BR112014000522B1 - Meio de cultura e método para cultivar salmonella e e. coli - Google Patents
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Abstract
meio de cultura, método para cultivar salmonella e e. coli e método para detectar salmonella e e. coli. a presente invenção refere-se a meios de cultura, composições para suplementar meios de cultura, e métodos para a cultura de amostras biológicas. em certas modalidades os métodos são métodos para detectar bactérias e em certas modalidades as bactérias incluem salmonella spp e em certas modalidades incluem e. coli spp. em certas modalidades os meios e as composições compreendem uma alcanolamina e um composto de cobalamina.
Description
[001] A presente invenção refere-se de modo geral a meio e métodos para cultura de micro-organismos e métodos para detectar micro-organismos.
[002] 1. Roof, D. M., & J. R. Roth. 1988. Ethanolamine utilization in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 170:3855-3863.
[003] 2. Roof, D. M., & J. R. Roth. 1989. Functions required for vitamin B12- dependent ethanolamine utilization in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 171:3316-3323.
[004] 3. Chang, G. W., & J. T. Chang. 1975. Evidence for the B12-dependent enzyme ethanolamine deaminase in Salmonella. Nature 254:150-151.
[005] 4. Garsin, D.A. 2010. Ethanolamine utilization in bacterial pathogens: role and regulation. Nat. Rev. Microbiol. 8 (4): 290-295.
[006] 5. Kofoid, E., C. Rappleye, I. Stojiljkovic, & J. Roth. 1999. The 17-gene ethanolamine (eut) operon of Salmonella typhimurium encodes five homologues of carboxysome shell proteins. J. Bacteriol. 181: 5317-5329.
[007] 6. Brinsmade S.R., Paldon T., Escalante-Semerena J.C. 2005. Minimal functions and physiological conditions required for growth of salmonella entérica on ethanolamine in the absence of the metabolosome. J. Bacteriol. 187(23): 8039-46.
[008] 7. Capítulo 4 intitulado Isolation and identification of Salmonella from, meat, poultry and eggs products in USDA/FSIS Microbiology Laboratory guidebook, 3rd Edition, Rev. #4, http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG 4 05.pdf
[009] 8. Capítulo 5B intitulado Detection and Isolation of non-O157 Shiga-toxin Producing Escherichia coli (STEC) from Meat Products in USDA/FSIS Microbiology Laboratory guidebook, 3rd Edition, Rev. #1, http://www.fsis.usda.gov/PDF/Mlg 5B 01.pdf
[0010] 9. Capítulo 5 intitulado Salmonella in FDA Bacterial Analytical Manual, 8th Edition, November 2011 Version, http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/Bacterio logicalAnalyticalManualBAM/ucm070149.htm
[0011] Em uma primeira modalidade a invenção divulga um meio de cultura compreendendo concentrações biologicamente eficazes de: um composto de cobalamina, e uma alcanolamina.
[0012] Em certas modalidades o composto de cobalamina é selecionado do grupo que consiste em cobalamina, metil cobalamina, adenosilcobalamina, hidroxocobalamina e cianocobalamina.
[0013] Em certas modalidades a alcanolamina é etanolamina.
[0014] Em certas modalidades a invenção divulga um meio de cultura bacteriana.
[0015] Em certas modalidades as bactérias são salmonella spp ou E. coli spp.
[0016] Em certas modalidades as bactérias são salmonella typhimurium, E. coli 157, Shigatoxin E. coli ou Enterohemorrhagic E. coli.
[0017] Em certas modalidades o composto de cobalamina está presente a uma concentração maior que cerca de 0,002M e a referida alcanolamina está presente a uma concentração maior que cerca de 0,001 mg/litro.
[0018] Em uma outra série de modalidades a invenção divulga um método para cultura de uma amostra biológica, o método compreendendo a etapa de incubar a amostra na presença de concentrações biologicamente eficazes de: um composto de cobalamina, e uma alcanolamina.
[0019] Em certas modalidades o composto de cobalamina é selecionado do grupo que consiste em cobalamina, metil cobalamina, adenosilcobalamina, hidroxocobalamina e cianocobalamina.
[0020] Em certas modalidades a alcanolamina é etanolamina.
[0021] Em certas modalidades o método é para cultura de bactérias.
[0022] Em certas modalidades as bactérias são salmonella spp ou E. coli spp.
[0023] Em certas modalidades as bactérias são salmonella typhimurium, E. coli 157, Shigatoxin E. coli ou Enterohemorrhagic E. coli.
[0024] Em certas modalidades a alcanolamina está presente a uma concentração maior que cerca de 0,002M e o referido composto de cobalamina está presente a uma concentração maior que cerca de 0,001 mg/litro.
[0025] O método é para detectar Salmonella spp ou E. coli spp em uma amostra.
[0026] Em certas modalidades o método é para detectar Salmonella spp ou E. coli spp em uma amostra e a alcanolamina é etanolamina.
[0027] Em certas modalidades o método compreende ainda uma etapa de PCR, ligação de lectina, difusão simples, difusão lateral, ligação de anticorpo, fluxo lateral, ou fluxo transversal.
[0028] Em uma outra série de modalidades a invenção divulga um método para cultivar preferencialmente Salmonella spp. e E. coli spp em um meio, o método compreendendo suplementar o meio com uma combinação biologicamente eficaz de um composto de cobalamina e uma alcanolamina.
[0029] Em uma outra série de modalidades a invenção divulga uma composição para suplementar um meio de cultura, a composição compreendendo: um composto de cobalamina, e uma alcanolamina.
[0030] Em certas modalidades o composto de cobalamina é selecionado do grupo que consiste em cobalamina, metil cobalamina, adenosilcobalamina, hidroxocobalamina e cianocobalamina.
[0031] Em certas modalidades a alcanolamina é etanolamina.
[0032] Em certas modalidades a composição é para o crescimento de bactérias.
[0033] Em uma modalidade as bactérias são salmonella spp ou E. coli spp.
[0034] Em uma outra série de modalidades a invenção divulga um método para dectectar salmonella typhimurium, E. coli 157, Shigatoxin E. coli e Enterohemorrhagic E. coli em uma amostra biológica, o método compreendendo cultivar a amostra na presença de uma concentração biologicamente eficaz de: etanolamina; e um composto de cobalamina selecionado do grupo que consiste em metil cobalamina, adenosilcobalamina, hidroxocobalamina e cianocobalamina.
[0035] Os aspectos e as vantagens da presente matéria tornar-se-ão mais aparentes à luz da seguinte descrição detalhada de modalidades selecionadas, ilustradas nas figuras em anexo. Como será percebido, a matéria divulgada e reivindicada é passível de modificações em vários aspectos, tudo sem se afastar do escopo das reivindicações. Por conseguinte, os desenhos e a descrição devem ser considerados como ilustrativos por natureza, e não como limitativos e a escopo completo da matéria está especificado nas reivindicações.
[0036] Nesta descrição, a palavra "compreendendo" é usada em um sentido não limitativo para indicar que os itens subsequentes à palavra estão incluídos, mas que itens não especificamente mencionados não estão excluídos. Ficará entendido que quando indicamos que uma modalidade compreende um aspecto ou característica, também é considerado que em variantes alternativas da modalidade a modalidade pode consistir ou pode consistir essencialmente no aspecto em questão. Uma referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" não exclui a possibilidade de mais de um dos elementos estarem presentes, a menos que nitidamente exigido pelo contexto que haja um e apenas um dos elementos.
[0037] Nesta descrição a menção de faixas numéricas por limites inclui todos os números contidos naquela faixa incluindo todos os números inteiros, todos os inteiros e todas as frações intermediárias (por exemplo, 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, e 5 etc.).
[0038] Nesta descrição as formas singulares "um" e "o" incluem os referentes plurais a menos que nitidamente indicado em contrário pelo contexto. Assim sendo, por exemplo, uma referência a uma composição contendo "um composto" inclui uma mistura de dois ou mais compostos.
[0039] Nesta descrição o termo "ou" geralmente é empregado em seu sentido incluindo "e/ou" a menos que nitidamente indicado em contrário pelo contexto.
[0040] Nesta descrição, a menos que indicado em contrário, todos os números expressando quantidades ou ingredientes, medida de propriedades e assim por diante usados no relatório descritivo e nas reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Por conseguinte, a menos que indicado em contrário ou necessário à luz do contexto, os parâmetros numéricos apresentados no descrição são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que os especialistas na técnica buscam obter utilizando as tecnologias da presente invenção e tendo em vista às imprecisões de medição e quantificação. Sem restringir a aplicação da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, todo parâmetro numérico deve ser pelo menos interpretado à luz do número de dígitos significativos apresentados e com a aplicação de técnicas comuns de arredondamento. A despeito das faixas e parâmetros numéricos apresentando o amplo escopo da descrição serem aproximações, seus valores numéricos apresentados nos exemplos específicos são considerados amplamente somente à medida que são consistentes com a validade da descrição e para distinguir a matéria divulgada e reivindicada da técnica anterior.
[0041] Nesta descrição os termos "meios", "meio", "caldo", "meio de cultura", "meios de cultura", "caldo de cultura" e similares referem-se todos a uma mistura de nutrientes adequada para cultivar um microorganismo desejado que pode ser uma cepa ou espécie de bactéria ou micróbio ou micro-organismo ou patógeno. Em certas modalidades o meio pode ser ou pode compreender qualquer meio essencial conforme definição dada neste descrição e pode ser preparado na forma de um pó ou concentrado.
[0042] Em certas modalidades os meios contêm um tampão de pH. Em uma série de modalidades o tampão de pH é uma mistura de fosfato de potássio monobásico e dibásico, mas tampões biologicamente compatíveis alternativos podem ser adequados, tais como MOPS (também conhecido como ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico, ácido 3-morfolinopropano-1-sulfônico; ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico; ácido 3-N-morfolino propanossulfônico; e ácido 4-morfolinopropanossulfônico), e tampões do tipo carbonato de cálcio adequados, e serão facilmente selecionados e implementados pelos especialistas na técnica, para atingir um pH desejado para o meio.
[0043] Em certas modalidades, o meio pode ser apresentado na forma de um pó ou concentrado geralmente também chamado de "pó", "concentrado", "meio em pó", "pó de meio", "concentrado de meio", "meio concentrado" ou similar, compreendendo uma pluralidade de componentes e adequados para serem combinados com um volume predeterminado de água para proporcionar um meio líquido com concentrações desejadas dos componentes particulares. Tal meio em pó ou meio concentrado pode ser completo, o que significa que basta dissolver o mesmo em água adequada, normalmente água estéril, antes do uso. Alternativamente, em certas modalidades um meio em pó ou concentrado pode ser parcial, o que significa que componentes adicionais precisam ser acrescentados para proporcionar um meio completo para uso. Em certas modalidades um meio em pó ou concentrado também inclui um meio que é pelo menos parcialmente hidratado na forma concentrada adequada para diluição para produzir o meio para uso efetivo em cultura de bactérias. Ficará entendido que o termo "meio" ou "meios", conforme usado neste descrição, a menos que indicado em contrário pelo contexto, inclui tanto o meio final tendo componentes a concentrações adequadas para a cultura de bactérias e micro-organismos, quanto o meio em pó ou concentrado adequado para diluição. Os termos meio de enriquecimento "ActeroSalmonella/STEC" ou meio "AEM" e termos similares são usados para indicar de modo geral o meio de acordo com as modalidades.
[0044] Neste descrição os termos "Vitamina B12" e "cobalamina" têm seu significado usual e ambos referem-se à vitamina tendo a fórmula estrutural mostrada na FIG. 1A, em que R representa qualquer grupo que seja compatível com a atividade substancialmente normal da Vitamina B12 ou com uma atividade adequada para uso em certas modalidades da matéria reivindicada neste descrição. Em modalidades particulares e sem limitação do acima exposto o ligante R coordenado ao íon Co2+ central pode ser Me, OH, CN, 5’-desoxiadenosil. A título de exatidão e sem limitação, nomes alternativos para a vitamina B12 e derivados biologicamente ativos da mesma incluem: B-12, B12, Vitamina do Complexo B, Bedumil, Cobalamina, Cobalamina, Cobamina, Cobamina, Complexo Vitamínico B, Cianocobalamina, Cianocobalamina, Cianocobalaminum, Cicobemina, Hidroxocobalamina, Hidroxocobalamina, Hidroxocobalaminum, Hidroxocobemina, Hidroxocobémine, Idrossocobalamina, Metilcobalamina, Metilcobalamina, Vitadurin, Vitadurine, Vitamina B12, Vitamina B12, riboflavina, Vitamina B2; Flavin; Flavina; Lactoflavin; Riboflavina; Vitamina B - 2; e Vitamina G.
[0045] Similarmente, o termo "composto de cobalamina" será interpretado como incluindo todos os compostos substancialmente biologicamente equivalentes à Vitamina B12 ou cobalamina. A título de exemplo e sem limitação os especialistas na técnica vão entender facilmente que em certas modalidades uma referência à Vitamina B12 ou compostos de cobalamina deve ser interpretada como incluindo cianocobalamina, metil cobalamina, adenosil cobalamina, hidroxil cobalamina e outras substâncias químicas funcionalmente equivalentes, todas elas sendo facilmente identificadas pelos especialistas na técnica.
[0046] Ficará ainda entendido que em certas modalidades uma variedade de formas modificadas ou conjugadas da cobalamina podem ser biologicamente eficazes e todas elas serão facilmente reconhecidas pelos especialistas na técnica e serão consideradas como incluídas no termo "composto de cobalamina". No aspecto amplo, compostos de cobalamina podem incluir quaisquer compostos da estrutura geral ilustrada na FIG. 1B, em que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15 podem ser iguais ou diferentes uns dos outros, e podem ser independentemente H ou podem ser alquil de cadeia reta ou ramificada, cíclico, cicloalquil, e podem ser ramificados ou substituídos de várias maneiras, todas facilmente aparentes pelos especialistas na técnica e podem independentemente compreender, ou compreender pelo menos 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais átomos de carbono. Nas modalidades particulares e sem restrição do acima exposto o ligante R15 coordenado ao íon Co2+ central pode ser Me, OH, CN, 5’-desoxiadenosil.
[0047] Nesta descrição o termo "alcanolaminas", também alternativamente denominadas "aminoalcoóis" significa compostos orgânicos compreendendo um grupo álcool e um grupo amino em um esqueleto alcano. Exemplos não limitativos de alcanolaminas incluem metanolamina, etanolamina, dimetiletanolamina, N-metiletanolamina, heptaminol, isoetarina, norepinefrina, propanolaminas, pentanolaminas, esfingosina, dialcanolaminas tendo a fórmula N(H)R1,R2 e trialquilanolaminas tendo a fórmula NR1,R2,R3. Em modalidades particulares uma alcanolamina pode ser etanolamina ou pode compreender um esqueleto tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais átomos de carbono e pode compreender mais de um grupo amina, ou mais de um grupo hidroxil ou mais de um grupo amina e mais de um grupo hidroxil. Em certas modalidades, as alcanolaminas pode ser alcanolaminas substituídas. Em modalidades particulares uma alcanolamina pode ser etanolamina. A título de exatidão, nomes alternativos para etanolamina incluem monoetanolamina, 2-aminoetanol, colamina, Aminoetanol, 2-hidroxietilamina, Glicinol, Olamina, Etilolamina, 2-Amino-1-etanol. Em modalidades particulares, as alcanolaminas são selecionadas do grupo que consiste em: propileno glicol, monoisopropanol, etileno glicol, 2-1aminoacetaldeído, aminopropionitrila, etilenodiamina, 2-aminopropanol, 1,2,diaminopropano, N-metilaminoetanol,2-hidroxietil-hidrazina, 3-amino-1-propanol, 2-fluoretanol, glicolamida, 2-aminoetanol, (R)-(-)1,2,propanodiol.
[0048] Ficará entendido que nesta descrição, a menos que indicado em contrário pelo contexto, uma referência a um meio ou uma solução compreendendo alcanolamina ou compostos de cobalamina ou a "uma" alcanolamina ou "um" composto de cobalamina ou similar, pode incluir duas, três ou uma pluralidade de alcanolaminas ou de compostos de cobalamina ou de alcanolaminas e compostos de cobalamina. Por conseguinte, a título de exemplo e não limitativo a especificação de que um meio compreende 1 grama por litro de alcanolamina contempla que o 1 grama pode compreender uma mistura de diferentes alcanolaminas cujos pesos em conjunto totalizam 1 grama. Da mesma forma e mais uma vez a título de exemplo e não limitativo a estipulação de que uma mistura compreende 1 grama de composto de cobalamina deve ser interpretada como contemplando que o 1 grama compreende porções de um ou mais compostos de cobalamina, por exemplo metilcobalamina, cianocobalamina e/ou outros compostos de cobalamina, cujas quantidades em conjunto totalizam 1 grama.
[0049] Nesta descrição o verbo "tamponar" significa estabilizar o pH de uma solução, que pode ser um meio de cultura, em uma faixa predeterminada, de maneiras que serão facilmente evidentes para os especialistas na técnica. O substantivo "tampão" significa uma substância química adequada para estabilizar o pH de uma solução.
[0050] Neste descrição o termo meio ou caldo "básico" ou "essencial" refere-se a um caldo parcial compreendendo certos compostos básicos necessários facilmente reconhecidos pelos especialistas na técnica, e cuja composição detalhada pode ser varia e ainda assim permitir o crescimento dos micro-organismos a serem cultivados. Portanto, em certas modalidades e sem limitação, meio essencial pode compreender sais, tampão, e extrato de proteína, e em certas modalidades pode compreender cloreto de sódio, fosfato de sódio monobásico e dibásico, sulfato de magnésio e cloreto de cálcio. Em certas modalidades um litro de meio essencial pode ter a receita geral mostrada na Tabela 1, mas em modalidades alternativas o meio essencial vai ou pode compreender um ou mais dentre água, ágar, proteínas, aminoácidos, hidrolisado de caseína, sais, lipídios, carboidratos, sais, minerais, e tampões de pH e pode conter extratos tais como extrato de carne, extrato de levedura, triptona, fitona, peptona, e extrato de malte, e em certas modalidades o meio pode ser ou pode compreender meio luria bertani (LB); meio LB com baixo teor de sal (1% de peptona, 0,5% de extrato de levedura, e 0,5% de NaCl), meio SOB (2% de peptona, 0,5% de extrato de levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCh, 10 mM de MgSO4), meio SOC (2% de peptona, 0,5% de extrato de levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4, 20 mM de glicose), Superbroth (3,2% de peptona, 2% de extrato de levedura, e 0,5% de NaCl), meio 2xTY (1,6% de peptona, 1% de extrato de levedura, e 0,5% de NaCl), TerrificBroth (TB) (1,2% de peptona, 2,4% de extrato de levedura, 72 mM de K2HPO4, 17 mM de KH2PO4, e 0,4% de glicerol), caldo LB Miller ou caldo LB Lennox (1% de peptona, 0,5% de extrato de levedura, e 1% de NaCl). Ficará entendido que nas modalidades particulares um ou mais componentes podem ser omitidos do meio essencial. Em certas modalidades o meio pode ser um meio simples, complexo ou definido e pode ser um meio enriquecido e pode ser suplementado de uma ampla variedade de maneiras, todas elas sendo facilmente entendidas pelos especialistas na técnica. Em um amplo aspecto os especialistas na técnica entenderão que o meio contempla qualquer composição geralmente adequada para dar suporte ao crescimento de um ou mais microorganismos.
Tabela 1: Receita básica para meio essencial de acordo com uma modalidade
Tabela 1: Receita básica para meio essencial de acordo com uma modalidade
[0051] Na Tabela 1, X e Y são valores numéricos expressos em gramas. Cada um de X e Y pode ser independentemente 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11,0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19. 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0,11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0 ou mais de 19,0, ou qualquer números intermediário e nas modalidades particulares a faixa X a Y pode ser delimitada por quaisquer valores de X e Y. Ficará entendido que nas modalidades particulares extrato de levedura pode ser usado em várias formas e uma gama de alternativas para o extrato de levedura Bacto TM será facilmente selecionada pelos especialistas na técnica. A título de exemplo, em modalidades particulares, triptona, extratos de carne, e extratos vegetais podem ser alternativas adequados, tampões alternativos podem ser usados e em algumas modalidades sais alternativos de magnésio, cálcio e sódio podem ser usados e em modalidades particulares alternativas para magnésio, cálcio e sódio podem ser selecionadas. Os especialistas na técnica vão facilmente fazer ajustes adequados na receita para o meio básico para satisfazer propósitos particulares. Ficará entendido que toda e qualquer variante do meio básico que seja compatível com a eficiência do enriquecimento divulgado nesta descrição destina-se a estar incluída no escopo da matéria reivindicada.
[0052] A Tabela 2 mostra a receita para uma modalidade possível do meio essencial.
Tabela 2: Meio essencial de acordo com uma modalidade
Tabela 2: Meio essencial de acordo com uma modalidade
[0053] Os versados na técnica vão compreender facilmente que o crescimento de um micro-organismo desejado será promovido melhor a temperaturas selecionadas adequadas para o micro-organismo em questão. Em modalidades particulares o cultivo pode ser realizado a cerca de 39°C e o caldo a ser usado pode ser preaquecido até esta temperatura em preparação para inoculação com uma amostra para testagem. Em certas modalidades divulgadas nesta descrição, o cultivo pode ser realizado a qualquer temperatura entre 33°C e 43°C e pode ser realizado a cerca de 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, ou 39°C, ou 40°C, ou 41°C ou 42°C ou 43°C ou entre 33°C e 34°C, 34°C e 35°C, 35°C e 36°C, 36°C e 37°C, 37°C e 38°C, 38°C e 39°C, 39°C e 40°C, 40°C e 41°C, 41°C e 42°C, ou 42°C e 43°C ou a uma temperatura entre 34°C e 43°C, ou entre 35°C e 42°C, ou entre 36°C e 42°C, 38°C e 42°C ou entre 39°C e 41°C ou entre 39°C e 40°C ou entre 38°C e 39°C, ou entre 39°C e 40°C, ou entre 40°C e 41°C, ou entre 41°C e 42°C ou entre 42°C e 43°C.
[0054] Nesta descrição "enriquecimento" ou "suplementação" de meio refere-se à adição de componentes selecionados (também denominados "suplementos" ou coletivamente "suplemento") para promover o crescimento, a proliferação ou outras características de um ou mais micro-organismos desejados, um meio "enriquecido" ou "suplementado" é um meio que tenha sido enriquecido dessa maneira. Uma "solução de enriquecimento" ou "solução de suplemento" ou "suplemento" ou "solução aditiva" refere-se a uma solução compreendendo esses componentes adicionais. Em certas modalidades os componentes incluídos em uma solução de enriquecimento podem compreender uma combinação biologicamente eficaz de alcanolamina e um composto de cobalamina e em certas modalidades a alcanolamina pode ser etanolamina e o composto de cobalamina pode ser selecionado do grupo que consiste em cobalamina, metil cobalamina, adenosilcobalamina, hidroxocobalamina e cianocobalamina. Em modalidades particulares um suplemento pode promover ou selecionar pelo crescimento de Salmonella spp ou E. coli spp. Ficará entendido que um suplemento ou solução de enriquecimento pode compreender concentrações de seus princípios ativos substancialmente acima das concentrações finais desejadas de tais princípios, de modo que a adição do suplemento ao meio receptor pode ser feita sem alterações indesejável ou excessiva no volume ou concentração dos componentes essenciais do meio receptor. Em certas modalidades as soluções de enriquecimento podem compreender cerca de 1 mg/ml composto de cobalamina ou cerca de 0,125 mg/ml de composto de cobalamina ou cerca de 16,6M de alcanolamina, ou podem compreender o composto de cobalamina e a alcanolamina em concentrações relativas e absolutas para que sua adição a um meio seja biologicamente eficaz para promover o crescimento de E. Coli spp e Salmonella spp. Em certas modalidades a alcanolamina pode ser etanolamina e o composto de cobalamina pode ser cobalamina.
[0055] Em certas modalidades o enriquecimento de um meio pode compreender adicionar a cerca de um litro do meio cerca de 4 ml de solução de composto de cobalamina a 0,125mg/ml e cerca de 2 ml de uma solução 16,6M de alcanolamina e em certas modalidades a alcanolamina pode ser etanolamina e o composto de cobalamina pode ser cobalamina. Entretanto, será facilmente compreendido pelos versados na técnica que essas quantidades podem ser variadas para se adequar a exigências particulares, e em modalidades alternativas o meio enriquecido final pode conter cerca de 1x10-6, 2x10-6, 3x10-6, 4x10-6, 5x10-6, bx10-6, 7x10-6, 8x10-6, 9x10-6, 1x10-5, 2x10-5, 3x10-5, 4x10-5, 5x10-5, bx10-5, 7x10-5, 8x10-5, 9x10-5, 1x10-4, 2x10-4, 3x10-4, 4x10-4, 5x10-4, bx10-4, 7x10-4, 8x10-4, 9x10-4, 1x10-3, 2x10-3, 3x10-3, 4x10-3, 5x10-3, bx10-3, 7x10-3, 8x10-3, 9x10-3, 1x10-2, 2x10-2, 3x10-2, 4x10-2, 5x10-2, bx10-2, 7x10-2, 8x10-2, 9x10-2, 1x10-1, 2x10-1, 3x10-1, 4x10-1, 5x10-1, bx10-1, 7x10-1, 8x10-1, 9x10-1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, b0, 70, 80, 90, 1x102, 2x102, 3x102, 4x102, 5x102, bx102, 7x102, 8x102, 9x102, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, bx103, 7x103, 8x103, 9x103, ou mais de 9x103g/litro de composto de cobalamina e em modalidades particulares o composto de cobalamina pode variar em uma faixa cujos limites superior e inferior são definidos por qualquer um dos valores acima e pode ser de cerca de 1x10-3 g/litro e em modalidades particulares pode variar entre 1x10-4e 1x10-1 g/litro, ou entre 1x10-4 e 1 g/litro ou pode ser maior que 1x10-4 g/litro, 1x10-3g/litro, 1x10-2g/litro ou 1x10-1g/litro. Similarmente será facilmente entendido pelos especialistas na técnica que a concentração de alcanolamina no meio enriquecido pode aproximar-se ou exceder 0,02M de alcanolamina, mas em modalidades particulares o meio enriquecido pode conter pelo menos ou mais de cerca de 1x10-6, 2x10-6, 3x10-6, 4x10-6, 5x10-6, 6x10-6, 7x10-6, 8x10-6, 9x10-6, 1x10-5, 2x10-5, 3x10-5, 4χ10-5, 5χ10-5, 6χ10-5, 7χ10-5, 8χ10-5, 9χ10-5, 1χ10-4, 2χ10-4, 3χ10-4, 4χ10-4, 5χ10-4, 6χ10-4, 7χ10-4, 8χ10-4, 9χ10-4, 1χ10-3, 2χ10-3, 3χ10-3, 4χ10-3, 5χ10-3, 6χ10-3, 7χ10-3, 8χ10-3, 9χ10-3, 1χ10-2, 2χ10-2, 3χ10-2, 4χ10-2, 5χ10-2, 6χ10-2, 7χ10-2, 8χ10-2, 9χ10-2, 1χ10-1, 2χ10-1, 3χ10-1, 4χ10-1, 5χ10-1, 6χ10-1, 7χ10-1, 8χ10-1, 9χ10-1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 1χ102, 2χ102, 3χ102, 4χ102, 5χ102, 6χ102, 7χ102, 8χ102, 9χ102, 1χ103, 2χ103, 3χ103, 4χ103, 5χ103, 6χ103, 7χ103, 8χ103, 9χ103 de etanolamina ou um precursor biologicamente eficaz ou uma forma modificada do mesmo e em modalidades particulares pode conter entre 2x10-3 e 2x10-1M de alcanolamina, e em certas modalidades pode conter entre 2x10-3 e 2M de alcanolamina e em certas modalidades a alcanolamina pode ser ou pode compreender etanolamina. Em modalidades particulares de um caldo enriquecido de acordo com certas modalidades, a alcanolamina pode estar presente a uma concentração maior que cerca de 0,001M, 0,002M, 0,01M, 0,02M, 0,1M ou 0,2M e o composto de cobalamina pode estar presente a uma concentração maior que cerca de 0,001mg/ml, 0,01mg/ml ou 0,1mg/ml.
[0056] Nesta descrição "condições de cultura" significa os parâmetros para o cultivo de um micro-organismo, e inclui a composição química e as propriedades físicas do meio de cultura assim como a temperatura, agitação, contenção, e duração da cultura e quaisquer outros parâmetros que podem afetar o crescimento do micro-organismo. Assim sendo, em modalidades particulares, uma cultura pode ser mantida a qualquer temperatura dentre qualquer temperatura entre 33°C e 43°C e pode ser realizada a cerca de 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C,40°C, 41°C, 42°C ou 43°C ou entre 33°C e 34°C, 34°C e 35°C, 35°C e 36°C, 36°C e 37°C, 37°C e 38°C, 38°C e 39°C, 39°C e 40°C, 40°C e 41°C, 41°C e 42°C, ou 42°C e 43°C ou a uma temperatura entre 34°C e 43°C, ou entre 35°C e 42°C, ou entre 36°C e 42°C, 38°C e 42°C ou entre 39°C e 41°C ou entre 39°C e 40°C ou entre 38°C e 39°C, ou entre 39°C e 40°C, ou entre 40°C e 41°C, ou entre 41°C e 42°C ou entre 42°C e 43°C ou entre ou em qualquer outra faixa de temperatura compatível com o crescimento da bactéria de interesse. Nas modalidades particulares a temperatura da cultura pode ser de cerca de 39°C. Ficará entendido que temperaturas acima de 43°C e abaixo de 33°C também podem ser usadas para o cultivo de micro-organismos usando o meio descrito nesta descrição, no entanto foi constatado que onde se deseja cultivar E. coli spp ou Salmonella spp, temperaturas fora da faixa entre 43°C e 33°C podem permitir o crescimento relativamente mais rápido de outros micro-organismos indesejados ou ser menos eficazes em promover o crescimento do micro-organismo de interesse. O pH do meio de cultura geralmente é ajustado entre 7 e 8 e por exemplo em modalidades particulares é ou é cerca de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 ou 9,0 ou pode variar em faixas delimitadas por quaisquer dois dos valores acima. Portanto, nas modalidades particulares o pH do meio de cultura varia em faixas com limites inferiores de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, ou 7,9 e com limites superiores de 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7.7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 ou 9,0. Em uma modalidade o meio tem um pH entre 7,8 e 8,4, em uma outra modalidade o meio tem um pH entre 7,9 e 8,3 e em ainda uma outra modalidade o meio tem um pH entre 8,0 e 8,2.
[0057] Ficará entendido que um pH fora da faixa de pH 7-9 pode ainda ser útil em certas modalidades, mas que a eficiência e seletividade da cultura podem ser negativamente afetadas. Uma cultura pode ser cultivada por qualquer período desejado subsequente à inoculação com uma amostra, mas foi constatado que em certas modalidades um período de cultura de 7 horas é suficiente para enriquecer o teor de salmonella spp ou E. coli spp o suficiente para permitir sua testagem por métodos normais. No entanto, em modalidades alternativas para fins particulares o período de cultura será maior ou menor e será de até ou inferior a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais horas. Os versados na técnica vão selecionar prontamente um período de cultura adequado para satisfazer exigências particulares.
[0058] Nesta descrição um "micro-organismo" significa uma bactéria, que pode ser uma bactéria patogênica e em certas modalidades é Salmonella spp ou E. Coli spp. Nas modalidades particulares a Salmonella é salmonella typhimurium, e a E. Coli é E. Coli 157, Shigatoxin E. Coli (STEC) ou Enterohemoragic E. Coli (EHEC).
[0059] Nesta descrição "detectar" um micro-organismo significa qualquer processo para observar a presença ou ausência de um microorganismo, ou uma alteração na presença de um micro-organismo, em uma amostra biológica, se o micro-organismo ou a alteração no microorganismo é efetivamente detectada ou não. Em outras palavras, o ato de testar uma amostra quanto à presença de um micro-organismo ou uma alteração no nível de um micro-organismo constitui uma "detecção" mesmo que se determine que o micro-organismo não está presente ou está abaixo do nível de sensibilidade. A detecção pode ser uma observação quantitativa, semiquantitativa ou não quantitativa e pode basear-se em uma comparação com uma ou mais amostras de controle. A detecção pode ser aplicada a qualquer amostra onde se deve avaliar a presença ou ausência do micro-organismo, e nas modalidades particulares, porém sem limitar a generalidade do acima exposto, uma amostra é ou compreende qualquer forma de material biológico e pode compreender triturados, ou não triturados, carnes, aves, peixes, frutos do mar, vegetais, frutas, laticínios, leite, ovos, alimentos embalados, alimentos enlatados, alimentos em garrafa, ou alimentos embrulhados, ou cotonetes ou esfregaços ("swipe pads ou wipes"). Ficará entendido que várias metodologias de detecção são possíveis e que estas serão facilmente selecionadas e implementadas pelos especialistas na técnica. Nas modalidades particulares a detecção é realizada usando-se métodos de PCR, PCR em tempo real, lectinas, difusão simples, difusão lateral, detecção imunológica, fluxo lateral, ou fluxo transversal e tais métodos incluem ensaios baseados em EIA e em ELISA e podem envolver a incorporação de detecção fluorescente ou colorimétrica, podem incluir tecnologia imunocromatográfica, e podem incorporar técnicas moleculares tais como hibridização de DNA e ensaios baseados em PCR. Em certas modalidades a detecção é efetuada usando-se a metodologia de teste MICTTM da FoodChekTM e um aparelho onde uma alíquota da cultura enriquecida é aquecida para matar o analito-alvo. A amostra aquecida é carregada em um cassete de fluxo lateral, que é composto de um bloco de amostra/conjugado contendo partículas magnéticas nanométricas conjugadas a um anticorpo que vai se ligar o antígeno do patógeno. Os testes também contêm um segundo anticorpo em uma fita estreita chamada de zona de captura. O fluxo capilar leva o líquido carregado através do bloco de amostra até o bloco de conjugado, onde a bactéria-alvo se liga às partículas revestidas com o anticorpo. Este complexo imune escorre para dentro da fita de teste até a zona de captura. O resultado é um acúmulo de partículas magnéticas na zona de captura. Se o patógeno-alvo estiver ausente, não se formarão complexos imunes, partículas não ficarão acumuladas na linha de captura, e o resultado do teste será negativo. Mais para baixo, uma linha de controle que fora traçada de maneira similar, porém com um reagente diferente verifica que o teste tenha sido realizado corretamente e que os reagentes ainda estão ativos. O cassete é lido em um instrumento capaz de detectar baixas concentrações de partículas magnéticas. O detector sente pequenas alterações em um campo magnético a longo da fita de teste à medida que passa por baixo de um grupo de bobinas de leitura. As bobinas são enroladas em direções alternadas de modo que um perfil de sinais característico é gerado pela presença de partículas magnéticas ligadas às linhas de teste ou de controle. O instrumento compara o sinal de detecção com um valor limítrofe positivo codificado no código de barras afixado em cada cassete individual, e então reporta um resultado positivo ou negativo. Os resultados são apresentados no painel de exibição de cristal líquido do instrumento e impressos, ou transferidos para um computador associado. Além de todos os parâmetros de análise, o código de barras também codifica o nome do teste, o número de lote, e a data de validade, que são impressos junto com o resultado de teste. Ficará entendido que diversos procedimentos de testagem reconhecidos para Salmonella spp, E.coli spp e outros microorganismos são amplamente conhecidos pelos especialistas na técnica e que esses versados na técnica combinarão facilmente tais métodos de detecção adequados com as culturas e os métodos de cultura divulgados nesta invenção. A título ilustrativo e não limitativo, nas modalidades particulares métodos de detecção possíveis incluem ou utilizam a matéria divulgada em qualquer um dos documentos US6483303; US 6597176; US6607922; US6927570; US7323139, cujos conteúdos encontram-se aqui incorporados em sua integridade a título de referência e adicionalmente explicam a metodologia de teste MICTTM da FoodChek™ que pode ser opcionalmente usada nas modalidades desta invenção ou junto com as mesmas.
[0060] Nesta descrição o termo "biologicamente eficaz" significa um composto, substância química ou mistura ou combinação de compostos ou substâncias químicas tendo o efeito biológico desejado. Por conseguinte, uma referência a uma mistura ou combinação biologicamente eficaz de uma alcanolamina e um composto de cobalamina significa que a mistura tem o efeito desejado de preferencialmente promover o crescimento do micro-organismo desejado, e em certas modalidades o micro-organismo pode ser uma ou mais de uma E. coli spp. ou uma salmonella spp.
[0061] Nesta descrição o termo "concentrado", onde usado com referência a uma ou mais substâncias químicas ou componentes, significa uma preparação contendo uma substância química ou componente ou mistura de substâncias químicas ou componentes a concentrações significativamente mais altas que suas concentrações de trabalho desejáveis. Assim, por exemplo, caso se deseje utilizar uma substância química a uma concentração de 0,02 M, então uma solução concentrada adequada da substância química pode ser uma solução 20M, para que a adição da solução concentrada a, por exemplo, um meio de cultura, possa atingir a concentração de trabalho desejada sem de alguma forma alterar materialmente a concentração dos outros componentes do meio de cultura.
[0062] Nesta descrição os termos "promover preferencialmente o crescimento de" um micro-organismo especificado, e "cultivar preferencialmente" micro-organismo especificado e termos similares são usados com referência a condições de cultura que promovem ou suportam o crescimento do micro-organismo especificado em preferência ao crescimento de outros micro-organismos. Por conseguinte, em certas modalidades são divulgados métodos e meios que resultam em crescimento e divisão aumentados de salmonella spp. e E. coli spp., em preferência a outros micro-organismos. Portanto, os termos indicam condições nas quais o crescimento do microorganismo especificado é melhorado em relação a outros microorganismos em uma amostra, de maneira que o crescimento dos outros micro-organismos possa ser inibido, ou possa ser aumentado, mas que em qualquer um dos casos a proporção do micro-organismo promovido desejado vai aumentar em relação aos outros microorganismos na cultura. Em certas modalidades o crescimento em uma cultura pode ser exclusivamente ou substancialmente exclusivamente o crescimento do micro-organismo de interesse.
[0063] Nesta descrição os termos "amostra" e "amostra biológica" têm o mesmo e o mais amplo significado possível consistente com seu contexto e referem-se de modo geral e sem limitação a qualquer coisa que se deseja testar quanto à presença de um ou mais micro-organismos de interesse, e incluem todo tipo do objeto em questão quer ele contenha efetivamente ou não quaisquer micro-organismos, ou quaisquer micro-organismos de interesse e quer ele contenha ou não salmonella spp. ou E. coli spp. Em certas modalidades uma amostra pode ser obtida retirando-se um pedaço ou porção, ou pelo uso de um cotonete, lenço, filtro, esfregaço, ou qualquer outro método adequado, todos eles sendo facilmente compreendidos e implementados e selecionados pelos versados na técnica. Nas modalidades particulares a amostra é ou compreende material alimentício ou é ou compreende material vegetal ou animal ou é ou compreende qualquer tipo que seja de carnes, frutos do mar, peixes, vegetais, frutas, saladas, refeições prontas, ovos, laticínios, materiais alimentícios combinados e não combinados, alimentos enlatados, ou qualquer outra forma de gêneros alimentícios frescos, crus, cozidos, não cozidos, congelados, refrigerados, moídos, picados, embalados, tratados termicamente, secados, em conserva, refinados ou em conserva. Em outras modalidades, uma amostra pode ser retirada de um ambiente, superfície, recipiente ou local onde se deseja determinar se um micro-organismo de interesse está presente, por exemplo, e sem limitação superfícies de uma cozinha, superfícies de cozimento, recipientes de armazenamento de alimentos, talheres, geladeiras, freezers, recipientes de exposição, materiais de embrulho, plantas e animais vivos e qualquer outro ambiente, local, superfície, ou material que seja que possa ser de interesse a um usuário. Os especialistas na técnica vão entender e implementar métodos adequados para a seleção, obtenção e manipulação de qualquer amostra para uso em certas modalidades. Em modalidades selecionadas as amostras são amostras de carne, peixe, frutos do mar, vegetais, ovos ou laticínios.
[0064] Em uma modalidade a invenção divulga um meio de cultura compreendendo concentrações biologicamente eficazes de: um composto de cobalamina, e uma alcanolamina. Em algumas variantes da modalidade e sem limitação das outras variantes da modalidade, o composto de cobalamina é selecionado do grupo que consiste em cobalamina, metil cobalamina, adenosilcobalamina, hidroxocobalamina e cianocobalamina. Em variantes particulares da modalidade a alcanolamina é etanolamina. Em certas modalidades the culture medium é um meio de cultura bacteriana e em certas modalidades as bactérias são ou incluem salmonella spp e E. coli spp. ou qualquer uma das mencionadas acima. Em variantes particulares da modalidade as bactérias são ou podem incluir salmonella typhimurium, E. coli 157, Shigatoxin E. coli ou Enterohemorrhagic E. coli.
[0065] Em variantes particulares da modalidade, o composto de cobalamina está presente a uma concentração maior que 0,002M e a alcanolamina está presente a uma concentração maior que 0,001 mg/litro.
[0066] Em uma série de variantes a E. coli é E. coli 157 e a Salmonella é Salmonella typhimurium e em uma modalidade a amostra biológica é uma amostra de alimento, que pode ser uma amostra de carne e pode ser uma amostra de carne moída.
[0067] A composição e o uso de um exemplo não limitativo da composição e do uso de um exemplo de um meio de acordo com esta modalidade é o seguinte.
[0068] Para preparar o meio, suspender 14,2 g de constituintes do meio essencial em pó em 1 litro de água destilada. A composição do meio essencial de acordo com o exemplo está mostrada na Tabela 3. Distribuir em um recipiente final e esterilizar por autoclavagem a 121°C por 15 minutos. Resfriar para a temperatura ambiente. Antes de usar, adicionar 2 mL por litro de solução de etanolamina (suplemento 1) e 0,5 mL por litro de vitamina B12 (suplemento 2). Misturar bem. Estes suplementos estão ainda ilustrados na Tabela 4. O pH do meio varia entre 7,9 e 8,5, com um valor-alvo de cerca de 8,2.
[0069] Ficará entendido que embora sejam fornecidas pelo fabricante informações quanto aos componentes, estas são dadas a título de exemplo apenas, e não a título limitativo. Os versados na técnica vão entender prontamente que os mesmos materiais ou materiais equivalentes ou graus adequados podem ser obtidos de uma gama de fontes alternativas e os versados na técnica vão determinar prontamente alternativas adequados para os componentes listados na Tabela 3.
Tabela 3: Composição de um meio essencial de acordo com esta modalidade
Tabela 4: Suplementos adicionados ao meio essencial para formar o meio final para uso 
Tabela 3: Composição de um meio essencial de acordo com esta modalidade
[0070] Procedimento: Testar 10 mL por litro de meio preparado por inoculação com S. Typhimurium ATCC 14028 e E. coli O157:H7 ATCC 43895. Ambas devem crescer no meio depois de um período de incubação adequado. O controle negativo é incubar o mesmo meio pelo mesmo período de tempo ou por um período de tempo maior sem qualquer inoculante. Não deve haver crescimento de bactéria ou microorganismo evidente.
[0071] Quando a mistura acima (também denominada caldo ou "meio" "básico" ou "essencial") tiver esfriada, uma composição para enriquecer ou suplementar o caldo essencial é adicionada, a composição compreendendo etanolamina e Vitamina B12. Na prática, a etanolamina e a Vitamina B12 podem ser adicionadas ao meio imediatamente antes do uso. Os versados na técnica vão entender que a solução de vitamina e a etanolamina devem ser esterilizadas antes do uso. Em uma modalidade a solução de vitamina B12 é preparada misturando-se 1 mg de vitamina B12 por ml de água (1mg/mL) e a etanolamina concentrada e a solução de vitamina B12 são esterilizadas em filtro antes do uso.
[0072] Os versados na técnica também vão prontamente entender que, a título de conveniência, o caldo básico ou o caldo completo pode ser preparado como um concentrado e diluído com água estéril quando desejado para uso.
[0073] Em certas modalidades uma amostra biológica é então adicionada a um volume desejado de meio enriquecido e mantida a uma temperatura desejada por um período desejado. Onde o micro- organismo a ser detectado é Salmonella spp, então em um exemplo desta modalidade a temperatura do meio de cultura varia entre cerca de 38°C e 40°C e em outra variante é de cerca de 39°C. Em certas modalidades a cultura é mantida à temperatura desejada, com qualquer agitação desejada ou necessário, por qualquer período de tempo desejado. Quando a finalidade da cultura é a detecção do micro-organismo de interesse, então uma duração de cultura de cerca de 7 (sete) horas ou mais pode ser adequada para a maioria dos procedimentos de teste mas em modalidades variantes particulares períodos de tempo de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mias horas serão escolhidos. No entanto, os versados na técnica vão prontamente ajustar a duração, agitação, e temperatura das condições de cultura conforme necessário ou desejável para fins particulares.
[0074] Em uma outra modalidade a invenção divulga um método para cultura de uma amostra biológica, o método compreendendo a etapa de incubar a amostra na presença de concentrações biologicamente eficazes de: um composto de cobalamina, e uma alcanolamina. Em algumas variantes da modalidade, o meio é o meio de acordo com uma modalidade de meio de cultura. Em modalidades particulares, o composto de cobalamina é selecionado do grupo que consiste em cobalamina, metil cobalamina, adenosilcobalamina, hidroxocobalamina e cianocobalamina; e em certas modalidades a alcanolamina é etanolamina. O método de acordo com a modalidade pode ser um método para cultura de bactérias. Em algumas variantes da modalidade as bactérias são salmonella spp ou E. coli spp ou incluem tanto salmonella spp quanto E. coli spp. Em algumas variantes da modalidade as bactérias incluem salmonella typhimurium, E. coli 157, Shigatoxin E. coli ou Enterohemorrhagic E. coli. Em algumas variantes da modalidade a alcanolamina pode estar presente a uma concentração maior que 0,002M, 0,02M, ou 0,2M e o composto de cobalamina pode estar presente a uma concentração maior que 0,001 g/litro, 0,01g/litro ou 0,1 g/litro. Em certas modalidades o método é para detectar Salmonella spp ou E. coli spp ou ambas em uma amostra biológica.
[0075] Em certas modalidades o método compreende uma etapa de PCR, ligação de lectina, difusão simples, difusão lateral, ligação de anticorpo, fluxo lateral, ou fluxo transversal.
[0076] Em outras modalidades o método é um método para cultivar preferencialmente Salmonella spp. e E. coli spp em um meio, o método compreendendo suplementar o meio com concentrações biologicamente eficazes de um composto de cobalamina e uma alcanolamina.
[0077] Em uma outra série de modalidades encontram-se divulgadas composições para suplementação de um meio de cultura. Em certas modalidades tal composição compreende um composto de cobalamina, e uma alcanolamina. Em algumas variantes da modalidade e sem limitação, o composto de cobalamina é selecionado do grupo que consiste em cobalamina, metil cobalamina, adenosilcobalamina, hidroxocobalamina e cianocobalamina. Em certas modalidades a alcanolamina é etanolamina. Em certas modalidades as composições são para o crescimento de bactérias. Em certas modalidades as bactérias são ou incluem salmonella spp ou E. coli spp e em certas modalidades são salmonella typhimurium, E. coli 157, Shigatoxin E. coli e Enterohemorrhagic E. coli.
[0078] Em uma outra modalidade encontram-se divulgados métodos para detectar bactérias em uma amostra biológica. Em certas modalidades e sem limitação das outras modalidades, as bactérias são ou incluem uma ou ambas dentre E. coli spp. e salmonella spp. Em variantes particulares da modalidade o método compreende cultivar a amostra na presença de uma combinação biologicamente eficaz de: etanolamina e um composto de cobalamina. Em certas modalidades o composto de cobalamina é selecionado do grupo que consiste em metil cobalamina, adenosilcobalamina, hidroxocobalamina e cianocobalamina.
[0079] Em uma variante da modalidade a invenção divulga um método para detectar micro-organismos que podem ser Salmonella spp ou E. coli spp em uma amostra. Em algumas variantes da modalidade o método compreende as etapas de sequencialmente: cultivar a amostra em um volume de meio compreendendo quantidades biologicamente eficazes de etanolamina e composto de cobalamina; e detectar a E. coli spp ou Salmonella spp na cultura. Na modalidade as concentrações de etanolamina e vitamina B12 são escolhidas de acordo com outras modalidades. Em certas modalidades a cultura é incubada por um tempo adequado a uma temperatura e em outras condições adequadas para permitir o crescimento do microorganismo de interesse antes da detecção do micro-organismo. Em modalidades particulares a detecção compreende detectar as bactérias usando métodos de PCR, lectinas, difusão simples, difusão lateral, detecção imunológica, fluxo lateral, ou fluxo transversal ou pode utilizar outra metodologia de detecção adequada.
[0080] Depois de cultivar os micro-organismos no meio de acordo com uma modalidade por um período de tempo adequado em condições de cultura adequadas, a presença do micro-organismo de interesse é detectada por qualquer um de uma gama de métodos facilmente evidentes para os versados na técnica. Tais métodos incluem, porém sem limitação, métodos de detecção por PCR, detecção por PCR em tempo real, ligação de lectina, difusão simples, difusão lateral, detecção imunológica, fluxo lateral, ou fluxo transversal. Sem limitação, métodos imunológicos incluem imunoprecipitação, análise de mancha, imunorradioensaio ou imunoprecipitação associada a ligantes magnéticos, ou podem compreender outros métodos imunológicos adequados. Nas modalidades particulares uma alíquota da cultura é aquecida ou tratada de alguma maneira para matar o micro-organismo antes do teste. A amostra aquecida é processada pela metodologia desejada para identificar a presença de antígenos ou sequências de ácidos nucleicos que diagnosticam o micro-organismo de interesse.
[0081] Em uma modalidade o meio é usado em combinação com uma metodologia de teste patenteada da FoodChek. Tal metodologia é doravante denominada MICT. Em termos amplos, em uma modalidade do processo MICT, uma alíquota da cultura enriquecida pode ser aquecida para matar o analito-alvo. A amostra aquecida é carregada em um cassete de fluxo lateral, que é composto de um bloco de amostra/conjugado contendo partículas magnéticas nanométricas conjugadas a um anticorpo que vai se ligar ao antígeno do patógeno. Os testes também podem conter um segundo anticorpo em uma fita estreita chamada de zona de captura. O fluxo capilar leva o líquido carregado através do bloco de amostra até o bloco de conjugado, onde a bactéria alvo se liga às partículas revestidas com o anticorpo. Este complexo imune escorre para dentro da fita de teste até a zona de captura. O resultado é um acúmulo de partículas magnéticas na zona de captura. Se o patógeno-alvo estiver ausente, não se formarão complexos imunes, partículas não ficarão acumuladas na linha de captura, e o resultado do teste será negativo. Mais para baixo, uma linha de controle que fora traçada de maneira similar, porém com um reagente diferente verifica que o teste tenha sido realizado corretamente e que os reagentes ainda estão ativos. O cassete é lido em um instrumento capaz de detectar baixas concentrações de partículas magnéticas. O detector sente pequenas alterações em um campo magnético a longo da fita de teste à medida que passa por baixo de um grupo de bobinas de leitura. As bobinas são enroladas em direções alternadas de modo que um perfil de sinais característico é gerado pela presença de partículas magnéticas ligadas às linhas de teste ou de controle. O instrumento compara o sinal de detecção com um valor limítrofe positivo codificado no código de barras afixado em cada cassete individual, e então reporta um resultado positivo ou negativo. Os resultados são apresentados no painel de exibição de cristal líquido do instrumento e impressos, ou transferidos para um computador associado. Além de todos os parâmetros de análise, o código de barras também codifica o nome do teste, o número de lote, e a data de validade, que são impressos junto com o resultado de teste. Modalidades dos métodos e aparelhos para o MICT estão descritas em um ou mais dos documentos US7323139, US6927570, US6607922, US6597176, US6518747, US6483303, US 6046585, US6275031, US6437563, que estão aqui incorporados em sua integridade a título de referência. Os versados na técnica vão entender prontamente que uma ampla variedade de metodologias de teste alternativas pode ser usada.
[0082] Meios de acordo com as modalidades podem substituir pelo menos a primeira etapa de enriquecimento em protocolos tradicionais para isolamento e identificação de Salmonella.
[0083] Em certas modalidades é possível atingir os níveis do micro-organismo-alvo requeridos para algumas das atuais tecnologias de detecção (isto é, cerca de 103 a 104 cfu/ml) em aproximadamente 7 horas de incubação a partir de um inóculo inicial que pode compreender tão pouco quanto cerca de 1cfu. Em outras modalidades pode ser possível atingir tais níveis. Em certas modalidades a detecção pode usar processos MICT. Em certas modalidades a amostra inicial pode ser carne e a amostra pode ser cerca de 375g de carne, no entanto, os versados na técnica vão perceber que amostras de qualquer tamanho e natureza adequados podem ser selecionadas para fins particulares.
[0084] Os exemplos a seguir são apresentados como ilustrações das modalidades e não restringem o escopo da matéria das várias modalidades reivindicadas.
[0085] A Tabela 5 mostra a fórmula para um meio para cultivar bactérias da espécie Salmonella, também denominado meio de enriquecimento ActeroSalmonella/STEC.
[0086] A composição e o uso de um meio de acordo com a modalidade é a seguinte. Suspender 14,2g dos constituintes do meio em pó em 1 litro de água destilada. Distribuir em um recipiente final e esterilizar por autoclavagem a 121°C por 15 minutos. Resfriar para a temperatura ambiente. Antes do uso, adicionar 2 mL por litro de solução de etanolamina (suplemento 1) e 0,5 mL por litro de vitamina B12 (suplemento 2). Misturar bem. O pH do meio varia entre 7,9 e 8,5, com um valor-alvo de cerca de 8,2.
Tabela 5: Composição de um meio essencial de acordo com o exemplo
Tabela 5: Composição de um meio essencial de acordo com o exemplo
[0087] Resfriar o meio essencial e acrescentar o seguinte: 
[0088] Procedimento: Testar 10 mL por litro de meio preparado por inoculação com S. Typhimurium ATCC 14028 e E. coli O157:H7 ATCC 43895. Ambas devem crescer no meio depois de um período de incubação adequado. O controle negativo é incubar o mesmo meio pelo mesmo período de tempo ou por um período de tempo maior sem qualquer inoculante. Não deve haver crescimento de bactéria ou micro- organismo evidente.
[0089] Quando a mistura acima (também denominada meio ou caldo "básico" ou "essencial") tiver esfriado, a etanolamina e a Vitamina B12 são adicionadas. Atualmente a etanolamina e a Vitamina B12 são adicionadas ao meio imediatamente antes do uso. Os versados na técnica vão entender que a solução de vitamina e a etanolamina devem ser esterilizadas antes do uso. Na prática a solução de vitamina B12 é preparada misturando-se 1 mg por ml de água (1mg/mL) ou 1mg per ml (1mg/ml) e a etanolamina e a solução de vitamina B12 são esterilizadas em filtro.
[0090] Os versados na técnica também vão prontamente entender que, a título de conveniência, o caldo básico ou o caldo completo pode ser preparado como um concentrado e diluído com água estéril quando desejado para uso.
[0091] Uma amostra é preparada para amostras de carne moída compostas de 325g.
[0092] 1. Preaquecer o meio básico até 39°C mantendo o meio por uma noite (10-20 horas) em uma incubadora ou por algumas horas em um banho de água.
[0093] 2. Imediatamente antes do enriquecimento adicionar 2mL de etanolamina e 500μL de uma solução de 1mg/mL de vitamina B12 a 1 l do meio básico preaquecido. Misturar vigorosamente por turbilhonamento e inversão.
[0094] 3. Adicionar duas partes do meio preaquecido (contendo tanto etanolamina quanto vitamina B12) a uma parte de amostra (Ex. 650mL de meio suplementado a 325g de carne moída) em um saco de Stomacher equipado com um filtro.
[0095] 4. Homogeneizar a amostra por 30 segundos a 150 rpm em Stomacher® 3500.
[0096] 5. Fechar o saco frouxamente e incubar as amostras para enriquecimento por 7 horas a 39°C em um banho de água. Se um grande número de amostras deve ser analisado, verificar se a temperatura da água entre os sacos de amostra atinge 39°C antes de começar a registrar o tempo de incubação. É importante controlar com precisão o período de enriquecimento para obter resultados valiosos e precisos.
[0097] 6. Depois de 7 horas retirar as amostras do banho de água e ressuspender os conteúdos.
[0098] Depois de preparada a amostra, Salmonella spp. ou E.coli spp pode ser detectada usando o processo analítico da FoodChek como descrito acima, ou usando quaisquer métodos de teste convencionais. Em um exemplo a Salmonella spp. pode ser detectada usando-se anticorpos seletivos adequados. Em certas modalidades usando métodos de detecção adequadamente sensíveis, a sensibilidade pode ser de 1cfu/325g de carne moída. Tais métodos de detecção adequadamente sensíveis podem compreender o uso de anticorpos seletivos.
[0099] Provisões e reagentes: Água estéril, destilada/desionizada. Qualquer fonte; Caldo de Tetrationato (TT) - Quelab Laboratories, Québec, Canadá; Caldo de Peptona de Soja Rappaport-Vassiliadis (RVS) - Oxoid, Hampshire, Inglaterra; Caldo Rappaport-Vassiliadis (RV); Ágar Xilose Lisina Tergitol-4 (XLT4) - Difco Becton Dickinson, New Jersey, EUA; Ágar BG Sulfa (BGS) - Difco Becton Dickinson, New Jersey, EUA; Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) - Quelab Laboratories, Québec, Canadá; ágar entérico Hektoen (HE) - Quelab Laboratories, Québec, Canadá; Triplo Açúcar Ferro (TSI) - Difco Becton Dickinson, New Jersey, EUA; Ágar Lisina Ferro (LIA) - BBL Becton Dickinson, New Jersey, EUA; antissoro de Salmonella - Difco Becton Dickinson, New Jersey, EUA; kits API 20 E para identificação de enterobacteriacae - Biomérieux, Marcy-L’etoile, França; agulhas de inoculação plásticas e laços calibrados 10μL. Qualquer fonte; Pipetas estéreis, 10 mL - Qualquer fonte.
[00100] Aparelho: Incubadora estacionária Symphony™ (VWR, EUA) ou equivalente - Capaz de fornecer 39°C ± 0,5; Incubadora estacionária, modelo 1555 (VWR, EUA) ou equivalente. - Capaz de fornecer 35°C ± 2,0; Banho de água (Polyscience, EUA) ou equivalente. - Capaz de fornecer 39°C ± 0,5; Banho de água, circulante, controlada termostaticamente (Lindberg/Blue, EUA), ou equivalente - Capaz de fornecer 42°C ± 0,2; Banho de água, circulante, controlada termostaticamente (Lindberg/Blue, EUA), ou equivalente -Capaz de fornecer 43°C ± 0,2; Micropipette - Capaz de distribuir com precisão 500 μL - Qualquer fonte; Balança de carregamento superior para pesar amostras de 25, 100 e 325 g - Qualquer fonte; Stomacher -Seward modelo 3500 (Seward, Londres, Inglaterra) ou equivalente -para misturação vigorosa de amostras de alimentos em caldo de enriquecimento; Stomacher - Seward Modelo 400 (Seward, Londres, Inglaterra) ou equivalente - para misturação vigorosa de amostras de alimentos em caldo de enriquecimento; Misturador de vórtice (VWR, EUA).
[00101] Preparação geral do meio: Para preparar o Actero Salmonella/STEC, suspender 14,2 g do meio em pó em um litro de água destilada e misturar bem. Distribuir no recipiente final e esterilizar por autoclavagem a 121°C por 15 minutos. Resfriar para a temperatura ambiente. Em alguns casos foi constatado que não é necessário autoclavar o meio se ele for usado imediatamente após o preparo, mas neste caso é preferível usar água estéril para fazer o meio. Antes do uso, acrescentar 2 mL de suplemento 1 (16,6M de etanolamina) e 0,5 mL de suplemento 2(1 mg/ml de vitamina B12) a um litro do meio essencial em condições assépticas.
[00102] Materiais adicionais e reagentes: placas de ágar Tripticase Soja com 5% de sangue de ovelha (ágar-sangue) - BBL Becton Dickinson, New Jersey, EUA; caldo TT (TT Hajna) - Quelab Laboratories, Québec, Canadá; Ágar Triptona Soja (TSA) - Quelab Laboratories, Québec, Canadá; Caldo de Triptona Soja (TSB) - Oxoid, Hampshire, Inglaterra; Ágar de Contagem de Placas (PCA); solução salina tamponada com fosfato (PBS) - Oxoid, Hampshire, Inglaterra; Ágar Rainbow Modificado (mRBA) - Biolog, Califórnia, EUA; Ágar Sulfito de Bismuto (BS) - Difco Becton Dickinson, New Jersey, EUA; Caldo de Lactose - Quelab Laboratories, Québec, Canadá; Água de Peptona Tamponada (BPW) - Fluka Analytical, St-Louis, EUA; banho de água Isotemp (Fisher Scientific, EUA) ou equivalente. - Capaz de fornecer 55°C ± 0,2. Materiais, métodos e reagentes necessários para realizar os métodos de referência estão ainda detalhados em: Capítulo 4 intitulado Isolation and identification of Salmonella from, meat, poultry and eggs products in USDA/FSIS Microbiology Laboratory guidebook, 3rd Edition, Rev. #4, http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG 4 05.pdf; Capítulo 5B intitulado Detection and Isolation of non-O157 Shiga-toxin Producing Escherichia coli (STEC) from Meat Products in USDA/FSIS Microbiology Laboratory guidebook, 3rd Edition, Rev. #1, http://www.fsis.usda.gov/PDF/Mlg 5B 01.pdf; Capítulo 5 intitulado Salmonella in FDA Bacterial Analytical Manual, 8th Edition, November 2011 Version, http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/Bacterio logicalAnalyticalManualBAM/ucm070149.htm
[00103] Preparação de amostras: A preparação de amostras depende do tipo e do tamanho da amostra. Por conseguinte, o protocolo para preparar a amostra é escolhido de forma a refletir essas condições. Métodos de preparação para tipos de amostra selecionados estão ainda explicados abaixo.
[00104] Análise: A análise das amostras depende dos tipos das amostras. Por conseguinte, o protocolo para preparar a amostra deve ser escolhido de forma a refletir o tipo de amostra.
[00105] Interpretação e Relatório dos Resultados de Teste: Os resultados são confirmados de acordo com o "US FDA Bacteriological Analytical Manual" Capítulo 5 e "USDA FSIS Microbiology Laboratory Guidebook" Capítulos 4.05 e 5B.01. Estas duas referências serão bem compreendidas pelos versados na técnica e estão aqui incorporadas em sua integridade a título de referência à medida que são permitidas por lei.
[00106] Os seguintes estudos de validação foram conduzidos:
[00107] Os estudos de robustez foram realizados para avaliar o efeito da modificação de dois parâmetros: a temperatura e o tempo de incubação. As variáveis de robustez e suas respectivas faixas estão mostradas na Tabela 6.
[00108] Metodologia: Cada condição do intervalo de teste foi avaliada por análise do crescimento de três culturas puras em placas de ágar seletivo. S. typhimurium ATCC 14028 foi escolhida como a representante da Salmonella spp. e os resultados foram analisados em placas de ágar XLT4 e BGS. E. coli 0157:H7 ATCC 43895 foi escolhida como uma STEC e foi analisada em ágar rainbow modificado e E. faecalis ATCC 19433 foi escolhida como a cepa não alvo e foi analisada em ágar XLT4, BGS e rainbow modificado.
[00109] Para os três parâmetros, as cepas foram espalhadas em ágar tripticase soja com 5% de sangue de ovelha (também denominado ágar-sangue) e incubada por uma noite a 35°C ± 1°C. Algumas colônias das cepas-alvo foram transferidas para 9 mL de TSB por 6-7 horas a 35°C ± 1°C. Cada cultura foi diluída 1:10 em TSB fresco e foi incubada por uma noite à mesma temperatura. Estas culturas foram então diluídas para obter um nível de inoculação fracional (0,5 CFU por amostra) no caldo Actero Salmonella/STEC Actero Salmonella/STEC. As culturas foram cultivadas usando-se o protocolo padrão à exceção do parâmetro avaliado.
[00110] Para a cepa não alvo a mesma metodologia foi usada para cultura à exceção do nível de inoculação que foi 10 vezes mais alto. Dez réplicas de cada alvo e 5 réplicas do não alvo foram testadas para cada parâmetro.
[00111] Resultados: De acordo com a análise de POD (probabilidade de detecção) efetuada nos resultados, não foram observadas diferenças significativas (Tabela 6). O intervalo de confiança entre a dPOD (diferença na probabilidade de detecção) de condições extremas contém um zero, de modo que não existe uma diferença estatítica entre cada parâmetro. Assim sendo, as alterações mínimas na temperatura e número de vezes testado não afetou significativamente a capacidade do Actero Salmonella/STEC para recuperar a S. typhimurium ATCC 14028 e a E. coli 0157:H7 ATCC 43895. A presença da cepa não alvo E. faecalis ATCC 19433 nas amostras de Actero Salmonella/STEC não foi detectada em nenhum dos casos (dados não mostrados).
Tabela 6. Resultados de Robustez do Método Actero Salmonella/STEC
aN = Número de porções de teste
bx = Número de porções de teste positivas
cPODA = Resultados positivos na condição A dividido pelo número total de ensaios
dPODB = Resultados positivos na condição B dividido pelo número total de ensaios
edPODAB = Diferente entre os valores de POD na condição A e na condição B
f95% de CI = Se o intervalo de confiança de um dPOD não contém zero, então a diferença é estatisticamente significativa no nível de 5%
Tabela 6. Resultados de Robustez do Método Actero Salmonella/STEC
bx = Número de porções de teste positivas
cPODA = Resultados positivos na condição A dividido pelo número total de ensaios
dPODB = Resultados positivos na condição B dividido pelo número total de ensaios
edPODAB = Diferente entre os valores de POD na condição A e na condição B
f95% de CI = Se o intervalo de confiança de um dPOD não contém zero, então a diferença é estatisticamente significativa no nível de 5%
[00112] Cento e nove (109) cepas de Salmonella (Tabela 7), representando quase todas as espécies de Salmonella (incluindo cepas lactose-positivas) e 50 cepas de E. coli produtoras da toxina Shiga (STEC) (Tabela 8), representando espécies de STEC (cepas pertencentes ao "big six" e à família de E. coli O157) foram analisadas para testar a capacidade do caldo para enriquecer cepas de Salmonella spp. e STEC.
[00113] Metodologia: Todas as cepas Salmonella spp. e STEC foram espalhadas em ágar-sangue e incubadas por uma noite a 35°C. Algumas colônias das cepas-alvo foram transferidas para 10 mL de TSB por 6-7 horas a 35°C. Cada cultura foi diluída 1:10 em TSB fresco e foi incubada por uma noite à mesma temperatura. A cultura foi então diluída para inocular uma baixa concentração (entre 1,0 e 20 CFU/mL) da cepa no caldo Actero Salmonella/STEC. Cada cepa foi cultivada em triplicata. As culturas foram cultivadas a 39 ± 0,5°C por 7 horas em um banho de água. O crescimento de cepas de Salmonella foi analisado espalhando-se 10 μL de cada amostra sobre placas de ágar seletivo para Salmonella (XLT4, BGS, XLD e HE). Para as cepas STEC, o crescimento foi confirmado espalhando-se cada amostra sobre placas de ágar rainbow modificado.
[00114] Resultados: Os resultados do estudo de inclusividade estão resumidos nas Tabelas 7 e 8, respectivamente, para cepas de Salmonella spp. e STEC. Entre as 110 cepas de Salmonella testadas no caldo Actero Salmonella/STEC, 6 mostraram um crescimento lento e 3 não cresceram. No total, 106 de 109 (97,2%) cepas de Salmonella cresceram no caldo Actero Salmonella/STEC e puderam ser identificadas em placas específicas de ágar seletivo. Quanto às espécies STEC, as 50 (100%) cepas testadas cresceram no caldo Actero Salmonella/STEC e puderam ser identificadas em placas, mas 2 mostraram um crescimento mais lento em comparação com as outras. Assim sendo, ao todo, 98,1% das cepas-alvo foram identificadas nas condições usadas para o enriquecimento.
Tabela 7: Lista de Salmonella spp. - Resultados do estudo de inclusividade
a LFZ (PHAC): Laboratory for Foodborne Zoonose (Public Health Agency of Canada), Guelph, Canadá, SGSC: Salmonella Genetic Stock Center, Department of Biological Sciences, University of Calgary, Canadá, MAPAQ : Ministério da Agricultura, Peixes e Alimentos de Quebec, Quebec (QC), Canadá. CIPARS (PHAC): Canadian Integrated Program for Antimicrobial Resistance Surveillance, (Public Health Agency of Canada), Saint-Hyacinthe, Canadá. Maxivet inc: Saint-Hyacinthe, Québec, Canadá
+ Presença de colônias típicas de Salmonella spp. em placas de ágar seletivo para Salmonella
+*Presença de colônias típicas de Salmonella spp. em placas de ágar seletivo para Salmonella mas o crescimento observado foi mais lento.
- Não foi observado crescimento em nenhuma das placas de ágar seletivo para a cepa de particular Salmonella.
Tabela 8: Lista de STEC - Resultados do teste de inclusividade
Estas bactérias tiveram crescimento mais lento em comparação com as outras
a PHAC: Public Health Agency of Canada, Guelph, Canadá. EcL: E. coli Laboratory, Faculty of Veterinary Medicine, Saint-Hyacinthe, Québec (QC), Canadá. E. coli ref. center: E. coli Reference Center, The Pennsylvania State University, Pennsylvania, EUA. LSPQ: Laboratoire de Santé publique du Québec, Saint-Anne-de-Bellevue, Québec (QC), Canadá. CRDA: Centre de Recherche et Développement sur les Aliments, Saint-Hyacinthe, Québec (QC), Canadá
+Presença de colônias típicas de STEC em ágar rainbow.
+* Presença de colônias típicas de STEC em ágar rainbow modificado, mas o crescimento observado foi mais lento.
- Não foi observado crescimento em nenhuma forma das placas de ágar seletivo para a cepa específica de Salmonella.
Tabela 7: Lista de Salmonella spp. - Resultados do estudo de inclusividade
+ Presença de colônias típicas de Salmonella spp. em placas de ágar seletivo para Salmonella
+*Presença de colônias típicas de Salmonella spp. em placas de ágar seletivo para Salmonella mas o crescimento observado foi mais lento.
- Não foi observado crescimento em nenhuma das placas de ágar seletivo para a cepa de particular Salmonella.
Tabela 8: Lista de STEC - Resultados do teste de inclusividade
a PHAC: Public Health Agency of Canada, Guelph, Canadá. EcL: E. coli Laboratory, Faculty of Veterinary Medicine, Saint-Hyacinthe, Québec (QC), Canadá. E. coli ref. center: E. coli Reference Center, The Pennsylvania State University, Pennsylvania, EUA. LSPQ: Laboratoire de Santé publique du Québec, Saint-Anne-de-Bellevue, Québec (QC), Canadá. CRDA: Centre de Recherche et Développement sur les Aliments, Saint-Hyacinthe, Québec (QC), Canadá
+Presença de colônias típicas de STEC em ágar rainbow.
+* Presença de colônias típicas de STEC em ágar rainbow modificado, mas o crescimento observado foi mais lento.
- Não foi observado crescimento em nenhuma forma das placas de ágar seletivo para a cepa específica de Salmonella.
[00115] Trinta e uma (31) cepas não alvo, escolhidas como parentes genéticos próximos da Salmonella e E. coli e espécies que são encontradas no mesmo ambiente, foram testadas no meio de enriquecimento Actero Salmonella/STEC. Elas representam 25 gêneros diferentes e bactérias e leveduras.
[00116] Metodologia: Cada cepa não alvo foi espalhada em ágar-sangue e incubada por uma noite a 35°C. Em seguida, cada cepa não alvo foi cultivada em sua condição ideal. Cada suspensão bacteriana foi diluída para inocular o caldo Actero Salmonella/STEC com uma concentração média 10 vezes maior que aquela que foi usada para as cepas-alvo. Esta etapa foi feita em triplicata. Seu crescimento no caldo Actero Salmonella/STEC foi testado a 39 ± 0,5°C por 7 horas em um banho de água e por 18 horas em uma incubadora. Elas foram então analisadas em placas de ágar seletivo específico para Salmonella e STEC para verificar se estavam crescendo e se o caldo Actero Salmonella/STEC, por qualquer motivo, causa alguma alteração no fenótipo que poderia levar a uma interpretação errônea dos resultados.
[00117] Resultados: Os resultados de exclusividade estão resumidos na Tabela 9. A maioria das cepas não alvo não cresceram nas placas de ágar seletivo. Daquelas onde foi possível observar crescimento, nenhuma mostrou um fenótipo que possa ser parecido com cepas de Salmonella ou STEC, ou levar a uma interpretação errônea dos resultados em placas de ágar seletivo.
Tabela 9: Bactérias não Salmonellalnão STEC incluídas no teste de exclusividade
a FMV: Laboratory of Bacteriology, Diagnostic Service, Faculty of Veterinary Medicine, University of Montreal, Canadá. SGSC: Salmonella Genetic Stock Center, Department of Biological Sciences, University of Calgary, Canadá. ARS: Agricultural Research Service, Washington DC, 20250, EUA.
Tabela 9: Bactérias não Salmonellalnão STEC incluídas no teste de exclusividade
[00118] 4. Preparação de amostras: Todos os diferentes alimentos foram adquiridos em lojas de varejo próximas aos locais em que as experiências foram conduzidas.
[00119] 5. Testagem dos alimentos: O estudo matriz (usando 5 tipos de alimento) foi realizado para avaliar a capacidade de recuperação das cepas de Salmonella e d STEC a partir do caldo Actero Salmonella/STEC em comparação com o enriquecimento padrão. Diferentes condições de enriquecimento foram usadas de acordo com o tipo de alimento testado. Os alimentos foram escolhidos por dois motivos: 1) pela frequente implicação em surtos de formas relevantes de envenenamento ou contaminação alimentar, e 2) em função do tipo de estresse suportado pela cepa-alvo (estresse de frio e calor).
[00120] Preparação das amostras: S. enteritidis (isolada de asas de frango) foi espalhada em TSBA e incubada por uma noite 35°C. Algumas colônias foram transferidas para 9 mL de TSB por 6-7 horas a 35°C. A cultura foi diluída 1:10 em TSB fresco e foi incubada por uma noite à mesma temperatura. Antes da inoculação, 1,5 mL de cultura foi tratado termicamente por 2 minutos a 55°C em um banho de água para atingir 50-80% de lesão do inóculo. O grau de lesão foi determinado por comparação do crescimento em placas de ágar seletivo e não seletivo. O grau de lesão obtido para o inóculo foi de 63%. Cinco mil e quinhentos ml de ovos líquidos inteiros foram inoculados com um nível para produzir resultados fracionalmente positivos (1 CFU/100 g) e homogeneizados por agitação manual. Mil e quinhentos ml de ovos líquidos inteiros foram deixados sem inoculação. As duas partes foram armazenadas a 4°C por 48 horas para permitir que a bactéria estabilizasse no alimento. Uma análise MPN (número mais provável) foi preparada para estimar o nível de contaminação depois do período de estabilização. A parte inoculada foi dividida em dois grupos de vinte amostras de 100 g e a parte não inoculada foi dividida em dez amostras de 100 g no saco Stomacher equipado com filtro.
[00121] Enriquecimento em ActeroSalmonella/STEC: Um grupo (20 amostras inoculadas e 5 não inoculadas) foi homogeneizado por 30 segundos com 300 mL de caldo Actero Salmonella/STEC preaquecido e incubado a 39 ± 0,5°C por 7 horas em um banho de água. As amostras foram então espalhadas diretamente em ágar sulfa verde brilhante (BGS) e ágar xilose lisina tergitol 4 (XLT4) e todas as colônias presumidas foram confirmadas por procedimentos bioquímicos e sorológicos de acordo com o protocolo de referência USDA/FSIS para Salmonella.
[00122] Confirmação do enriquecimento com ActeroSalmonella/STEC: Da amostra de Actero Salmonella/STEC enriquecida, 0,5 ml foi transferido para 10 mL de caldo de tetrationato (Hajna) e 0,1 ml para 10 mL de caldo de soja Rappaport-Vassiliadis modificado (RVS) e foram incubados a 42 ± 0,5°C por 22-24 horas. Eles foram então espalhados em BGS e XLT4 e incubados a 35°C por 18-24 horas. Se as colônias fossem pequenas ou não visíveis, elas eram reincubadas por mais 18-24 horas. Até 3 colônias típicas foram coletadas por placa e transferidas para planos inclinados TSI e LIA. Procedimentos bioquímicos e sorológicos como em MLG 4.05 foram efetuados para confirmar amostras positivas.
[00123] Enriquecimento do método referência: O segundo grupo (20 amostras inoculadas e 5 não inoculadas) foi enriquecido em 900 mL de água de peptona tamponada por 18-24 horas a 35 ± 2,0°C e em seguida processado de acordo com o protocolo de referênca USDA/FSIS para Salmonella. As amostras MPN foram tratadas da mesma maneira. Todas as amostras presumidas positivas foram submetidas à identificação bioquímica e sorológica recomendada pelo USDA/FSIS.
[00124] Preparação de amostras: S. saintpaul foi espalhada em ágar-sangue e incubada por uma noite a 35°C. Algumas colônias foram transferidas para 9 mL de TSB por 6-7 horas a 35°C. A cultura foi diluída 1:10 em TBS fresco e foi incubada por uma noite à mesma temperatura. Mil e setecentos gramas (1700 g) de vieiras congeladas cruas foram inoculados a um nível para produzir resultados fracionalmente positivos (1,25 CFU/25 g) e homogeneizados por agitação manual. Trezentos gramas (300 g) de vieiras congeladas cruas foram deixados sem inoculação. As duas partes foram armazenadas por duas semanas a menos 20°C para permitir que a bactéria estabilizasse no alimento. Uma análise MPN (número mais provável) foi preparada para estimar o nível de contaminação depois do período de estabilização. A parte inoculada foi dividida em dois grupos de vinte amostras de 25 g e a parte não inoculada foi dividida em dois grupos de 5 amostras de 25 g.
[00125] Enriquecimento em ActeroSalmonella/STEC: Um grupo (20 amostras inoculadas e 5 não inoculadas) foi homogeneizado por 30 segundos com 50 mL de caldo Actero Salmonella/STEC preaquecido e incubado a 39 ± 0,5°C por 7 horas em um banho de água. As amostras foram então espalhadas diretamente em ágar xilose lisina desoxicolato (XLD) e ágar entérico Hektoen (HE) e todas as colônias presumidas foram confirmadas por procedimentos bioquímicos e sorológicos de acordo com o protocolo de referência BAM 5 para Salmonella.
[00126] Confirmação do enriquecimento com ActeroSalmonella/STEC: Da amostra de Actero Salmonella/STEC enriquecida, 1,0 ml foi transferido para 10 mL de caldo de tetrationato e 0,1 ml para 10 mL de caldo Rappaport-Vassiliadis (RV) e foram incubados, respectivamente, a 35 ± 2°C e 42 ± 0,5°C por 22-24 horas. Eles foram então espalhados em placas de ágar seletivo como em Bam 5 e os positivos presumidos foram confirmados por procedimentos bioquímicos e sorológicos de acordo com o protocolo de referência BAM 5 para Salmonella.
[00127] Enriquecimento do método referência: O segundo grupo de amostras (20 inoculadas e 5 não inoculadas) foi enriquecido em 225 mL de caldo de lactose, que foi incubado a 35 ± 2°C por 24 ± 2 horas e foi processado de acordo com o método de referência BAM 5 para Salmonella. Todas as amostras presumidas positivas foram submetidas à identificação bioquímica e sorológica recomendada pelo FDA.
[00128] Preparação de amostras: Frango moído cru naturalmente contaminado foi usado. Para obter resultados positivos fracionais (nível baixo), frango moído naturalmente contaminado foi cuidadosamente misturado com produto não contaminado para garantir a homogeneidade (mil e trezentos gramas (1300g) foram preparados). Para a porção de alto nível, duzentos e cinquenta gramas (250 g) do frango moído naturalmente contaminado não foram diluídos. Uma análise MPN foi montada para determinar o nível de Salmonella no frango moído. Uma parte com baixa contaminação foi dividida em dois grupos de vinte amostras de 25 g e a parte com alto nível de contaminação foi dividida em dez amostras de 25 g. Todas as amostras foram colocadas em um saco Stomacher equipado com filtro.
[00129] Enriquecimento em ActeroSalmonella/STEC: Um grupo (20 amostras com baixo nível e 5 com alto nível) foi homogeneizado por 30 segundos com 50 mL de caldo Actero Salmonella/STEC preaquecido e incubado a 39 ± 0,5°C por 20 horas em uma incubadora. Eles foram então espalhados em BGS e XLT4 e incubados a 35°C por 18-24 horas e todas as colônias presumidas positivas foram confirmadas por procedimentos bioquímicos e sorológicos de acordo com o protocolo de referência USDA/FSIS para Salmonella.
[00130] Confirmação do enriquecimento com ActeroSalmonella/STEC: Da amostra de Actero Salmonella/STEC enriquecida, 0,5 ml foi transferido para 10 mL de caldo de tetrationato (Hajna) e 0,1 ml para 10 mL caldo de soja Rappaport-Vassiliadis modificado (RVS) e foram incubados a 42 ± 0,5°C por 22-24 horas. Eles foram então espalhados em BGS e XLT4 e incubados a 35°C por 18-24 horas. Se as colônias fossem pequenas ou não visíveis, elas eram reincubadas por mais 18-24 horas. Até 3 colônias típicas foram coletadas por placa e transferidas para planos inclinados TSI e LIA. Procedimentos bioquímicos e sorológicos como em MLG 4.05 foram efetuados para confirmar amostras positivas.
[00131] Enriquecimento do método referência: O segundo grupo de amostras (20 amostras inoculadas e 5 não inoculadas) foi enriquecido em 900 mL de água de peptona tamponada por 18-24 horas a 35 ± 2,0°C e em seguida processadas de acordo com o protocolo de referência USDA/FSIS para Salmonella. As amostras para MPN foram tratadas da mesma maneira. Todas as amostras presumidas positivas foram submetidas à identificação bioquímica e sorológica recomendada pelo USDA/FSIS.
[00132] Preparação de amostras: S. montevideo foi espalhada em ágar-sangue e incubada por uma noite a 35°C. Algumas colônias foram transferidas para 9 mL de TSB por 6-7 horas a 35°C. A cultura foi diluída 1:10 em TBS fresco e foi incubada por uma noite à mesma temperatura. Mil e quinhentos gramas (1500 g) de couve-de-bruxelas foram inoculados a um nível para produzir resultados fracionalmente positivos (1,0 CFU/25 g) e cuidadosamente homogeneizados por agitação manual. Quatrocentos gramas (400 g) de couve-de-bruxelas foram deixados sem inoculação. As duas partes foram armazenadas a 4°C por 48 horas para deixar a bactéria estabilizar no alimento. Uma análise MPN foi preparada para estimar o nível de contaminação depois do período de estabilizada. A parte inoculada foi dividida em dois grupos de vinte amostras de 25 g e a parte não inoculada foi dividida em dois grupos de cinco amostras de 25 g.
[00133] Enriquecimento em ActeroSalmonella/STEC: Um grupo (20 amostras inoculadas e 5 não inoculadas) foi homogeneizado por 30 segundos com 150 mL de caldo Actero Salmonella/STEC preaquecido e incubado a 39 ± 0,5°C por 7 horas em um banho de água. Da amostra de Actero Salmonella/STEC enriquecida, 1,0 ml foi transferido para 10 mL de caldo de tetrationato e 0,1 ml para 10 mL de caldo Rappaport-Vassiliadis (RV) e foram incubados, respectivamente, a 43 ± 0,2°C e 42 ± 0,2°C por 18 horas (porque foi considerado que as couves-de-bruxelas tinham alta carga microbiana). Eles foram então espalhados em placas de ágar seletivo como em Bam 5 e as positivas presumidas foram confirmadas por procedimentos bioquímicos e sorológicos de acordo com o protocolo de referência BAM 5 para Salmonella.
[00134] Confirmação do enriquecimento com ActeroSalmonella/STEC: Para a confirmação, o duplo enriquecimento das amostras de Actero Salmonella/STEC foi novamente colocado para incubação por mais 6 horas por um total de 24 horas (segundo recomendado pelo FDA). Elas foram então espalhadas em placas de ágar seletivo como em Bam 5 e as positivas presumidas foram confirmadas por procedimentos bioquímicos e sorológicos de acordo com o protocolo de referência BAM 5 para Salmonella.
[00135] Enriquecimento do método referência: O segundo grupo de amostras (20 inoculadas e 5 não inoculadas) foi enriquecido em 225 mL de caldo de lactose, que foi incubado a 35 ± 2°C por 24 ± 2 horas e foi processado de acordo com o método de referência BAM 5 para Salmonella. Todas as amostras presumidas positivas foram submetidas à identificação bioquímica e sorológica recomendada pelo FDA.
[00136] Resultados: Todos os resultados do estudo do método de comparação estão resumidos nas tabelas 10, 11 Nos ovos líquidos inteiros, usando o caldo Actero Salmonella/STEC para um enriquecimento de 7 horas em um banho de água a 39°C, 10 de 20 amostras foram detectadas positivas. Um duplo enriquecimento das amostras enriquecidas com Actero Salmonella/STEC de acordo com o protocolo de referência USDA/FSIS confirmou os resultados para especificicidade de 100% (Tabela 10). Das 20 amostras testadas pelo método de referência, 10 foram confirmadas positivas. Todas as amostras não inoculadas foram constatadas negativas tanto pelo método de enriquecimento com Actero Salmonella/STEC da FoodChek quanto pelo método de referência do USDA/FSIS (Tabela 11).
[00137] A) Nas vieiras congeladas cruas, mais uma vez, o desempenho do método de enriquecimento da FoodChek usando o caldo Actero Salmonella/STEC foi similar ao método de referência. Efetivamente, usando o caldo Actero Salmonella/STEC para um enriquecimento de 7 horas em um banho de água, 5 amostras foram confirmadas positivas das 20 inoculadas ao nível fracional para uma especificidade de 100% (Tabela 10). O método de referência do FDA (BAM 5) detectou 4 amostras positivas. Todas as amostras não inoculadas foram confirmadas negativas por ambos os métodos. A análise estatística (estudo não pareado) dos resultados obtidos mostra que não há diferenças significativas entre os métodos de enriquecimento com Actero Salmonella/STEC da FoodChek e o método de referência do USDA/FSIS (Tabela 11).
[00138] B) No frango moído cru, amostras naturalmente contaminadas foram testadas. O método ActeroSalmonella/STEC da FoodChek, consistindo em um enriquecimento de 20 horas a 39°C em uma incubadora usando o caldo Actero Salmonella/STEC, detectou 7 positivas das 20 analisadas. A confirmação pelo duplo enriquecimento das amostras em Actero Salmonella/STEC também produziu os mesmos 7 positivos para uma especificidade de 100% (Tabela 10). O método de referência detectou 10 amostras positivas das 20 testadas. Ambos os métodos detectaram as 5 amostras de alto nível naturalmente contaminadas. Como este é um estudo não pareado, a análise estatística dos resultados obtidos mostra que não há diferenças significativas entre os métodos de enriquecimento com Actero Salmonella/STEC da FoodChek e o método de referência do USDA/FSIS (Tabela 11).
[00139] C) Na couve-de-bruxelas, o método de enriquecimento da FoodChek consistindo em um primeiro enriquecimento em um banho de água por 7 horas a 39°C no caldo Actero Salmonella/STEC e um segundo enriquecimento no caldo TT e RV por 18 horas em banhos de água a 43°C e 42°C, respectivamente, encontrou 11 amostras positivas confirmadas das 20 preparadas (Tabela 10). Para o método de referência, infelizmente, muito poucas colônias típicas foram isoladas e todas elas foram negativas por testagem bioquímica. Foram feitas até três tentativas para reisolar as colônias típicas não isoladas, mas nenhuma delas foi positiva para Salmonella por testagem bioquímica. O único resultado positivo encontrado é uma amostra de 50 g da análise MPN. A análise estatítica dos resultados obtidos aqui mostra que não há diferenças significativas entre os dois métodos (Tabela 11).
Tabela 10: Método Actero Salmonella/STEC da FoodChek Presumido vs. Confirmado
aMPN = O número mais provável baseia-se no POD de porções de teste do método de referência entre laboratórios usando a calculadora AOAC MPN, com um intervalo de confiança de 95%
bN/A = Não aplicável
cN = Número de porções de teste
dx = Número de porções de teste positivas
ePODCP = Resultados positivos presumidos do método candidato dividido pelo número total de ensaios
fPODCC = Resultados positivos confirmados do método candidato dividido pelo número total de ensaios
gdPODCP = Diferença entre os valores de POD do resultado presumido do método candidato e os valores de POD do resultado confirmado do método candidato
h95% de CI = Se o intervalo de confiança de um dPOD não contém zero, então a diferença é estatisticamente significativa no nível de 5%
Tabela 11: Resultados de Comparação do Método
aMPN = O número mais provável baseia-se no POD de porções de teste do método de referência entre laboratórios usando a calculadora AOAC MPN, com um intervalo de confiança de 95%
bN/A = Não aplicável
cN = Número de porções de teste
dx = Número de porções de teste positivas
ePODC = Resultados positivos confirmados do método candidato dividido pelo número total de ensaios
fPODR = Resultados positivos confirmados do método candidato dividido pelo número total de ensaios
gdPODC = Diferença entre os valores de POD t do método candidato e os valores de POD do método de referência
h95% de CI = Se o intervalo de confiança de um dPOD não contém zero, então a diferença é estatisticamente significativa no nível de 5%
Tabela 10: Método Actero Salmonella/STEC da FoodChek Presumido vs. Confirmado
bN/A = Não aplicável
cN = Número de porções de teste
dx = Número de porções de teste positivas
ePODCP = Resultados positivos presumidos do método candidato dividido pelo número total de ensaios
fPODCC = Resultados positivos confirmados do método candidato dividido pelo número total de ensaios
gdPODCP = Diferença entre os valores de POD do resultado presumido do método candidato e os valores de POD do resultado confirmado do método candidato
h95% de CI = Se o intervalo de confiança de um dPOD não contém zero, então a diferença é estatisticamente significativa no nível de 5%
Tabela 11: Resultados de Comparação do Método
bN/A = Não aplicável
cN = Número de porções de teste
dx = Número de porções de teste positivas
ePODC = Resultados positivos confirmados do método candidato dividido pelo número total de ensaios
fPODR = Resultados positivos confirmados do método candidato dividido pelo número total de ensaios
gdPODC = Diferença entre os valores de POD t do método candidato e os valores de POD do método de referência
h95% de CI = Se o intervalo de confiança de um dPOD não contém zero, então a diferença é estatisticamente significativa no nível de 5%
[00140] As modalidades e os exemplos apresentados neste descrição são ilustrativos da natureza geral da matéria reivindicada e não são limitativos. Ficará entendido pelos versados na técnica como essas modalidades podem ser facilmente modificadas e/ou adaptadas para várias aplicações e de várias maneiras sem se afastar do escopo da matéria reivindicada. As reivindicações aqui apresentadas devem ser interpretadas como incluindo sem limitação todas as modalidades alternativas e equivalentes da presente matéria. As expressões, palavras e termos empregados nesta descrição são ilustrativos e não limitativos. Onde permitido por lei, todas as referências citadas nesta descrição estão aqui incorporadas em sua integridade a título de referência. Será apreciado que quaisquer aspectos das diferentes modalidades divulgadas nesta descrição podem ser combinados em uma gama de modalidades alternativas possíveis, e combinações alternativas de aspectos, todas essas combinações variadas de aspectos devendo ser interpretadas como fazendo parte da matéria reivindicada. Modalidades particulares podem alternativamente compreender ou consistir em ou excluir qualquer um ou mais dos elementos divulgados.
Claims (11)
- Meio de cultura para detecção de salmonella spp ou Escherichia coli (E. Coli) em uma amostra de alimento ou do ambiente, caracterizado pelo fato de que compreende concentrações biologicamente eficazes de uma mistura de nutrientes compreendendo:
Dihidrato de cloreto de cálcio (CaCl.2H2O);
Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4);
Sulfato de magnésio anidro;
Cloreto de sódio (NaCl)
Extrato de levedura;
Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4);
Ácido Cítrico (C6H8O7);
Vitamina B12 em uma concentração de 0,1 a 1,0 mg/L;
Etanolamina em uma concentração de 1,0 a 3,0 g/L;
Sulfato de ferro em uma concentração de 0,01 a 0,05 g/L; e
Piruvato de Sódio em uma concentração de 0,5 a 2,0 g/L. - Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mistura de nutrientes compreende um extrato de levedura em uma concentração de 1 a 4 g/L.
- Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o extrato de levedura está presente em uma concentração de 3 g/L.
- Meio de cultura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que
a vitamina B12 está presente em uma concentração de 0,5 mg/L;
a etanolamina está presente em uma concentração de 2,0 g/L;
Sulfato ferroso está presente em uma concentração de 0,019 g/L; e
o Piruvato de sódio está presente em uma concentração de 1,0 g/L. - Método para cultivar salmonella spp ou Escherichia coli (E. Coli) em uma amostra de alimento ou do ambiente, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de incubar a amostra no meio como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
- Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio compreende um extrato de levedura em uma concentração de 1 a 4 g/L.
- Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o meio compreende
vitamina B12 em uma concentração de 0,5 mg/L;
etanolamina em uma concentração de 2,0 g/L;
Sulfato ferroso em uma concentração de 0,019 g/L; e
Piruvato de sódio em uma concentração de 1,0g/L. - Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a Escherichia coli (E. coli) é E. coli O157, E. coli produtora de toxina shiga (STEC), e E. coli enterohemorrágica (EHEC).
- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a Salmonella spp é Salmonella typhimurium e Salmonella entérica.
- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de detecção de Salmonella spp ou E.Coli após a etapa de incubação.
- Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção compreende ainda uma reação de polimerase de cadeia (PCR), ligação de lecitina, difusão simples, difusão lateral, ligação de anticorpo, fluxo lateral, detecção imunológica, ELISA ou etapa através de fluxo.
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