KR102022876B1 - 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 동시 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 동시 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0의 배지를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법에 관한 것이고, 또한 본 발명은 내부필터가 장착된 생물반응기를 이용하여 상기 파라코커스속 LL1 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0인 배지로 배양하는 단계를 포함하는 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주로부터 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 동시 생산방법{Method for co-production of polyhydroxyalkanoates and carotenoids}
본 발명은 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시에 효과적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 화석 연료의 과다 사용에 따른 자원 고갈 및 환경 오염에 대한 우려가 증가함에 따라 안정적이면서 지속적으로 플라스틱을 생산하려는 연구가 대두되고 있다. 이러한 대체 플라스틱 개발의 일환으로 현재 바이오매스 자원으로부터 생분해성 플라스틱 폴리히드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoates; PHA)를 생산하는 기술이 가장 주목을 받고 있다.
종래 생분해성 플라스틱 PHA 생산을 위해 사탕수수 등의 당질계, 옥수수 등의 전분계를 이용한 제 1세대 알코올 및 PHA가 생산되고 있으나, 이는 식품 및 가축 사료와의 경쟁, 재배 면적의 포화 등 많은 문제에 봉착하고 있다. 이에 지구상에서 가장 풍부하고 고갈 없이 재생이 가능한 자원으로 대표되는 목질자원 리그노셀룰로오스를 이용한 제 2세대 알코올이 개발 중에 있으나, 리그노셀룰로오스는 난분해성 방향족 중합체인 리그닌과 탄수화물인 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스의 복합체로서, 리그닌을 제거하기 위해 복잡한 과정을 거쳐야 하고 이로 인해 비용도 많이 드는 문제가 있다.
한편, PHA는 미생물의 체내에 에너지 저장물의 형태로 축적되는 폴리에스터로서, 그 중의 하나인 poly(3-hydroxybutyrate) [(P(3HB)]가 1925년 레모이그네 (Lemoigne)에 의해 바실루스 메가테리움 (Bacillus megaterium)으로부터 처음으로 발견되었다. PHA는 합성 고분자와 견줄만한 우수한 성질을 가진 생분해성 고분자로, 식품 포장용 및 일회용 제품포장용 등으로 사용된다면 합성고분자 물질의 난분해성으로 인한 심각한 공해문제를 해결할 수 있게 된다. 그러나 현재 PHA는 높은 제조원가가 필요한 문제가 있어 기존의 비분해성 플라스틱을 대체하기가 어려운 실정이므로 제조원가를 절감할 수 있는 새로운 생산 공정의 개발이 필요한 실정이다.
또한, 카로티노이드(carotenoid)는 항산화 활성을 가지고 있는 C40 이소프레노이드 화합물(isoprenoid compounds)로서 자연계에 널리 분포되어 있는 한 군의 색소를 총칭하며, 현재까지 알려진 카로티노이드는 6백여 종에 이른다. 이들은 각각 다른 형태로 존재하며 분자 구조에 따라서도 노란색, 적색, 주홍색, 주황색 등 여러 색으로 존재한다. 그 예로 β-카로텐(β-carotene; 당근의 주황색 색소), 라이코펜(licopene; 토마토의 적색 색소), 푸코잔틴(fucoxanthin; 해조류의 황갈색 또는 갈색 색소) 등이 있다.
카로티노이드는 인체 내에서 비타민 A의 전구체로서의 역할을 하며, 산화 방지 효과와 유해산소 소거작용, 암세포 증식 억제작용 및 발암 억제작용이 강하여 순환기 질환, 암 및 성인병 등을 예방하는 효능을 가진 것으로 알려져 있다. 최근에는 카로티노이드가 직접적인 자외선에 의한 신체의 면역기능을 향상시켜 자외선 노출로부터 피부의 손상을 줄여주거나 멜라닌 생성을 억제함이 밝혀지면서 유럽이나 미국에서 미용 소재로 각광을 받기 시작했다. 현재 카로티노이드는 건강식품 소재(영양 보충제), 인간을 대상으로 한 약학적 제제와 식품 착색제 또는 동물용 사료의 색소 등으로 사용되고 있다.
이러한 카로티노이드를 얻기 위한 방법으로는 미생물이 사용되고 있는데, 현재 카로티노이드를 생산하는 것으로 알려진 미생물로는 효모인 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 녹색조류인 해마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis), 그람-양성균 브레비박테리움 (Brevibacterium 103) 및 그람-음성균 아그로박테리움 아우란티아컴(Agrobacterium aurantiacum) 등이 알려져 있다. 그러나, 이러한 미생물들은 높은 함량으로 카로티노이드를 생산하지 못하기 때문에, 고농도로 카로티노이드를 생산할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2015-0105010호
이에 본 발명은 효과적으로 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시에 생산할 수 있는 방법을 개발하였는데, 특히 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시에 생산할 수 있는 파라코커스속 균주를 확인하였고, 파라코커스속 균주를 이용한 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 동시 생산 조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 파라코커스속 LL1(KP288668) 균주를 이용하여 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 함량이 증가된 파라코커스속 LL1(KP288668) 균주의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 내부필터가 장착된 생물반응기를 이용하여 파라코커스속 LL1(KP288668) 균주로부터 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 파라코커스속 LL1(KP288668) 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0의 배지를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 탄소원은 메탄올, 유당, 갈락토오스, 글리세롤, 과당, 포도당, 만니톨, 자일로스, 셀로비오스, 프로피온산, 발레르산, 크루드 글리세롤, 바닐린, 레불린산, γ-부티로락톤 및 알지네이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 또는 그 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 48시간~96시간 동안 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 파라코커스속 LL1(KP288668) 균주는 상기 배지의 총 부피 기준 1~10%(v/v)로 접종하여 배양하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 내부필터가 장착된 생물반응기를 이용하여 파라코커스속 LL1(KP288668) 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0인 배지로 배양하는 단계를 포함하는, 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 함량이 증가된 파라코커스속 LL1(KP288668) 균주의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 내부필터는 (i) 하나 또는 복수의 원통형 세라믹 여과막(60); (ⅱ) 한쪽 말단이 상기 원통형 세라믹 여과막에 연결되고 다른 한쪽 말단은 윗덮개에 연결되는 하나 또는 복수의 실리콘 튜브; 및 (ⅲ) 하부가 상기 하나 또는 복수의 실리콘 튜브와 연결되고, 상부는 외부관에 연결된 윗덮개를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 내부필터가 장착된 생물반응기를 이용하여 파라코커스속 LL1(KP288668) 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0인 배지로 배양하는 단계를 포함하는, 파라코커스속 LL1(KP288668) 균주로부터 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 내부필터는 (i) 하나 또는 복수의 원통형 세라믹 여과막(60); (ⅱ) 한쪽 말단이 상기 원통형 세라믹 여과막에 연결되고 다른 한쪽 말단은 윗덮개에 연결되는 하나 또는 복수의 실리콘 튜브; 및 (ⅲ) 하부가 상기 하나 또는 복수의 실리콘 튜브와 연결되고, 상부는 외부관에 연결된 윗덮개를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트는 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) 공중합체인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카로티노이드는 아스타잔틴 및 β-카로틴을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 이용하여 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시에 생산할 수 있는 방법을 규명한 것으로, 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0의 배지를 이용하여 배양하거나, 내부필터가 장착된 생물반응기를 이용하여 파라코커스속 LL1(KP288668) 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0인 배지로 배양할 경우, 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 합성이 증가된 파라코커스속 LL1 균주를 대량 생산할 수 있고, 배양된 상기 파라코커스속 LL1 균주로부터 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시에 효율적으로 대량 수득할 수 있어, 여러 가지 중요한 생물학적 기능을 갖는 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 이용하는 각종 산업에 널리 활용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 각기 다른 pH 조건 하에서 배양하면서 생산되는 PHA 함량, 총 카로티노이드 함량, 잔여 글리세롤 및 건조세포중량(DCW)의 변화를 측정하여 나타낸 것이다.
도 2a는 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주 배양 시, 첨가한 탄소원 종류별 생산되는 PHA 함량, 총 카로티노이드 함량, 잔여 글리세롤 및 건조세포중량(DCW)의 변화를 측정하여 나타낸 것이다.
도 2b는 탄소원으로 발레르산 1% (v/v)를 첨가한 배지를 이용하여 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 플라스크 배양한 후, 생산되는 PHA 함량, 총 카로티노이드 함량, 잔여 글리세롤 및 건조세포중량(DCW)의 변화를 측정하여 나타낸 것이다.
도 2c는 탄소원으로 크루드 글리세롤 2% (v/v)를 첨가한 배지를 이용하여 파라코커스속 LL1 균주를 플라스크 배양한 후, 생산되는 PHA 함량, 총 카로티노이드 함량, 잔여 글리세롤 및 건조세포중량(DCW)의 변화를 측정하여 나타낸 것이다.
도 2d는 탄소원으로 글리세롤, 바닐린, 레불린산, γ-부티로락톤, 알지네이트, 메탄올을 사용하고, 질소원으로 곰팡이 배양액 (Trichoderma reesei), 효모 배양액 (Candida molischiana)을 사용하여 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 플라스크 배양한 후, 생산되는 PHA 함량, 총 카로티노이드 함량, 잔여 글리세롤 및 건조세포중량(DCW)의 변화를 측정하여 나타낸 것이다.
도 3은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주에 의한 PHA 및 카로티노이드 동시 생산에 글리세롤 농도가 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 생물반응기(발효조)에서 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 회분식 배양으로 배양하면서 배양 시간별 PHA와 카로티노이드의 공동 생산 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명의 일실시예에서 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 세포 유지 배양을 위해 사용한 생물반응기(발효조)의 모식도를 나타낸 것이고, 도 5b는 상기 생물반응기 내부에 구비된 세라믹 필터의 개략도를 나타낸 것이다.
도 6은 내부 세라믹 필터 (0.1 μm 공극 크기)가 구비된 본 발명의 생물반응기에서 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1를 세포 유지 배양을 수행하여 생산되는 PHA와 카로티노이드의 동시 생산 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 방법으로 배양한 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1로부터 합성되어 생산된 PHA의 성분을 HNMR 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 8은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1에서 추출한 카로티노이드의 TLC 분리결과를 나타낸 사진으로서, 1: 표준 자유 아스타잔틴, 2: 표준 β-카로틴, 3-5: 서로 다른 배양시간 후에 회분식 배양 결과로부터 얻은 카로티노이드 추출물을 나타낸 것이다.
본 발명은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 이용하여 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법을 제공함에 특징이 있다.
구체적으로 본 발명은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0의 배지를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법을 제공한다.
한편, 종래 미생물을 이용하여 유용 생리활성물질을 다량 생산하려는 연구가 시도되고 있고, 폴리히드록시알카노에이트 또는 카로티노이드를 미생물로부터 수득하려는 연구가 진행되고 있다.
또한, 미생물 중에서 파라코커스 (Paracoccus) 종은 PHA를 축적할 수 있는 큰 잠재력을 보여주는 소수의 미생물 중 하나이다. 그러나 이러한 파라코커스 (Paracoccus) 종 모두가 PHA를 생산할 수 있는 것이 아니다.
이에 본 발명자들은 PHA 뿐만 아니라 카로티노이드를 동시에 생산할 수 있는 미생물을 찾던 중, NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 이용할 경우 가능성이 있음을 확인하였고, PHA 및 카로티노이드를 동시 합성할 수 있는 상기 균주의 배양 조건을 규명하기 위한 실험들을 진행한 결과, NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0의 배지를 이용하여 배양할 경우, 상기 균주가 PHA 및 카로티노이드를 동시 합성할 수 있음을 확인하였고 따라서 이들 물질을 동시에 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하기 위한 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주의 배양조건으로, 상기 탄소원은 이에 제한되지는 않으나, 메탄올, 유당, 갈락토오스, 글리세롤, 과당, 포도당, 만니톨, 자일로스, 셀로비오스, 프로피온산, 발레르산, 크루드 글리세롤, 바닐린, 레불린산, γ-부티로락톤 및 알지네이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 또는 그 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 글리세롤을 사용할 수 있다.
또한 상기 배지는 미생물 배양에 사용되는 일반 배지를 모두 사용할 수 있으며, 이들 배지의 종류로는 MB(Marine broth), DMB(diluted marine broth), NB(nutrient broth), DNB(diluted nutrient broth), tryptic soy broth, Zobell's broth, DZB(dilute zobell broth) 또는 이들의 변형 배지를 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 플라스크를 이용한 진탕 배양 시에는 무균 해양 배지 (Marine broth 2116, Difco)를 사용하였고, 상기 생물반응기를 이용한 회분식 배양 및 내부필터를 장착한 생물반응기를 이용한 세포 유지 배양은 1 g/L의 (NH4)2SO4를 함유하는 변형된 최소 염 배지 (MS)를 사용하였다.
또한 상기 탄소원은 상기 균주 배양을 위한 배지 총 부피의 1~5%(v/v)가 되도록 첨가하여 사용한다.
본 발명의 일실시예에서는 탄소원의 최적 첨가량 확인을 위한 실험을 수행하였는데, 그 결과 5%(v/v)를 초과한 10%(v/v)의 탄소원 첨가 시에는 오히려 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 내 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 함량이 감소되는 것으로 나타났다.
또한, 탄소원으로 글리세롤을 사용한 일실시예에서는 96시간 배양한 실험군들 중, 2%(v/v)의 글리세롤 첨가군이 다른 함량으로 첨가한 군에 비해 잔여 글리세롤이 전혀 없는 것으로 나타났다. 이는 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주가 탄소원으로 글리세롤을 사용할 경우 2%(v/v)의 글리세롤이 가장 효율적으로 기질의 활성을 모두 보인다는 것을 의미한다.
뿐만 아니라, 본 발명의 다른 일실시예에서는 1%(v/v)의 메탄올, 락토스, 갈락토오스, 과당, 글루코스 및 만니톨을 각각 탄소원으로 하여 배양한 결과, NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주가 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 합성하여 이들을 동시 생산할 수 있는 것을 확인하였다.
따라서 상기 탄소원은 균주 배양을 위한 배지 총 부피 기준 1~5%(v/v)가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다.
또한, 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하기 위한 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주 배양은 pH 7.0~ 8.0의 조건으로 48시간~96시간 동안 수행한다.
본 발명의 일실시예를 통해 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 합성 및 생산할 수 있는 pH 조건을 확인한 결과, pH 7.0 미만 또는 pH 8.0 초과인 범위에서는 이들 물질의 동시 생산이 불가능한 것으로 나타났다. 따라서 상기 균주의 배양은 pH 7.0~ 8.0의 범위로 수행하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pH 7.5로 수행하는 것이 좋다.
또한, 배양 시간은 48시간~96시간 동안 수행하는 것이 바람직한데, 48시간 미만으로 배양할 경우, NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주에서 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 동시 합성이 이뤄지지 않는 문제점이 있으며, 96시간을 초과하여 배양할 경우 합성된 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 활성 및 변성을 초래할 수 있으므로, 상기 시간동안 배양하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주는 상기 배지의 총 부피 기준 1~10%(v/v)로 접종한다.
나아가 본 발명은 내부필터가 장착된 생물반응기를 이용하여 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0인 배지로 배양하는 단계를 포함하는, 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 함량이 증가된 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 사용된 상기 생물반응기 및 내부필터의 모식도는 5a 및 5b에 기재되어 있으며, 본 발명의 생물반응기 내부에 구비된 내부필터는 파라코커스속 LL1(KP288668) 균주의 고농도 배양을 위한 것이며, (i) 하나 또는 복수의 원통형 세라믹 여과막(60); (ⅱ) 한쪽 말단이 상기 원통형 세라믹 여과막에 연결되고 다른 한쪽 말단은 윗덮개에 연결되는 하나 또는 복수의 실리콘 튜브(70); 및 (ⅲ) 하부가 상기 하나 또는 복수의 실리콘 튜브와 연결되고, 상부는 외부관에 연결된 윗덮개(80)를 포함한다.
본 발명의 생물반응기는 연속배양용 배지를 공급하는 배지저장조(feed tank, 10), 여과액저장조(recovery tank, 30)와, 발효조(fermenter, 20)로 구성된다. 상기 발효조(20) 내부에 내부필터가 장착되며, 배지저장조(10)와 발효조(20) 사이에는 공급펌프(40)가 구비되며, 발효조(20)와 여과액저장조(30) 사이에는 여과펌프(50)가 구비되어, 이들 펌프에 의해 배지의 연속적인 공급과 여과 및 배출을 행한다. 본 발명의 내부필터는 세라믹 재질의 원통형 여과막(60)과, 이 원통형 세라믹 여과막을 연결하는 실리콘 튜브(70), 및 전체 필터를 고정시키는 역할을 하는 윗덮개(80)로 구성되어 있다.
본 발명 내부필터에서의 원통형 여과막(60)은 세라믹 재질로 이루어져 있어 세포를 여과하는 필터 역할을 수행한다. 세라믹 여과막(60)의 세공크기(pore size)는 유산균의 종류와 배양조건에 따라 다르게 선택할 수 있으며, 바람직하게는 0.05 - 0.2㎛이며, 보다 바람직하게는 0.07 - 0.15㎛ 이고, 보다 더 바람직하게는 0.1 ㎛이다. 원통형 세라믹 여과막의 개수는 하나 또는 그 이상의 복수개로 할 수 있으며, 발효조의 용량에 따라 세라믹 여과막의 개수와 여과막에서의 세공크기를 조절할 수 있다.
실리콘 튜브(70)는 윗덮개(80)와 하나 또는 복수개의 원통형 세라믹 여과막(60)을 연결한다. 실리콘 튜브의 실리콘 재질은 윗덮개와 원통형 세라믹막의 세척 및 세척 후의 결합을 용이하게 하여 편리성을 제공한다.
윗덮개(80)는 부식을 방지하기 위해 스테인리스 스틸관으로 제조하는 것이 바람직하다. 윗덮개의 하나의 외부관(90)에 의해 발효조 외부의 여과펌프(50)와 연결되고, 연결된 펌프에 의해 배양 여과액이 여과액저장조(recovery tank, 30)로 배출된다.
본 발명자들은 상기 본 발명에 따른 내부필터가 장착된 생물반응기(발효조)에 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 접종하고 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0인 배지를 이용하여 배양한 결과, 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 합성이 증가된 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 대량 생산할 수 있음을 확인하였고 또한, 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시에 대량생산할 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명은 내부필터가 장착된 생물반응기를 이용하여 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.0~ 8.0인 배지로 배양하는 단계를 포함하는, NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주로부터 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법도 제공할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 본 발명의 방법으로 배양된 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주로부터 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 분리하고 성분 분석을 수행하였는데, 그 결과 상기 균주 내에서 합성된 PHA는 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) 공중합체인 것을 확인할 수 있었고, 상기 카로티노이드는 아스타잔틴 및 β-카로틴을 포함하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상 기술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 방법은 PHA 및 카로티노이드의 합성이 증가된 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주 또는 균체를 고농도로 대량생산할 수 있으며, PHA 및 카로티노이드를 동시에 용이하게 고수율로 생산할 수 있는 효과가 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
① 미생물 및 배양조건
본 발명의 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하기 위해 사용한 미생물은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 사용하였으며, 상기 미생물은 인도의 Lonar 호수에서 분리된 것으로 Sawant et al에 의해 동정 및 규명된 미생물이다(Sawant et al., 2015, Bioresource Technology, 194, 247-255).
상기 파라코커스속 LL1 미생물의 배양은, NaCl 10g/L를 함유한 Luria-Bertani(LB) 한천 배지에서 배양하였으며, 종 배양(seed culture)은 200rpm에서 16-20 시간 동안 30℃에서 진탕배양 한 다음, 250 mL 플라스크를 이용하여 50 mL LB 배지에 콜로니 한 개를 접종하여 배양을 수행하였다. 플라스크 배양은 150 mL의 무균 해양 배지 (Marine broth 2116, Difco)가 들어있는 500 mL 삼각 플라스크에서 수행되었다. 또한 상기 배양은 최적의 pH 및 접종 농도 확인을 위해 pH 5.5~8.0의 범위 및 접종 농도 1~10 %(v/v)의 범위에서 수행하였고 그에 대한 영향을 평가하였다.
② 회분식 배양(batch culture) 및 세포유지 배양(cell retention culture)
본 발명자들은 상기 진탕배양과 달리 회분식 배양을 통해 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 미생물을 배양하였다. 회분식 배양은 초기 작동 부피가 2L인 5L 크기의 발효기 (KoBiotech사, Korea)를 사용하여 수행하였다. 질소원으로 1 g/L의 (NH4)2SO4를 함유하는 변형된 최소 염 배지(MS)를 생물 반응기 실험에 사용하였다. 또한 상기 파라코커스속 LL1 미생물의 접종 농도는 10%(v/v)로 하였으며, 2%(v/v) 글리세롤을 함유하는 MS 배지에 첨가하였다. 또한 30℃의 온도 및 pH를 7.5가 유지되도록 하였는데, 이때 pH 7.5의 유지는 4N NaOH 및 4N HCl을 사용하여 조절하였다. 폭기 속도(aeration rate), 교반 및 용존 산소(DO)는 각각 2.5 vvm, 300 rpm 및 20% 이상으로 유지시켰다.
나아가 본 발명자들은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 미생물을 세포 유지 배양으로도 배양하였는데, 즉, 내부 세라믹 필터(0.1 μm 공극 크기)가 장착된 생물반응기(발효기)를 이용하여 수행하였다.
③ 카로티노이드 추출
발효액 (분비액)과 미생물 세포 바이오 매스로부터 전체 카로티노이드의 함량을 측정하기 위해, 분석을 위한 샘플은 각각 10 mL씩 무균적으로 회수하였다. 샘플을 4 ℃에서 10,000 rpm으로 15 분간 원심 분리하여 세포에 결합된 카로티노이드를 정량화하였다. 펠릿을 정상 식염수 (0.85 % w/v NaCl)로 세척하고, 상등액을 Optima XE-90 Beckman coulter를 사용하여 192,000xg에서 3시간 동안 원심 분리하여 소포를 수확하고 분비된 카로티노이드를 정량화하였다. 두 펠릿을 모두 아세톤 (5 mL)에 재현탁하고, 초음파 처리를 한 후, 55°C에서 15 분간 배양하였다. 카로티노이드 추출물을 10,000 rpm에서 15 분간 원심 분리기를 사용하여 잔류 바이오매스로부터 분리하고, 0.01% butylated hydroxy toluene (BHT)와 희미한 빛의 존재 하에서 정량분석을 수행하였다.
④ PHA 분석, 건조세포중량 ( DCW ) 분석
미생물 세포 배양액 10 ml를 무균적으로 채취하고 4℃에서 10,000 rpm으로 15 분간 원심 분리하였다. 세포 펠렛을 식염수로 세척하고 다시 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 이후 세포를 동결 건조하여 분말화 한 후, 이를 건조세포중량 (DCW)과 PHA 함량 평가에 사용하였다. PHA 함량은 건조된 세포의 methanolysis 반응 후 기체 크로마토그래피 (GC, Agilent 6890A)를 사용하여 측정하였다. 또한, 세포 유지 배양으로 수득한 PHA 공중합체는 FTIR 및 1HNMR을 통해 분석하였다. 모든 샘플의 상등액은 0.2 ㎛ 주사기 필터를 통해 여과한 후, Aminex HPX-87P 컬럼 (Bio-Rad, USA)이 장착된 HPLC (YL 9100, Younglin Inc., 한국)를 이용하여 잔류 기질 농도를 측정하였고, 이때 이동 용매는 5mM의 황산(sulfuric acid)을 사용하였으며 0.6ml/min의 유속으로 분석하였다. Paraococcus 세포에서 추출한 카로티노이드는 OptimaPak C18 컬럼 (10 × 250 mm, RS Tech, Korea)이 장착된 HPLC를 사용하여 정량화하였으며, Paracoccus 세포에서 추출한 카로티노이드는 농축하여 실리카겔 60 F254 TLC 플레이트 (10 × 10 cm, Merck) 상에서 분리하였는데, n-헥산:아세톤 (60:40) 용매를 사용하여 15-20분 동안 전개시켰다.
< 실시예 1>
NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주를 이용하여 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 및 카로티노이드의 동시 생산 조건 규명
<1-1> pH 조건
본 발명자들은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주를 이용하여 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 및 카로티노이드를 동시 생산할 수 있는 최적의 pH 조건을 확인하기 위해, 상기 파라코커스 LL1 균주를 다양한 pH 범위(pH 6.5~ 8.0)에서 배양한 후, 각 pH에서의 PHA 함량, 총 카로티노이드 함량 및 건조세포중량(DCW)을 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주로부터 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 및 카로티노이드를 동시에 가장 많은 함량으로 수득하기 위한 pH는 7.5인 것으로 나타났다. pH 7.5보다 낮은 pH 7.0 및 pH 7.5 보다 높은 pH 8.0에서 상기 균주를 배양한 경우에는 오히려 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 및 카로티노이드의 함량이 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 건조세포중량(DCW)도 pH 7.5에서 가장 높은 것으로 나타났다.
<1-2> 탄소원 조건
NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주를 배양할 때 탄소원으로서, 메탄올, 유당, 갈락토오스, 글리세롤, 프락토스(과당) 및 만니톨을 각각 첨가하여 배양한 후, PHA 함량, 총 카로티노이드 함량 및 건조세포중량(DCW)을 측정하였다. 이때 상기 메탄올은 배지 총 부피 기준 0.5%(v/v)로 첨가하였고, 그 외의 탄소원은 각각 배지 총 부피 기준 1%(v/v)로 첨가하여 배양하였다.
분석 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주는 메탄올, 유당, 갈락토오스, 글리세롤, 프락토스(과당) 또는 만니톨의 다양한 탄소원을 사용하여 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 및 카로티노이드를 동시에 생산할 수 있는 것으로 나타났으며, 특히 글리세롤을 사용한 경우, 특히 더 많은 양의 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 및 카로티노이드를 동시에 생산할 수 있는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명자들은 탄소원으로서 발레르산 1%(v/v)을 사용하였고 플라스크 배양을 수행한 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 96시간 후 카로티노이드 12 mg/L, P(3HB-co-3HV) 공중합체 내의 3HV 함량은 95%를 얻었다. 따라서 탄소원으로 발레르산을 사용할 경우 카로티노이드의 생산량을 증가시킬 수 있으며, 높은 함량의 3HV를 포함한 P(3HB-co-3HV) 공중합체를 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 탄소원으로 크루드 글리세롤 2% (v/v)를 첨가한 배지를 이용한 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주의 플라스크 배양한 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 순도가 높은 고가의 글리세롤 이외에 저가의 크루드 글리세롤을 이용하여 PHA 및 카로티노이드를 동시 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
뿐만 아니라, 본 발명자들은 탄소원으로 글리세롤, 바닐린, 레불린산, γ-부티로락톤, 알지네이트, 메탄올 및 질소원으로 곰팡이 배양액 (Trichoderma reesei), 효모 배양액 (Candida molischiana)을 이용하여 상기 Paracoccus sp. LL1 플라스크 배양한 결과, 도 2d에 나타낸 바와 같이 PHA 및 카로티노이드를 동시 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
<1-3> 탄소원의 농도 조건
상기 <1-2>를 통해 본 발명자들은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주를 사용할 경우, 다양한 탄소원을 사용하여도 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 및 카로티노이드를 동시에 생산할 수 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 최적의 탄소원 처리량을 확인하기 위해, 탄소원 중에서 글리세롤을 배양 배지의 총 부피 기준 1, 2, 5 및 10%(v/v)의 양으로 각각 첨가하여 파라코커스 LL1 균주를 시간별(48시간, 72시간 및 96시간)로 배양한 다음 PHA 함량, 총 카로티노이드 함량 및 건조세포중량(DCW)을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, PHA 및 카로티노이드의 함량은 글리세롤 5%(v/v) 까지는 글리세롤 첨가양에 비례하여 증가하는 것으로 나타났으나, 5%(v/v)를 초과한 10%(v/v)를 첨가한 군에서는 오히려 PHA 및 카로티노이드의 양이 감소하는 것으로 나타났다.
한편, 탄소원인 글리세롤에 대한 잔여 글리세롤(residual glycerol)의 함량을 분석한 결과, 2%(v/v)의 글리세롤 첨가 및 96시간 배양군에서만 잔여 글리세롤이 없는 것으로 나타났고, 그 외의 배양군에서는 잔여 글리세롤이 모두 존재하는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 토대로 볼 때, NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주를 사용하여 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 및 카로티노이드를 동시 생산할 수 있는 최적의 조건은 2%(v/v)의 글리세롤 및 96시간 배양할 경우임을 알 수 있었고, 상기 조건의 경우 PHA 48.2% 함량 및 카로티노이드 2.77mg/L의 함량을 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 따라서 2%(v/v)의 글리세롤 및 96시간 배양 조건은 첨가한 탄소원을 100% 모두 활용하여 PHA 및 카로티노이드를 동시 생산할 수 있는 조건임을 알 수 있었다.
또한 상기 실시예 1에서 수행한 배양 방법은 진탕배양 조건으로 수행하였다.
<실시예 2>
삭제
회분식 배양(batch culture)을 통한 폴리히드록시알카노에이트 ( PHA ) 및 카로티노이드의 동시 생산 조건 규명
본 발명자들은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주의 배양 규모를 증가시켜 2L의 발효조를 이용한 회분식 배양을 통해서도 PHA 및 카로티노이드를 동시 생산할 수 있는지를 확인하였다. 이를 위해 상기 파라코커스 LL1 균주를 상기 실험방법의 회분식 배양 방법에 따라 균주 배양을 수행하였고, 이때 탄소원으로는 글리세롤 2%(v/v)를 첨가하였으며, 배양 시간별 PHA 함량, 총 카로티노이드 함량 및 건조세포중량(DCW)을 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 회분식 배양을 수행할 경우 배양 시간에 따라 PHA 함량, 총 카로티노이드 함량 및 건조세포중량(DCW)이 증가하는 것으로 나타났으나, 96시간을 경과한 경우에는 이들 함량이 감소되는 것으로 나타났다.
따라서 회분식 배양을 수행할 경우, PHA 및 카로티노이드를 동시 수득하기 위해서는 72시간~96시간을 배양 시간으로 하는 것이 최적 조건임을 알 수 있었으며, 96시간 배양 시, 균체농도 8.72 g/L, 균체 내 PHA 함량 43.2%, 카로티노이드 3.6 mg/L인 것으로 측정되었다.
< 실시예 3>
내부 세라믹 필터가 구비된 반응기를 이용한 폴리히드록시알카노에이트 ( PHA ) 및 카로티노이드의 동시 생산 조건 규명
나아가 본 발명자들은 세포 유지 배양을 수행할 경우, PHA 및 카로티노이드의 함량을 더욱 증진시킬 수 있는 조건을 확립하기 위해, 생물반응기(배양기) 내부에 내부 세라믹 필터가 구비된 반응기를 이용하여 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주를 배양하였다. 이때에도 앞서 배양한 바와 같이 글리세롤 2%(v/v)를 첨가한 상태에서 배양하였다. 본 실험에서 사용된 상기 내부 세라믹 필터가 구비된 반응기는 연속배양용 배지를 공급하는 배지저장조(feed tank, 10), 여과액저장조(recovery tank, 30)와, 발효조(fermenter, 20)로 구성되어 있으며, 발효조(20) 내부에 내부필터가 장착되며, 배지저장조(10)와 발효조(20) 사이에는 공급펌프(40)가 구비되며, 발효조(20)와 여과액저장조(30) 사이에는 여과펌프(50)가 구비되어, 이들 펌프에 의해 배지의 연속적인 공급과 여과 및 배출을 수행할 수 있다. 도 5a에는 본 발명에서 사용한 세포 유지 배양에 사용된 생물반응기의 개략도를 나타낸 것이고, 도 5b에는 발효조 내부에 구비된 세라믹 필터의 개략도를 나타내었다. 본 발명의 발효조 내부에 구비된 내부필터는 세포의 고농도 배양을 위한 것이며, (i) 하나 또는 복수의 원통형 세라믹 여과막(60); (ⅱ) 한쪽 말단이 상기 원통형 세라믹 여과막에 연결되고 다른 한쪽 말단은 윗덮개에 연결되는 하나 또는 복수의 실리콘 튜브(70); 및 (ⅲ) 하부가 상기 하나 또는 복수의 실리콘 튜브와 연결되고, 상부는 외부관에 연결된 윗덮개(80)로 구성되어 있다.
상기와 같이 내부 세라믹 필터(0.1um 공극크기)가 구비된 반응기에서 파라코커스 LL1 균주의 세포 유지 배양을 수행한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 배양 시간에 따라 PHA 함량, 총 카로티노이드 함량 및 건조세포중량(DCW)이 증가하는 것으로 나타났으나, 96시간을 경과한 경우에는 이들 함량이 감소되는 것으로 나타났다.
따라서 세포 유지 배양을 수행할 경우, 회분식 배양과 같이, PHA 및 카로티노이드를 동시 수득하기 위해서는 72시간~96시간을 배양 시간으로 하는 것이 최적 조건임을 알 수 있었으며, 96시간 배양 시, 균체농도 24.2 g/L, 균체 내 PHA 함량 39.3%, 카로티노이드 농도가 7.14 mg/L인 것으로 측정되었다.
그러므로 이상의 결과를 통해 본 발명자들은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주를 이용하여 PHA 및 카로티노이드를 동시에 수득하기 위한 최적의 배양조건은 글리세롤 2%(v/v)를 첨가한 상태에서 72~96시간 동안 배양하는 것임을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
파라코커스속 균주들 및 다양한 기질을 이용한 PHA 및 및 카로티노이드의 동시 생산 가능 여부 분석
다양한 종류의 파라코커스속 균주 및 다양한 탄소원 종류와 배양 조건 하에서 균주들을 배양한 후, PHA 및 및 카로티노이드의 함량을 분석하였다.
Figure 112018024613054-pat00001
그 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 파라코커스속 균주들이라고 하여 모두 PHA 및 및 카로티노이드를 생산할 수 있는 것이 아님을 알 수 있었으며, 본 발명의 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주를 사용한 경우에만 생산이 가능한 것을 알 수 있었다.
또한, 다양한 탄소원과 각기 다른 배양 조건에서 PHA는 생산이 가능한 것으로 나타났으나, 상기 표 1의 조건들로 배양한 실험군들 중에서는 파라코커스 LL1 균주를 2%(v/v) 글리세롤 첨가 및 세포유지배양 방법으로 배양한 조건의 경우, PHA 및 및 카로티노이드를 동시에 생산할 수 있는 것으로 나타났고, 그 이외의 배양 조건에서는 카로티노이드를 생산할 수 없는 것으로 나타났다.
그러므로 상기의 결과를 통해, 파라코커스속 균주 중에서 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주만이 PHA 및 및 카로티노이드를 동시 생산할 수 있음을 알 수 있었으며, 이들을 동시에 생산하기 위해서는 앞서 기술된 본원발명의 실시예를 통한 방법을 수행할 경우, 상기 표 1에 나타낸 것과 같이 좀처럼 용이하게 생산할 수 없었던 카로티노이드를 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 5>
본 발명의 배양방법으로 배양한 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스 LL1 균주로부터 생산한 PHA 및 카로티노이드의 확인
나아가 본 발명자들은 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 이용하여 상기 기술한 배양방법으로 생산한 PHA 및 카로티노이드를 HNMR 및 FTIR spectroscopy를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 배양 후 상기 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1에서 합성된 PHA는 1H-NMR 피크 분석결과 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) [P(3HB-co-3HV)] 공중합체인 것을 확인할 수 있었고(도 7 참조), 추출한 카로티노이드는 아스타잔틴, β-카로틴을 비롯한 다른 카로티노이드들을 포함하고 있는 것으로 나타났다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
10: 배지저장조(feed tank)
20: 여과액저장조(recovery tank)
30: 발효조
40: 공급펌프
50: 여과펌프
60: 여과막
70: 실리콘튜브
80: 윗덮개
90: 관

Claims (10)

  1. NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.5인 배지를 이용하여 96시간 동안 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 탄소원은 메탄올, 유당, 갈락토오스, 글리세롤, 과당, 만니톨, 프로피온산, 발레르산, 크루드 글리세롤, 바닐린, 레불린산, γ-부티로락톤 및 알지네이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는,
    폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주는 상기 배지의 총 부피 기준 1~10%(v/v)로 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 내부필터가 장착된 생물반응기를 이용하여 NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주를 1~5%(v/v)의 탄소원을 포함하고 pH가 7.5인 배지로 96시간 동안 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 탄소원은 메탄올, 유당, 갈락토오스, 글리세롤, 과당, 만니톨, 프로피온산, 발레르산, 크루드 글리세롤, 바닐린, 레불린산, γ-부티로락톤 및 알지네이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는,
    NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주로부터 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 내부필터는 (i) 하나 또는 복수의 원통형 세라믹 여과막(60); (ⅱ) 한쪽 말단이 상기 원통형 세라믹 여과막에 연결되고 다른 한쪽 말단은 윗덮개에 연결되는 하나 또는 복수의 실리콘 튜브; 및 (ⅲ) 하부가 상기 하나 또는 복수의 실리콘 튜브와 연결되고, 상부는 외부관에 연결된 윗덮개를 포함하는 것을 특징으로 하는, NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주로부터 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 폴리히드록시알카노에이트는 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) 공중합체인 것을 특징으로 하는, NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주로부터 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 카로티노이드는 아스타잔틴 및 β-카로틴을 포함하는 것을 특징으로 하는, NCBI GenBank 등록번호(Accession No.) KP288668의 파라코커스속 LL1 균주로부터 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드를 동시 생산하는 방법.
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