BR112012021846B1 - processo para produção de violaceína e deoxiviolaceína contendo pigmento bioativo de chromobacterium sp. (mtcc 5522) - Google Patents
processo para produção de violaceína e deoxiviolaceína contendo pigmento bioativo de chromobacterium sp. (mtcc 5522) Download PDFInfo
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Abstract
PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE VIOLACEÍNA E DEOXIVIOLACEÍNA CONTENDO PIGMENTO BIOATIVO DE CHROMOBACTERIUM SP. (MTCC 5522). A presente invenção descreve um processo para a produção de pigmento natural azul-violeta contendo violaceína e seu derivado (deoxiviolaceína) usando Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 (MTCC 5522, NCIM 5341; número de acesso no Genbank FJ982784). O método compreende as etapas de manutenção e crescimento da bactéria em meio específico sob condições definidas de temperatura, pH e agitação. No final da incubação, a biomassa e o pigmento são separados do caldo da cultura, o pigmento é recuperado da biomassa por meio de extração com solvente e finalmente o pigmento é concentrado por secagem.
Description
A presente invenção trata de uma estirpe bacteriana isolada, Chromobacterium sp. com número de acesso MTCC 5522. Além disso, a presente invenção prevê um processo para a produção de violaceína e seus derivados contendo pigmento bioativo natural utilizando uma nova bactéria isolada Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 (MTCC 5522, NCIM no. 5341; número de acesso no Genbank FJ982784). Mais particularmente, a invenção prevê um método para a produção de um pigmento bioativo contendo violaceína e seus derivados utilizando Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 mantida e cultivada em meio específico sob condições definidas e para subsequente recuperação do pigmento do meio de cultura.
Os metabólitos secundários microbianos têm um efeito importante na saúde, nutrição, e economia da sociedade humana. Estes metabólitos secundários incluem antibióticos, antivirais, citotoxinas, pigmentos, antioxidantes, feromonas, inibidores de enzimas, imunomoduladores, agentes antitumorais e fatores de crescimento que exibem um amplo espectro de atividade biológica. A "violaceína" (3-[l,2-di- hidro-5-(5-hidroxi-lH-indol-3-il)-2-oxo-3H-pirrol-3-ilideno] -1,3-dihidro-2H-indol-2-ona) é um derivado indólico colorido azul-violeta e metabolito secundário, isolado principalmente de bactérias do gênero Chromobacterium. A violaceína apresenta importantes atividades biológicas que têm importantes aplicações farmacêuticas incluindo propriedade antitumoral, antibacteriana, antiviral, modulação enzimáticas, citotóxica, antiprotozoária e protege das radiações ionizantes e propriedades antiparasitárias (Durai et al., 2007).
O papel biológico da violaceína em Chromobacterium violaceum, bem como a sua via de biossíntese são intensamente estudados. A violaceína foi descoberta para ser um pigmento respiratório (Friedheim, 1936) e a sua produção está envolvida na regulação da síntese de triptofano (DeMoss, 1967). L-triptofano é prontamente convertido em violaceína por Chromobacterium violaceum. No entanto, a violaceína não é necessária para o crescimento e a sobrevivência de C. Violaceum, pois a produção do pigmento é interrompida quando C. violaceum é cultivada em um meio complexo e completo (Sivendra e Lo, 1975; Duran e Faljoni- Alario,1980). Embora s C. violaceum seja capaz de crescer tanto sob condições aeróbicas quanto anaeróbicas, a produção de violaceína ocorre apenas na presença de oxigênio (DeMoss e Evans, 1959). Quando as enzimas da via violaceína são inativadas por liofilização rápida, tanto L. triptofano quanto indol foram metabolizados para índigo, outro pigmento violeta foi usado como corante (O. Sebek, e H. Jaeger,
Nature., 1962, 196, 793-795). A publicação No. WO/2004/056960 divulga os genes que codificam polinucleotideos do cromossoma de Chromobacterium violaceum, a atividade de expressão e as aplicações destes polinucleotideos. Além de produzir violaceína, uma espécie de Chromobacterium, Chromobacterium suttsuga sp. nov foi encontrada para apresentar atividade inseticida como revelado na publicação número WO/2005/032250. Chromobacterium violaceum também produz outros compostos úteis, tal como o composto fisiologicamente ativo HS-1 com atividade antitumoral e antimicrobiana (patente US 5,428,175), uma preparação enzimática purificada utilizada para a produção de peptídeos alfa, beta-dehidrotriptofanil (Patente US 5,356,794), onde a arfamenina é útil como um estimulador de defesa do hospedeiro, agente antitumoral e serve para melhorar a imunidade mediada por células (Patente US 4,859,593), e sal de ácido 2-oxo-l-azetidinesulfonico tendo atividade antibiótica (Patente US 4,529,698) .
O pigmento violeta produzido por Chromobacterium violaceum é um composto de violaceína (cerca de 90%) e outros compostos tais como desoxi violaceína (DeMoss e Evans (1959) um pigmento menos abundante, transhidroxi violaceína ou seus derivados, e triacetil violaceína e diacetil(di) metilviolaceína.
Referências podem ser feitas para o pedido de patente brasileiro PI0101346-7 no qual um processo de aplicação da violaceína como antimicobacteriano utilizando o agente ativo dissolvido em dimetilsulfóxido para utilização posterior em soluções aquosas é divulgado.
Referências podem ser feitas para a publicação "W02006/074451 (US 20060263368)" em que o inventor descreve a utilização de violaceína como um agente citotóxico ou porção de proliferação anticelular para terapia do cancro. Para combater tumores e melhorar a capacidade de redução da toxicidade, uma formulação de violaceína encapsulada em composto hidrofóbico, tais como beta-ciclodextrina conjugada com uma nanopartícula de ouro através de um ditiol específico e o processo usando a violaceína encapsulada são reivindicados no pedido de patente brasileiro PI0502657-1. Referências podem ser feitas a patente "KR2007088150", onde os inventores revelam um agente de controle de pragas compreendendo violaceína derivada de Chromobacterium violaceum para controle de infestações, bem como atividade antifúngica e método para a preparação de violaceína.
Uma preparação cosmética útil para a proteção da pele e das membranas mucosas, tais como antibacterianas e antivirais e compreendendo corante de violaceína, transhidroxi violaceína, desoxiviolaceína, deoxiviolaceína, triacetilviolaceína ou seus derivados, e diacetil(di)metilviolaceína ou seus análogos furanos, em combinação com lipofílico e/ou substâncias hidrofílicas são revelados na patente N° DE102005051869. Um processo para a preparação de transhidroxiviolaceína, processo para preparar seu uso para a profilaxia e terapia de doenças virais são divulgados na patente No. DE 3813465.
O pigmento violeta azulado, tal como violaceína ou deoxiviolaceína, produzido a partir de Janthinobacterium lividum é tratado com uma solução aquosa de tioureia para melhorar a resistência à luz do pigmento tal como divulgado na Patente No. JP11152687. A patente brasileira PI9801307 revela uma formulação de ciclodextrina/violaceína com solubilidade e versatilidade da violaceína aumentadas para uso como agente antibacteriano, antitumoral, antiviral e tripanocida. Agente antiparasitário e antifúngico contendo violaceína é divulgado na patente KR20070088150. Violaceína de Pseudoalteromonas sp. da estirpe "Black Beauty" (DSM 13623) para aplicação na indústria de alimentos, têxtil e de brinquedos foi relatada na patente americana Na2004053375.
Um procedimento para a produção, extração e purificação de violaceína foi desenvolvido por D. Rettori e N. Duran (World J Microbiol. Biotech. 1998, 14, 685-688), utilizando Chromobacterium violaceum (CCT 3496) cultivada em algodão, em frascos Roux modificados de 1 litro. O pedido de patente brasileiro PI9702918-1 descreve um processo para biossíntese de violaceína, tendo atividade antitumoral, utilizando arroz como fonte de carbono no meio ágar nutriente. Violaceína tendo atividade antiviral contra os vírus da poliomielite e herpes podem ser preparados por cultivo de Chromobacterium violaceum em um fermentador de batelada arejado entre 20 a 25°C durante 5 a 7 dias em um meio contendo peptona, glicose e sal comum com pH 6 a 7, extraindo o pigmento bruto utilizando etanol e, em seguida, re-extraindo usando n-heptano, como revelado na patente DE3935066.
O rendimento de violaceína de Chromobacterium violaceum utilizando conhecidos métodos microbiológicos é muito baixo (0,43 g/L) para aplicações comerciais de grande escala. A patente japonesa JP 7227290 divulga um método industrial de baixo custo adicionando uma fonte de triptofano, ácido antranílico ou seu sal, em uma dada concentração para a cultura de Chromobacterium sp líquida e para extrair violaceína do meio líquido ou da célula, ou de ambos.
A utilização de um biorreator de prateleiras para superfícies (bps) para produção, extração e purificação de um metabólito bacteriano é revelada no pedido de patente brasileiro PI9702986-6. Um antioxidante natural antimicrobiano de Chromobacterium e Janthinobacterium e sua preparação cosmética são revelados na patente japonesa JP 10139612. A patente japonesa JP6253864 revela um método para a preparação de violaceína por inoculação de uma ou ambas de Chromobacterium e Janthinobactrium em caldo.
Para atender a demanda de violaceína, esta é extraída também de maneira economica por um processo técnico simples de outras espécies. Uma bactéria Pseudoalteromonas sp, de sedimento marinho, da estirpe Black Beauty (inicialmente depositada sob o número DSM 13623) deu 13 vezes o rendimento e o corante bruto foi extraído da massa de células por suspensão com metanol quente como descrito nas patentes No. AT000000369438, DE000010063712, EP000001341925, US020040053375 e W0002002050299. A estirpe S9601 Janthinobacterium lividum (depositada como FERM P-15894), isolada de casulos do lixo ou fios de seda tigindos também produz um derivado de violaceína, que é utilizado como um corante com excelente tom de cor, textura e solidez de fingimento (JP 10113169). A protease e a violaceína são simultaneamente produzidas usando uma cultura líquida de Chromobacterium e Janthinobacterium sp que contém matéria em decomposição de pêlos de animal e produto de fibra de proteína de pêlos de animal ou seda que é mergulhada na solução, melhorando assim eficazmente a percepção das fibras e realizando a coloração ao mesmo tempo (JP 6341069).
As estirpes de bactérias recombinantes têm sido utilizadas para a produção de pigmento de violaceína e seus derivados. Um método para produzir estirpes de recombinação especial de bactéria através da introdução da síntese de deoxiviolaceína relacionada a um grupo de genes e a produção de deoxiviolaceína são divulgados para Pseudomonas putida nas patentes chinesas CN 101386834 e CN 101368169 e para Bacillus coli BL21-CondonPlus (DE3)-RIL na patente chinesa CN 101319219, para E. coli no documento WO1999/020799.
A patente US 7,244,607 descreve Chromobacterium subtsugae sp. nov. que produz metabolites tingidos em violeta com atividade inseticida. Comparado com Chromobacterium subtsugae sp. Nov., Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 na presente invenção produz o pigmento em um curto período de incubação com simples necessidades nutricionais. A presente invenção supera o inconveniente de baixo rendimento da produção do pigmento violaceína, utilizando uma nova estirpe de Chromobacterium, nomeada Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 (NCIM 5341) mantida e cultivada em meios específicos de cultura sob condições definidas de crescimento e extraindo o pigmento violaceína, utilizando um solvente orgânico tal como metanol, etanol ou butanol. A principal vantagem da presente invenção é a produção melhorada da violaceína contendo pigmento bioativo comparativamente em menos tempo e sendo o pigmento produzido estável mesmo em altas temperaturas e sobre uma faixa de pH mais ampla.
O principal objetivo da presente invenção é fornecer uma estirpe bacteriana isolada, Chromobacterium sp. tendo número de acesso MTCC 5522.
Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um processo para a produção aumentada de violaceína e seus derivados contendo pigmento bioativo natural utilizando
Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 (NCIM 5341; número de acesso no Genbank FJ982784) mantido e cultivado em meios de cultura específicos e em condições de crescimento definidas.
Ainda outro objetivo da presente invenção é a separação e purificação de violaceína e seus derivados contendo pigmento bioativo natural de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 (MTCC 5522, NCIM 5341; número de acesso no Genbank FJ982784), mantido e cultivado em meios de cultura específicos sob condições de crescimento definidas.
Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma estirpe isolada bacteriana, Chromobacterium sp. tendo número de acesso MTCC 5522, em que as referidas células Chromobacterium possuem 0,3 a 0,6 μm de largura e 0,9 a 1,5 μm de comprimento, são Gram negativas anaeróbias facultativas, Oxidase positivas, apresentam teste de produção de indol negativo, teste de vermelho de metila positivo, teste Voges-Proskauer negativo, teste de utilização do citrato positivo, teste TSI fermentando apenas glicose, teste da catalase negativo e teste da ureia negativo.
Além disso, a invenção presente proporciona um processo para a produção de pigmento microbiano bioativo azul-violeta contendo violaceína e seu derivado deoxiviolaceína, que utiliza uma nova bactéria isolada Chromobacterium sp. depositada em MTCC, IMTECH, Chandigarh com número de acesso MTCC 5522, no qual o dito processo compreende as etapas de: a) inocular Chromobacterium sp. com número de acesso MTCC 5522 em um meio de crescimento com pH na faixa de 5 a 9, com temperatura de 27 a 32°C durante um período de 8 a 30 horas sob agitação entre 150 e 2 50 rpm para obter biomassa bacteriana contendo o pigmento; b) misturar a biomassa bacteriana contendo o pigmento tal como obtido na etapa (a) com um solvente, na proporção que varia entre 1:3 a 1:5 para se obter uma mistura; c) opcionalmente, centrifugar a biomassa bacteriana com o pigmento tal como obtido na etapa (a) na velocidade na faixa de 9660 X g a 10.000 X g, em uma temperatura que varia entre 4 a 7°C por um período de 10 a 15 minutos para se obter o sobrenadante livre de células contendo pelotas de biomassa e pigmentos; d) misturar o aglomerado de células contendo biomassa e pigmento tal como obtido na etapa (c) com um solvente, na proporção que varia entre 1:3 a 1:5 para se obter uma mistura; e) centrifugar a mistura, como obtido na etapa (d) ou na etapa (b) em uma velocidade na faixa de 9660 x g a 10.000 X g, a uma temperatura que varia entre 4°C e 7°C por um período de 10 a 15 minutos para obter o pigmento extraído com solvente; f) concentrar o pigmento extraído com solvente tal como obtido na etapa (e) por evaporação de rotor ou secagem a vácuo em uma temperatura que varia entre 50°C a 70°C para obter o pigmento microbiano bioativo azul-violeta contendo violaceína e seu derivado deoxiviolaceína.
Em uma forma de realização da presente invenção, o pH está na faixa de 6,5 a 7,5 e o período de tempo está na faixa de 20 a 24 horas.
Ainda em outra concretização da presente invenção., o meio de crescimento compreende 0,4 a 0,5% do extrato de levedura e 1 a 1,5% de peptona ou 0,5 a 1% de amido, 0,25 a 0,75% de peptona e 0,1 a 0,3% de extrato de levedura.
Ainda em outra concretização da presente invenção, o solvente utilizado é selecionado a partir do grupo consistindo de etanol, metanol, butanol, ou uma combinação destes.
Ainda em outra forma de realização da presente invenção, o rendimento do referido pigmento bioativo está na faixa de 0,6 a 1,0 g do pigmento/g da biomassa seca após um período de incubação de 24 horas.
Ainda em outra forma de realização da presente invenção o referido pigmento bioativo inibiu o crescimento de 93 a 97% das bactérias Gram positivas, 55 a 60% das bactérias Gram negativas, 10 a 20% do crescimento de fungos, 20 a 30% do crescimento de protozoários e exibiu propriedade de eliminação de radicais livres.
Ainda em outra forma de realização da presente invenção, o referido pigmento bioativo é estável na faixa de temperatura que varia de 0°C a 80°C e com pH na faixa de 2 a 8.
Ainda em outra forma de realização da presente invenção, uma estirpe isolada bacteriana, Chromobacterium sp. tendo número de acesso MTCC 5522, em que as referidas células Chromobacterium possuem 0,3 a 0,6 μm de largura e 0,9 a 1,5 μm de comprimento, são Gram negativas anaeróbias facultativas, Oxidase positivas, apresentam teste de produção de indol negativo, teste de vermelho de metila positivo, teste Voges-Proskauer negativo, teste de utilização do citrato positivo, teste TSI fermentando apenas glicose, teste da catalase negativo e teste da ureia negativo.
Ainda em outra forma de realização da presente invenção, a Chromobacterium sp. é isolada dos sedimentos de argila provenientes da drenagem ácida de mina no lago do distrito de Thiruvananthapuram em Kerala na índia.
Ainda em outra forma de realização da presente invenção, o pigmento produzido é extraído diretamente, ou após a separação da biomassa do caldo da cultura.
Ainda em outra forma de realização da presente invenção, o solvente orgânico utilizado para a extração do pigmento bacteriano de violaceína é diretamente adicionado ao caldo da cultura contendo a biomassa e ao pigmento bioativo para a extração completa do caldo.
O esquema 1 representa um filograma obtido pelo método de agrupamento de vizinhos baseado nas sequências do gene 16S rRNA mostrando a posição filogenética da Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 com outra violaceína que produz os organismos obtidos a partir do GenBank. A barra de escala representa 0,02 substituições por posição do nucleotídeo.
A figura 1 mostra o crescimento da biomassa e o perfil da produção do pigmento de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 em caldo Luria Bertani (LB) com pH 7 e a 30°C sob condição de agitação (200 rpm).
A figura 2 mostra um cromatograma HPLC do pigmento bioativo em solução etanólica realizado em uma coluna ODS com uma fase móvel com metanol e detector de comprimento de onda de 575 nm (taxa de fluxo de solvente 1 ml/min).
A figura 3 mostra o espectro de absorção UV-VIS do pigmento violeta.
A figura 4 mostra os espectros de massa do pigmento bruto mostrando a presença de violaceína e deoxiviolaceína no pigmento.
A figura 5 mostra o efeito do pH diferente no crescimento da biomassa e a produção de pigmento por Chromobacterium NIIST-CKK-01. O valor da densidade óptica (OD) medida após 24 horas de incubação sob o pH específico do meio de crescimento é mostrado. OD da biomassa e o pigmento foram medidos a 600 e 575 nm respectivamente.
A figura 6 mostra o efeito da agitação em diferentes valores de rpm sobre crescimento e a produção de pigmento por Chromobacterium NIIST-CKK-01. O valor OD medido após 24 horas de incubação sob RPM específica é mostrado. OD da biomassa e do pigmento foram medidos em 600 e 575 nm respectivamente.
A figura 7 mostra a atividade antimicrobiana do pigmento bruto em uma concentração de 5 mg/L em bactérias a) Gram positivas (Bacillus) e b) Gram negativas (Pseudomonas). O crescimento das bactérias é representado pela leitura de OD a 600 nm. Controle + Metanol (MeOH) foram contabilizados os efeitos inibitórios do metanol (MeOH) sobre o crescimento.
A presente invenção revela Chromobacterium sp. tendo número de acesso MTCC 5522, em gue as referidas células Chromobacterium possuem 0,3 a 0,6 μm de largura e 0,9 a 1,5 μm de comprimento, são Gram negativas anaeróbias facultativas, Oxidase positivas, apresentam teste de produção de indol negativo, teste de vermelho de metila positivo, teste Voges-Proskauer negativo, teste de utilização do citrato positivo, teste TSI fermentando apenas glicose, teste da catalase negativo e teste de ureia negativo.
Além disso, a presente invenção proporciona um processo para a produção de pigmento bioativo natural azul- violeta contendo violaceína e seus derivados, utilizando uma bactéria Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 (MTCC 5522, NCIM 5341; número de acesso no Genbank FJ982784), mantido e cultivado em meios de cultura específicos e em condições de crescimento definidas.
Neste processo, uma nova estirpe biologicamente pura isolada de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 (cultura depositada para NCIM; número de acesso no Genbank FJ982784) é mantida e cultivada em meios específicos de cultura através da inoculação dos meios de cultura da composição predefinida com quantidade apropriada de inoculo e cresce sob condições definidas de temperatura, pH e agitação. Após a incubação da cultura por um período específico, a biomassa bacteriana foi separada do meio de cultura por meio de centrifugação. A recuperação da substância da biomassa foi realizada por extração com um solvente orgânico adequado adicionado à cultura em uma proporção predeterminada. O pigmento extraído foi então concentrado por evaporação de rotor ou secado sob vácuo em uma temperatura definida.
A Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 é mantida em meio sólido de 0,5% de extrato de levedura, 1,5% de peptona e 1,5% de ágar, sob condição refrigerada de 4 a 7°C por não mais do que duas semanas.
A principal vantagem da presente invenção é o aumento da produção de violaceína e o seu derivado contendo pigmento natural em curta duração e o pigmento bioativo produzido ser estável mesmo a temperaturas muito elevadas e sendo o pigmento produzido estável mesmo em altas temperaturas e sobre uma faixa de pH mais ampla.
A chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 é uma bactéria aeróbica, isolada dos sedimentos de argila provenientes da drenagem ácida de mina no lago do distrito de Thiruvananthapuram em Kerala na índia. A posição taxonômica da bactéria é Bactérias; Proteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Chromobacterium; Chromobacterium sp. NIIST- CKK-01. A bactéria é capaz de utilizar substratos orgânicos como o acetato, glicose, amido, glicerol e cultivadas em meio de ágar Luria Britani (LB) (composição (g/L) de peptona-10, extrato de levedura-5, NaCl-5, ágar-15) ou caldo, meio ágar nutriente (composição (g/L) peptona-5, extrato de carne de vaca-3, extrato de levedura-5, ágar-15) ou caldo, meio de ágar R2A (composição (g/L) caseína ácida hidrolisada-0,5, extrato de levedura-0,5, peptona protease- 0,5, dextrose-0,5, amido solúvel-0,5, fosfato dipotássico- 0,3, MgSO4-0,3, piruvato sódico-0,3, ágar-15g). As colônias de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 são circulares, nas cores violeta escuro, e opaca, com superfície brilhosa no ágar LB, ágar nutriente e meio ágar R2A. A faixa de diâmetro da colônia varia de 12 a 20 mm. A estirpe é Gram negativa. A estirpe testada para testes bioquímicos positivos, tais como oxidase, vermelho de metila, bem como testes de utilização do citrato e negativos para produção de catalase, urease e índol e testes Voges-Proskauer. Teste de tríplice açúcar- indol (ETI) positivo para glicose e sem produção de sulfeto. A observação SEM (Microscópio Eletrônico de Varredura) mostrou que o tamanho da célula varia de 0,4 a 0,6 X 1,8 a 2,2 μm.
Tal como aqui utilizado, toda % é percentagem para peso, também expressa como % (w/w), a menos que seja especificado o contrário. Neste processo a Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 é cultivada em um meio de crescimento específico contendo de 0,2 a 0,7% de extrato de levedura e 1,2 a 1,7% de peptona em peso por base de peso. O meio de cultura contém 0,5 a 1% de amido, 0,2 a 0,7% de peptona e 0,1 a 0,5% de extrato de levedura em peso por base de peso é utilizado.
O meio de cultura é inoculado com 1 a 5% (v/v por base de volume) célula bacteriana inócula de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01. Para aumentar a produção de corante bioativo, a Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 é cultivada em um meio de cultura com pH mantido entre 5 a 9, sendo o pH ótimo de 6,5 a 7,5, e a temperatura ótima em 30°C, a agitação da cultura é mantida de 150 a 250 rpm. A cultura é incubada por um período de 20 a 24 horas.
Quando a confluência é atingida, a biomassa bacteriana é separada do meio de cultura líquido por centrifugação e o pigmento bioativo é extraído da biomassa bacteriana por extração com solventes orgânicos, tais como etanol, metanol ou butanol adicionados ao caldo de cultura inicial na proporção de 1:3. 0 pigmento bioativo assim recuperado é concentrado ou secado por evaporação usando um rotor ou por secagem a vácuo sob uma temperatura na faixa de 50 a 60°C. O 5 pigmento bioativo, assim, produzido a partir de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 exibe estabilidade em um faixa de temperatura entre 2 0 a 80°C e pH entre 5 a 9. O rendimento do pigmento de violaceína microbiano obtido é de cerca de 0,6 a 1,0 g por grama de cultura em uma base de 10 peso seco, em um período de incubação de 24 horas. Tabela 1: Efeito da temperatura sobre a estabilidade do pigmento de violaceína de C. NIIST-CKK-01
Tabela 2: Efeito do pH sobre a estabilidade do pigmento violaceína de C. NIIST-CKK-01 
A Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 é uma bactéria aeróbica, isolada dos sedimentos de argila provenientes da drenagem ácida de mina no lago do distrito de
Thiruvananthapuram em Kerala na índia. A bactéria foi 5 encontrada associada com partículas de argila tipo caulim.
Esta foi inicialmente isolada no meio ágar nutriente (composição (g/L) peptona-5, extrato de carne de vaca-3, extrato de levedura-5, ágar-15).
A caracterização da Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 10 revelou que pode se utilizar substratos orgânicos simples e complexos para o crescimento e produção do pigmento sem L- triptofano exógeno no meio. Entre as fontes de carbono, o crescimento de glicose melhorou, mas inibiu a produção do pigmento. O pigmento foi produzido com pH entre 5 e 9, entre 15 20 e 40°C, salinidade de até 1,5% e sob aeróbia para a condição microaerof ílica. Em pH 4, 4,5 e 10 um ligeiro crescimento foi observado, mas sem produção de pigmento. Este é o primeiro relato da produção de violaceína em crescimento bacteriano sob uma faixa ampla de pH. Para estirpe C. violaceum BB-78, a produção máxima de pigmento foi observada em pH 7 (Riveros et al. , 1989) . A estirpe psicrotrófiça RT 102 mostrou concentração celular máxima e produção de pigmento em pH 6 (Nakamura et ai, 2 002) . Do mesmo modo, o pH ótimo para a produção de violaceína por Duganella sp. B2 foi pH 6,71 (Wang et al., 2009) .
Durante 24 horas de incubação no meio específico (composição 0,5% de extrato de levedura, 1,5% de peptona) Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 em condições ótimas, pH 7, 30°C e sob 200 rpm de agitação, produzido lg violaceína/ grama de biomassa (peso seco) que é maior do que qualquer um dos relatórios anteriores.
A maior produção de violaceína relatada até agora está em Duganella sp. B2 (1,62 g/L em 32 horas) em condições ótimas de pH (6,72), temperatura (40°C), agitação (200 ml) em 25 ml de volume de um meio definido contendo L-triptofano como o precursor para a biossíntese da violaceína (Wang et al., 2009). Embora, a Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 seja melhor em termos de exigência nutricional simples, condições de crescimento, produção de pigmentos precoce e rendimento de pigmento; a produção de pigmento foi diminuída pela presença de glicose. No entanto a inibição total não foi observada.
A temperatura afetou consideravelmente a produção de pigmentos por Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01, mas mostrou pouco efeito sobre o crescimento da presente estirpe. A produção de violaceína a 3 0°C foi iniciada com 10 horas de incubação, enquanto que a produção de pigmento a 3 5 °C iniciou-se a cerca de 6 horas. A produção máxima de pigmento foi encontrada a 30°C em um período de incubação de 24 horas.
A presente estirpe exibiu crescimento máximo em meios isentos de salinidade, mas cerca de 55% de declínio no crescimento foi observado em 1,5% de salinidade. Por outro lado, a produção de pigmento em 1,5% de salinidade foi 10% mais baixa comparado com meios sem salinidade.
A análise filogenética baseada no gene 16S rRNA indicou 98% de similaridade com o gênero Chromobacterium. Parte do gene 16S rRNA (número de acesso no GenBank: FJ982784) de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 foi sequenciada e alinhada com outra violaceína que produz sequências de estirpes no GenBank. A árvore filogenética gerada pelo método de agrupamento de vizinho com base na sequência do gene 16S rRNA mostrou que a estirpe Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 caiu na radiação do cluster compreendendo Chromobacterium, Janthinobacterium, Pseudoalteromonas e Duganella (Esquema 1) . Os maiores valores de similaridade de sequência foram observados entre Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 e seus vizinhos mais próximos na árvore filogenética, ou seja, Chromobacterium sp. 60 (EF077669), Chromobacterium sp. USM2 (FJ668944) , Chromobacterium sp. MBIC 3901 (17487 ABO), Chromobacterium piscinae (AJ871127), e etc. Chromobacterium subtsugae PRAA4 (AY 344056) coberta pela patente US 7,244,607 formou um cepa separada, juntamente com Chromobacterium violaceum (ATCC 12472, GenBank-M22510) e Chromobacterium violaceum CV09 (FJ 753567) .
Figura 1. As características fenotípicas, genotípicas e filogenéticas de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 são diferentes de Chromobacterium subtsugae PRAA4. Além disso, o pigmento bioativo produzido por Chromobacterium sp. NIIST- CKK-01 é estável sob ampla faixa de temperatura e pH.
Os exemplos a seguir são dados a título de ilustração e, portanto, não deve ser interpretado de forma a limitar o âmbito da presente invenção.
PRODUÇÃO E EXTRAÇÃO DO PIGMENTO BIOATIVO DA CULTURA DE CHROMOBACTERIUM SP. NIIST-CKK-01
Uma alçada de 24 horas de idade da cultura pura de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 em meio de ágar sólido (ágar LB ou ágar nutriente) foi inoculada com 50 ml do meio de crescimento (0,5% de extrato de levedura e 1,5% de peptona) , colocada em um frasco de Erlenmeyer de 250 ml. Alternativamente, 10% (v/v) da cultura pura de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 de 24 horas de idade em caldo LB também foi usado como inóculo. O pH do meio era 7. Os frascos inoculados com Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 foram subsequentemente incubados em um agitador rotativo em temperatura ambiente (30°C) e 200 rpm durante 24 horas. O pigmento azul-violeta, violeta escuro começou a aparecer no meio por cerca de 6 horas de incubação e continuou depois do aumento da biomassa (figura 1).
Após 24 horas de incubação, a biomassa bacteriana com pigmento foi centrifugada a 9676,8 X g e a 4°C por 10 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante límpido foi removido. O aglomerado contendo a biomassa e o pigmento foi misturado com 5 ml de metanol extra puro. A mistura foi centrifugada novamente a 9676,8 X g e a 4°C por 10 minutos para separar o aglomerado de células da mistura de pigmento com solvente. A extração do pigmento foi repetida duas vezes usando solvente fresco como descrito. Todos os solventes extraídos do pigmento foram aglomerados em conjunto e o pigmento foi concentrado para secagem normal a vácuo em um dessecador. A quantidade de biomassa e do pigmento produzido pode ser explicada através da medição da densidade óptica a 600 nm e 57 5 nm, respectivamente. O rendimento do pigmento por este método foi de cerca de 1,0 g de pigmento/g de biomassa seca em 24 horas.
A análise por HPLC foi realizada para verificar a pureza do pigmento produzido usando coluna ODS (Lichrospher- 100; Merck) com acetonitrila (40%) em 1 ml/min como fase móvel e um detector UV-VIS em 575 nm (figura 2) . Os espectros de absorção UV-VIS indicaram absorção máxima de
575 nm, típico de violaceína e seus derivados (figura 3).
SEPARAÇÃO DO PIGMENTO BIOATIVO DO MEIO DE CULTURA DE CHROMOBACTERIUM SP. NIIST-CKK-01 ATRAVÉS DA EXTRAÇÃO COMPLETA DO CALDO
Conforme descrito no exemplo 1, a violaceína contendo pigmento bioativo foi produzida usando cultura pura de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01. Após 24 horas de incubação, todo o caldo (incluindo a biomassa e o pigmento) foi transferido para um frasco de separação de 250 ml de capacidade. 10 ml de n-butanol extra puro foi diretamente adicionado ao caldo no frasco de separação e muito bem misturado. O pigmento bioativo foi dissolvido em n-butanol e formou uma camada separada no topo. A camada inferior contendo principalmente os detritos celulares e vestígios de pigmento foi separada. A porção inferior separada foi novamente re-extraída com 10 ml de n-butanol para recuperar os vestígios de pigmento. O pigmento contendo n-butanol foi aglomerado e concentrado por meio de secagem em vapor rotativo a 70°C.
Uma alçada de 24 horas de idade da cultura pura de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 do meio de ágar sólido (ágar LB) foi inoculada com 50 ml do meio de crescimento (0,5% extrato de levedura e 1,5% peptona), colocada em um frasco de Erlenmeyer de 250 ml. Alternativamente, 10% (v/v) da cultura pura de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 com 24 horas de idade em caldo LB ou em meio de caldo de nutrientes também foi usado como inoculo. O pH do meio era 7. Os frascos inoculados com Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 foram subsequentemente incubados em um agitador rotativo a 25°C de temperatura e 200 rpm por 24 horas. O pigmento azul- violeta, violeta escuro começou a aparecer no meio por cerca de 12 horas de incubação e continuou depois do aumento da biomassa.
Após 24 horas de incubação, o meio de cultura líquido contendo a biomassa e o pigmento, foi transferido para um frasco de separação de 250 ml de capacidade. 10 ml de n- butanol extra puro foi diretamente adicionado ao caldo no frasco de separação e muito bem misturado. O pigmento bioativo se dissolveu em n-butanol e formou uma camada separada no topo. A camada inferior, contendo principalmente os detritos celulares e vestígios de pigmento, foi separada. A porção inferior separada foi novamente re-extraída com 10 ml de n-butanol para recuperar os vestígios de pigmento. O pigmento contendo n-butanol foi aglomerado e concentrado por meio de secagem em vapor rotativo a 70°C. O rendimento do pigmento por este método foi de cerca de 0,7 g de pigmento/g de biomassa seca em 24 horas.
Uma alçada de 24 horas de idade da cultura pura de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 do meio de ágar sólido (ágar LB) foi inoculada com 50 ml do meio de crescimento (0,5% extrato de levedura e 1,5% de peptona), colocada em um frasco de Erlenmeyer de 250 ml. Alternativamente, 10% (v/v) da cultura pura de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 com 24 horas de idade em caldo LB ou em meio de caldo de nutrientes também foram usados como inoculo. O pH do meio estava na faixa de 7. Os frascos inoculados com Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 foram subsequentemente incubados em um agitador rotativo a 35°C de temperatura e 200 rpm por 24 horas. O pigmento azul-violeta, violeta escuro começou a aparecer no meio por cerca de 12 horas de incubação e continuou depois do aumento da biomassa.
Após 24 a 3 0 horas de incubação, o meio de cultura líquido contendo a biomassa e o pigmento, foi transferido para um frasco de separação de 250 ml de capacidade. 10 ml de n-butanol extra puro foi diretamente adicionado ao caldo no frasco de separação e muito bem misturado. O pigmento bioativo se dissolveu em n-butanol e formou uma camada separada no topo. A camada inferior contendo principalmente os detritos celulares e vestígios de pigmento foi separada. A porção inferior separada foi novamente re-extraída com 10 ml de n-butanol para recuperar os vestígios de pigmento. O pigmento contendo n-butanol foi aglomerado e concentrado por meio de secagem em vapor rotativo a 70°C. O rendimento do pigmento por este método foi de cerca de 0,6 g de pigmento/g de biomassa seca em 24 horas.
A resposta do meio pH na produção de violaceína foi estudada em experiências de batelada.
O pH do meio (0,5% extrato de levedura e 1,5% peptona) foi inicialmente ajustado para 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 em separado pela adição de ácido ou alcalino. A média em cada pH foi inoculada com alçada de 24 horas de idade da cultura pura de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01. O efeito do pH sobre o crescimento e a produção do pigmento em Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 são mostrados na figura 5. O crescimento e a produção de pigmento pela estirpe foram observados ao longo de uma faixa de pH de 5 a 9, com um crescimento ótimo observado em pH em torno de 7. Em pH 4 e pH 10 um ligeiro crescimento bacteriano foi observado, mas não houve produção de pigmento.
A resposta do meio de agitação sobre a produção de violaceína foi estudada em culturas de lote. O meio de crescimento (0,5% de extrato de levedura e 1,5 de peptona) em pH neutro (pH 7) foi inoculado com alçada de 24 horas da cultura pura de Chromobacterium sp. NIIST-CKK-01 e incubada em um conjunto agitador rotativo em diferentes velocidades de agitação ou RPM (rotações por minuto) . A resposta do isolado no crescimento e produção de pigmentos sob diferentes velocidades de agitação é mostrada na figura 6. Ambas as culturas estáticas e agitadas apresentaram crescimento bem como a produção de pigmento. Houve aumento significativo na produção de biomassa e pigmento em altas agitações.
O pigmento bioativo extraído contendo violaceína e seus derivados descorados quando mantidos diretamente sob a luz solar se desestabilizou. Portanto, isto indica que o pigmento decomposto da violaceína não é estável sob a luz solar direta, enquanto que no escuro o pigmento permaneceu estável por 2 semanas. TERMOESTABILIDADE E ESTABILIDADE DO PH DO PIGMENTO BIOATIVO O pigmento manteve-se estável a uma temperatura de 80°C durante 1 hora e à temperatura de armazenamento de 4°C durante o período testado de 2 semanas (Tabela 1). O pigmento permaneceu estável com pH na faixa de 2 a 8, durante 2 semanas de incubação no escuro (Tabela 2) A ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DO PIGMENTO BIOATIVO DE CHROMOBACTERIUM SP. NIIST-CKK-01 A violaceína extraída e os seus derivados contendo pigmento bioativo mostraram inibição de 93 a 97% da atividade antibacteriana contra bactérias Gram positivas, Bacillus (figura 7a). Para bactérias Gram negativas, Pseudomonas a inibição foi de cerca de 55 a 60% (Figura 7b). ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO PIGMENTO BIOATIVO DA CHROMOBACTERIUM SP. NIIST-CKK-01 A violaceína extraída e os seus derivados contendo pigmento bioativo mostraram 10 a 15% de inibição no crescimento em Penicilina. A experiência foi realizada utilizando pigmento na concentração de 5 mg/L, que foi inicialmente dissolvido em etanol e adicionado à cultura de fungos. Um controle foi realizado com o mesmo volume de etanol sozinho utilizado para dissolver o pigmento. A temperatura de incubação e o pH foram de 30°C e 7, respectivamente. Após 48 horas de incubação, o peso seco da biomassa fúngica foi quantificado. Uma redução de cerca de 10 a 20% em biomassa fúngica foi observada na cultura do pigmento bioativo adicionado. ATIVIDADE ANTIPROTOZOÁRIA DO PIGMENTO BIOATIVO DE
A violaceína extraída e os seus derivados contendo pigmento bioativo exibiram 20 a 30% de inibição do crescimento do protozoário ciliado.
A ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO PIGMENTO BIOATIVO DE CHROMOBACTERIUM SP. NO. DE ACESSO MTCC 5522 Potenciais eliminações dos radicais livres do pigmento foram testados contra uma solução metanólica de 2,2-difenil 1-1-picril hidrazil (DPPH). O pigmento foi incubado em solução metanólica de DPPH (0,1 mM) durante 20 minutos e a densidade óptica medida a 517 nm. Um controle foi realizado em paralelo com 100% de DPPH na ausência do pigmento. Ácido gálico (lmg/ml de stock) em metanol foi utilizado como padrão. O pigmento violeta bruto mostrou um máximo de 64% de atividade antioxidante contra DPPH, e o potencial antioxidante foi obtido como IC50 (concentração inibitória) de 0,6 mg/ml.
1. Maior produção de violaceína e seus derivados contendo pigmento bioativo. 2. Produção de pigmentos em curto período de tempo. 3. Exigências de crescimento simples para manutenção e o crescimento da bactéria que produz o pigmento bioativo. 4. O precursor L-triptofano para a síntese de violaceína não é necessário no meio de crescimento. 5. Separação e purificação simples do pigmento bioativo produzido através de extração completa do caldo.
Claims (6)
1. Processo para produzir um pigmento microbiano bioativo azul-violeta contendo violaceína e seu derivado deoxiviolaceína, que utiliza Chromobacterium sp. depositada em MTCC, IMTECH, Chandigarh com número de acesso MTCC 5522, CARACTERIZADO pelo fato de que referido processo compreende as etapas de: i) inocular Chromobacterium sp. em um meio de crescimento com um pH na faixa de 5 a 9, com uma temperatura em uma faixa de 27° a 32°C durante um período de tempo de 8 a 30 horas sob agitação entre 150 e 250 rpm para obter biomassa bacteriana contendo o pigmento; ii) misturar a biomassa bacteriana contendo o pigmento tal como obtido na etapa (i) com um solvente, na proporção que varia entre 1:3 a 1:5 para se obter uma mistura; iii) opcionalmente, centrifugar a biomassa bacteriana com o pigmento tal como obtido na etapa (i) em uma velocidade na faixa de 9660 X g a 10.000 X * g, em uma temperatura que varia entre 4° a 7°C por um período de 10 a 15 minutos para se obter o sobrenadante livre de células contendo aglomerados de biomassa e pigmentos; iv) misturar o aglomerado de células contendo biomassa e pigmento tal como obtido na etapa (iii) com um solvente, na proporção que varia entre 1:3 a 1:5 para se obter uma mistura; v) centrifugar a mistura, como obtido na etapa (iv) ou na etapa (ii) em uma velocidade na faixa de 9660 x g a 10.000 x g, a uma temperatura que varia entre 4°C e 7°C por período de 10 a 15 minutos para obter o pigmento extraído com solvente; vi) concentrar o pigmento extraído com solvente tal como obtido na etapa (v) por evaporação de rotor ou secagem a vácuo na temperatura que varia entre 50°C a 70°C para obter o pigmento microbiano bioativo azul-violeta contendo violaceína e seu derivado deoxiviolaceína.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o pH está na faixa de 6,5 a 7,5 e o período de tempo está na faixa de 20 a 24 horas.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de crescimento compreende 0,4 a 0,5% do extrato de levedura e de 1 a 1,5% de peptona ou 0,5 a 1% de amido, 0,25 a 0,75% de peptona e 0,1 a 0,3% de extrato de levedura.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o solvente é selecionado do grupo que consiste de etanol, metanol, butanol, ou uma combinação destes.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o pigmento bioativo produzido está na faixa de 0,6 a 1,0g do pigmento/g da biomassa seca após um período de incubação de 24 horas.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o solvente orgânico usado para a extração do pigmento bacteriano violaceína é adicionado diretamente ao líquido de cultura que contém a biomassa e o pigmento bioativo para a extração do líquido inteiro.
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