（ｂｕｌｋ　　１ｏｎ）。

歴史的には、基礎栄養培地は、生物学的抽出物、例えば
、血清または肝油出物を補充した後はじめて、細胞の生
長を支持するように案出された。血清は、とくに、有効
な補充物質であることが証明された。なぜなら、多分、
それは生理学的に許容されうる濃度で必要な生長促進因
子および増殖促進因子を含有するからである。このタイ
プの基礎栄養培地の例は、次の通りである：イーグルの
基礎培地（ＢＭＥ）　、その組成は米国特許第３．４５
０．５９８号［ウェルシュ（Ｗｅｌｓｈ）ら］に記載さ
れている、およびダルベツコの編成イーグル（ＤＭＥ）
培地、その組成はハム（Ｈａｍ）ら、「培地および生長
の要件（Ｍ　ｅｄｉａ　　ａｎｄ　　Ｇ　ｒｏｗｔｈＲ
ｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）　Ｊ　、酵素学における方法
（Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ　、
　）、（１９７８）、の表ＩＴに記載されている。ＤＭ
Ｅ倍地は、比較的高い濃度の必須アミノ酸および糖を含
有し、血清を補充した細胞の大量培養のために配合され
た、商業的入手可能な培地の代表である。

細胞培養技術中の生長のソフィスティケーションを用い
ると、血清または他の生物学的抽出中に存在する因子が
同定された。細胞の生長および増殖のために必要な規定
された蛋白質を基礎栄養培地に補充することによって、
血清不合環境において哺乳動物の細胞を生長させること
が、現在、可能である。例えば、ハムのＦ１２倍地培地
ローナル蛋白質不合生長のために配合された。Ｆ１２の
組成はハム（Ｈａｍ）ら上の参考文献の表ＩＩに記載さ
れており、このＦ１２は低濃度の必須アミノ酸および糖
を含有し、そして脂質、核酸誘導体、ビタミンおよび非
必須アミノ酸を含む。

低い血清濃度における細胞の大量培養のだめの、容易に
得られかつ十分に複雑な基礎栄養培地は、ＤＭＥおよび
Ｆ１２を混合することによって調製できることは、現在
一般に受入れられている。このような混合物は、また、
多くの細胞のタイプの血清不合生長を支持することがで
きる。バーネス（Ｂ　ｅｒｎｓｅ）ら、［血清不合培地
において培養した細胞の生長の生長の方法（Ｍ　ｅｔｈ
ｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｇ　ｒｏｗｔｈ　　ｏｆ　　Ｃｕ
１ｔｕｒｅｄ　　Ｃｅ１ｌｓ　　ｉｎ　　Ｓｅｒｕｍ−
Ｆｒｅｅ　　Ｍｅｄｉｕｍ）　Ｊ　、アナリティカル・
バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　）　、Ｖｏｌ、　　ｌ　Ｏ２，２５５−７０ページ
（１９８０）、は両者のアプローチの例を記載している
。

いくつかの商業的に入手可能な栄養培地は、ＤＭＥ、Ｆ
１２および／または他の培地、例えば、ハム（Ｈａｍ）
ら上の参考文献の表ＩＩに記載されている混合物に基づ
く。しかしながら、現存する商用培地の簡単な混合物は
すべての細胞系を培養するためにはまったく最適ではな
く、それゆえ培地の調製は大抵特定の細胞系または細胞
のタイプを目標としてきている。ウォルフェ（Ｗｏｌｆ
ｅ）ら、「血清不合培地中のクツｌ−Ｃ６膠腫の連続的
培養（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｓ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　ｏｆ
　　Ｒａｔ　　Ｃ５Ｇｌｉｏｍａ　　ｉｎ　　Ｓｅｒｍ
−Ｆｒｅｅ　　Ｍｅｄｉｕｍ）　Ｊ　、ジャーナル・オ
ブ・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ、
　）　、Ｖｏｌ、　８７．４３４−４２ページ（１９８
０）は、微量元素が補充されおよびさらに次の規定され
た蛋白質を補充された、３：１のＤＭＥ対Ｆ１２混合物
の使用を教示している：インスリン、トランス７エリ、
線維芽細胞の生長因子、脂肪酸不合ウシ血清アルブミン
に対して錯化したリノール酸、および血清拡張因子（ｓ
ｅｒｕｍ　−ｓｐｒｅａｄｉｎｇ　　ｆａｃｔｏｒ）　
　（ビトロネクチン）。

生物学的物質（例えば、モノクローナル抗体および遺伝
子操作された蛋白質）を生産するために、培養した哺乳
動物細胞を使用することが増加し、化学的に規定された
血清不合培地の要求が増加している。所望の細胞産生物
の精製は、少なくとも数１００の異なる蛋白質を含有し
うる血清の存在によって、大きく複雑である。したがっ
て、培地の蛋白質含量をわずかの規定された化合物に減
少し、これらからモノクローナル抗体または他の細胞産
生物をいっそう容易に分離できるようにすることが望ま
しい。

必要な栄養および蛋白質の因子に加えて、培地はｐＨレ
ベルを調節するための手段をもたなくてはならない。よ
り典型的には、ｐＨの調節は重炭酸塩／二酸化炭素の系
に頼り、これは二酸化炭素の調整剤ならびに培養物に一
定レベルの二酸化炭素を供給するためのインキュベータ
ーを必要とする。この系の緩衝化容量は、生物適合性有
機緩衝化剤、例えば、α−グリセロールホスフェートま
たはＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）を含めることによっ
て拡張できる。扱いにくい重炭酸塩／二酸化炭素の系の
代わりのものが提案されてきたが、この分野において有
意に受入れなかった。参照、例えば、レイポビッツ（Ｌ
　ｅｉｂｏｖｉｔｔｚ）、［大気との遊離ガス交換にお
ける組繊細胞の培養物の生長および維持（Ｔ　ｈｅ　　
Ｇ　ｒｏｗｔｈ　　ａｎｄ　　Ｍ　ａｉｔｅｎａｎｃｅ
　　ｏｆ　　Ｔｉ５ｓｕｒｅ−Ｃｅｌｌ　　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　　ｉｎ　　ＧａｓＥｘｃｈａｎｇｅ　　ｗｉｔｈ
　　ｔｈｅ　　Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）　、　Ａｍ。

Ｊ、　　Ｈｙｇｉｅｎｅ、　ＶＯｌ、　７８．１７３−
８０ページ（１９６３）、これは遊離の基本アミノ酸を
使用し、そしてグルコースの代わりにＤ（＋）ガラクト
ース、ピルヒン酸ナトリウムおよびＤＬ−α−アラニン
を使用する培地（Ｌ−１５）を開示している。Ｌ−１５
倍培地大気との遊離ガスの交換において使用できると考
えられる。

本発明の基礎栄養培地は、規定される蛋白質因子または
非常に低いレベルの血清を補充するときにおける、高い
または低い密度の哺乳動物細胞の培養のために案出され
た。この培地は空気の平衡化を利用する緩衝系を含有す
る。

本発明の主目的は、哺乳動物細胞の高い密度の培養に遊
離でありかつ血清の不存在下にあるいは低い濃度の血清
の存在下に、このような培養を支持する、化学的に規定
された培地を提供することである。１つの重要な意図す
る利益は、血清中に存在する生長阻害剤の濃度の減少で
ある。さらに、培地に低いレベルの外因性蛋白質を供給
することによって、所望細胞産生物の回収および精製が
促進されることである。

より特定の目的は、ハイブリドーマ細胞による免疫グロ
ブリンの高い生成と適合するナトリウム／カリウム比お
よび合計のモル浸透圧濃度（ｏｓｍ。

１ａｒｉｔｙ）を有する培地を案出することである。ま
た、培地が免疫グロブリンと同時精製するポリペプチド
を含まないことを意図する。本発明の目標は、培養物か
ら回収される細胞産生物の純度を顕著に改良することで
ある。

追加の目標は、中空繊維のバイオリアクター（ｂｉｏｒ
ｅａｃｔｏｒ）中の使用にとくによく適した細胞培地を
提供することである。この目標を達成するため、培地の
処方は培養した細胞へ悪影響を与えるために十分なモル
浸透圧濃度の変化を回避または減少することを意図する
。

他の目的は、高い細胞密度に適するが、低い密度の培養
を阻害しないレベルで栄養を有する培地を案出すること
である。低い密度から高い密度の培養条件に移行すると
き、培地の交換を排除し、ならびに血清補充培地から血
清不含培地細胞を「ウィーニング（ｗｅａｎｉｎｇ）　
Ｊすることの必要性を減少または排除することを意図す
る。

本発明のなお他の目的は、広範な種類の細胞のタイプま
たは源の培養に適する、基礎栄養培地を案出することで
ある。この培地はヒト細胞のクローナル生長に適合する
ことを意図する。

なお他の重要な目的は、空気と二酸化炭素との混合物で
はなく、空気との平衡化のために配合される緩衝系をも
つ培地を提供することである。

ここに記載する基礎栄養培地は、高い細胞密度および低
い細胞密度の両者の培養に適する、栄養物質および他の
成分の完全に新規な配合物である。

培地は、生体外哺乳動物細胞の培養のための万能栄養培
地として機能するために、適当なレベルの必須アミノ酸
および非必須アミノ酸およびアミノ酸誘導体、バルクイ
オンおよび微量元素、緩衝剤、ビタミン、補酵素、炭水
化物および誘導体、核酸誘導体および脂質からなる。基
礎培地は、規定された蛋白質で、あるいは低いレベルの
血清または他の生物学的抽出物で補充されるように案出
されている。こ・の培地の緩衝系は、空気平衡化された
ｐＨ調節を可能とするように特別に配合されている。

栄養培地を、特定の用途のために、あるいは特定の細胞
系または細胞のタイプの生長のための個々に案出するの
は典型的である。高い細胞密度のための先行技術の配合
物は、低い細胞密度の培養に対して大きい障害である、
ある種の成分を高い濃度で含有することが頻繁に発見さ
れる。さらに、多くの先行の培地は１つの細胞系のため
に特別に配合されており、そしてその細胞系のみに最適
である濃度の成分を含有する。先行技術の培地または培
地の組み合わせは、ここに記載する培地の成分のすべて
を含有せず、また個々の成分は先行技術の培地と同一濃
度で使用されていない。

ここに記載する培地は万能基礎栄養培地である。

それは低い細胞密度および高い細胞密度の両者の培養を
効果的に支持することが立証された。それは種々の細胞
系および細胞のタイプが必要とする栄養成分を供給する
ことが立証された。この培地は、とくに、種々の生産モ
ード、例えば、中空繊維のバイオリアクター、発酵器、
スピンナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ　　ｆｌａｓｋ）
およびローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ　　ｂｏｔｌｅ）
におけるモノクローナル抗体の生産によく適する。培地
を規定された蛋白質（すなわち、ホルモンおよび生長因
子）で、あるいは低いレベルの血清で補充するとき、高
い純度の細胞産生物、例えば、モノクローナル抗体を容
易に回収できる。

細胞の生長に必須な主要栄養成分および他の因子の大分
部分は、既知であり、そして多くの組み合わせおよび配
合で従来使用されてきている。しかしながら、成分の濃
度は、本発明の栄養培地のための新しく配合された。成
分は、この分野において普通に実施されているように、
１つの特定の細胞系または生産条件の組に対して単に最
適化されていない。むしろ、成分は万能培地において生
長因子および増強剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）の相互の関係
をもった組として最適化されている。さらに、ｐＨ調節
系は先行技術の培地と劇的に異なる。

ここに記載かつ下表に列挙する成分は、培地の生産の分
野において普通の物理的およびイオン化の状態で与えら
れている。しかしながら、他の物理的状態および／また
はイオン化状態を、必要に応じて、使用できる。ＨＥＰ
ＥＳおよび水酸化ナトリウムを除外した、成分のいずれ
の濃度も、モル浸透圧濃度、ｐＨおよびナトリウム対カ
リウムの比がここに記載する範囲内にあるかぎり、下表
に記載するものから２桁程度に多く変化させることがで
きる。ＨＥＰＥＳの濃度は約１５．０〜約２８．０ミリ
モルの範囲であることができる。使用するＮａＯＨの量
は選択するｐＨの関数である。

ＣａＣＱｚ・２Ｈ２Ｏ１４７２Ｏ２ｌｘ　１０−’　　
　１４７−０２ＣｕＳＯ＝”５ＴｏＯ２４９，６８３ｘ
　１０−’　　　０．０００７４９ＦｅＳＯ４４ＨｘＯ
２７８２Ｏ２ｌｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　０．２７８Ｆｅ
（ＮＯｓ）ｓ”９Ｈｚｏ　　　　　４０４．０２　　　
　２Ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　０．０８０８ＫＣＱ７４．
５５　　　　　４Ｘ　１０−”　　　　２９８．２Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２０２４６，３８ｂｘ　１０鴫　　　　１
９７．ＩＮａＣＱ５８．４４　　　　　１．０５Ｘ　Ｉ
　Ｏ−’　　　６１３６．２ＮａｚＨＰＯａ・７Ｈ２０
２６８，１３ｘ　１０−’　　　　８０．４３ＮａＨ２
ＰＯ４−２Ｈ２０１５６２Ｏ１６Ｘ　１０−’　　　　
９３．６０６Ｎａ２ＳｅＯｓ・５ＨｔＯ２６３２Ｏ１３
ｘ　１０−’　　　　０．００７８９ＮａｚＳｉ０３−
ｑｎ２ｏ　　　　　２８４．２　　　　　１　Ｘ　Ｉ　
Ｏ−”　　　　２−２−８４２（ＮＨ４）６．Ｏｚｎ・
４Ｈ２０１２３５，９３ｘ　１０″″’　　　　０．０
０３７１ＮＨ４ＶＯ３１１６，９９５ｘ　１０−”　　
　　０．００００５８５ＮｉＳＯａ・６Ｈ２Ｏ２６２，
８０３Ｘ　１０−”’　　　０．００００７８８ｚｎｓ
ｏ、−７ｕ、ｏ　　　　　　２８７．５４　　　　８ｘ
　１０−’　　　　０．２３必須アミノ酸Ｌ−Ａｒｇ　　　　　　　　　２１０．７　　　　３ｘ
　ｌ　Ｏ−’　　　　１６８．５６Ｌ−Ｃｙｓ　ＨＣＱ
、　ＮＨ０１７５，６３Ｘ　Ｉ　Ｏ−’　　　　５２．
６８Ｌ−Ｇｌｎ　　　　　　　　　１４６．１　　　　
５ｘ　１０−’　　　　７３０．５Ｌ−Ｈ４ｓ　ＨＣｆ
ｆ　、　Ｈ２Ｏ２０９，７２Ｘ　１０−’　　　　４１
．９４Ｌ−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｐｒｏ’　　　　１３１．
１３　　　　１　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’　　　　１３．１１３
Ｌ−１１ｅ　　　　　　　　　１３１．２　　　　６Ｘ
　Ｉ　Ｏ−’　　　　７８．７２Ｌ−Ｌｅｕ　　　　　
　　　　１３１．２　　　　　１３ｘ　Ｉ　Ｏ−’　　
　　７８．７２Ｌ−Ｌｙｓ　ＨＣＱ１８２．７　　　　
３ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　１４６．１６Ｌ−Ｍｅｔ　　
　　　　　　　　１４９．２　　　　　　ｌｘ　１０−
３１４９．２Ｌ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　１６５．２
　　　　　３ｘ　ｌ　Ｏ″″’　　　　４９．５６Ｌ−
Ｔｈｒ　　　　　　　　　１１９．１　　　　　５ｘ　
ｌ　Ｏ−’　　　　７ｌ−４６Ｌ−Ｔｒｐ　　　　　　
　　　２０４．２　　　　　５ｘ　１０−’　　　　１
２．２５２Ｌ−Ｔｙｒ（ジＮａつ２Ｈ２０２３７，２３
Ｘ　１０−’　　　　７１．１６Ｌ−Ｖａｌ　　　　　
　　　　ｌ１７．２　　　　　６ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　
　７０．３２Ｌ−Ａｌａ　　　　　　　　　８９．０９
　　　　　２Ｘ　１０−’　　　　１．７８２Ｌ−Ａｓ
ｎ　、　ＮＨ０１５０，１３Ｘ　１０−’　　　　４５
．０３Ｌ−Ａｓｐ　　　　　　　　　１３３．１　　　
　　２Ｘ　Ｉ　０−５２．６６２Ｌ−Ｇｌｕ　　　　　
　　　　１４７．１　　　　　２Ｘ　１０−Ｓ２．９４
２Ｇｌｙ　　　　　　　　　　７５．０７　　　　　３
ｘ　Ｉ　Ｃ１”　　　　２．２５２Ｌ−Ｐｒｏ　　　　
　　　　　１１５．ｌ　　　　　、　２Ｘ　１０−’　
　　　２３．０２Ｌ−５ｅｒ　　　　　　　　　　１０
５．１　　　　　３ｘ　ｌ　Ｏ”−’　　　　３１．５
３アミノ酸誘導体グルタチオン　　　　３０７．３　　　　１Ｘ　１０″
″’　　　　０．３０７プトレシン２ＨＣｆｆ　　　　
１６１．１　　　　３Ｘ　Ｉ　Ｏ−’　　　　（ＬＯ４
８水溶性ビタミンおよび補酵素ビオチン　　　　　　２４４．３　　　　３Ｘ　１０−
’　　　　０．００７Ｄ−Ｃａパントチネート　２３８
．３　　　　　２Ｘ　１０−’　　　　４．７６６葉酸
　　　　　　　　４４１．４１　　　　６Ｘ　１０−’
　　　　２．６４８７オリニン酸（Ｃａつ　６０１．６
　　　　１Ｘ　Ｉ　Ｏ−’　　　　０．６０２ニアシア
ンアミド　　１２２．１３×ｌＯ′″″’　　　　３．
６６３にコチンアミド）アミノ安息香酸　　　１３７．１４　　　　３Ｘ　１０
−’　　　　０．４１１ピリドキサールＨｃＱ　　２０
３．６　　　　　１×１０−’　　　　２．０３６ピリ
ドキシンＨＣＱ２０５．６　　　　３Ｘ　１０−’　　
　　０．０６２リボフラビン　　　　３７６．４　　　
　　８Ｘ　１０−’　　　　０．３０１チアミンＭＣＩ
２　　　　３３７．０　　　　９Ｘ　Ｉ　Ｏ−’　　　
　３．０３６ビタミンＢ１２　　　　　１３５５．４　
　　　　３Ｘ　Ｉ　Ｏ”−’　　　　０．４０７炭水化
物および誘導体Ｄ−グルコース　　　　１８０．１６　　　　２Ｘ　１
０−’　　　　３６０３．２Ｎａ　ピルベート　　　　
１１０．ＯＬＸ　１０−３１１０．０核酸誘導体アデニン　　　　　　１３５．１３　　　　１Ｘ　Ｉ　
Ｏ−’　　　　０．１３５ハイポキサンチン　　１４６
．１　　　　７Ｘ　１０−’　　　　１．０２２７（Ｎ
ａつチミジンＨｃＱ３３７．３　　　　１×１０−’　　　
　３．３７３脂質および誘導体コリンクロライド　　１３９．６３　　　　１Ｘ　Ｉ　
Ｏ−’　　　　１３．９６エ９　／−ル７ミンＨＣＱ　
９７．５５　　　　　２Ｘ　１０−’　　　　１．９５
１１−イノシトール　　　１８０．２　　　　　ｌｘ　
ｌ　Ｏ−’　　　　１８．０２リノール酸　　　　　２
８０．４　　　　１Ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　０．０２８
リポ酸　　　　　　　　２０６．３　　　　　２ｘ　Ｉ
　Ｏ−’　　　　０−０４１緩衝剤）ＩＥＰＥｓ　　　　　　　　２３８．３　　　　２．
５Ｘ１０−’　　　５９５７．５ＮａＯＨ４０２Ｏ１１
，２３Ｘ　１０−”　　４９２．１２ＮａＨＣＯ３８４
，Ｏｆ　　　　　３ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　２５２−０
３ナトリウム（合計）ミリモル　　　　　１２３．１カ
リウム（合計）ミリモル　　　　　　４．０ナトリウム
：カリウム　　　　　　　３０．７合計のモル浸透圧濃
度（ｍｏｓｍ）　　　　　３０２　、７バルクイオンお
よび微量元素バルクイオンは、細胞の生長および膜電位および浸透圧
のバランスを維持するために必要である。

それらは、また、酵素反応においてコファクターの役割
を演する。ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウム、塩素、リン酸および硫酸のイオンのすべては、
正常な細胞の代謝において重要な機能をはたす。培地中
の特定のナトリウム対カリウムの比は、膜内外電位の調
節において重要であり、これについてはさらに説明する
。重炭酸塩または二酸化炭素は、また、必要であり、そ
して低い密度の細胞培養のために培地中に供給しなくて
いはならない。高い密度の細胞の培養において、細胞自
体は、外部の重炭酸塩および二酸化炭素を必要としない
で、十分なレベルで発生することができる。微量の無機
元素（鉄、亜鉛、セレン、ケイ素、バナジウム、銅、ニ
ッケルおよびモリブデン）は、多くの酵素の機能のため
に必要である（例えば、グルタチオンリダクターゼにお
けるＳｅ＋つ。微量元素は、また、膜内外のシダナリン
グ（ｓ　ｉｇｎａ　ｌ　ｉｎｇ）の事象を直接調節する
ことができる（例えば、インスリンの応答のバナデート
の調節）。上の表に記載する特定の化合物は、培地の調
製に普通に使用され、そして示す水和状態が本発明の培
地の粉末状態の安定性のために有利であるので、ここに
おいて好ましい。置換は当業者にとって実施することが
できるであろう。

アミノ酸次の必須アミノ酸をこの培地中に含めることができる：
Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）　、Ｌ−システィン（Ｌ
−Ｃｙｓ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ　−Ｇ　ｉｎ）、Ｌ−
ヒスチジン（Ｌ　　ＨＩｓ）　％　Ｌ−ヒドロキシプロ
リン（Ｌ　−Ｈｙｄｒｏｘｙ　−Ｐ　ｒｏ）　、Ｌ−イ
ンロイシン（Ｌ−１１ｅ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｌｅｕ
）、Ｌ−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−メチオニン（Ｌ−
Ｍｅｔ）　、Ｌ−７エニルアラニン（Ｌ−ｐｈｅ）　、
Ｌ−スレオニン（Ｌ−Ｔｈｒ）、Ｌ＝ニトリブトファン
Ｌ−Ｔｒｐ）、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）およびＬ−
バリン（Ｌ−Ｖａｌ）。さらに、以下の非必須アミノ酸
が含まれる：Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）　、Ｌ−アス
パラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａ
ｓｐ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ　−Ｇ　Ｉｕ）、グリシ
ン（Ｇｌｙ）、Ｌ−プロリン（Ｌ　−Ｐ　ｒｏ）および
Ｌ−セリン（Ｌ−３ｅｒ）。さらに、アミノ酸誘導体の
グルタチオンプトレシンが本発明の培地中に存在する。

再び、上の表に列挙する形態は、とくに容易に溶解する
粉末状培地の調製のために、好ましい。液状培地の調製
のため、これらのアミノ酸の別の形態を選択することが
できる。

ビタミン／補酵素ある数の水溶性ビタミンおよび補酵素は細胞の培養を助
けることが知られている。ビオチン、パントテン酸、葉
酸、７オリニン酸、ニアシアンアミドにコチンアミド）
、ｐ−アミノ安息香酸、ピリドキサール、ピリドキシン
、リボフラビン、チアミン、およびビタミンＢ１２を、
この培地において使用する。

炭水化物グルコース、とルベートおよびグルタミンを本発明の培
地においてエネルギー源および炭素ｇＫキして利用する
。ピルベートはナトリウムピルベートとして供給する。

この方法の制御のためには、細胞がエネルギー源として
使用する成分を変更することが望ましいことがある。例
えば、グルコースの代わりにガラクトースまたはフルク
トースを使用することができ、そしてグルタミンの濃度
を変更することができる。

核酸誘導体アデニンおよびハイポキサンチンをプリン源として供給
する。チミジンはピリミジン源として供給する。

坦１一本発明の配合物は、次の脂質、脂質前駆体および脂質誘
導体を含む：コリン、エタノールアミン、ｉ−イノシト
ール、リノール酸およびリボ酸。追加の脂質および他の
誘導体、例えば、メチルリ不才ｖ　−ト（ｍｅｔｈｙｌ
　　１ｉｎｅｏｌａｔｅ）を、特定の細胞のタイプのた
めに要求されるとき、添加するか、あるいは代わりに使
用することができる。エタノールアミンは膜のリン脂質
生合成経路における主要成分である。

緩衝剤ここに記載する栄養培地の緩衝剤系は独特である。この
系は、ｐＨ調節のための空気平衡化を使用する容易さお
よび柔軟性を提供する。培地は主として血清不合または
非常に低い血清濃度の培養に意図するので、これは本発
明の重要な面である。

血清濃度を低下すると、１０％の二酸化炭素／空気と平
衡にあるｐＨの調節に通常適する重炭酸塩のレベルは禁
止的となることが発見された。本発明の緩衝系は、また
、ｐＨを生理学的に適合性の範囲内に維持するために従
来要求された二酸化炭素濃度のわずられしい調節の代替
の手段を提供する。

この緩衝系は、重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′　−２−エタンス
ルホン酸）、水酸化ナトリウムおよび二酸化炭素を利用
する。低い密度の培養において細胞代謝のために要求さ
れる二酸化炭素の少量は、本発明の培地に、大気の二酸
化炭素および培地中に存在するＨＣＯ，−の平衡を経て
供給される。

高い密度の培養のために、十分な二酸化炭素は通常の細
胞の代謝を経て生成される。細胞を機能化する非常に密
に充填されたビーズを有する、とくに中空繊維のバイオ
リアクターの場合において、大量の二酸化炭素が発生す
る。緩衝系が二酸化炭素／重炭酸塩の平衡に基づく場合
、環境は急速に酸性過ぎるようになって、細胞は最適レ
ベルで機能することはできなくなる。本発明の培地にお
ける空気平衡化緩衝系はこの問題を排除する。

ｐＨ指示薬のフェノールレッドを使用する必要性は本発
明の培地において排除される。なぜなら、この培地の緩
衝系は、空気平衡化系において普通の培養条件下にｐＨ
を生理学的範囲内に維持するであろうからである。これ
は所望の細胞産生物の精製において究めて有利である。

なぜなら、フェノールレッドは蛋白質に結合して、蛋白
質のクロマトグラフィーの挙動を変化させるからである
。

さらに、フェノールレッドは細胞の生合成および代謝に
影響を及ぼすことがある。したがって、フェノールレッ
ドの排除は、必要な精製工程を減少しかつ回収可能な産
生物の増加において意味がある。

培地は約ｐＨ７２Ｏ〜約ｐＨ７，４および３７℃で配合
することができる。これより高いｐＨ１例えば、約ｐＨ
８２Ｏは、この方法の制御の手段として追加の塩基を添
加する代わりに、培養した細胞によって生成された乳酸
を中和するための、連続的に供給するバイオリアクター
のための方法の制御の手段として使用できる。培地を中
空繊維のバイオリアクター中で使用するとき、ｐＨ７，
，３５（３７℃）における配合は好ましい。ｐＨ７。

２（３７℃）における配合は他の用途に好ましい。

モル浸透圧濃度培地のナトリウム対カリウムの比および合計のモル浸透
圧濃度は、高いレベルのネズミ免疫グロブリンの生成と
の適合のために調節した。好ましいナトリウム対カリウ
ムの比は約３０であるが、約２５〜約３５の範囲である
ことができる。この培地のモル浸透圧濃度は低く、約２
８５〜約３１５、好ましくは約２９５〜約３０５　ｍｏ
ｓｍであることができる。

ここに記載する培地は、中空繊維のバイオリアクター、
発酵器、スピンナーフラスコおよびローラーボトルにお
けるモノクローナル抗体の生産にとくによく適する。こ
れらのタイプの培養において日常的に使用する高いレベ
ルのガス交換は、本発明の配合物と適合する。培地のモ
ル浸透圧濃度は培養の間の多少の上昇を可能とするよう
に低いレベルに保持し、その間なおモル浸透圧濃度を健
康な生産的細胞を維持するために適当な範囲内に維持す
る。中空繊維反応器において使用するため、培地は好ま
しくは約２９５　ｍｏｓｍで再構成する。さらに、生物
適合性還元剤、例えば、グルタチオンを培地中に含めて
、これらの高いレベルのガス交換から生ずる潜在的に酸
化性の複雑さを補償した。

本発明の基礎栄養培地の処方は上の表に記載されている
。成分の量はモル濃度ならびに濃度で与えられている。

この表の処方は本発明の好ましい実施態様である。各成
分の量は、２桁で変化させることができる、すなわち、
上の表に記載する量の約５０％〜約２００％の間で変化
することができる。各成分の濃度はそれが細胞に入る機
構、能動的または受動的な移送、および生物学的活性の
所望レベルについて十分な移送を達成するために要求さ
れる濃度を基準にして選択した。

個々の成分の水和状態および調製された基礎栄養培地は
、便利さに従って変化させることができる。ここに与え
る水利状態は、培地の調製の分野において普通に使用さ
れているものである。しかしながら、実際的事柄として
、調製された培地をできるだけ乾燥して得ることが好ま
しい。

前述の基礎栄養培地は、使用前に再構成するために、乾
燥または濃縮した調製物として配合しかつ包装すること
ができる。本発明の好ましい実施態様において、培地は
、上の表に記載する最初の６０種類の成分からなる、乾
燥粉末として調製する。次いで、乾燥培地を再構成する
とき、残りの２成分を添加する。再構成は使用直前に実
施できる。あるいは、培地を再構成し、そして包装する
ことができる。この培地の貯蔵寿命は、乾燥粉末として
約４℃において貯蔵したとき、少なくとも数年である。

液体培地は、調製したばかりのとき、あるいは乾燥粉末
から再構成したとき、安定性に劣るが、約約４℃におい
て貯蔵したとき、約２か月間以上安定である。

再構成は、上の表に記載する相対的濃度が存在するかぎ
り、培地の重炭酸塩、塩基または他の成分の濃厚原溶液
を添加することによって実施することができる。それら
の成分を固体として添加する場合、再構成は無菌の、脱
イオンした組織培養等級の水を添加することによって達
成される。培地は使用前に滅菌する。粉末状培地を再構
成するためのグロトコールは実施例１に記載されている
。

追加の酸化防止剤、還元剤、ビタミン、炭水化物、アミ
ノ酸および／または誘導体、核酸および／または誘導体
、および蛋白質は、再構成の前、間または後に添加する
ことができる。主要な添加する成分は蛋白質および／ま
たは他のホルモンである。

前述のように、本発明の基礎栄養培地は、低いレベルの
血清で、あるいは規定した蛋白質で補充するように案出
されている。この培地は、培養する特定の細胞系のため
に適した量の血清で補充するとき、細胞の生長および代
謝を支持するであろう。しかしながら、典型的には先行
技術の培地を使用したときより、かなり低いレベルの血
清が本発明の培地の補充に必要であることが立証された
。

この配合物は、血清不合で使用することができ、あるい
は非常の低いレベル、好ましくは約１容量％より低いレ
ベルで使用できるが、これより高いレベルを必要に応じ
て使用できる。

ここに記載する培地は、最少の数の規定された蛋白質で
補充するとき、血清不合細胞培養のために使用できる。

精確な蛋白質の補充は、培養する細胞の要求に依存する
であろう。ネズミハイブリドーマのための精確な蛋白質
の補充は、インスリン、アルブミンおよび鉄飽和トラン
スフェリンから成る。インスリンは、約１．０〜１０．
Ｏｐｇ／ｍ１１好ましくは約５．０μｇ／ｍｌの濃度で
存在できる。アルブミンは、約１Ｏ１０〜１０００゜０
μｇ／ｍｌ、好ましくは約５０　、０　μｇ／ｍｌの濃
度で存在できる。鉄飽和トランスフェリンは、約１゜０
〜２５　、０　μｇ／ｍｌ、好ましくは約１．０μｇ／
ｍｌの濃度で存在できる。これらの３種類の蛋白質で基
礎栄養培地を補充することは、高い細胞密度および低い
細胞密度の両者の培養にきわめてすぐれることが発見さ
れた。必要に応じて、追加の蛋白質を添加することがで
きる。

次の実施例によって、本発明を例示する。これらの実施
例は本発明を限定することを意味しない。

本発明の説明を通じて、次の略号を使用した。

ＢＳＡ　　　−ウシ血清アルブミン ℃−セ氏度ｃｍ”　　　　−立方センチメートルＤＭＥ　　　−ダルベツコ変性イーグルＴＦ−１−ラン
スフェリンｇ　　−グラムＬ　　−リットルＭ　　−モルｍＭ　　　　−ミリモルｍｇ　　　　−ミリグラムｍｉｎ　　−分ｍｌ　　　　　−ミリリッ　トルｍｏｓｍ　　　　−ミリモル浸透圧濃度（μｍｏｌ／Ｋ
ｇ）ＭＷ　　　−分子量Ｎ　　−規定ｎｍ　　　　−ナノモルｏｓｍ　　　　−モル浸透圧濃度（ｍｍｏｌ／Ｋｇ） μ　　−マイクロＰＢＳ　　　−リン酸塩緩衝化食塩水％　　−パーセントｒｐｍ　　　　−回転数７分 ■　　−体積ｗｔ　　　　−重量実施例Ｉ（培地の調製）粉末状培地この培地は、上の表に記載する最初の６０種類の成分（
すなわち、Ｎ　ａ　ＨＣＯ３およびＮａＯＨを除外する
すべての成分）を、上の表に記載する量で混合すること
によって調製した。これらの成分を粉砕して乾燥粉末を
形成した。

原溶液重炭酸塩／塩基（Ｎ　ａＨＣＯ３／　Ｎ　ａｏ　Ｈ）の
原溶液を次のようにして調製した：（１）ｐＨ７，２（３７℃）について、原溶液は１７．
９２２ｍｇのＮａＨＣＯ，を７１１．２ｍｌのＮａＯＨ
の１．ＯＯＮの溶液に添加することによって調製した。

次いで、この体積を１リツトルに調節した。

ｍｇのＮａＨＣＯ，を９５０．ＯｍｌのＮａＯＨの１゜
０ＯＮの溶液に添加することによって調製した。

次いで、この体積を１リツトルに調節した。

アルブミン／トランスフェリンの原溶液は、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）［マイルス・ダイアグノスチクス（
Ｍｉｌｅｓ　　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ベンテック
ス（ｐ　６ｎｔｓｘ）等級、２×再結晶化〕およびウシ
鉄飽和トランスフェリン（ＴＦ）［マイルス・ダイアグ
ノスチクス（Ｍｉｌｅｓ　　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）
　］を、最終調製における１０００倍の試薬の濃度で使
用して調製した。１００．Ｏｍｌの原溶液について、５
．０ｇのＢＳＡ、Ｏ，１ｇのＴＦおよび１０゜Ｏｍｌの
ｌ０ＸＰＢＳ　（ダルベツコのＣａ＋＋不含、Ｍｇ”＋
不合）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）。この原溶液を滅菌濾過
し、そして４℃で貯蔵した。

インスリンの原溶液は、ウシインスリン（ＩＮＳ）［シ
ダ？　（Ｓｉｇｍａ）　　ｒ　５５００］　を最終調製
における１０００倍の濃度で溶解することによって調製
した。ｌｏｏ、Ｏｍｌの原溶液について、５００．０ｍ
ｇのＩＮＳを、ＰＢＳ中の０．０５ＭのＨＣＩの溶液中
に溶解した［１．ＯＮのＨＣＩおよびＩＱＸＰＢｓ　（
ダルベツコのＣａ”＋不含、Ｍ　ｇ＋　＋不含）（ＧＴ
ＢＣＯ／ＢＲＬ）を使用した］。この原溶液を滅菌濾過
し、モして４℃で貯蔵した。

粉末状培地の再構成および蛋白質の補充６リツトルの組
織培養等級の水を１０．０リツトルの容器に入れ、これ
に１９５．７ｇの量の粉末状培地［１０リットル等価（
ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）パッケージ］を添加した。この
パッケージを１００゜Ｏｎ＋１のアリコートの水で２回
すすいだ。次に、１５０．０ｍ１（１５２Ｏｍｌ／Ｌ培
地）の重炭酸塩／塩基の原溶液をこの容器に添加した。

適当な重炭酸塩／塩基の原溶液は、培地の用途に依存し
て選択した。容器の側面を６３０．Ｏｍｌの水ですすい
で、すべての粉末を確実に溶解した。ｌ（１０ｍｌ（１
２Ｏｍｌ／Ｌ培地）のアルブミン／トランスフェリンの
原溶液およびインスリンの原溶液の各々を添加した。３
リツトルの水を添加して、体積を１０、ＯＬにした。

標準の再構成した培地のｐ）（は、ブラッドガス分析器
（ｂｌｏｏｄ　　ｇａｓ　　ａｎａｌｙｚｅｒ）　　［
コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）　］　　（３７℃におい
て）で７．１８±０．０３であると決定された。バイオ
リアクターの再構成した培地のｐ）（は、７．３５±０
．０３であると決定された。モル浸透圧濃度は、蒸気圧
浸透圧測定［ウェスコ−（Ｗｅｓｃｏｒ）　］によって
２９５±５．０であると決定された。

再構成した培地は、マスターフレックス（Ｍａｓｔｅｒ
Ｈｅｘ）　　（商標）ポンプ（＃２５ヘッド）［コール
−パーマ−（Ｃｏｌｅ　−Ｐａｒｍｅｒ）　］を使用し
てほぼ５００．０ｍｌ／分で濾過滅菌した。この溶液を
ミリ−スタック（Ｍｉｌｌｉ−ｓｔａｃｋ）　Ｇ　Ｓ　
（商標）ガラスフィルター［ミリポア（Ｍ　１ｌｌｐｏ
ｒｅ）　Ｍ　５ｃ−３Ｏ５Ｃ２２）を通過させて、無菌
のガラスおよびポリカーボネートのカーポイに入れた。

再構成した培地は、滅菌性および細胞の増殖を促進する
能力を評価するために試験した。培地の１０、Ｏｍｌの
アリコートを組織培養フラスコ（Ｔ−７５）中に無菌的
に入れ、これに１００万のＣＲＬ　　１６０６ネズミハ
イブリドーマ細胞［アメリカン・タイプ・カルチャー−
コレクション（Ａ　ｍｅｒｊｃａｎ　　Ｔ　ｙｐｅ　　
Ｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ。

１２３０１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、　Ｓ　、　Ａ、　２０８５２
）から入手した〕を添加した。次いで、１００μＬのア
リコートをｌｏ、ＯｍｌのＰＢＳで希釈し、そして細胞
濃度をコールタ−カウンター（Ｃｏｕｔｅｒ　　Ｃｏｕ
ｎｔｅｒ）　　（商標）粒子カウンタ［コールタ−・エ
レクトロニクス（Ｃｏｕｌｔｅｒ　　Ｅ　１ｅｃｔｒｏ
ｎｉｃｓ）　］　で決定した。このフラスコを密に留め
、そして３７℃で２４時間インキュベーションした。少
なくとも２ｏｏ、ｏｏｏ細胞細胞７ゲｌ測され、この培
地の培養を支持する能力を示した。

びんに入れた培地を室温において一夜放置して滅菌性を
評価した。くもりまたは微生物汚染の他の証拠は観察さ
れなかった。次いで、この培地を４℃で貯蔵した。

実施例ＩＩこの実施例は、実施例Ｉの血清不含培地中の細胞の生長
およびモノクローナル抗体の生産を、血［１］充ＤＭＥ
　（ダルベツコ変性イーグル）培地中の細胞の生長およ
びモノクローナル抗体の生産と比較する。本発明の培地
を使用して、よりすぐれた細胞の生長および抗体の生産
が見られた。

不ズミハイブリドーマ系統ＣＲＬ　　１６０６の細胞の
アリコートを、表ＴＩに示すように、実施例■の再構成
した培地（ｐＨ７，２）中に接種した。これを培養物Ｉ
ＩＡと表示した。細胞の他のアリコートを、１０％（Ｖ
／Ｖ）の胎児ウシ血清（ＧＩＢＣ○／Ｂ　Ｂ　Ｌ）を補
充したＤＭＥ培地中に接種した。この培地および細胞を
ポリスチレンのローラーボトル（コーニング、４９０ｃ
ｍ２）中に入れた。培養物ｒｆＡを含有するローラーボ
トルを密閉した。培養物ＩＩＢを含有するローラービン
を、密閉前に１０％の二酸化炭素／空気で通気した。両
者のローラーボトルを、約１．Ｏｒｐｍのローラー装置
上のインキュベーターに３７℃において入れた。

各培養物のアリコートを毎日取り出し、そして細胞濃度
をコールタ−カウンターの粒子カンタ−（コールタ−・
エレクトリックス）で決定した。

細胞の生存能力は、トリパンブルー色素の排除アッセイ
（シグマ・ケミカル・カンパニー）によって決定した。

結果を表■に示す。

細胞を毎日のアリコートの各々から遠心によって取り出
した。アリコートの各々からのコンディショニングした
培地は、実験の終了まで、４℃で貯蔵した。アリコート
の各々中に存在する抗体（抗フィブロネクチンＩｇＧ）
は、エライザ（ＥＬＩＳＡ）分析によって決定した。

表Ｉ０　　０．０２１±、００１　０．０２２±、００１　
　　−−　　−−２５　　０．０４０±、００１　０．
０２１±、００１　　　３．２　　２．２４７　　０．
０９８±−００１０２Ｏ５９±、００１　　　８．１　
　４．５７１　　　　０．３１０±、０１７　０．１８
５±、００５　　　　１６．６　　　１１．５９７　　
１．２００±、０１６　０．７４０±、０２６　　８０
．３　１００．０１２０　　２−３００±、０３０　２
．０００±、０２８　　２６２．９　１４９．６１４４
　　０．９１０±、０１８　１．５００±、０１０　　
３０７．８　２３８．６１６９　　　　　　　　　　　
　　　１０００．０　４２０．０実施例ＩＩＩこの実施例は、両者とも同一の規定された蛋白質を補充
した、本発明の培地中および他の血清不含培地中の細胞
の生長および抗体の生産を比較する。実施例ＩＩにおけ
るように、ＣＲＬ１６０６細胞を、表ＩＩ（時間０）に
示すように、本発明の培地（培養物１１１Ａ）または商
業的に入手可能な調製物から調製した培地（培養物ＩＩ
ＩＢ）を含有するローラーボトル中に接種した。培養物
１１１Ａは実施例Ｉ　（ｐＨ７，２）を接種することに
よって調製した。培養物１１１Ｂは、３部のＤＭＥ培地
（ＧＩ　ＢＣＯ／ＢＢＬ）を１部のＦ１２培地（ＧＩＢ
Ｃ○／ＢＢＬ）　、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ　（シグマ・
ケミカル・カンパニー）、０゜０２ｍＭのエタノールア
ミン（シグマ・ケミカル・カンパニー）および３．０ｍ
Ｍの重炭酸ナトリウム（シグマ・ケミカル・カンパニー
）と混合し、そして次の成分を補充することによって調
製しｌこ　：５０．０部ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＩＣＮ　　
バイオケミカルス）、１．０部ｇ／ｍｌの鉄飽和トランスフェリン（ＩＣＮ　
　バイオケミカルス）、および５．０部ｇ／ｍｌのウシ
インスリン（シグマ・ケミカル・カンパニー）。

両者の調製物のｐＨは、コーニングのブラッド−ガス分
析器に従い３７℃で７．２に到達するまで、水酸化ナト
リウムで調節した。°両者の配合物のモル浸透圧濃度は
、ウェスコールの蒸気圧浸透圧計に従ってほぼ２９５　
ｍｏｓｍに調節した。実施例Ｉの手順を反復した。結果
を表ＩＩに記載する。

表■ ０　　０．０５０±、００１　０．０４９±、００１　
　　−−　　−−２１　　０．０９４±、００４　０．
０８６±、００４　　　９．４　　１２．５４６　　０
．３６０±、００９　０．２９０±、００６　　２０．
．１　　２１．０７１　　　１．１００±、００３　０
．７００±、０１０　　７３．６　　７２．５９３　　
２．０００±、０３２　１．４００±、０１４　　２０
９．７　１３２．０１１７　　０．６３０±、０１２　
１．１００±、００４　　４５２．３　１３６．２１４
０　　　　　　　　０．４４０±、０１９　　４５７．
０　２３１．０１６５　　　　　　　　　　　　　　　
７９２．０　１６５．０実施例ｒｖこの実施例は、本発明の培地に基づく培養において生成
されたモノクローナル抗体の純度と血清補充した培地に
基づく培養において生成されたモノクローナル抗体の純
度とを比較する。

２つのローラーボトルを、培地の１ｍｌ当り２゜■±ｏ
、ｔｘｔｏ’のＣＲＬ　　１６０６細胞で接種しｌ；。

一方のローラーボトル（培ｉ［７１ＶＡ）は実施例■の
培地（ｐＨ７，２）を含有した。他方のローラーボトル
（培養物ＩＶＢ）は１０％の（ｖ／ｖ）の胎児ウシ血清
を補充したＤＭＥ培地を含有した。コンディショニング
した培地の試料は、培養の１日および４日の後に、実施
例ＩＩに記載するようにして調製した。次いで、試料中
に含有される蛋白質を、高性能大きさ排除クロマトグラ
フィー　［ＨＰＳＥＣ，Ｚｏｒｂａｘ（商標）、イー・
アイ・デュポン・デ・ニモアス・カンパニー（Ｅ。

１、　ｄｕＰｏｎｔ　　ｄｅ　　Ｎｅｍｏｕｒｓ　　Ｃ
ｏ、　）　、０．７５Ｘ２５ｍｍのカラム、アイソクラ
チック（１ｓｏｃｒａＬ　１ｃ）０．３Ｍの塩化ナトリ
ウム１０．０５Ｍのリン酸ナトリウム；　ｐＨ７、Ｏ；
　０　、２５ｍｌ／ｍ１ｎｌによって検査した。

表ＩＩＩは、高度に精製したＢＳＡ　（ウシ血清アルブ
ミン）またはＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）の標準に類似
する保持時間で移動する物質の相対量を表わす。２８０
ｎｍにおける吸収を測定し、そして積分したピーク面積
を決定した。さらに、培養物ＶＩＢ中で生成されたモノ
クローナル抗体は、１０％の胎児ウシ血清補充物によっ
て存在するウシＩｇＧおよびアルブミン（３，２±０．
３５ｍｇ／ｍｌの合計１ｇＧおよびアルブミン）の中に
検出できなかったことが示される。

表■ ピーク面積単位試料　　　　ＩｇＧ（Ｒｆ物１６．７）　　　　　ＢＳ
Ａ（Ｒｆ＃１７．７）ＩＶＡ、第１日　　基線　　　　
　　　　　５．７７０（Ｒｆ−１７，６３）ＩＶＡ％第
４日　　１５，６４７（Ｒｆ−１６，７５）　　　　５
，４７０（Ｒｆ＝１７．９５）ＩＶＡ１第１日　　埋没
　　　　　　　　６８６．５２８（Ｒｒ　＝　１７．６
３）ＩＶＡ、第４日　　埋没　　　　　　　　６４１，
５９２（Ｒｒ＝　１７．９２）２８０ｎｍにおいて、Ｉ
ｇＧの１．０ｇ／ｍｌ溶液のＩｇＧの吸収はＩ　−Ｏｍ
ｇ／ｍｌＢ　Ｓ　Ａの溶液のそれの１．７１５倍である
。こうして、表ＩＩＩのデータが示唆するように、培養
物ＩＶＡ、第４日の試料はほぼ１７０μｇ／ｍｌのＩｇ
Ｇを含有し、そしてモノクローナル抗体は６３％の純度
であった：［１ｇＧ］　　　　　　　　　　１．６６８
Ｘ　［ＢＳＡ］［ＢＳＡ］　＋　［１ｇＧ］　　　　［
ＢＳＡ］　＋　（１，６６８Ｘ　［ＢＳＡ］）１．６６
８Ｘ　［ＢＳＡ］（１＋　１．６６８）Ｘ　［ＢＳＡ］１．６６８！＋１゜６６８ −　０．６３−６３％ここで：Ａ２．、ＢＳＡ＝　　１．６６８Ｘ　［ＢＳＡ］さらに、高度に精製したＩｇＧは、試料の大きさ排除の
クロマトグラフィーの工程後においてのみ、得ることが
できるように思われる。より高い産生物の力価およびよ
り大きσ１産生物の純度の両者をもつ粗製のコンディシ
ョニングした培地は、細胞をさらに数日間培養すること
によって容易に得ることができる。この実施例の条件下
に、培養物ＩＶＡ中の細胞は第４日までに１２Ｏ００２
Ｏ００細胞／ｍｌの密度に到達しただけであり、これは
飽和密度の半分より少ない。

実施例Ｖこの実施例は、凍結保存から細胞を生き返らせるための
、この培地の利用を明らかにする。この実施例は、また
、前もった適合［［ウィーニング（ｗｅａｎｉｎｇ）　
Ｊ　３手順を必要としないで、高い血清濃度の存在下に
前に培養した細胞の増殖を、この培地が支持できること
を立証する。

ＨＢ１２７細胞系（ＳＰ２１０　　Ａｇ１４）の細胞を
ＡＴＣＣから入手した。この細胞系は、常に、血清補充
培地中で生長されてきた。この５Ｐ２１０不ズミハイブ
リド一マ系列は、実施例Ｉ〜ＩＶにおいて使用したＣＲ
Ｌ　　１６０６系統七異なる親融合相手から誘導された
。これらの２つの細胞系は一緒に、工業的に普通に使用
される細胞を生産するモノクローナル抗体の大部分の代
表である。この実施例は、両者が血清補充ＤＭＥ培地よ
り本発明の培地においてよりよく生長することを立証す
る。

細胞を融解し、そして２つの等しい部分に分割した。こ
れらの部分を、３７℃において、実施例Ｉの再構成した
培地（ｐＴ（７，２）中で（培養物ＶＡ）、あるいは１
０％の血清を補充したＤＭＥ培地中で（培養物ＶＢ）−
夜インキユベーションした。第２日において、培養の各
々における培地を新鮮な調製物との遠心によって交換し
た。培養物をインキュベーターに戻した。第５日に、培
養の各々における細胞を計数した。培養物ＶＡにおいて
、６８７２Ｏ００細胞／ｍｌが観測され、これに対して
培養物ＶＢにおいて、わずかに２５１゜０００細胞／ｍ
ｌが観測された。したがって、血清補充培地中で常に生
長されてきた、この細胞系でさえ、中間のウィーニング
培養物を必要としないで、本発明の血清不合培地におい
て有意により良好に生長した。

実施例Ｖｌこの実施例は、低い濃度の血清の存在下における細胞系
の固定依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ　　ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ）細胞系の培養ために、この培地が適することを立
証する。細胞系は２つの異なる種および２つの異なる組
織から検査した。

この実験のため、ＬＬＣ−ＰＫＩ　（ブタ腎臓）細胞（
ＡＴＣＣ番号ＣＬ　１０１）およびＣＡＰＥ（ウシ内皮
）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２０９）をＡＴＣＣから入
手した。細胞系の各々のための細胞接種物は、原培養物
を５．０ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ　（エチレンジア
ミン四酢酸）（ＧＩＢＣＯ／Ｂ　Ｂ　Ｌ）の溶液で処理
し、そして単細胞を実施例Ｉの再構成した培地（ｐＨ７
，２）中に懸濁することによって調製した。次いで、細
胞系の各々の細胞を本発明の培地を含有する３回の反復
実験のＴ−２５フラスコに添加した（本発明のこの培地
は、実施例Ｉの蛋白質原溶液を添加しないで、記載する
再構成手順によって、実施例Ｉの粉末から再構成した）
。この培地を、表ＴＶに示す濃度の胎児ウシ血清で補充
した。フラスコを密閉し、そして３７℃のインキュベー
ターに入れた。

培養の５日後に、培地を各７ラスコから取り出し、そし
て培養物を上のようなトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で処理
した。細胞がフラスコの表面から分離した後、細胞をリ
ン酸塩緩衝化食塩溶液中に再懸濁した。細胞の数をコウ
ルターカウンターの粒子カウンター（コウルター・エレ
クトリクス）で決定した。結果を表■Ｖに示す。

表■ ＣＬ１０ｌ　　　１％　　　９．５Ｘ　１０’　　１１
．４±、４Ｘ　１０’ＣＣＬ　２０９　　２％　　　１
．ＯＸ　１０’　　　３．３±、２Ｘ　１０’実施例Ｖ
ＩＩ本発明の培地を、アミコン・バイクツアイバー（Ａｍｉ
ｃｏｎ　　Ｖｉｔａｆｉｂｅｒ）　Ｉ　Ｉ　−Ｐ　３０
　（商標）［Ｗ、Ｒ，ブレイス・アンド・カンパニー（
Ｇｒａｃｅ　　＆　　Ｃｏ、　）のアミコン・ディビジ
ョン（Ａｍｉｃｏｎ　　Ｄ　１ｖｉｓｉｏｎ）　］中空
繊維のバイオリアクター　（ＭＷ３０２Ｏ００の公称限
外濾過カット−オフ）におけるモノクローナル抗体の生
産に使用した。この系は、中空繊維のカートリッジを連
続的に循環する培地と新鮮な培地との交換を可能とした
。培養した細胞でカートリッジが充填されるにつれて、
この交換の速度を増加した。最終の交換速度（充填した
カートリッジについて）はほぼ２゜ＯＬ／日であり、そ
して８１．ＯＬの培地を全バイオリアクター実験の間に
使用した。

滅菌およびアセンブリングに引続いて、中空繊維のカー
トリッジおよびバイオリアクターの系を、順次に組織培
養等級の水で、そして実施例Ｉの培地（ｐＨ７，２）で
フラッシュした。実施例■の粉末から次の蛋白質補充物
質で記載する再構成手順によって再構成した本発明の培
地とのインキュベーションによって、この系の培地台を
表面を、蛋白質で被覆した：　１　、　Ｏｍｇ／ｍｌの
ＢＳＡ、ｌ。

Ｏμｇ／ｍｌのＴＦおよび５．０μｇ／ｍｌのｌＮ５０
この系の滅菌は、この培地で３日間操作後、培地の透明
度の視的観察によって評価した。

次いで、カートリッジを３×１０’のＣＲＬ１６０６細
胞で接種した。毎日の試料を採取し、そしてｐＨについ
て測定した。ｐＨが６．８以下に低下する毎に、培地の
供給速度を最大２．ＯＬ／日まで増加した。その速度に
到達したとき、培地を、）Ｈ７，３５で再構成した同一
の培地に切換えｌ二。

試料を表Ｖに示す細胞空間から採取し、そしてモノクロ
ーナル抗体の産生物（ＭＡＢ）を実施例ＩＶにおけるよ
うにＨＰＳＥＣによって特徴づけかつ定量した。試料の
ほとんどにおいて、ＭＡＢの純度は９５％より大きかっ
た。４９日の操作にわたる、この中空繊維のバイオリア
クターによるＭＡＲの累積生産を表Ｖに示す。

表Ｖ操作の合計日数　　　　　累積生産（ｇ）７　　　　　
　　　　０．００６１０　　　　　　　　　０．０２２１４　　　　　　　　　０．３７０１８　　　　　　　　　１．４４１２１　　　　　　　　　２．２０２２４　　　　　　　　　２．５７０２８　　　　　　　　　２．８５２３６　　　　　　　　　３．４５８３９　　　　　　　　　３．８４７４４　　　　　　　　　　　　　　４．２９９４８　　
　　　　　　　　　　　　４．６６２ｔｏ、０００およ
び３０．０００のＭＷの限外濾過のカットーオウを有す
る他の繊維を使用して構成した他の中空繊維のバイオリ
アクターを使用して、同様な結果を得た。

本発明の原理、好ましい実施態様および操作のモードを
以上に説明した。しかしながら、ここにおいて保護され
ることを意図する本発明は、開示した特定の形態は限定
でなく説明を目的とすると見なすべきであるので、限定
的に解釈すべきでない。種々の変更および変化は本発明
の精神を逸脱しないで可能である。

本発明の主な特徴および実施の態様は、次の通りである
： ■、次表：成分　　　　　　　　盆ヱｌ　　　舌圧　　　　　那／
ｆバルクイオンおよび微量元素ＣａＣＱｘ・２Ｈ２Ｏ１４７２Ｏ２’ｌｘ　ｌ　０−３
１４７．０２ｃｕｓｏ、・５ｕ、ｏ　　　　　　２４９
．６８　　　　３ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　０．０００７
４９ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２７８２Ｏ２ｌｘ　１０−’
　　　　０．２７８Ｆｅ（ＮＯｓ）ｘ・９Ｈ２Ｏ　　　
４０４−０２　　　　２Ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　０−０
８０８ＫＣ（１７４，５５４ｘ　１０−５２９８．２Ｍ
ｇ５Ｏ，・７Ｈ２０２４６，３８８Ｘ　ｌ　Ｏ″″’　
　　　１９７．ＩＮａＣＱ　　　　　　　　　　５８．
４４　　　　　１．０５ＸｌＯ−’　　　６１３６．２
Ｎａ２ＨＰＯ＋・７Ｈ２Ｏ２６８，ｌ　　　　　　３ｘ
　ｌ　Ｏ−’　　　　８０．４３ＮａＨｘＰＯ４・２Ｔ
ｏＯ１５６２Ｏ１５ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　９３・６０
６Ｎａ２ＳｅＯｓ’５Ｈ２０２６３２Ｏ１３Ｘ　１０−
’　　　　０−００７８９Ｎａ２Ｓ＋Ｏｓ・９Ｈ２Ｏ　
　　　２８４．２　　　　　　ｌｘ　ｌ　Ｏ−”　　　
　２−８４２（ＮＨ，）６Ｍｏ、Ｏ□、’４Ｈ２０１２
３５，９３×１０−’　　　　０．００３７１ＮＨ４Ｖ
Ｏ３１１６，９９５Ｘ　Ｉ　Ｏ−”　　　０．００００
５８５ＮｉＳＯ＋・６Ｈ２０２６２，８０３Ｘ　１０−
１’　　　　０．００００７８８ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０
２８７−５４３ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　０．２３必須ア
ミノ酸Ｌ−Ａｒｇ　　　　　　　　　２１０．７　　　　　３
ｘ　ｌ　Ｏ−″　　　１６８．５６Ｌ−Ｃｙｓ　ＨＣＱ
　、　Ｈ２Ｏ１７５，６３Ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　５２
．６８Ｌ−Ｇ−１ｎ　　　　　　　　　１４６．１　　
　　　５ｘ　１０−’　　　　７３０．５Ｌ−ＨＩｓ　
ＨＣ（１、ＬＯ２０９，７２Ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　４
１．９４Ｌ−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｐｒｏ　　　　　１３１
．１３　　　　　ｌｘ　ｌ　Ｏ”−’　　　　１３．１
１３Ｌ−１１ｅ　　　　　　　　　１３１．２　　　　
　５ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　７８．７２Ｌ−Ｌｅｕ　　
　　　　　　　　１３１．２　　　　　５ｘ　１０−’
　　　　７８．７２Ｌ−Ｌｙｓ　ＨＣｌ２　　　　　　
１８２．７　　　　　３ｘ　１０−’　　　　１４６．
１６Ｌ−Ｍｅｔ　　　　　　　　　　１４９．２　　　
　　　ｌｘ　ｌ　Ｏ”−”　　　　１４９．２Ｌ−Ｐｈ
ｅ　　　　　　　　　　１６５．２　　　　　３ｘ　ｌ
　Ｏ−’　　　　４９．５６Ｌ−丁ｈｒ　　　　　　　
　　　　　　　　１１９．１　　　　　　　　　６Ｘ　
　１　０−’　　　　　　　７１．４６Ｌ−丁ｒｐ　　
　　　　　　　　　　　　　２０４．２　　　　　　　
　６Ｘ　Ｉ　　Ｏ→　　　　　　１２．２５２Ｌ−Ｔｙ
ｒ（ジＮａつ２Ｈ２０２３７，２３ｘ　１０−’　　　
　７１．１６Ｌ−Ｖａｌ　　　　　　　　　　１１７．
２　　　　　５ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　７０．３２Ｌ−
Ａｌａ　　　　　　　　　８９．０９　　　　　２Ｘ　
Ｉ　Ｏ−’　　　　１．７８２Ｌ−Ａｓｎ　、　Ｈ，Ｏ
ｆ５０．１　　　　　３ｘ　１０−’　　　　４５．０
３Ｌ−Ａｓｐ　　　　　　　　　　１３３−１　　　　
　２Ｘ　Ｉ　Ｏ−’　　　　２．６６２Ｌ−ＧＬｕ　　
　　　　　　　　１４７．１　　　　　２Ｘ　１０−’
　　　　２．９４２Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　７５
．０７　　　　　３ｘ　１０−’　　　　２．２５２Ｌ
−Ｐｒｏ　　　　　　　　　　Ｈ５，１２Ｘ　Ｉ　Ｏ−
’　　　　２３．０２Ｌ−３ｅｒ　　　　　　　　　１
０５．１　　　　　３ｘ　１０−’　　　　３１．５３
アミノ酸誘導体グルタチオン　　　　３０７．３　　　　１Ｘ　１０−
’　　　　０．３０７プトレシン２ＨＣ（１１６１，１
３ｘ　１０−’　　　　０．０４８水溶性ビタミンおよ
び補酵素ビオチン　　　　　　２４４．３　　　　３Ｘ、ｌ　Ｏ
−’　　　　０．００７Ｄ−Ｃａバントテ不−ｈ　　２
３８．３　　　　　２Ｘ１０−’　　　　４．７６６葉
酸　　　　　　　　４４１．４１　　　　６Ｘ　Ｉ　Ｏ
”−’　　　　２．６４８７オリニン酸（Ｃａつ　６０
１．６　　　　　ｌｘ　１０−’　　　　０．６０２Ｈ
２０アミノ安息香酸　　　１３７．１４　　　　３ｘ　１０
−’　　　　０．４１１ピリドキサールｕｃＱ２０３．
６　　　　　　ｌｘ　ｌ　Ｏ→　　　２．０３６ピリド
キシンＨＣ（２２０５，６３Ｘ　Ｉ　Ｏ−’　　　　０
．０６２リボフラビン　　　　３７６．４　　　　８ｘ
　ｌ　Ｏ−’　　　　０．３０１チアミンＨＣＱ３３７
．０　　　　９Ｘ　ｌ　Ｏ””’　　　　３．０３６ビ
タミンＢ１２　　　　　１３５５．４　　　　　３ｘ　
１０−’　　　　０．４０７炭水化物および誘導体Ｄ−グルコース　　　　１８０．１６　　　　２Ｘ　１
０−”　　　　３６０３．２Ｎａピルベート　　　　１
１０．Ｏｌｘ　１０−”　　　　１１０．０核酸誘導体アデニン　　　　　　１３５．１３　　　　　ＬＸ　１
０弓　　　０．１３５ハイポキサンチン　　１４６．１
　　　　７ｘ　ｌ　Ｏ−’　　　　１．０２２７（Ｎａ
つチミジンＨＣＱ　　　　　３３７．３　　　　　ｌｘ　
ｌ　Ｏ−’　　　　３．３７３脂質および誘導体コリンクロライド　　１３９．６３　　　　　ｌｘ　１
０−’　　　　１３．９６エタノールアミンＨＣＱ　９
７．５５　　　　　２Ｘ　Ｉ　Ｏ”−’　　　　１．９
５１１−イノシトール　　　１８０．２　　　　１Ｘ　
１０−’　　　　１８．０２リノール酸　　　　　２８
０．４　　　　１　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’　　　　０．０２８
リポ酸　　　　　　　２０６．３　　　　２Ｘ　Ｉ　Ｏ
−’　　　　０．０４１量Ｉ剋ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　２３８．３　　　　　２
．５×１０−”　　　５９５７．５ＮａＯＨ４０２Ｏ１
１，２３Ｘ　Ｉ　Ｏ−”　　４９２−１２ＮａＨＣ０，
８４２Ｏ１３ｘ　１０−３２５２．０３ナトリウム（合
計）ミリモル　　　　　１２３．１カリウム（合計）ミ
リモル　　　　　　４．０ナトリウム：カリウム　　　
　　　　３０．７合計のモル浸透圧濃度（ｍｏｓｍ）　
　　　　３０２．７に記載する成分を含んでなることを
特徴とする生体外哺乳動物細胞培養のための基礎栄養培
地。

２、前記成分の各々は、前記第１項に記載する表に記載
する量で存在する前記第１項記載の栄養培地。

３、前記成分の各々は、前記第１項に記載する表に記載
する量の約５０％〜約２００％の量で存在する前記第１
項記載の栄養培地。

４、約２８５〜約３１５ミリ浸透モルのモル浸透圧濃度
を有する前記第１項記載の栄養培地。

５、約２９５〜約３０５ミリ浸透モルのモル浸透圧濃度
を有する前記第４項記載の栄養培地。

６、約７．０〜約８．０のｐＨ（３７℃）を有する前記
第１項記載の栄養培地。

７、約７．２のｐＨを有する前記第６項記載の栄養培地
。

８、約７．３５のｐＨを有する前記第６項記載の栄養培
地。

９、約２５〜約３５のナトリウム対カリウムの比を有す
る前記第１項記載の栄養培地。

１０、前記比は約３０である前記第９項記載の栄養培地
。

１１、規定された蛋白質が補充されている前記第１項記
載の栄養培地。

１２、前記蛋白質はアルブミン、鉄飽和トランスフェリ
ンおよびインスリンからなる前記第１１項記載の栄養培
地。

１３、アルブミンは約ｌ０００〜約１００μｇ／ｍｌの
濃度で存在し、鉄飽和トランスフェリンは約０．１〜約
２５　、　Ｏｐｇ／ｒｎＩの濃度で存在し、そしてイン
スリンは約１．０〜約１０．０μｇ／ｍｌの濃度で存在
する前記第１２項記載の栄養培地。

１４、血清または他の生物学的抽出物が補充されている
前記第１項記載の栄養培地。

１５、前記血清または抽出物は培地の約１容量％までの
比率で存在する前記第１４項記載の栄養培地。

１６、空気平衡化されている緩衝系からなる前記第１項
記載の栄養培地。

１７、前記第１項に記載する表に記載する最初の６０種
類の成分を含んでなることを特徴とする乾燥基礎栄養培
地調製物。

１８、前記成分の各々は、前記第１項に記載する表に記
載する量で存在する前記第１７項記載の乾燥栄養培地調
製物。

１９、前記成分の各々は、前記第１項に記載する表に記
載する量の約５０％〜約２００％の量で存在する前記第
１７項記載の乾燥栄養培地調製物。

２０、前記第１７項記載の乾燥調製物に、前記第１項に
記載する表の残りの２成分を添加することによって配合
されたことを特徴とする再構成された基礎栄養培地。

２１、約２８５〜約３１５ミリ浸透モルのモル浸透圧濃
度および約７．０〜約８．０のｐＨを有する前記第２０
項記載の再構成された栄養培地。

Claims

【特許請求の範囲】１）次表：￥成分￥　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
￥分子量￥　￥モル￥　　　　　　　　￥ｍｇ／ｌ￥￥
バルクイオンおよび微量元素￥ＣａＣｌ＿２・２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　１
４７．０２　１×１０＾−＾３　　　　　１４７．０２ＣｕＳＯ＿４・５Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
４９．６８　３×１０＾−＾９　　　　　　　０．００
０７４９ＦｅＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
７８．０２　１×１０＾−＾６　　　　　　　０．２７
８Ｆｅ（ＮＯ＿３）＿３・９Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　４
０４．０２　２×１０＾−＾７　　　　　　　０．０８
０８ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
７４．５５　４×１０＾−＾３　　　　　２９８．２ＭｇＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
４６．３８　８×１０＾−＾４　　　　　１９７．１ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５８．４４　１．０５×１０＾−＾１　６１３６．２Ｎａ＿２ＨＰＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
６８．１　　３×１０＾−＾４　　　　　　８０．４３ＮａＨ＿２ＰＯ＿４・２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　１
５６．０１　６×１０＾−＾４　　　　　　９３．６０
６Ｎａ＿２ＳｅＯＣｌ＿３・５Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　２
６３．０１　３×１０＾−＾８　　　　　　　０．００
７８９Ｎａ＿２ＳｉＯ＿３・９Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
８４．２　　１×１０＾−＾２　　　　　　　２．８４
２（ＮＨ＿４）６Ｍｏ＿７Ｏ＿２＿４・４Ｈ＿２Ｏ　１２
３５．９　　３×１０＾−＾９　　　　　　　０．００
３７１ＮＨ＿４ＶＯ＿３　　　　　　　　　　　　　　　　１
１６．９９　５×１０＾−＾１＾０　　　　　０．００
００５８５ＮｉＳＯ＿４・６Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
６２．８０　３×１０＾−＾１＾０　　　　　０．００
００７８８ＺｎＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
８７．５４　８×１０＾−＾７　　　　　　　０．２３￥必須アミノ酸￥Ｌ−Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
１０．７　　８×１０＾−＾４　　　　　１６８．５６Ｌ−Ｃｙｓ　ＨＣｌ．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　１
７５．６　　３×１０＾−＾４　　　　　　５２．６８Ｌ−Ｇｌｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
４６．１　　５×１０＾−＾３　　　　　７３０．５Ｌ−Ｈｉｓ　ＨＣｌ．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　２
０９．７　　２×１０＾−＾４　　　　　　４１．９４Ｌ−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　１
３１．１３　１×１０＾−＾４　　　　　　１３．１１
３Ｌ−Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３１．２　　６×１０＾−＾４　　　　　　７８．７２Ｌ−Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３１．２　　６×１０＾−＾４　　　　　　７８．７２Ｌ−Ｌｙｓ　Ｈｃｌ　　　　　　　　　　　　　　　１
８２．７　　８×１０＾−＾４　　　　　１４６．１６Ｌ−Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
４９．２　　１×１０＾−＾３　　　　　１４９．２Ｌ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
６５．２　　３×１０＾−＾４　　　　　　４９．５６Ｌ−Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
１９．１　　６×１０＾−＾４　　　　　　７１．４６Ｌ−Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
０４．２　　６×１０＾−＾５　　　　　　１２．２５
２Ｌ−Ｔｙｒ（ジＮａ＾＋）２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　２
３７．２　　３×１０＾−＾４　　　　　　７１．１６Ｌ−Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
１７．２　　６×１０＾−＾４　　　　　　７０．３２Ｌ−Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８９．０９　２×１０＾−＾５　　　　　　　１．７８
２Ｌ−Ａｓｎ．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　１
５０．１　　３×１０＾−＾４　　　　　　４５．０３Ｌ−Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３３．１　　２×１０＾−＾５　　　　　　　２．６６
２Ｌ−Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
４７．１　　２×１０＾−＾５　　　　　　２．９４２Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
７５．０７　３×１０＾−＾５　　　　　１２．２５２Ｌ−Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
１５．１　　２×１０＾−＾４　　　　　２３．０２Ｌ−Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０５．１　　３×１０＾−＾４　　　　　３１．５３￥アミノ酸誘導体￥グルタチオン　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
０７．３　　１×１０＾−＾６　　　　　　０．３０７プトレシン２ＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　１
６１．１　　３×１０＾−＾７　　　　　　０．０４８￥水溶性ビタミンおよび補酵素￥ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
４４．３　　３×１０＾−＾６　　　　　　０．００７Ｄ−Ｃａパントテネート　　　　　　　　　　　　　２
３８．３　　２×１０＾−　＾５　　　　　４．７６６葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
４１．４１　６×１０＾−＾６　　　　　　２．６４８フオリニン酸（Ｃａ＾＋）Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　６
０１．６　　１×１０＾−＾８　　　　　　０．６０２
５ニアシアンアミド（ニコチンアミド）　　　　　　　１
２２．１　　３×１０＾−＾５　　　　　　３．６６３アミノ安息香酸　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３７．１４　３×１０＾−＾６　　　　　　０．４１１ピリドキサールＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　２
０３．６　　１×１０＾−＾５　　　　　　２．０３６ピリドキシンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　２
０５．６　　３×１０＾−＾７　　　　　　０．０６２リボフラビン　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
７６．４　　８×１０＾−＾７　　　　　　０．３０１チアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　３
３７．０　　９×１０＾−＾６　　　　　　３．０３６ビタミンＢ１２　　　　　　　　　　　　　　　　１３
５５．４　　３×１０＾−＾７　　　　　　０．４０７￥炭水化物および誘導体￥Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　１
８０．１６　２×１０＾−＾２　　　３６０３．２Ｎａピルベート　　　　　　　　　　　　　　　　　１
１０．０　　１×１０＾−＾３　　　　１１０．０￥核酸誘導体￥アデニン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３５．１３　１×１０＾−＾６　　　　　　０．１３５ハイポキサンチン（Ｎａ＾＋）　　　　　　　　　　１
４６．１　　７×１０＾−＾６　　　　　　１．０２２
７チミジンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　３
３７．３　　１×１０＾−＾５　　　　　　３．３７３￥脂質および誘導体￥コリンクロライド　　　　　　　　　　　　　　　　１
３９．６３　１×１０＾−＾４　　　　　１３．９６エタノールアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　
９７．５５　２×１０＾−＾５　　　　　　１．９５１ｉ−イノシトール　　　　　　　　　　　　　　　　１
８０．２　　１×１０＾−＾４　　　　　１８．０２リノール酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
８０．４　　１×１０＾−＾７　　　　　　０．０２８リポ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
０６．３　　２×１０＾−＾７　　　　　　０．０４１￥緩衝剤￥ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
３８．３　　２．５×１０＾−＾２　５９５７．５ＮａＯＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
４０．０１　１．２３×１０＾−＾２　４９２．１２ＮａＨＣＯ＿３　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８４．０１　３×１０＾−＾３　　　　２５２．０３ナトリウム（合計）ミリモル　　　　　　　　　　　１
２３．１カリウム（合計）ミリモル　　　　　　　　　　　　　
　４．０ナトリウム：カリウム　　　　　　　　　　　　　　　
３０．７合計のモル浸透圧濃度（ｍｏｓｍ）　　　　　　　　３
０２．７に記載する成分を含んでなることを特徴とする生体外哺
乳動物細胞培養のための基礎栄養培地。２、前記成分の各々は、次表：￥成分￥　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　￥
分子量￥　　￥モル￥　　　　　　　　　￥ｍｇ／ｌ￥￥バルクイオンおよび微量元素￥ＣａＣｌ＿２・２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　１
４７．０２　１×１０＾−＾３　　　　　１４７．０２ＣｕＳＯ＿４・５Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
４９．６８　３×１０＾−＾９　　　　　　　０．００
０７４９ＦｅＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
７８．０２　１×１０＾−＾６　　　　　　　０．２７
８Ｆｅ（ＮＯ＿３）＿３・９Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　４
０４．０２　２×１０＾−＾７　　　　　　　０．０８
０８ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
７４．５５　４×１０＾−＾３　　　　　２９８．２ＭｇＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
４６．３８　８×１０＾−＾４　　　　　１９７．１ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５８．４４　１．０５×１０＾−＾１　６１３６．２Ｎａ＿２ＨＰＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
６８．１　　３×１０＾−＾４　　　　　　８０．４３ＮａＨ＿２ＰＯ＿４・２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　１
５６．０１　６×１０＾−＾４　　　　　　９３．６０
６Ｎａ＿２ＳｅＯ＿３・５Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
６３．０１　３×１０＾−＾８　　　　　　　０．００
７８９Ｎａ＿２ＳｉＯ＿３・９Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
８４．２　　１×１０＾−＾２　　　　　　　２．８４
２（ＮＨ＿４）６Ｍｏ＿７Ｏ＿２＿４・４Ｈ＿２Ｏ　１２
３５．９　　３×１０＾−＾９　　　　　　　０．００
３７１ＮＨ＿４ＶＯ＿３　　　　　　　　　　　　　　　　１
１６．９９　５×１０＾１−＾０　　　　　　０．００
００５８５ＮｉＳＯ＿４・６Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
６２．８０　３×１０＾−＾１＾０　　　　　０．００
００７８８ＺｎＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
８７．５４　８×１０＾−＾７　　　　　　　０．２３￥必須アミノ酸￥Ｌ−Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
１０．７　　８×１０＾−＾４　　　　　１６８．５６Ｌ−Ｃｙｓ　ＨＣｌ．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　１
７５．６　　３×１０＾−＾４　　　　　　５２．６８Ｌ−Ｇｌｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
４６．１　　５×１０＾−＾３　　　　　７３０．５Ｌ−Ｈｉｓ　ＨＣｌ．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　２
０９．７　　２×１０＾−＾４　　　　　　４１．９４Ｌ−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　１
３１．１３　１×１０＾−＾４　　　　　　１３．１１
３Ｌ−Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３１．２　　６×１０＾−＾４　　　　　　７８．７２Ｌ−Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３１．２　　６×１０＾−＾４　　　　　　７８．７２Ｌ−Ｌｙｓ　ＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　１
８２．７　　８×１０＾−＾４　　　　　１４６．１６Ｌ−Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
４９．２　　１×１０＾−＾３　　　　　１４９．２Ｌ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
６５．２　　３×１０＾−＾４　　　　　　４９．５６Ｌ−Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
１９．１　　６×１０＾−＾４　　　　　　７１．４６Ｌ−Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
０４．２　　６×１０＾−＾５　　　　　　１２．２５
２Ｌ−Ｔｙｒ（ジＮａ＾＋）２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　２
３７．２　　３×１０＾−＾４　　　　　　７１．１６Ｌ−Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
１７．２　　６×１０＾−＾４　　　　　　７０．３２Ｌ−Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８９．０９　２×１０＾−＾５　　　　　　　１．７８
２Ｌ−Ａｓｎ．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　１
５０．１　　３×１０＾−＾４　　　　　　４５．０３Ｌ−Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３３．１　　２×１０＾−＾５　　　　　　　２．６６
２Ｌ−Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
４７．１　　２×１０＾−＾５　　　　　　　２．９４
２Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
７５．０７　３×１０＾−＾５　　　　　　２．２５２Ｌ−Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
１５．１　　２×１０＾−＾４　　　　　２３．０２Ｌ−Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０５．１　　３×１０＾−＾４　　　　　３１．５３￥アミノ酸誘導体￥グルタチオン　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
０７．３　　１×１０＾−＾６　　　　　　０．３０７プトレシン２ＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　１
６１．１　　３×１０＾−＾７　　　　　　０．０４８￥水溶性ビタミンおよび補酵素￥ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
４４．３　　３×１０＾−＾８　　　　　　０．００７Ｄ−Ｃａパントテネート　　　　　　　　　　　　　２
３８．３　　２×１０＾−＾５　　　　　　４．７６６葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
４１．４１　６×１０＾−＾６　　　　　　２．６４８フオリニン酸（Ｃａ＾＋）Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　６
０１．６　　１×１０＾−＾６　　　　　　０．６０２
５ニアシアンアミド（ニコチンアミド）　　　　　　　１
２２．１　　３×１０＾−＾５　　　　　　３．６６３アミノ安息香酸　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３７．１４　３×１０＾−＾６　　　　　　０．４１１ピリドキサールＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　２
０３．６　　１×１０＾−＾５　　　　　　２．０３６ピリドキシンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　２
０５．６　　３×１０＾−＾７　　　　　　０．０６２リボフラビン　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
７６．４　　８×１０＾−＾７　　　　　　０．３０１チアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　３
３７．０　　９×１０＾−＾６　　　　　　３．０３６ビタミンＢ１２　　　　　　　　　　　　　　　　１３
５５．４　　３×１０＾−＾７　　　　　　０．４０７￥炭水化物および誘導体￥Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　１
８０．１６　２×１０＾−＾２　　　３６０３．２Ｎａピルベート　　　　　　　　　　　　　　　　　１
１０．０　　１×１０＾−＾３　　　　１１０．０￥核酸誘導体￥アデニン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３５．１３　１×１０＾−＾６　　　　　　０．１３５ハイポキサンチン（Ｎａ＾＋）　　　　　　　　　　１
４６．１　　７×１０＾−＾６　　　　　　１．０２２
７チミジンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　３
３７．３　　１×１０＾−＾５　　　　　　３．３７３￥脂質および誘導体￥コリンクロライド　　　　　　　　　　　　　　　　１
３９．６３　１×１０＾−＾４　　　　　１３．９６エタノールアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　
９７．５５　２×１０＾−＾５　　　　　　１．９５１ｉ−イノシトール　　　　　　　　　　　　　　　　１
８０．２　　１×１０＾−＾４　　　　　１８．０２リノール酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
８０．４　　１×１０＾−＾７　　　　　　０．０２８リボ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
０６．３　　２×１０＾−＾７　　　　　　０．０４１￥緩衝剤￥ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
３８．３　　２．５×１０＾−＾２　５９５７．５ＮａＯＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
４０．０１　１．２３×１０＾−＾２　４９２．１２ＮａＨＣＯ＿３　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８４．０１　３×１０＾−＾３　　　　２５２．０３ナトリウム（合計）ミリモル　　　　　　　　　　　１
２３．１カリウム（合計）ミリモル　　　　　　　　　　　　　
　４．０ナトリウム：カリウム　　　　　　　　　　　　　　　
３０．７合計のモル浸透圧濃度（ｍｏｓｍ）　　　　　　　　３
０２．７に記載する量の約５０％〜約２００％の量で存在する特
許請求の範囲第１項記載の栄養培地。３、約２８５〜約３１５ミリ浸透モルのモル浸透圧濃度
を有する特許請求の範囲第１項記載の栄養培地。４、約７．０〜約８．０のｐＨ（３７℃）を有する特許
請求の範囲第１項記載の栄養培地。５、約２５〜約３５のナトリウム対カリウムの比を有す
る特許請求の範囲第１項記載の栄養培地。６、規定された蛋白質が補充されている特許請求の範囲
第１項記載の栄養培地。７、前記蛋白質はアルブミン、鉄飽和トランスフェリン
およびインスリンからなる特許請求の範囲第７項記載の
栄養培地。８、血清または他の生物学的抽出物が補充されている特
許請求の範囲第１項記載の栄養培地。９、次表：￥成分￥　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　￥
分子量￥　￥モル￥　￥ｍｇ／ｌ￥￥バルクイオンおよ
び微量元素￥ＣａＣｌ＿２・２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　１
４７．０２　１×１０＾−＾３　　　　　１４７．０２ＣｕＳＯ＿４・５Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
４９．６８　３×１０＾−＾９　　　　　　　０．００
０７４９ＦｅＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
７８．０２　１×１０＾−＾６　　　　　　　０．２７
８Ｆｅ（ＮＯ＿３）＿３・９Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　４
０４．０２　２×１０＾−＾７　　　　　　　０．０８
０８ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
７４．５５　４×１０＾−＾３　　　　　２９８．２ＭｇＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
４６．３８　８×１０＾−＾４　　　　　１９７．１ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５８．４４　１．０５×１０＾−＾１　６１３６．２Ｎａ＿２ＨＰＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
６８．１　　３×１０＾−＾４　　　　　　８０．４３ＮａＨ＿２ＰＯ＿４・２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　１
５６．０１　６×１０＾−＾４　　　　　　９３．６０
６Ｎａ＿２ＳｅＯ＿３・５Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
６３．０１　３×１０＾−＾８　　　　　　　０．００
７８９Ｎａ＿２ＳｉＯ＿３・９Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
８４．２　　１×１０＾−＾２　　　　　　　２．８４
２（ＮＨ＿４）６Ｍｏ＿７Ｏ＿２＿４・４Ｈ＿２Ｏ　１２
３５．９　　３×１０＾−＾９　　　　　　　０．００
３７１ＮＨ＿４ＶＯ＿３　　　　　　　　　　　　　　　　１
１６．９９　５×１０＾−＾１＾０　　　　　０．００
００５８５ＮｉＳＯ＿４・６Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
６２．８０　３×１０＾−＾１＾０　　　　　０．００
００７８８ＺｎＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
８７．５４　８×１０＾−＾７　　　　　　　０．２３￥必須アミノ酸￥Ｌ−Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
１０．７　　８×１０＾−＾４　　　　　１６８．５６Ｌ−Ｃｙｓ　ＨＣｌ．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　１
７５．６　　３×１０＾−＾４　　　　　　５２．６８Ｌ−Ｇｌｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
４６．１　　５×１０＾−＾３　　　　　７３０．５Ｌ−Ｈｉｓ　ＨＣｌ２．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
０９．７　　２×１０＾−＾４　　　　　　４１．９４Ｌ−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｐｒｏ　　　　　　　　　　１３
１．１３　１×１０＾−＾４　　　　　１３．１１３Ｌ−Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３
１．２　　６×１０＾−＾４　　　　　７８．７２Ｌ−Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３
１．２　　６×１０＾−＾４　　　　　７８．７２Ｌ−Ｌｙｓ　ＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　１８
２．７　　８×１０＾−＾４　　　　１４６．１６Ｌ−Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４
９．２　　１×１０＾−＾３　　　　１４９．２Ｌ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６
５．２　　３×１０＾−＾４　　　　　４９．５６Ｌ−Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１
９．１　　６×１０＾−＾４　　　　　７１．４６Ｌ−Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
４．２　　６×１０＾−＾５　　　　　１２．２５２Ｌ−Ｔｙｒ（ジＮａ＾＋）２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　２３
７．２　　３×１０＾−＾４　　　　　７１．１６Ｌ−Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１
７．２　　６×１０＾−＾４　　　　　７０．３２Ｌ−Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８
９．０９　２×１０＾−＾５　　　　　　１．７８２Ｌ−Ａｓｎ．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　　１５
０．１　　３×１０＾−＾４　　　　　４５．０３Ｌ−Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３
３．２×１０＾−＾５　　　　　　２．６６２Ｌ−Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４
７．１　　２×１０＾−＾６　　　　　　２．９４２Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７
５．０７　３×１０＾−＾５　　　　　　２．２５２Ｌ−Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１
５．１　　２×１０＾−＾４　　　　　２３．０２Ｌ−Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
５．１　　３×１０＾−＾４　　　　　３１．５３￥アミノ酸誘導体￥グルタチオン　　　　　　　　　　　　　　　　　３０
７．３　　１×１０＾−＾６　　　　　　０．３０７プ
トレシン２ＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　１６１．１　　
３×１０＾−＾７　　　　　　０．０４８￥水溜性ビタミンおよび補酵素￥ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２４
４．３　　３×１０＾−＾６　　　　　　０．００７Ｄ−Ｃａパントテネート　　　　　　　　　　　　２３
８．３　　２×１０＾−＾５　　　　　　４．７６６葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４４
１．４１　６×１０＾−＾６　　　　　　２．６４８フオリニン酸（Ｃａ＾＋）Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　６０
１．６　　１×１０＾−＾６　　　　　　０．６０２５ニアシアンアミド（ニコチンアミド）　　　　　　１２
２．１　　３×１０＾−＾５　　　　　　３．６６３アミノ安息香酸　　　　　　　　　　　　　　　　１３
７．１４　３×１０＾−＾６　　　　　　０．４１１ピリドキサールＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　２０
３．６　　１×１０＾−＾５　　　　　　２．０３６ピリドキシンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　２０
５．６　　３×１０＾−＾７　　　　　　０．０６２リボフラビン　　　　　　　　　　　　　　　　　３７
６．４　　８×１０＾−＾７　　　　　　０．３０１チアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　３３７
．０　　９×１０＾−＾６　　　　　　３．０３６ビタミンＢ１２　　　　　　　　　　　　　　　１３５
５．４　　３×１０＾−＾７　　　　　　０．４０７￥炭水化物および誘導体￥Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　１８
０．１６　２×１０＾−＾２　　　３６０３．２Ｎａピルベート　　　　　　　　　　　　　　　　１１
０．０　　１×１０＾−＾３　　　　１１０．０￥核酸誘導体￥アデニン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３
５．１３　１×１０＾−＾６　　　　　　０．１３５ハイポキサンチン（Ｎａ＾＋）　　　　　　　　　１４
６．１　　７×１０＾−＾６　　　　　　１．０２２７チミジンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　３３
７．３　　１×１０＾−＾５　　　　　　３．３７３￥脂質および誘導体￥コリンクロライド　　　　　　　　　　　　　　　１３
９．６３　１×１０＾−＾４　　　　　１３．９６エタノールアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　９
７．５５　２×１０＾−＾５　　　　　　１．９５１ｉ−イノシトール　　　　　　　　　　　　　　　１８
０．２　　１×１０＾−＾４　　　　　１８．０２リノール酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　２８
０．４　　１×１０＾−＾７　　　　　　０．０２８リポ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
６．３　　２×１０＾−＾７　　　　　　０．０４１￥緩衝剤￥ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２３
８．３　　２．５×１０＾−＾２　５９５７．５ＮａＯＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
０．０１　１．２３×１０＾−＾２　４９２．１２ＮａＨＣＯ＿３　　　　　　　　　　　　　　　　　８
４．０１　３×１０＾−＾３　　　　２５２．０３ナトリウム（合計）ミリモル　　　　　　　　　　１２
３．１カリウム（合計）ミリモル　　　　　　　　　　　　　
４．０ナトリウム：カリウム　　　　　　　　　　　　　　３
０．７合計のモル浸透圧濃度（ｍｏｓｍ）　　　　　　　３０
２．７に記載する最初の６０種類の成分を含んでなることを特
徴とする乾燥基礎栄養培地調製物。１０、前記成分の各々は、次表：￥成分￥　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　￥
分子量￥　　￥モル￥　　　　　　　　￥ｍｇ／ｌ￥￥バルクイオンおよび微量元素￥ＣａＣｌ＿２・２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　１
４７．０２　１×１０＾−＾３　　　　　１４７．０２ＣｕＳＯ＿４・５Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
４９．６８　３×１０＾−＾９　　　　　　　０．００
０７４９ＦｅＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
７８．０２　１×１０＾−＾６　　　　　　　０．２７
８Ｆｅ（ＮＯ＿３）＿３・９Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　４
０４．０２　２×１０＾−＾７　　　　　　　０．０８
０８ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
７４．５５　４×１０＾−＾３　　　　　２９８．２ＭｇＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
４６．３８　８×１０＾−＾４　　　　　１９７．１ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５８．４４　１．０５×１０＾−＾１　６１３６．２Ｎａ＿２ＨＰＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
６８．１　　３×１０＾−＾４　　　　　　８０．４３ＮａＨ＿２ＰＯ＿４・２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　１
５６．０１　６×１０＾−＾４　　　　　　９３．６０
６Ｎａ＿２ＳｅＯ＿３・５Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
６３．０１　３×１０＾−＾８　　　　　　　０．００
７８９Ｎａ＿２ＳｉＯ＿３・９Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　２
８４．２　　１×１０＾−＾２　　　　　　　２．８４
２（ＮＨ＿４）６Ｍｏ＿７Ｏ＿２＿４・４Ｈ＿２Ｏ　１２
３５．９　　３×１０＾−＾９　　　　　　　０．００
３７１ＮＨ＿４ＶＯ＿３　　　　　　　　　　　　　　　　１
１６．９９　５×１０＾−＾１＾０　　　　　０．００
００５８５ＮｉＳＯ＿４・６Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
６２．８０　３×１０＾−＾１＾０　　　　　０．００
００７８８ＺｎＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　２
８７．５４　８×１０＾−＾７　　　　　　　０．２３￥必須アミノ酸￥Ｌ−Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
１０．７　　８×１０＾−＾４　　　　　１６８．５６Ｌ−Ｃｙｓ　ＨＣｌ．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　１
７５．６　　３×１０＾−＾４　　　　　　５２．６８Ｌ−Ｇｌｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
４６．１　　５×１０＾−＾３　　　　　７３０．５Ｌ−Ｈｉｓ　ＨＣｌ．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　２
０９．７　　２×１０＾−＾４　　　　　　４１．９４Ｌ−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　１
３１．１３　１×１０＾−＾４　　　　　　１３．１１
３Ｌ−Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１３１．２　　６×１０＾−＾４　　　　　７８．７
２Ｌ−Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１３１．２　　６×１０＾−＾４　　　　　７８．７
２Ｌ−Ｌｙｓ　ＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　
　１８２．７　　８×１０＾−＾４　　　　１４６．１
６Ｌ−Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１４９．２　　１×１０＾−＾３　　　　１４９．２Ｌ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１６５．２　　３×１０＾−＾４　　　　　４９．５
６Ｌ−Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１１９．１　　６×１０＾−＾４　　　　　７１．４
６Ｌ−Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２０４．２　　６×１０＾−＾５　　　　　１２．２
５２Ｌ−Ｔｙｒ（ジＮａ＾＋）２Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　
　２３７．２　　３×１０＾−＾４　　　　　７１．１
６Ｌ−Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１１７．２　　６×１０＾−＾４　　　　　７０．３
２Ｌ−Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　８９．０９　２×１０＾−＾５　　　　　　１．７
８２Ｌ−Ａｓｎ．Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　
　１５０．１　　３×１０＾−＾４　　　　　４５．０
３Ｌ−Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１３３．１　　２×１０＾−＾５　　　　　　２．６
６２Ｌ−Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１４７．１　　２×１０＾−＾５　　　　　　２．９
４２Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　７５．０７　３×１０＾−＾５　　　　　　２．２
５２Ｌ−Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１１５．１　　２×１０＾−＾４　　　　　２３．０
２Ｌ−Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１０５．１　　３×１０＾−＾４　　　　　３１．５
３￥アミノ酸誘導体￥グルタチオン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　３０７．３　　１×１０＾−＾６　　　　　　０．３
０７プトレシン２ＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　
　１６１．１　　３×１０＾−＾７　　　　　　０．０
４８￥水溶性ビタミンおよび補酵素￥ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２４４．３　　３×１０＾−＾６　　　　　　０．０
０７Ｄ−Ｃａパントテネート　　　　　　　　　　　　　　
　２３８．３　　２×１０＾−＾５　　　　　　４．７
６６葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　４４１．４１　６×１０＾−＾６　　　　　　２．６
４８フオリニン酸（Ｃａ＾＋）Ｈ＿２Ｏ　　　　　　　　　
　６０１．６　　１×１０＾−＾６　　　　　　０．６
０２５ニアシアンアミド（ニコチンアミド）　　　　　　　　
　１２２．１　　３×１０＾−＾５　　　　　　３．６
６３アミノ安息香酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１３７．１４　３×１０＾−＾６　　　　　　０．４
１１ピリドキサールＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　
　２０３．６　　１×１０＾−＾５　　　　　　２．０
３６ピリドキシンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　
　２０５．６　　３×１０＾−＾７　　　　　　０．０
６２リボフラビン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　３７６．４　　８×１０＾−＾７　　　　　　０．３
０１チアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　３３７．０　　９×１０＾−＾６　　　　　　３．０
３６ビタミンＢ１２　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１３５５．４　　３×１０＾−＾７　　　　　　０．４
０７￥炭水化物および誘導体￥Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１８０．１６　２×１０＾−＾２　　　３６０３．２Ｎａピルベート　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１１０．０　　１×１０＾−＾３　　　　１１０．１￥核酸誘導体￥アデニン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１３５．１３　１×１０＾−＾６　　　　　　０．１
３５ハイポキサンチン（Ｎａ＾＋）　　　　　　　　　　　
　１４６．１　　７×１０＾−＾８　　　　　　１．０
２２７チミジンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　３３７．３　　１×１０＾−＾５　　　　　　３．３
７３￥脂質および誘導体￥コリンクロライド　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１３９．６３　１×１０＾−＾４　　　　　１３．９
６エタノールアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　
　　９７．５５　２×１０＾−＾５　　　　　　１．９
５１ｉ−イノシトール　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１８０．２　　１×１０＾−＾４　　　　　１８．０
２リノール酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２８０．４　　１×１０＾−＾７　　　　　　０．０
２８リポ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２０６．３　　２×１０＾−＾７　　　　　　０．０
４１￥緩衝剤￥ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２３８．３　　２．５×１０＾−＾２　５９５７．５ＮａＯＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４０．０１　１．２３×１０＾−＾２　４９２．１
２ＮａＨＣＯ＿３　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　８４．０１　３×１０＾−＾３　　　　２５２．０
３ナトリウム（合計）ミリモル　　　　　　　　　　　　
　１２３．１カリウム（合計）ミリモル　　　　　　　　　　　　　
　　　４．０ナトリウム：カリウム　　　　　　　　　　　　　　　
　　３０．７合計のモル浸透圧濃度（ｍｏｓｍ）　　　　　　　　　
　３０２．７に記載する量の約５０％〜約２００％の量で存在する特
許請求の範囲第９項記載の乾燥栄養培地調製物。