CN111518718A - 一种重组大肠杆菌产indigoidine培养基及发酵和制备色素粗品方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组大肠杆菌产indigoidine培养基及发酵和制备色素粗品方法。上述培养基，按1L体积计算，是由如下重量的原料组成：胰蛋白胨5g，酵母浸粉10g，氯化钠10g，3‑(N‑吗啉)丙磺酸5g，剩余为水；发酵过程采用变温培养方式控制，前期37℃以菌体生长为主，后期28℃以生产产物为主；色素粗品采用旋转蒸发和真空冷冻干燥的方法制备。本发明的培养基配方营养丰富，促进大肠杆菌生长代谢，且发酵过程采用变温培养的方式适合大肠杆菌前期生长和后期产素的需求，发酵周期较短。制备色素粗品的方法适合于实验室水平小量制备，并可应用于indigoidine标准曲线的制作。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌产indigoidine培养基及发酵和制备色素粗品方法
背景技术
植物和微生物是生产天然蓝色素的主要原料来源。植物天然蓝色素主要有靛蓝、栀子蓝。链霉菌、假单胞菌、基因工程菌株等微生物中的某些种类能够产生天然蓝色素，如放线菌紫(红)素、紫色杆菌素等，且微生物所产的某些色素还兼有抗菌效果。
indigoidine是一种无毒的微生物天然蓝色产物。indigoidine合成酶(indigoidine synthetase)是非核糖体多肽合成酶，最适酶活为28℃，经4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferases，PPTase，EC 2.7.8.7)活化，将微生物体内的2分子谷氨酰胺合成为1分子indigoidine。最早从植物病原菌欧文氏杆菌(Erwiniasp.)中发现indigoidine色素并分离，其具有清除自由基的能力使植物病原菌可耐受植物应激防御反应所分泌的过氧化物。之后陆续从其他微生物产物中也发现了indigoidine，如：假单胞菌(Pseudomonas sp.)、福格斯氏菌(Vogesella sp.)。近年来，在多种链霉菌，如淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)与色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)，的基因组中发现indigoidine合成酶基因并以沉默基因的形式存在，目前通过分子克隆技术，使其在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母菌等宿主中成功异源表达。
indigoidine为非水溶性蓝色素，能够溶解于少数几种有机溶剂，如DMF、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃、吡啶、N-甲基吡咯烷酮等。还可被连二亚硫酸钠还原为隐色体形式。该色素具有一定的抗菌性和氧化还原性。
当前indigoidine在很多方面已有应用的报道。在分子生物学中可作为筛选标记，如应用于蓝白斑筛选系统。色素明亮深邃的蓝色类似于靛蓝，也可作为新型天然蓝色素及染料应用于印染、食品和医药行业，目前已有报道其用于蛋白质类纤维织物的染色。由于indigoidine结构性质，使其具有作为有机半导体材料的潜能，在太阳能、信息记录和液晶材料等方面有广阔的开发应用前景。
目前通过基因工程和微生物发酵技术，使大肠杆菌成功发酵生产indigoidine色素。但当前使用的发酵温度偏低，不易控制，整个发酵周期大于30h，且LB培养基的增菌效果一般，色素产量偏低，发酵液后期pH偏高，不利于色素的生产。在制备色素粗品方面，由于indigoidine不溶于水的性质，采用超高速离心从发酵液中获取产物的方法，需要超高速离心设备，不适于一般实验室与工厂条件，且其它方法以DMSO作为提取色素溶剂时，受温度影响较大，价格偏高。
发明内容
以下所述技术方案中，所涉及的菌株为一株含有indigoidine合成酶基因(idgS)和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因(sfp)的重组大肠杆菌工程菌E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp。其中表达载体pBT2-ET-idgS-sfp，以专利CNl07502617A中公布的pBT2-ET-5R-EGFP质粒为骨架，在其HindIII和Nhe I克隆位点之间插入idgS-sfp基因，替换原有的5R-EGFP基因，idgS与sfp串联克隆。idgS基因来自淡紫灰链霉菌(StreptomyceslavenduLae)CGMCC 4.1386，GenBank登录号：AHW58010；sfp基因来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，GenBank登录号：X63158.1。所述indigoidine合成酶(idgS)编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(sfp)编码基因序列如SEQID NO.2所示。
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种重组大肠杆菌产indigoidine培养基。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种重组大肠杆菌产indigoidine发酵培养的方法。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种利用重组大肠杆菌产indigoidine发酵液制备色素粗品的方法。
为解决上述第一个技术问题，本发明一种重组大肠杆菌产indigoidine培养基，按1L体积计算，是由如下重量的原料组成：
胰蛋白胨5g，酵母浸粉10g，氯化钠10g，3-(N-吗啉)丙磺酸5g，剩余为水。
优选地，重组大肠杆菌产indigoidine培养基的pH＝7.0。
为解决上述第二个技术问题，本发明一种重组大肠杆菌产indigoidine发酵培养的方法，如下：
以1％(V/V)接种量将液体种子转接于上述重组大肠杆菌产indigoidine培养基中，发酵过程前期37℃培养6～8h，后期28℃培养10～12h，发酵终止，整个发酵过程摇床转速为180r/min。
为解决上述第三个技术问题，本发明提供一种利用重组大肠杆菌产indigoidine发酵液制备色素粗品的方法，包括如下步骤：
步骤1：取50mL发酵液于EP管中，12000r/min离心20min，弃上清，留沉淀。
所述沉淀为大肠杆菌菌体和indigoidine色素沉淀的混合；
步骤2：向步骤1中的沉淀加入5mL甲醇，振荡悬浮，12000r/min离心10min，弃上清，此过程重复2次；然后分别用乙酸乙酯、正己烷采用上述方法清洗沉淀2次。
步骤3：向步骤2中所得沉淀加入20mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，振荡混匀，超声溶解沉淀中的色素，至溶液颜色不再加深，12000r/min离心20min，上清溶液经0.22μm有机微孔滤膜过滤，即为色素溶液。
步骤4：将步骤3中的色素溶液经旋转蒸发除去DMF，在水浴温度65～72℃，蒸发瓶转速50～60r/min，真空度-0.1MPa的条件下，旋蒸至蒸发瓶内产生蓝黑色固态物质并无流动液体时结束。所述蓝黑色固态物质为indigoidine色素粗品；
步骤5：取1mL超纯水加入步骤4中的旋蒸瓶内，超声悬浮蓝黑色固态物质，转移至EP管中，于-80℃下冻存24h，然后放入真空冷冻干燥机中冻干14～18h，此时EP管中蓝黑色固体完全变干，即为干燥的indigoidine色素粗品。所述蓝黑色固态物质为indigoidine色素粗品；
本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明公开了一种重组大肠杆菌产indigoidine培养基及发酵和制备色素粗品的方法。本发明获得的菌体生物量与产物效价高于通常所用的LB培养基，发酵全程pH可控制在7～7.5范围内。发酵周期较短，可控制在20h以内，温度易于控制。本方法无需超高速离心设备，适用于一般实验室水平进行小量提取，对产物产量没有限制，尤其适用于产量较低的情况。
附图说明
图1表示表达载体pBT2-ET-idgS-sfp质粒图谱
图2表示酵母浸粉浓度对indigoidine产量的影响
图3表示37℃培养不同时间对indigoidine产量的影响
具体实施方式
以下实施例中，所涉及的菌株为一株含有indigoidine合成酶基因(idgS)和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因(sfp)的重组大肠杆菌工程菌E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp。其中表达载体pBT2-ET-idgS-sfp为E.coli-Staphylococci穿梭质粒，氯霉素与氨苄青霉素抗性(Cmr、Ampr)，由本发明人团队构建并保存。
表达载体pBT2-ET-idgS-sfp：以我们前期论文(张变强，唐巧巧，柯灵超，张健，王德培，朱燕，高强.肉葡萄球菌电转化条件的优化，天津科技大学学报，2019，34(3)：8-14)中构建的pBT2-ET-5R-EGFP质粒为骨架，在其HindIII和Nhe I克隆位点之间插入idgS-sfp基因，替换原有的5R-EGFP基因，idgS与sfp串联克隆。idgS基因来自淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavenduLae)CGMCC 4.1386，GenBank登录号：AHW58010；sfp基因来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，GenBank登录号：X63158.1。质粒图谱见图1。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
菌株：重组大肠杆菌工程菌株E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp
大肠杆菌产indigoidine培养基(g/L)：胰蛋白胨5，氯化钠10，3-(N-吗啉)丙磺酸5，酵母浸粉分别为5、10、15，剩余为水；培养基初始pH＝7.0；1×105Pa灭菌20min。
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠10，剩余为水；培养基初始pH＝7.0；1×105Pa灭菌20min。
按如下步骤：
(1)将菌株E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp经三区划线于含0.1mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基活化，37℃培养14h长出白色单菌落，然后变温至28℃培养6h后，白色单菌落变为蓝色；
(2)挑取(1)中蓝色较深的单菌落于含0.1mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min培养11h，即为种子液；
(3)以1％(V/V)接种量将种子液转接到装有50mL上述培养基的250mL三角瓶中，发酵过程前期37℃培养7h，后期28℃培养12h，发酵终止，即得到发酵液，整个发酵过程摇床转速为180r/min；
(4)取(3)中不同发酵培养基的发酵液各50mL置于离心管中，12000r/min离心20min，弃上清，向沉淀中加入10mL蒸馏水，振荡悬浮，12000r/min离心10min，弃上清，此过程重复2次。向沉淀中加入3mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，振荡混匀，超声溶解1h，12000r/min离心20min，取上清色素溶液。
(5)在λ＝590nm处测量色素溶液吸光度值，OD590(indigoidine色素溶液在λ＝590nm处有最大吸收峰，即λmax＝590nm)。若色素溶液OD590大于0.8，则稀释至0.2～0.8范围内测定，即OD590＝OD590稀释*稀释倍数。
(6)酵母浸粉浓度对indigoidine产量的影响如图2所示，当酵母浸粉为10g/L时，产量最高，是LB培养基产量的2.8倍，37℃培养7h时菌体量比LB提高了30.1％。
实施例2
菌株：重组大肠杆菌工程菌株E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp
大肠杆菌产indigoidine培养基(g/L)：胰蛋白胨5，酵母浸粉10，氯化钠10，3-(N-吗啉)丙磺酸5，剩余为水；培养基初始pH＝7.0；1×105Pa灭菌20min。
按如下步骤：
(1)将菌株E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp经三区划线于含0.1mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基活化，37℃培养14h长出白色单菌落，然后变温至28℃培养6h后，白色单菌落变为蓝色；
(2)挑取(1)中蓝色较深的单菌落于含0.1mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min培养11h，即为种子液；
(3)以1％(V/V)接种量将种子液转接到装有50mL上述培养基的250mL三角瓶中，发酵过程前期37℃培养，培养时间分别为4h、6h、7h、8h、10h、12h，后期28℃培养12h，发酵终止，即得发酵液，整个发酵过程摇床转速为180r/min；
(4)取(3)中37℃不同培养时间的发酵液各50mL置于离心管中，12000r/min离心20min，弃上清，向沉淀中加入10mL蒸馏水，振荡悬浮，12000r/min离心10min，弃上清，此过程重复2次。向沉淀中加入3mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，振荡混匀，超声1h，12000r/min离心20min，取上清色素溶液。
(5)在λ＝590nm处测量色素溶液吸光度值，OD590(indigoidine色素溶液在λ＝590nm处有最大吸收峰，λmax＝590nm)。若色素溶液OD590大于0.8，则稀释至0.2～0.8范围内测定，即OD590＝OD590稀释*稀释倍数。
(6)37℃培养不同时间对indigoidine产量的影响如图3所示，37℃培养6～8h产量较高，其中培养7h产量最高，且OD590＝9.47，分别为4h、10h产量的3.83倍、4.64倍，12h时OD590＝0.074，没有色素产出。
实施例3
利用重组大肠杆菌产indigoidine发酵液制备色素粗品，按如下步骤：
(1)取50mL实施例1或2中的发酵液于EP管中，12000r/min离心20min，弃上清，留沉淀；所述沉淀为大肠杆菌菌体和indigoidine色素的混合沉淀；
(2)向(1)中沉淀加入5mL甲醇，振荡悬浮，12000r/min离心10min，弃上清，此过程重复2次；然后分别用乙酸乙酯、正己烷采用上述方法清洗沉淀2次。
(3)向步骤(2)中所得沉淀加入20mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，振荡混匀，超声溶解沉淀中的色素，至溶液颜色不再加深，12000r/min离心20min，上清溶液经0.22μm有机微孔滤膜过滤，即为色素溶液。
(4)将步骤(3)中的色素溶液经旋转蒸发除去DMF，在水浴温度70℃、蒸发瓶转速60r/min、真空度-0.1MPa的条件下，旋蒸至蒸发瓶内产生蓝黑色固态物质并无流动液体时结束；所述蓝黑色固态物质为indigoidine色素粗品；
(5)取1mL超纯水加入步骤(4)中的旋蒸瓶内，超声悬浮蓝黑色固态物质，转移至EP管中，于-80℃下冻存24h，然后放入真空冷冻干燥机中冻干14h，此时EP管中蓝黑色固体完全变干，即为干燥的indigoidine色素粗品；所述蓝黑色固态物质为indigoidine色素粗品。
应用例1
利用实施例3中的indigoidine色素粗品制作标准曲线，按如下步骤：
(1)取实施例3中1mg色素粗品，溶于1mL DMF，配制为1g/L的标准母液；
(2)将(1)中1g/L标准母液梯度稀释，配置成5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的标准溶液；
(3)用紫外分光光度计检测5个不同浓度的标准溶液在最大吸收波长λmax＝590nm处吸光光度值OD590；
(4)以标准液浓度为横坐标，吸光光度值OD590为纵坐标，线性拟合得到indigoidine色素的标准曲线。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (4)
1.一种重组大肠杆菌产indigoidine培养基，其特征在于，按1L体积计算，由如下重量的原料组成：
胰蛋白胨5g，酵母浸粉10g，氯化钠10g，3-(N-吗啉)丙磺酸5g，剩余为水。
2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于：所述重组大肠杆菌产indigoidine培养基pH＝7.0～7.5。
3.利用如权利要求1所述一种重组大肠杆菌产indigoidine培养基进行发酵培养的方法，其特征在于，以1％(V/V)接种量将种子液转接于权利1所述的培养基中，发酵过程前期37℃培养6～8h，后期28℃培养10～12h，发酵终止，整个发酵过程摇床转速为180r/min。
4.一种重组大肠杆菌产indigoidine色素粗品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取50mL发酵液于EP管中，12000r/min离心20min，弃上清，留沉淀。
步骤2：向步骤1中的沉淀加入5mL甲醇，振荡悬浮，12000r/min离心10min，弃上清，此过程重复2次；然后分别用乙酸乙酯、正己烷采用上述方法清洗沉淀2次。
步骤3：向步骤2中所得沉淀加入20mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，振荡混匀，超声溶解沉淀中的色素，至溶液颜色不再加深，12000r/min离心20min，上清溶液经0.22μm有机微孔滤膜过滤，即为色素溶液。
步骤4：将步骤3中的色素溶液经旋转蒸发去除DMF，在水浴温度65～72℃，蒸发瓶转速50～60r/min，真空度-0.1MPa的条件下，旋蒸至蒸发瓶内产生蓝黑色固态物质并无流动液体时结束。
步骤5：取1mL超纯水加入步骤4中的旋蒸瓶内，超声悬浮蓝黑色固态物质，转移至EP管中，于-80℃下冻存24h，然后放入真空冷冻干燥机中冻干14～18h，此时EP管中蓝黑色固体完全变干，即为干燥的indigoidine色素粗品。
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