KR20120108198A - 내부필터시스템이 구비된 생물반응기를 이용한 유산균의 고농도 배양 및 대사산물의 생산 방법 - Google Patents

내부필터시스템이 구비된 생물반응기를 이용한 유산균의 고농도 배양 및 대사산물의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내부필터가 구비된 발효조에서 유산균을 연속 배양하여 젖산, 아세트산 및 만니톨 등의 대사산물을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 내부필터가 구비된 발효조를 사용하므로 유산균을 고농도로 생산할 수 있고, 중간 대사산물인 젖산, 아세트산 및 만니톨을 고수율로 연속적으로 생산 가능하다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 유산균은 우유 및 발효식품의 스타터로 사용할 수 있으며, 만니톨은 식품첨가물로 사용할 수 있고, 젖산은 생분해성 고분자인 폴리락테이트(PLA, polylactate)의 원료로 사용될 수 있다.

Description

내부필터시스템이 구비된 생물반응기를 이용한 유산균의 고농도 배양 및 대사산물의 생산 방법{Method for High Cell Density Culturing of Lactic Acid Bacteria and Producing Their Metabolites By Using Bioreactor Equipped with Internal Filter System}
본 발명은 내부필터시스템이 구비된 생물반응기를 이용하여 유산균을 고농도로 배양하고 이의 대사산물을 연속적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
유산균은 우유 및 낙농제품과 다양한 발효음식을 제조하는데 스타터로써 사용이 가능하다. 또한 배양을 통해 생성된 대사산물인 만니톨의 경우 식품제조에 첨가물로써 사용이 가능하며, 젖산은 생분해성 고분자인 폴리락타이드(PLA)의 원료로서 그 이용성이 점차 증가하고 있는 추세이다. 유산균 중 본 발명에서 배양에 이용한 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum) HJ-P4 균주는 김치발효 초기단계에 증식하는 주요 유산균으로써 호기적 조건이나 혐기적 조건 상태에서 모두 생장이 가능하며 다양한 종류의 채소나 과일의 표면, 기타 냉동 육류 및 유제품에서도 발견되고 있다. 이 균주의 성장에는 여러 가지 영양성분이 필요하지만 다양한 환경에 적응하여 성장할 수 있으며 당, 단백질 대사산물, 비타민 등이 많고 산소압이 낮은 곳에서 증식이 잘된다. 또한 사람과 동물의 대장과 점막 등에 상재균으로 존재하며, 우유 및 낙농제품과 다양한 발효음식을 제조하는데 스타터로써 사용되는 유익한 미생물로 알려져 있다. 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum) HJ-P4 균주는 거의 구형의 세포이지만 때로는 매우 짧은 간균의 형태를 띄게된다. 이 균의 크기는 약 0.5 ~ 0.7 X 0.7 ~ 1.2 ㎛이며, 한 쌍 또는 체인 형태로 배열되어 있다. 영양소가 풍부한 배지에서 성장시에는 짧은 체인의 형태를 보이지만, 열악한 환경에서는 체인이 길어지는 현상을 보이게 된다. 최적성장 온도는 20?30℃의 범위에 존재하며, 배지의 최적 pH의 범위는 6?7이다. 또한 이 균주는 이형젖산발효 유산균으로써 포도당을 당원으로 hexose monophosphate (6-phosphate gluconate)와 pentose phosphate pathways의 대사과정을 통해 젖산, 알코올, CO2 등을 생산하며, 배양이 진행됨에 따라 배양 시에 발생되는 유기산으로 인해 pH는 4.4?5.0으로 떨어지게 된다. 또한 탄소원으로 과량의 과당이 존재하는 경우에 만니톨 디하이드로게나아제(mannitol dehydrogenase)에 의해 대부분의 과당이 전자 수용체(elctron acceptor) 역할을 하여 만니톨로 환원되는 현상을 보인다. 이러한 특성을 이용하여 김치, 사워크라우트(sauerkraut), 케피어(kefir)와 같은 발효 제품의 스타터 이용과 발효 생산물의 다양한 응용에 관한 연구들이 보고된 바가 있으며, 앞으로 우리의 전통식품과 생명공학의 발전에 중요한 역할을 할 것이라 기대되고 있다. (Choi, I., Jung S., Kim B., Park, S., Kim, J., and Han, H. (2001), Novel Leuconostoc citreum starter culture system for fermentation of kimchi, a fermented cabbage product, Antonie van Leeuwenhoek., 15, 163-82). 하지만 아직까지 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum) HJ-P4 균주의 고농도 배양에 관한 실험이 수행되지 않았다. 고농도 세포배양을 하기 위해서는 세포성장에 최적인 조건을 유지하면서 배양을 해야 하는데 종래의 회분방식의 최대 약점은 생산물의 농도가 낮고 생산성이 낮다는 점이다. 미생물 발효는 일반 화학물질과는 달리 반응물(배지 등)의 농도를 일정 이상으로 높일 수 없으며 미생물 자체가 성장에 해로운 물질을 만들어내므로 균체 농도를 높게 유지하기가 어렵다. 이러한 문제를 해결하는 하나의 방법으로 필터를 이용한 연속 배양법이 고농도 배양에 시도되고 있다. (Chang, H. N., Lee, W. G.., Kim, B. S. (1993), Cell retention culture with an internal filter module: continuous ethanol fermentation., Biotechnol. Bioeng., 41, 677-681).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 유산균의 연속 배양 방식을 이용하여 유산균의 고농도로 배양하고 유용 대사산물을 고수율로 얻기 위한 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 내부필터가 구비된 생물반응기를 이용하여 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum) HJ-P4 균주를 연속배양하는 방법을 통해 유산균을 고농도로 배양함과 동시에 이의 대사산물을 연속적으로 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 내부필터가 구비된 생물반응기를 이용하여 유산균을 고농도로 배양하고 대사산물을 연속적으로 생산하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유산균을 연속 배양하여 젖산, 아세트산 또는 만니톨을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 내부필터가 구비된 발효조에 초기 회분배양용 배지를 넣고, 여기에 유산균을 접종하는 단계; (b) 접종된 유산균을 초기 회분배양하는 단계; 및 (c) 상기 발효조에 연속배양용 배지를 연속적으로 공급하면서 유산균을 배양하여 젖산, 아세트산 또는 만니톨을 생산하는 단계.
이하에서 본 발명을 각 단계별로 상세히 설명한다.
단계 (a): 내부필터가 구비된 발효조에 초기 회분배양용 배지를 넣고, 여기에 유산균을 접종하는 단계
본 발명은 종래에 연속배양이 어려웠던 유산균을 내부필터가 구비된 발효조를 이용하여 연속배양에 성공한 것에 기초한 것이다.
본 발명의 연속배양에 사용될 수 있는 유산균(Lactic acid bacteria)은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 락토코커스(Lactococcus)속 유산균, 락토바실러스(Lactobacillus)속 유산균, 류코노스톡(Leuconostoc)속 유산균, 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 유산균, 엔테로코커스(Enterococcus)속 유산균, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 유산균, 카르노박테리움(Carnobacterium) 속 유산균, 스트렙토코커스(Streptococcus)속 유산균, 오에노코커스(Oenococcus)속 유산균, 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus)속 유산균, 또는 페디오코커스(Pediococcus)속 유산균이며, 바람직하게는 류코노스톡속 유산균이고, 가장 바람직하게는 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum) HJ-P4 균주이다.
본 발명은 유산균의 연속배양을 통해 젖산(lactic acid), 아세트산(acetic acid) 또는 만니톨(mannitol)와 같은 유산균의 중간 대사산물을 고수율로 얻을 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 발효조 내부에 구비된 내부필터는 유산균의 고농도 배양을 위한 것이며, 다음의 구성요소를 포함한다: (i) 하나 또는 복수의 원통형 세라믹 여과막(60); (ⅱ) 한쪽 말단이 상기 원통형 세라믹 여과막에 연결되고 다른 한쪽 말단은 윗덮개에 연결되는 하나 또는 복수의 실리콘 튜브(70); 및 (ⅲ) 하부가 상기 하나 또는 복수의 실리콘 튜브와 연결되고, 상부는 외부관에 연결된 윗덮개(80).
본 발명의 생물반응기는 연속배양용 배지를 공급하는 배지저장조(feed tank, 10), 여과액저장조(recovery tank, 30)와, 발효조(fermenter, 20)로 구성된다. 상기 발효조(20) 내부에 내부필터가 장착되며, 배지저장조(10)와 발효조(20) 사이에는 공급펌프(40)가 구비되며, 발효조(20)와 여과액저장조(30) 사이에는 여과펌프(50)가 구비되어, 이들 펌프에 의해 배지의 연속적인 공급과 여과 및 배출을 행한다.(도 1a 참조).
본 발명의 내부필터는 세라믹 재질의 원통형 여과막(60)과, 이 원통형 세라믹 여과막을 연결하는 실리콘 튜브(70), 및 전체 필터를 고정시키는 역할을 하는 윗덮개(80)로 구성되어 있다(도 1b 참조).
본 발명 내부필터에서의 원통형 여과막(60)은 세라믹 재질로 이루어져 있어 세포를 여과하는 필터 역할을 수행한다. 세라믹 여과막(60)의 세공크기(pore size)는 유산균의 종류와 배양조건에 따라 다르게 선택할 수 있으며, 바람직하게는 0.05 - 0.2㎛이며, 보다 바람직하게는 0.07 - 0.15㎛ 이고, 보다 더 바람직하게는 0.1 ㎛이다. 원통형 세라믹 여과막의 개수는 하나 또는 그 이상의 복수개로 할 수 있으며, 발효조의 용량에 따라 세라믹 여과막의 개수와 여과막에서의 세공크기를 조절할 수 있다.
실리콘 튜브(70)는 윗덮개(80)와 하나 또는 복수개의 원통형 세라믹 여과막(60)을 연결한다. 실리콘 튜브의 실리콘 재질은 윗덮개와 원통형 세라믹막의 세척 및 세척 후의 결합을 용이하게 하여 편리성을 제공한다.
윗덮개(80)는 부식을 방지하기 위해 스테인리스 스틸관으로 제조하는 것이 바람직하다. 윗덮개의 하나의 외부관(90)에 의해 발효조 외부의 여과펌프(50)와 연결되고, 연결된 펌프에 의해 배양 여과액이 여과액저장조(recovery tank, 30)로 배출된다.
단계 (b): 접종된 유산균을 초기 회분배양하는 단계;
본 발명에서 상기 초기 회분배양용 배지는 유산균의 에너지원 및 세포구성물질원으로서 탄소원을 포함하며, 탄소원으로는 예컨대 글루코오스(glucose), 덱스트린(dextrin), 수크로오스(sucrose), 갈락토오스(galatose) 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 글루코오스이다. 본 발명에서 상기 연속배양용 배지에는 만니톨을 생산하는 경우에 탄소원으로서 글루코오스에 추가하여 프럭토오스(fructose, 과당)을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 초기 회분배양용 배지 또는 연속배양용 배지는 질소원을 포함하며, 질소원으로서는 예를 들어 단백질 분해물 또는 효모추출물(yeast extract)를 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 효모추출물을 사용한다.
본 발명의 초기 회분배양용 배지 또는 연속배양용 배지는 기타 무기염류 및 비타민을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 K2HPO4, MgSO4ㆍ7H2O, MnSO4ㆍ7H2O, FeSO4ㆍ7H2O, CaCl2ㆍ2H2O, 및 NaCl을 포함한다. 하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명의 배지는 1L 당 포도당 50g, 효모추출물 25g, K2HPO4 30g, MgSO4ㆍ7H2O 0.2g, MnSO4ㆍ7H2O 0.01g, FeSO4ㆍ7H2O 0.01g, CaCl2ㆍ2H2O 0.02g, 및 NaCl 0.01g을 포함한다.
본 발명의 초기 회분배양시 온도는 20-36℃, 보다 바람직하게는 22-34℃, 보다 더 바람직하게는 24-32℃이며, 가장 바람직하게는 26-30℃이다.
초기 회분 배양시 배지의 pH는 5-8, 보다 바람직하게는 6-7이고, 가장 바람직하게는 6.5이다. 배양시 교반속도는 배양조건에 따라 변화시킬 수 있으나, 바람직하게는 100-500 rpm, 보다 바람직하게는 200-400 rpm, 가장 바람직하게는 300 rpm이다.
단계 (c): 상기 발효조에 연속배양용 배지를 연속적으로 공급하면서 유산균을 배양하여 젖산, 아세트산 또는 만니톨을 생산하는 단계
본 발명에서 연속배양용 배지의 성분은 상술한 초기 회분배양용 배지의 성분과 매우 유사하다. 즉, 유산균의 에너지원 및 세포구성물질원으로서 탄소원을 포함하며, 가장 바람직하게는 글루코오스를 탄소원으로 포함한다. 또한, 질소원으로서 효모추출물(yeast extract)를 사용하고, 기타 무기염류 및 비타민을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 K2HPO4, MgSO4ㆍ7H2O, MnSO4ㆍ7H2O, FeSO4ㆍ7H2O, CaCl2ㆍ2H2O, 및 NaCl을 포함한다.
본 발명에서 상기 연속배양용 배지에는 만니톨을 생산하는 경우에 탄소원으로서 글루코오스에 추가하여 프럭토오스(fructose, 과당)을 더 포함시킨다.
본 발명에서 상기 연속배양은 초기 회분배양에 의해 탄소원이 고갈되는 시점에 연속배양용 배지를 연속적으로 공급하기 시작하면서 행한다. 본 발명의 연속배양시 온도, pH 범위, 및 교반속도는 상기 회분배양시의 온도, pH 범위 및 교반속도와 유사한 방식으로 행한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 연속배양은 배지의 희석율이 0.01 - 1 h-1의 범위내가 되도록 행하여, 보다 바람직하게는 0.02 - 0.7 h-1 이며, 보다 더 바람직하게는 0.03 - 0.6 h-1, 가장 바람직하게는 0.07 - 0.2 h-1 이다. 희석율이 높을수록 유산균 세포의 농도 증가 속도가 높게 나타나, 대사산물의 생산량이 증가될 수 있으나, 반면, 배지의 소비속도 증가로 인해 비용이 증가하는 단점이 있다.
중간 대사산물인 젖산, 아세트산 또는 만니톨은 연속 배양된 배지에 포함된 형태로 얻을 수 있으며, 이들 물질의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 화합물의 분리 및 정제 방법을 통해 행할 수 있다. 예컨대, 원심분리방법, 멤브레인 필터를 이용한 여과, 실리카겔 또는 셀라이트(celite)겔 컬럼을 이용한 여과, 액체 컬럼 크로마토그래피를 이용한 크기배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 또는 이들 크로마토그래피의 조합을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 내부필터가 구비된 발효조에서 유산균을 연속 배양하여 젖산, 아세트산 및 만니톨 등의 대사산물을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 내부필터가 구비된 발효조를 사용하므로 유산균을 고농도로 생산할 수 있고, 중간 대사산물인 젖산, 아세트산 및 만니톨을 고수율로 연속적으로 생산 가능하다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 유산균은 우유 및 발효식품의 스타터로 사용할 수 있고, 만니톨은 식품첨가물로 사용할 수 있으며, 젖산은 생분해성 고분자인 폴리락테이트(PLA, polylactate)의 원료로 사용될 수 있다.
도 1a은 본 발명의 생물반응기의 구성도이다. 본 발명의 생물반응기는 연속배양용 배지를 공급하는 배지저장조(feed tank, 10), 여과액저장조(recovery tank, 30), 발효조(fermenter, 20)로 구성된다. 상기 발효조(20) 내부에 내부필터가 장착되며, 배지저장조와 발효조 사이에 공급펌프(40)가 구비되고, 발효조와 여과액저장조 사이에 여과펌프(50)가 구비되어, 이들 펌프에 의해 배지의 연속적인 공급과 배출을 행한다. 내부필터는 세라믹 재질의 원통형 여과막(60)과, 이 원통형 세라믹 여과막을 윗덮개(80)에 연결하는 실리콘 튜브(70), 및 전체 필터를 고정시키는 역할을 하는 윗덮개(80)로 구성되어 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 사용된 원통형 세라믹 여과막(60)은 세공크기(pore size)가 0.1 ㎛로 규격은 내경 6 mm, 외경 8 mm, 길이 65 mm이며 이들 원통형 여과막이 20개 연결되어 전체 표면적은 330 cm2에 해당한다. 내부필터는 발효조의 유효용적 2.5 L에 맞추어 설계되었으며, 여과막의 개수를 늘려 표면적을 늘릴 수 있다. 20개의 원통형 여과막(60)을 연결시키는 윗덮개(80)는 부식을 방지하기 위해 스테인리스 스틸관으로 만들어졌으며, 필터의 결합과 세척의 편리성을 위해 원통형 세라믹 여과막(60)와 윗덮개(80)의 연결은 실리콘 튜브(70)를 사용하였다. 20개의 원통형 여과막은 윗덮개에 의해 연결되어 한 개의 관(90)만이 반응기 외부의 펌프와 연결, 여과액이 빠져나가도록 하였다. 본 발명에서 배지는 배지저장조(Feed tank, 10)에서 공급펌프(40)를 통해 내부필터가 장착된 발효조(Fermenter, 20)로 공급되며, 발효조내에 생성된 생산물은 여과펌프(50)에 연결된 윗덮개(80)의 관을 통해 여과액저장조(Recovery tank, 30)로 유출된다.
도 1b는 본 발명의 발효조(20) 내부에 설치되는 내부필터의 구조를 보다 상세히 보여준다. 본 발명의 내부필터는 원통형 세라믹 여과막(60)과, 이 원통형 여과막을 윗덮개(80)연결시켜 주는 실리콘 튜브(70) 및 윗덮개(80)으로 구성되며, 윗 덮개에는 하나의 관(90)만이 외부의 여과액 저장조(30)와 연결된다.
도 2는 본 발명의 내부필터가 장착된 생물반응기에 의해 유산균 연속배양을 행한 결과를 보여주는 것으로서, 유산균의 배양전과 배양후의 사진이다.
도 3은 본 발명의 내부필터가 구비된 생물반응기에 의해 탄소원으로 포도당을 사용하여 연속 배양하면서, 세포성장율 및 대사산물의 생산량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(희석율 0.07 h-1).
도 4는 본 발명의 내부필터가 구비된 생물반응기에 의해 탄소원으로 포도당과 과당을 사용하여 연속 배양하면서, 세포성장율 및 대사산물의 생산량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(희석율 0.07 h-1).
도 5는 본 발명의 내부필터가 구비된 생물반응기에 의해 탄소원으로 포도당과 과당을 사용하여 연속 배양하면서, 세포성장율 및 대사산물의 생산량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다 (희석율 0.13 h-1).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 방법
1. 균주, 배지 및 배양조건
본 실험의 배양에 사용한 유산균 균주는 류코노스톡 시트레룸(Leuconostoc citreum) HJ-P4 이다. 접종을 위한 성장배지는 Lactobacilli MRS를 사용하였다. 초기 회분배양에서의 성장배지는 배지 1L에 포도당(glucose) 20 g, 효모추출물 (yeast extract) 10 g, K2HPO4 20 g, MgSO4 ? 7H2 O 0.2 g, MnSO4 ? 7H2 O 0.01 g, FeSO4 ? 7H2O 0.01 g, CaCl2 ? 2H2 O 0.02 g, NaCl 0.01 g을 첨가하여 제조하였다. 내부필터가 장착된 발효조를 이용한 연속배양에서의 공급배지(feeding solution)는 배지 1L에 포도당(glucose) 50 g, 효모추출물(yeast extract) 25 g, K2HPO4 30 g, MgSO4 ? 7H2O 0.2 g, MnSO4 ? 7H2O 0.01 g, FeSO4 ? 7H2O 0.01 g, CaCl2 ? 2H2O 0.02 g, NaCl 0.01 g을 사용하였다. 또한 만니톨 생산을 위해서는 공급배지(feeding solution)에 과당(fructose) 100 g을 추가로 첨가하였다. 배양은 배양부피 1.5L, 온도는 28℃, pH는 6.5, 교반속도는 300 rpm으로 유지하여 행하였다.
2. 연속식 배양 공정
균주의 대량 배양 및 대사산물 생산을 위하여 연속식 배양 공정을 실시하였다. 연속식 배양 공정은 2.5 L 배양기에 초기회분 배양용 배지 1.5 L를 넣어 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum) HJ-P4 균주의 발효를 시작하였고, 발효후 6 시간 시점에서부터 상기 공급배지(feeding solution)를 배양기 내에 공급함과 동시에 내부필터를 작동시켰다. 배양액의 여과로 인한 배양기 내에 배지가 감소하는 만큼 새로운 배지를 연속적으로 공급함으로써 배양기 내의 배양부피를 1.5 L로 일정하게 유지시키면서 배양하였다.
3. 분석방법
상기 조건에서 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum) HJ-P4 균주의 농도와 배지내 대사산물을 측정하기 위해 다음의 방법을 이용하였다. 세포의 농도는 UV-spectrophotometer (Shimadzu 1650-PC., Japan)를 사용하여 660 nm에서 광학밀도(optical density)를 측정하였으며, 과당, 만니톨, 젖산 및 아세트산의 분석은 배양액을 15,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 멤브레인 필터(pore size 0.45 ㎛)로 여과하여 HPLC (YL 9100, Younglin, Inc., Korea)를 사용하여 분석하였다. 과당과 만니톨은 Zorbax Carbohydrate Analysis column, 이동상 아세토니트릴 및 물(acetonitrile and water) (75:25, v/v), 유속 1.4 mL/min, 컬럼온도 35℃에서 RI detector로 분석하였다. 젖산 및 아세트산은 Zorbax SB-Aq column, 이동상 아세토니트릴(1％) 및 20 mM NaHPO4 (99％, pH 2), 유속 1.0 mL/min, 컬럼온도 35℃에서 210 nm 파장에서 UV 검출기로 분석하였다. 포도당의 농도는 Glucose-E kits (YD Diagnostics, Korea)를 사용하여 글루코오스 옥시다아제-퍼옥시다아제(glucose oxidase-peroxidase)법을 이용하여 측정하였다.
4. 희석율의 변화
연속식 배양 공정시, 희석율에 따른 세포의 성장율 및 대사산물의 변화를 알아 보기 위해 희석율을 0.07 h-1, 및 0.13 h- 1 로 변화시켜 실험하였다.
실험결과
실시예 1: 탄소원으로 포도당(glucose)을 사용한 배양
초기배양 조건에서 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum) HJ-P4 균주의 회분배양을 시작하여, 탄소원이 고갈된 배양 후 6 시간 시점부터 포도당을 탄소원으로 첨가한 공급배지(feeding solution)를 공급함과 동시에, 내부필터를 작동시키기 시작하였으며, 배지가 여과되어 배양기내에 배지가 감소하는 만큼 새로운 배지를 희석율 0.07 h-1로 연속적으로 공급함으로써 배양기 내의 배양액 부피를 1.5 L로 일정하게 유지시키면서 105시간 동안 배양하였다. 배양 결과, 계속적인 배양액 공급으로 배양시간 95시간 까지 세포 농도가 증가하는 것을 확인하였다. 용존산소 (DO) 농도는 5 시간 후 거의 0으로 유지되었다. 세포 농도는 최대 OD (optical density) 값이 75 까지 증가하였으며, 젖산은 약 20 g/L로 일정하게 생산되었다.
실시예 2: 탄소원으로 포도당(glucose)과 과당(fructose)을 사용한 배양
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 탄소원이 고갈된 배양 후 6 시간 시점부터 포도당과 과당을 복합 탄소원으로 사용한 공급배지(feeding solution)을 공급함으로써 희석율 0.07 h-1로 105 시간 동안 연속배양을 수행하였다. 그 결과, 계속적인 기질 공급으로 배양시간 95 시간 까지 세포농도의 증가를 보였다. 세포 농도는 최대 OD 값이 75 까지 증가하였으며, 젖산은 약 40 g/L, 아세트산 약 20 g/L로 일정하게 생산되었다. 또한 탄소원으로 과당을 첨가해줌으로써 만니톨을 생산할 수 있었다. 배양 초기 만니톨 생산이 빠른 속도로 증가하다가, 배양시간 40 시간 이후로 생산속도가 감소하였고, 60 시간 이후로는 약 80 g/L로 일정하게 생산되었다.
실시예 3: 희석율의 변화
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 탄소원이 고갈된 배양 후 6시간 시점부터 포도당과 과당을 복합 탄소원으로 사용한 공급배지(feeding solution)를 공급함으로써, 희석율 0.13 h-1로 75 시간 동안 연속배양을 수행하였다. 그 결과, 만니톨의 농도는 초기 빠른 속도로 증가하다가 배양 25 시간 이후 약 75 g/L로 일정하게 생산되었으며, 세포의 농도는 희석율을 0.07 h-1로 배양했을 경우보다 빠른 속도로 증가하여 배양 60 시간에 OD 값이 70이 되었다. 희석율을 변화시켜 균체 및 대사산물의 생산 시간 및 생산성을 조절할 수 있었으며, 사용가능한 희석율의 범위는 0.01 - 1 h- 1 이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 다음의 단계를 포함하는 유산균을 연속 배양하여 젖산, 아세트산 또는 만니톨을 생산하는 방법:
    (a) 내부필터가 구비된 발효조에 초기 회분배양용 배지를 넣고, 여기에 유산균을 접종하는 단계;
    (b) 접종된 유산균을 초기 회분배양하는 단계; 및
    (c) 상기 발효조에 연속배양용 배지를 연속적으로 공급하면서 유산균을 배양하여 젖산, 아세트산 또는 만니톨을 생산하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유산균은 락토코커스(Lactococcus)속 유산균, 락토바실러스(Lactobacillus)속 유산균, 류코노스톡(Leuconostoc)속 유산균, 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 유산균, 엔테로코커스(Enterococcus)속 유산균, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 유산균, 카르노박테리움(Carnobacterium) 속 유산균, 스트렙토코커스(Streptococcus)속 유산균, 오에노코커스(Oenococcus)속 유산균, 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus) 속 유산균, 및 페디오코커스(Pediococcus)속 유산균으로 이루어지는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 유산균은 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum) HJ-P4인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 내부필터는 (i) 하나 또는 복수의 원통형 세라믹 여과막(60); (ⅱ) 한쪽 말단이 상기 원통형 세라믹 여과막(60)에 연결되고 다른 한쪽 말단은 윗덮개(80)에 연결되는 하나 또는 복수의 실리콘 튜브(70); 및 (ⅲ) 하부가 상기 하나 또는 복수의 실리콘 튜브(70)와 연결되고, 상부는 외부관(90)에 연결된 윗덮개(80)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 초기 회분배양용 배지 또는 연속배양용 배지는 포도당(glucose), 효모추출물, K2HPO4, MgSO4ㆍ7H2O, MnSO4ㆍ7H2O, FeSO4ㆍ7H2O, CaCl2ㆍ2H2O, 및 NaCl을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 연속배양용 배지는 과당(fructose)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 초기 회분배양은 온도 20-36℃, pH 6-7, 교반속도 200-400 rpm 에서 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 연속배양은 0.01h-1 - 1h-1의 희석율로 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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KR102022876B1 (ko) * 2018-03-12 2019-09-19 충북대학교 산학협력단 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 동시 생산방법

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