KR101576183B1

KR101576183B1 - 부산물을 이용한 에리스리톨 제조 방법, 에리스리톨 생산성이 우수한 모닐리엘라 폴리니스 변이 균주 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101576183B1
Application number: KR1020130164668A
Authority: KR
Inventors: 이상희; 오백록; 박성원; 박종진; 이강표
Original assignee: 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2015-12-09
Also published as: KR20150076048A; CN104745644B; CN104745644A

Abstract

본 발명은 하이드롤(hydrol) 및 CSL(Corn steep liquor)를 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용하여 에리스리톨 생산 균주로부터 에리스리톨을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 에리스리톨 생산 능력이 있는 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주 및 이를 포함하는 에리스리톨 제조용 생촉매 조성물에 관한 것이다.

Description

부산물을 이용한 에리스리톨 제조 방법, 에리스리톨 생산성이 우수한 모닐리엘라 폴리니스 변이 균주 및 이의 이용{Method of producing erythritol using by-products, Moniliella pollinis mutant with high productivity of erythritol and the use thereof}

에리스리톨은 4탄당 알코올로서, 올리고당이나 자일리톨과 더불어 대표적인 기능성 감미료이며, 포도주나 된장 등의 발효식품, 버섯 및 과실 등의 식물, 포유동물의 체액에 존재하는 천연물질이다. 에리스리톨의 감미도는 설탕의 70 ~ 80%이고, 열량이 설탕의 10% 미만(0.3 Kcal/g)인 저칼로리 감미료로 체내에서 에너지원으로 이용되지 않고 소변으로 대부분 배출된다. 용해 시 흡열작용을 하여 청량감을 가지고 있고, 용해도가 낮아 결정이 잘 생기며, 흡습성 및 착생성이 낮아 모든 식품에 적용 가능하다. 또한 충치 원인균인 스트렙토코커스 돌연변이체(Streptococcus mutants)가 이용하지 못하므로 산이나 글루칸(glucan)이 생성되지 않아 비충치성인 특징도 가지고 있다. 게다가, 기존의 당알코올류에 비해 다량 섭취하여도 설사유발이 적다. 이러한 성질들로 인해 에리스리톨은 청량감과 결정성이 필수인 캔디 등에 무설탕 원료로 사용되고 있다.

에리스리톨의 생산에는 추출법, 화학합성법 및 발효법이 있다. 이중 추출법은 과일이나 채소 등의 자연상태에서 극히 미량으로만 존재하기 때문에 산업적으로 경제성이 없고, 화학합성법은 원료물질이 고가이고 합성과정 중에 생산되는 부산물의 제거가 용이하지 않고 수율이 낮기 때문에 경제성이 없어 대량생산에 이용되고 있지 못하고 있다. 따라서 대부분의 에리스리톨은 발효법을 통하여 생산되고 있다.

발효법에 의한 에리스리톨의 생산은 주로 효모에 의해서 일어나고, 지금까지 에리스리톨을 생산할 수 있는 효모가 보고되고 있다. 이 중 모닐리엘라 토멘토사 바 폴리니스 (Moniliella tomentosa var. pollinis) 균주는 포도당으로부터 41% 라는 고수율로 에리스리톨을 생산할 수 있지만, 글리세롤, 리비톨 등의 부산물이 많이 생성되기 때문에 상업화에는 이르지 못했다. 오레오바시디움(Aureobasidium)속 균주 또한 에리스리톨을 생산할 수는 있지만, 생산성과 내당성이 떨어진다.

이외에도 발효법에 의한 에리스리톨 제조방법으로, 수도지마 츠쿠바엔시스(Pseudozyma tsukubaensis) 균주를 이용하는 방법(한국 등록 특허 0434518), 트리코스포로노이데스 마디다(Trichosporonoides madida) 균주를 이용하는 방법 (한국 등록 특허 0210958), 트리코스포로노이데스 메가치렌시스(Trichosporonoides megachilensis) 균주를 이용하는 방법(미국 공개 특허 2001-0008769)이 있지만, 수도지마 속 및 트리코스포로노이데스 마디다 균주를 이용하는 경우, 안전성이 문제될 수 있다. 트리코스포로노이데스 메가치렌시스 균주의 경우에는 사용 가능하지만, 생산량 및 전환율이 낮아 산업적으로 경제성이 떨어진다.

한편, 발효에 의한 에리스리톨의 생산에서는 주원료인 포도당이 제조원가에서 가장 많은 부분을 차지하고 있다. 이러한 상황에서, 제조원가를 낮추기 위해서는 에리스리톨의 수율과 생산성을 높여야 하고 주원료의 가격을 내려야 한다. 이는 에리스리톨을 생산하는 업계에서 가장 근본적이며 시급한 문제이다.

이러한 배경 하에, 포도당 대신 포도당을 제조하는 과정에서 발생하는 부산물인 탈수 모액 및 수수 전분 제조 부산물을 기질로 이용하여 에리스리톨을 우수하게 제조할 수 있음을 확인하고, 모닐리엘라 폴리니스 균주를 돌연변이 시켜 에리스리톨의 수율과 생산성이 향상된 돌연변이 균주가 이에 적합함을 확인하여, 에리스리톨 생산에서 제조원가를 절감시키면서 에리스리톨 생산성을 향상시킬 수 있는 본 발명을 완성하였다.

하이드롤 및 CSL를 포함하는 배지에서 에리스리톨 생산 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 에리스리톨을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 하이드롤 및 CSL를 포함하는, 에리스리톨 생산을 위한 에리스리톨 생산 균주 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 에리스리톨 생산 능력이 있는 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주(수탁번호 KCTC12720BP)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주를 포함하는, 에리스리톨 제조용 생촉매 조성물을 제공하는 것이다.

상기목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하이드롤 및 CSL를 포함하는 배지에서 에리스리톨 생산 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 에리스리톨을 제조하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 배지는 하이드롤을 배지 내의 포도당 농도가 5 내지 45(w/v)% 가 되도록 포함하는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 하이드롤은 포도당을 700 내지 900g/L 포함하는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 배지는 CSL을 0.5 내지 5(w/v)% 포함하는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 CSL은 CSL을 원심분리 또는 침지하여 얻은 상등액을 물과 3:1 내지 1:3 비율로 섞은 것일 수 있다. 또한 바람직하게, 상기 배양하는 단계는 30 내지 35℃의 온도에서 이루어지는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 배양하는 단계는 pH 5 내지 6에서 이루어지는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 배양하는 단계는 3 내지 10 일간 이루어지는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 배양하는 단계는 회분식, 유가식, 또는 연속식 형태의 배양인 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 배양하는 단계는 배양 시 발효조 내 포도당 농도가 50 g/L 이하가 되면 간헐적으로 하이드롤을 피딩(feeding)하는 것일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 하이드롤을 피딩하는 것은, 상기 발효조 내 포도당 농도를 10 내지 100g/L로 유지하는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 배지는 효모 추출물(Yeast extract)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 배지는 효모 추출물을 배지 내에 0 초과 내지 0.5(w/v)% 포함하는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 에리스리톨 생산 균주는 상기 배양하는 단계 전 종균 배양(seed culture) 된 것일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 종균 배양은 포도당, 질산칼륨(KNO₃), 제1인산칼륨(KH₂PO₄), 황산망간(MnSO₄), 및 티아민(Thiamine)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 것일 수 있다.

또한 보다 바람직하게, 상기 종균 배양은 pH 5 내지 6 및 온도 28 내지 32℃에서 1 내지 3일간 배양하는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 에리스리톨 생산 균주는 모닐리엘라 폴리니스(Moniliella pollinis), 모닐리엘라 토멘토사 바 폴리니스(Moniliella tomentosa var. pollinis), 모닐리엘라 아세토아부텐스 (Moniliella acetoabutens), 오레오바시디움 속 (Aureobasidium sp.), 트리코스포로노이데스 마디다(Trichosporonoides madida), 칸디다 마그놀리아(Candida magnolia), 토룰라 속(Tolula sp.), 피키아 속(Pichia sp.) 및 슈도지마 츠쿠밴시스 (Pseudosyma tsukubaensis)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 에리스리톨 생산 균주는 모닐리엘라 속 균주일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 에리스리톨 생산 균주는 모닐리엘라 폴리니스일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 에리스리톨 생산 균주는 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주일 수 있다.

또 하나의 양태로서 본 발명은 하이드롤(hydrol) 및 CSL(Corn steep liquor)를 포함하는, 에리스리톨 생산을 위한 에리스리톨 생산 균주 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 에리스리톨 생산 균주는 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주일 수 있다.

또 하나의 양태로서 본 발명은 에리스리톨 생산 능력이 있는 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서 본 발명은 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주를 포함하는, 에리스리톨 제조용 생촉매 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 벌집을 배양하여 에리스리톨을 생산하는 균주를 4개 선별하고, 그 중 에리스리톨 생산량이 가장 우수한 균주 하나를 선별하였다(실시예 1). 그 후, 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 동정을 의뢰하여 선별한 균주가 모닐리엘라 폴리니스 균주임을 확인하였다(실시예 2).

상기 선별한 모닐리엘라 폴리니스 균주를 자외선 돌연변이 시켜 본 발명의 균주인 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주를 분리하고, 에리스리톨 생산량을 확인하였다. 그 결과 돌연변의 전의 모균주에 비해 에리스리톨의 생산량 및 전환율이 우수하게 증가한 것을 확인하였다(실험예 1).

또한, 본 발명의 균주에 대해 효모 추출물 첨가량 및 온도 조건을 달리하여 에리스리톨 생산량 및 전환율을 알아보았다. 그 결과, 다양한 효모 추출물 첨가량 범위 및 온도 범위에서 에리스리톨 생산 및 전환이 관찰되었으나, 특히 효모 추출물을 0.5%(w/v) 첨가한 경우 및 온도는 35℃인 경우 에리스리톨의 생산량 및 전환율이 우수한 것을 확인하였다(실험예 2 내지 4).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 하이드롤 및 CSL을 사용하여 에리스리톨 생산이 가능한지 실험을 진행하였다. 그 결과, 다양한 CSL 범위에서 에리스리톨 생산 및 전환이 관찰되었으나, 특히 CSL을 배지 총 양 대비 1(w/v)% 첨가한 경우가 에리스리톨 생산량 및 전환율이 우수함을 확인할 수 있었다(실험예 5).

또 다른 실시예에서는 5L 발효조에서 에리스리톨의 생산은 어떠한지 확인하는 실험을 진행하였다. 그 결과, 하이드롤을 사용한 경우에 포도당을 사용한 경우와 유사하거나 우수한 에리스리톨 생산량, 전환율 및 생산성을 확인할 수 있었다(실험예 6).

또한, CSL과 효모 추출물을 혼합한 배지에서 에리스리톨 생산을 실시하였다. 그 결과, 특히 CSL 1(w/v)%와 효모 추출물 0.25(w/v)% 첨가한 경우가 에리스리톨 생산량 및 생산성이 우수함을 확인하였다(실험예 7).

본 발명의 또 다른 실험예에서는, 하이드롤 피딩 방법에 따른 에리스리톨의 생산을 알아보는 실험을 실시하였다. 그 결과, 배양 초기 포도당 농도가 50 g/L 또는 100 g/L 되도록 하이드롤을 첨가하고, 배양 시 발효조 내 포도당 농도가 50 g/L 이하가 되면 하이드롤을 간헐적으로 피딩하는 경우가 배양시간이 적음에도 불구하고 하이드롤의 생산량 및 생산성이 우수함을 확인하였다(실험예 8 및 9).

나아가, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 하이드롤 피딩을 계속 진행하여 더 이상 포도당을 이용하지 못할 때까지 발효를 진행하였다. 그 결과, 에리스리톨의 생산량이 250 g/L가 되는 것면 발효를 중단한 경우에 비하여, 에리스리톨 생산량은 증가하였으며, 전환율은 유사함을 확인하였다(실험예 10).

따라서, 하이드롤 및 CSL와 같은 부산물을 포함하는 배지에서 미생물 발효를 통해 에리스리톨을 우수하게 제조할 수 있음을 확인하였다. 또한, 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주는 에리스리톨 생산 능력이 우수하고, 특히, 하이드롤 및 CSL을 기질로 이용하여 에리스리톨을 우수하게 생산할 수 있음을 입증하였다.

이에, 상기 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주를 2013년 11월 5일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였고 수탁번호 KCTC18261P를 부여받았다 또한. 국제기탁용으로 2014. 11. 28일자로 새로이 기탁하여 수탁번호 KCTC12720BP를 새로이 부여받았다.

본 발명은 일 구현예로, 하이드롤 및 CSL를 포함하는 배지에서 에리스리톨 생산 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 에리스리톨을 제조하는 방법을 제공한다.

본원에서 용어 "에리스리톨"이란, 감미도가 설탕의 70 내지 80% 정도이고 청량한 감미를 갖고 있는 백색 결정성 분말의 감미료로, 화학식은 C₄H₁₀O₄ 이다. 구체적으로, 본 발명에서 에리스리톨은 발효법을 통하여 생산된 에리스리톨을 의미하고, 바람직하게 하이드롤과 CSL을 기질로 하고 미생물 발효를 통하여 생산된 에리스리톨일 수 있다. 일예로, 에리스리톨 생산 균주를 통하여 생산된 에리스리톨 일 수 있고, 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주를 통하여 생산된 에리스리톨일 수 있다. 상기 에리스리톨은 본 발명의 제조방법을 이용하거나 본 발명의 균주를 배양하여 얻어진 세포, 배양물, 또는 이의 추출물에서 얻어질 수 있고, 균주의 발효액을 여과, 정제, 결정화 또는 수세 과정을 거쳐 건조 후 얻어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

에리스리톨 생산 균주는 에리스리톨 생산 능력이 있는 균주로, 본 발명에서는 하이드롤, 및/또는 CSL을 이용하여 에리스리톨을 생산할 수 있는 에리스리톨 생산 균주를 의미한다. 예를 들어, 에리스리톨을 생산할 수 있는 균주와 26S rRNA 서열 비교 시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 일예로, 모닐리엘라 폴리니스 균주는 에리스리톨 생산 균주인데, 모닐리엘라 폴리니스 균주와 26S rRNA 서열 비교 시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

용어 "기질"이란, 에리스리톨 생산 균주가 에리스리톨을 생산하기 위해 사용하는 원료를 의미한다. 일예로, 포도당 자체일 수 있으며, 포도당을 포함하는 원료일 수 있다. 본 발명에서는, 기질로 하이드롤을 사용하였으나, 이에 제한되지 않으며, 에리스리톨 생산 균주가 에리스리톨의 생산하기 위해 사용하는 원료에 해당하는 한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서 "하이드롤"이란, 옥수수 및 기타 전분류를 당화(가수분해)하여 포도당을 제조하는 과정에서 부가적으로 발생하는 탈수 모액 및 포도당 제조 시 사용하는 수세수와 세정수 등의 물을 이용하여 포도당을 용해시킨 후 같은 당도를 갖는 모든 액을 의미한다. 하이드롤은 통상 700 내지 900 g/L의 포도당을 함유하고 있다. 본 발명에서 사용한 하이드롤은 포도당을 약 870 g/L 정도 포함하고 있었다. 따라서, 하이드롤은 에리스리톨 생산 균주가 에리스리톨을 생산하기 위한 기질로 사용될 수 있다.

일 구현예로, 에리스리톨 생산 균주를 배양하는 배지는 하이드롤을 배지 내의 포도당 농도가 5 내지 45(w/v)%가 되도록 포함할 수 있다. 포도당의 농도가 5(w/v)% 미만일 경우에는 배지 내 포도당 농도의 부족 현상이 일어나 세포에 손상을 입혀 세포활성이 떨어질 수 있으며, 포도당의 농도가 45(w/v)% 초과일 경우에는 고농도의 포도당이 유발하는 높은 삼투압으로 인해 미생물 생육에 저해를 받아 에리스리톨 생산 속도가 떨어질 수 있다. 구체적으로, 포도당 농도가 10 내지 45(w/v)%, 5 내지 10(w/v)% 등이 되도록 포함할 수 있으나, 5 내지 45(w/v)% 포도당 농도 범위 내에 해당하는 한 제한되지 않고 본 발명의 범위에 포함된다.

용어 "CSL"이라 함은 corn steep liquor의 약자로 옥수수 전분 제조 부산물을 농축한 상태로, 다량의 아미노산, 3내지 10(w/v)%의 질소 및 기타 물질 들을 포함하고 있는 농축액을 의미한다. 본 발명에서는, 통상 발효법을 통한 에리스리톨의 생산에 사용되는 효모 추출물 대신 CSL을 사용할 수 있다.

일 구현예로, 에리스리톨 생산 균주를 배양하는 배지는 CSL을 0.5 내지 5(w/v)% 포함할 수 있다. CSL의 함량이 0.5(w/v)% 보다 낮을 경우에는 미생물 생육에 필요한 질소원의 양 보다 배지 내 질소원이 부족하여 미생물 생육이 느려져 에리스리톨 생산 속도가 저하되는 영향을 줄 수 있으며, 5(w/v)%를 초과할 경우에는 배지 내 질소 과다로 인해 미생물이 저해를 받아 생육 및 활성이 떨어질 수 있다. 구체적으로, CSL을 0.5 내지 7(w/v)%, 0.5 내지 1(w/v)%, 1 내지 3(w/v)%, 0.5 내지 3(w/v)%일 수 있다. 구체적인 예로, CSL이 효모 추출물과 함께 사용되는 경우 CSL은 배지에 1(w/v)% 포함될 수 있고, 이 경우 효모 추출물은 배지에 0.25 내지 0,5(w/v)%포함될 수 있다.

본 발명의 일 구현예는, CSL을 옥수수 전분 제조 부산물을 농축한 상태 그대로 사용하지 않고, 원심분리 또는 침지하여 얻은 상등액을 물과 혼합하여 사용하는 것일 수 있다. 이 때, CSL을 원심분리 또는 침지하여 얻은 상등액과 물의 혼합 비율은 1:3 내지 3:1 일 수 있다. 상기 범위 보다 CSL을 원심분리 또는 침지하여 얻은 상등액의 함유 비율이 높을 경우, CSL 내의 부유물로 인해 미생물 생육이 저해를 받을 수 있으며, 상기 범위보다 CSL을 원심분리 또는 침지하여 얻은 상등액의 함유 비율이 낮을 경우에는 물의 비율이 높아지고 상대적으로 CSL의 양이 줄어들어 생육에 필요한 질소원 공급이 원활이 이루어지지 않을 수 있다. 구체적으로, 1:2, 1:1, 2:1 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적 상, 에리스리톨 생산 균주를 배양하는 배지에는 하이드롤과 CSL이 포함될 수 있는데, 하이드롤은 포도당 생산 시 발생하는 부산물이고, CSL은 전분 생성 후 남은 잔여물로 매우 저렴한 가격이다. 따라서, 통상의 발효법에 따른 에리스리톨의 생산에 사용되는 고가의 기질인 포도당 및 효모 추출물 대신 하이드롤 및 CSL을 사용하면 배양 시 현저하게 경제성이 높은 공정을 확립할 수 있다.

본 발명에서 하이드롤 및 CSL은, 에리스리톨 생산 균주가 에리스리톨을 생산하기 위한 탄소원 및 질소원으로 각각 사용될 수 있는데, 본 발명은 탄소원 및 질소원 모두 부산물로 이용한다는 것 뿐만 아니라 부산물을 이용하여 종래 보다 우수하게 에리스리톨을 생산하는 방법을 확립하였다.

또 다른 구현예로, 에리스리톨 생산 균주를 배양하는 배지는 효모 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 효모 추출물은 균주의 질소원으로 이용되는 물질로, CSL과 함께 균주의 배양에 충분한 영양원 공급을 위해 사용될 수 있다. 상기 효모 추출물은 배지 내에 0 초과 내지 0.5(w/v)% 포함될 수 있다. 효모 추출물이 상기 함량 범위보다 낮거나 효모 추출물을 전혀 넣지 않은 경우에는 미생물의 정상적인 생육 자체가 잘 이뤄지지 않는 문제가 있을 수 있으며, 0.5(w/v)%를 초과할 경우에는 미생물 생육은 활발하나 대사가 대체적으로 생육으로 치우치는 경향이 있어 목적하는 에리스리톨 생산성은 저하되는 문제가 있을 수 있다. 구체적으로, 상기 효모 추출물은 0 초과 내지 0.25(w/v)%, 0.25 내지 0.5(w/v)% 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 에리스리톨 생산 균주를 기질이 포함된 배지에서 배양하는 단계는 30 내지 37℃, 바람직하게는 30 내지 35℃의 온도에서 이루어질 수 있다. 온도가 30℃ 미만일 경우에는 미생물 생육 속도가 현저히 낮아지며, 에리스리톨 생산성도 매우 낮아지는 문제가 있을 수 있고, 37℃를 초과할 경우에는 미생물 생육에 적절한 온도가 아닌 고온이라 미생물이 고온에 의한 손상을 입거나 사멸해 버리는 문제가 있을 수 있다. 구체적으로, 35 내지 37℃, 30℃ 내지 35℃일 수 있으나, 에리스리톨 생산 균주가 에리스리톨을 우수하게 생산할 수 있는 온도 범위에 해당하는 한 이에 제한되지 않는다.

또한, 에리스리톨 생산 균주를 기질이 포함된 배지에서 배양하는 단계는 pH 5 내지 6에서 이루어질 수 있다. 배지 내의 pH가 3 미만이나 7을 초과하게 되면 pH가 미생물 생육에 영향을 주어, 균주가 거의 자리지 못하게 될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 에리스리톨 생산 균주는 배양 시 pH를 조절하지 않으면 보통 pH 4 정도를 스스로 유지하며 생육할 수 있다. 다시 말해, pH가 4 내지 7에서는 에리스리톨 생산성은 저하되지만, 미생물 생육에는 무리가 없을 수 있다. 그러나, 에리스리톨의 효율적인 생산을 위해서는 상기 범위의 pH(pH5~6)에서 배양하는 것이 바람직하다. 예를 들어, pH 5 내지 5.5, pH 5.5 내지 6, 또는 약 pH 5.5 일 수 있으나, 에리스리톨 생산 균주가 에리스리톨을 우수하게 생산할 수 있는 pH 범위에 해당하는 한 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 균주를 배양하는 단계는 3 내지 9 일 간 이루어 질 수 있다. 예를 들어, 상기 균주를 배양하는 단계는 약 5 내지 8일 또는 약 6 내지 7 일간 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일예로, 배양을 계속 진행하는 경우 에리스리톨 생산 속도나 포도당 소모 속도가 감소할 수 있으나, 최종 에리스리톨 생산량은 증가시킬 수 있다.

또 다른 구현예로, 에리스리톨 생산 균주를 기질이 포함된 배지에서 배양하는 단계는 회분식, 유가식, 또는 연속식 형태의 배양일 수 있다.

회분식 배양이란, 발효나 효소변환 등 반응조 내에서 미생물이나 효소를 이용하여 반응시키는 경우에 최초의 원료를 함유한 액과 미생물이나 효소를 모두 첨가한 후 반응 시킨 후, 나온 것을 회수하고 다시 다음 번 반응을 준비하기 위하여 수세하는 과정을 거치는 배양을 의미한다. 본 발명에서는 발효조 내에 에리스리톨 생산 균주가 에리스리톨을 생산하기 위한 배지 성분을 모두 첨가하고 배양 시킨 후, 배양 액을 회수하는 과정을 거치는 배양일 수 있다.

유가식 배양이란, 회분식 배양의 한 방법으로 유기영양 성분을 배양 중에 첨가하여 원하는 산물의 생산성을 높이는 배양을 의미한다. 본 발명에서는 에리스리톨 생산 균주의 배양 중에 하이드롤을 첨가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 에리스리톨 생산 균주 배양 중에 CSL, 포도당, 효모 추출물 등 에리스리톨의 생산을 증가시키기 위한 성분을 첨가하는 배양일 수 있다.

연속식 배양이란, 새로운 영양배지가 계속 공급되며 동시에 세포 및 생산물을 포함하는 배양액을 계속 제거하는 배양을 의미한다. 예를 들어, 에리스리톨 생산 균주 배양 중에 하이드롤을 계속적으로 공급하면서 에리스리톨이 생산된 배양액을 제거하는 배양일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "피딩"이란, 에리스리톨 생산 균주를 배양하는 배지에 하이드롤을 주입하여 배지 내 포도당의 농도를 조절하는 것을 의미한다. 예를 들어, 배지 내 포도당의 농도가 50 g/L 이하가 되면 하이드롤을 배지에 주입하는 것일 수 있으나, 하이드롤을 피딩하는 배지 내 포도당 농도 기준은 100 g/L, 200 g/L, 450 g/L일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 피딩은 간헐적으로 이루어 질 수 있는데, 간헐적으로 피딩이 이루어진다는 의미는 일정 시간 간격을 두고 되풀이하여 피딩이 이루어 질 수 있다는 것이고, 본 발명에서 간헐적으로 피딩이 이루어지는 일정 시간 간격은 포도당 농도가 일정 기준 이하가 되는 시간을 의미할 수 있다.

상기 간헐적인 피딩을 통하여, 발효조 내 포도당의 농도를 10 내지 100g/L 정도로 유지할 수 있다. 구체적으로, 40 내지 80g/L, 45 내지 70g/L 일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 배양 시 발효조 내 포도당 농도가 50 g/L 이하가 되면 하이드롤을 간헐적으로 피딩하여 배양액 내 포도당 농도를 50 내지 80g/L로 유지하였다. 이러한 간헐적 피딩을 통하여 발효조 내 포도당의 농도를 상기 범위로 유지함으로써 본 발명의 목적에 따라 에리스리톨을 우수하게 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구현예는, 에리스리톨 생산 균주를 에리스리톨 생산을 위한 발효 전에 종균 배양하는 것일 수 있다. 상기 종균 배양은 본격적인 발효를 개시하기 전에 균주의 활성을 증가시키고, 충분히 증식시켜 에리스리톨 발효를 수행할 수 있어 우수하게 에리스리톨을 생산할 수 있다. 본 발명에서 종균 배양은 에리스리톨 생산을 위한 배양 배지와 별도의 용기(예를 들어, 플라스크 등)에서 수행될 수 있고, 또한, 에리스리톨 생산을 위한 배양 배지와 동일한 용기(예를 들어, 발효조)에서 수행될 수도 있다.

상기 종균 배양에 사용되는 배지는 포도당, 질산칼륨(KNO3), 제1인산칼륨(KH2PO4), 황상망간(MnSO4), 티아민(Thiamine)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 에리스리톨 생산 균주의 배양에 적합한 성분에 해당하면 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 포도당 0.1 내지 10(w/v)%, 효모 추출물 0.1 내지 0.5(w/v)%, 질산 칼륨 0.01 내지 0.35(w/v)%, 제1인산칼륨 0.001 내지 0.025(w/v)%, 황산망간 1 내지 5ppm, 및 티아민 1 내지 3ppm를 포함하는 배지일 수 있다.

또한, 상기 종균 배양은 pH 5 내지 6 및 온도 28 내지 32℃ 에서 1 내지 3 일간 배양하는 것일 수 있는데, 이에 제한되지 않으며, 균주의 활성, 농도 및 배지 내 영양상태 등을 고려하여 적절히 변형될 수 있다.

본 발명의 하나의 양태는, 본 발명은 하이드롤 및 CSL을 포함하는 에리스리톨 생산을 위한 에리스리톨 생산 균주 배양용 배지 조성물에 관한 것이다. 하이드롤 및 CSL은 부산물로 이를 배지 내 기질로 포함하는 경우 매우 저렴하게 배지를 생산할 수 있다. 구체적으로 상기 배지 조성물은 모닐리엘라 속, 모닐리엘라 폴리니스, 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주의 에리스리톨 생산을 위한 발효에 사용될 수 있다.

본 발명에서 에리스리톨 생산 균주는, 균주의 대사 산물로 에리스리톨을 생산할 수 있는 균주를 의미한다. 구체적으로, 모닐리엘라 속의 미생물 일 수 있고, 모닐리엘라 폴리니스(Moniliella pollinis), 모닐리엘라 토멘토사 바 폴리니스(Moniliella tomentosa var. pollinis), 모닐리엘라 아세토아부텐스 (Moniliella acetoabutens), 오레오바시디움 속 (Aureobasidium sp.), 트리코스포로노이데스 마디다(Trichosporonoides madida), 칸디다 마그놀리아(Candida magnolia), 토룰라 속(Tolula sp.), 피키아 속(Pichia sp.) 또는 슈도지마 츠쿠밴시스 (Pseudosyma tsukubaensis)일 수 있으나 이에 제한되지 않고, 상기 균주와 26S rRNA 서열 비교 시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 에리스리톨 생산 균주는 모닐리엘라 폴리니스 일 수 있고, 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 에리스리톨을 제조하는 방법은 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 균주는 에리스리톨 생산 능력이 있는 모닐리엘라 폴리니스의 변이 균주로, 다른 모닐리엘라 폴리니스 균주 보다 에리스리톨 생산 능력이 우수할 뿐만 아니라, 기질로 하이드롤, 및/또는 CSL와 같은 부산물을 이용하여 매우 저렴하게 에리스리톨을 우수하게 생산할 수 있다. 예를 들어, 상기 균주는 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주와 26S rRNA 서열(서열번호 1) 비교 시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 일 구현예로, 본 발명의 균주는 에리스리톨 제조용 생촉매 조성물에 포함되어 제공될 수 있다. 상기 생촉매 조성물에는 에리스리톨의 생산량 또는 전환율을 증가시키는 성분이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명은 하이드롤 및/또는 CSL과 같은 부산물을 미생물 발효의 기질로 사용하여 에리스리톨을 제조하는 방법 및 하이드롤 및/또는 CSL과 같은 부산물을 포함하는 배지 조성물을 제공하며, 본 발명의 에리스리톨 제조 방법에 적합하고 에리스리톨 생산 능력이 우수한 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주를 제공한다. 이를 이용하면, 하이드롤 및 CSL을 기질로 사용함으로써 에리스리톨을 매우 저렴하게 생산할 수 있고, 상기 균주를 이용하면 에리스리톨의 수율 및 생산성을 증가시키고 배양일수의 단축이 가능하다.

도 1은 실험예 8의 피딩 방법에 따른 OD 값의 변화를 나타낸다. "기존 피딩"은 실시예 8의 배양 및 피딩 조건 1, "연속 피딩"은 실시예 8의 배양 및 피딩 조건 2, "간헐 피딩"은 실시예 8의 배양 및 피딩 조건 3을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Moniliella pollinis SYC - ERY1 모균주의 분리

본 발명에 사용된 미생물은 이하의 방법에 의해 분리하였다. 벌집을 35(w/v)% 포도당과 1.5(w/v)% 효모 추출물이 포함된 액체 배지에서 30도, 250rpm 조건으로 6일간 배양하였다. 배양한 배양액을 동일 조성의 고체 배지에 도말하여 약 5000개의 콜로니(colony)를 얻었다.

균주 분리를 통해 획득한 콜로니를 45(w/v)% 포도당, 0.5(w/v)% 효모 추출물, 0.35(w/v)% KNO₃, 0.025(w/v)% KH₂PO₄, 5ppm MnSO₄, 3ppm 티아민(Thiamine) 배지(pH 5.5) 4 ml(test tube)에 접종하여 30℃, 200rpm에서 6일간 배양하였다.

6일 배양한 배양액은 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고 배양 상등액만 얻고, 상등액을 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)로 분석하여 에리스리톨 생산 균주를 선별하였다.

TLC 분석 조건은 다음과 같다. TLC plate는 TLC Silica gel 60 F254를 사용하였으며, 전개 용매는 아세토나이트릴(Acetoniotrile): 이틸 아세테이트(Ethyl acetate) : 1-프로판올(1-propanol) : 물(water) = 85 : 20 : 20 : 15 (v/v/v/v) 이며, 전개 후 알칼리(Alkaline) AgNO₃ 용매에 plate를 5분간 담궈뒀다. 그 다음에 메탄올(MeOH) 용액에 30분간 담군 후, 1.5 M Na₂S₂O₃ 용액에 빠르게 담궜다가 빼내어 완전히 말린 후 스팟(spot)을 확인하였다.

TLC를 통해 5000개의 콜로니 중 에리스리톨을 생산하는 콜로니만 선별하였으며, 스팟이 뚜렷한 샘플들은 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)의 RI 분석을 통해 잔여 포도당과 생산된 에리스리톨의 양을 정량하였다. HPLC 분석 조건은 표 1과 같으며, 이후 모든 실시예는 동일한 조건에서 분석하였다. HPLC 분석은 Aminex HPC-87H 컬럼을 사용하였으며, 이동상 용매는 0.0025N H₂SO₄을 사용하여 65℃에서 0.5 ml/min의 속도로 용매를 흘리면서 RI 검출기로 분석하였다.

컬럼	Rezex ROA-Organic Acid H+ column (phenomenex 사)
용매	0.0025N H2SO4
유속	0.5 ml/min
온도	65℃
검출기	RI detector
Sample injection vol .	10 ul

HPLC를 통해 에리스리톨을 생산하는 균주를 총 4개를 선별하였으며, 4개의 균주를 250 ml 플라스크(flask)에 배양하여 생산양을 재확인하였다. 250ml 플라스크 배양 시, 콜로니 배양하던 배지(에리스리톨 생산 배지)와 동일한 배지를 사용하였으며, 앞으로 모든 실시예에서 포도당과 효모 추출물의 양만 달라지며 나머지 배지 성분은 동일하게 진행한다. 250ml 플라스크에 배지 25 ml을 첨가하여 배양하였으며, 30℃, 250 rpm에서 9일간 배양하였다. 배양 후, 에리스리톨 생산량을 비교하여 4개의 균주 중 가장 우수한 균주 하나를 선별하였다.

미생물 생육 확인은 자외선-분광광도법(UV-spectrophotometry)을 이용하였으며, 배양액을 샘플링하여 해당 균체를 수집 후 600nm에서 흡광도(optical density, OD)를 측정하였으며, 흡광도는 0.1 ~ 1.0 범위내에 들어오도록 배양액을 적당히 희석(10 ~ 100 배)하여 측정하였다.

실시예 2. 실시예 1에서 선별한 균주의 특성

상기 실시예 1에서 선별한 균주의 특성을 알아보고 균주를 동정하기 위해 대전광역시에 소재한 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 의뢰하여 진행하였다.

본 균주의 생리생화학적 특성은 다음과 같다.

1)당 유기산의 동화성

가용성 전분(Soluble starch) (+)

D-자일로스(D-xylose) (+)

L-아라비노스(L-arabinose) (-)

글리세롤(glycerol) (+)

2) 26S rRNA 유전자의 D1/D2 및 ITS 영역의 염기서열 분석

*모닐리엘라 폴리니스의 표준균주인 CSB 461.67T 균주와 서열 유사도가 100%로 동일한 것으로 조사되었다.

3) 탄소원 이용성 차이를 조사하는 생리생화학적 검사

모닐리엘라 폴리니스 균주의 탄소원 이용성 특성을 나타내었다.

상기 결과를 종합하여 볼 때, 상기 실시예 1에서 선별한 균주는 모닐리엘라 폴리니스 균주로 동정할 수 있었다.

* 실험예 1. 변이주 선별 및 에리스리톨 생산량 확인

실시예 1에서 선별한 균주(모균주)에 대한 자외선 돌연변이(UV mutation)를 통해 돌연변이 균주를 분리하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 선별한 균주(wild type)를 2(w/v)% 포도당, 2(w/v)%, 말트익스트렉트(Malt extract), 0.1(w/v)% 펩톤(peptone) 배지에서 2일간 배양한 후, 배양액을 이용하여 자외선 돌연변이를 진행하였다. 자외선 돌연변이는 균 배양액을 희석하여 자외선 돌연변이 배지(45(w/v)% 포도당, Yeast nitrogen base)에 도말하였다. 도말한 plate는 암조건에서 5분간 자외선 조사 후, 호일로 싸서 30℃ 배양기(incubator)에 배양하여 콜로니를 획득하였다. 획득한 콜로니는 균주 분리 시와 동일하게 배양하여 TLC 분석 및 HPLC RI 분석을 진행하였으며, 250 ml 플라스크(배지 50 ml)에서 9일간 배양하여 생산량을 확인하였다(표 2).

g/L 균주명	포도당	에리스리톨	전환율((g/g)%)
모균주	118	106	32
대조군	1013	121	35
SYC - ERY1	215	155	66

**모균주: 실시예 1에서 선별한 균주

**대조군: Moniliella pollinis KCTC 6813

**SYC-ERY1: 실험예 1에서 돌연변이를 통하여 획득한 균주

그 결과, 자외선 돌연변이 과정을 통해 획득한 콜로니의 균주에서 에리스리톨의 생산량이 현저하게 증가하였으며, 전환율 또한 우수하게 향상된 돌연변이 균주를 확인하였다. 상기 돌연변이 균주를 Moniliella pollinis SYC-ERY1로 명명하였으며, 한국생명공학연구원에 2013년 11월 5일에 기탁하여 수탁번호: KCTC18261P를 받았으며, 동일균주를 2014. 11. 28일자로 국제출원용으로 기탁하여 수탁번호 KCTC12720BP를 새로이 받았다. 상기 기탁균주 Moniliella pollinis SYC-ERY1의 유전자 분석 결과 26s rRNA는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것으로 분석되었다.

실험예 2. 변이주의 효모 추출물 첨가량 별 에리스리톨의 생산성

SYC-ERY1 균주를 45% 포도당이 첨가된 에리스리톨 생산배지(0.35(w/v)% KNO₃, 0.025(w/v)% KH₂PO₄, 5ppm MnSO₄, 3ppm Thiamine, pH 5.5)에 효모 추출물의 양을 달리하여 에리스리톨 생산량을 확인하였다. 배양 조건은 30℃, 250 rpm에 9일간 배양하였다. 표 3는 효모 추출물의 첨가량 별 에리스리톨 생산량을 나타낸 것이다.

Yeast extract (w/v)	포도당 (g/L)	에리스리톨 (g/L)	전환율 ((g/g)%)
0.25	143	157	51
	157	146	50
	154	155	52
0.5	0	272	60
	0	262	58
	1	258	57
1.5	51	106	27
	75	99	26
	43	126	31

그 중, 효모 추출물을 0.5%(w/v) 첨가한 경우가 에리스리톨의 생산량 및 전환율이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 0.5(w/v)% 효모 추출물 첨가된 에리스리톨 생산 배지에서 재확인

상기 실험예 2에서 확인한 결과가 재현성이 있는지 알아보기 위해 동일한 방법으로 다시 배양하여 에리스리톨 생산량을 확인해보았다. 이의 배양 결과는 표 4과 같다.

실험횟수	포도당 (g/L)	에리스리톨 (g/L)	전환율 ((g/g)%)
1	24	234	55
2	23	232	54
3	25	234	55

그 결과, 실험예 2의 결과와 유사한 결과를 나타내어 재현성이 있음을 확인하였다.

실험예 4. 온도에 따른 에리스리톨의 생산

상기 실험예 3과 동일한 조건으로 배양을 실시하였다. 단, 온도의 영향을 알아보기 위해 배양 온도를 각기 달리하여 진행하였다. 모든 조건 (배지 조성, 배양일, rpm)은 동일하며, 온도는 30, 35, 37℃ 총 세 가지 조건에서 실시하였다. 그 결과는 표 5와 같다.

온도(℃)	포도당(g/L)	에리스리톨 (g/L)	전환율((g/g)%)
30	0	194	43
35	0	233	52
37	98	145	41

그 결과, 35℃인 경우 에리스리톨의 생산량 및 전환율이 우수한 것을 확인하였다.

실험예 5. 하이드롤 및 CSL 을 이용한 에리스리톨의 생산

배지 비용 절감을 위해 하이드롤(㈜ 삼양제넥스) 및 CSL(㈜ 삼양제넥스)을 사용하여 에리스리톨 생산이 가능한지 실험을 진행하였다. CSL은 부유물이 많으므로 원심분리하여 상등액을 물과 1:1 비율로 섞어 2배 희석한 것을 사용하였다. 실험구는 대조구(기존 에리스리톨 생산 배지) 포함하여 총 6가지 조건을 실시하였다. 대조구 제외한 실험구는 0.5(w/v)% 효모 추출물 대신 CSL을 배지 총 양 대비 1, 3, 5, 7, 9 (w/v)%를 첨가하여 진행하였다. 효모 추출물 외의 다른 배지 성분들은 동일하게 첨가하였다. 실험 결과 분석 시, 하이드롤 내의 포도당 양으로 환산하였다. 배양은 30℃, 250rpm에서 실시하였다. 실험결과는 아래 표 6에 나타내었다.

실험조건	포도당(g/L)	에리스리톨 (g/L)	전환율((g/g)%)
대조구	2	220	49
CSL 1 (w/v)%	54	201	51
CSL 3 (w/v)%	155	88	30
CSL 5 (w/v)%	256	42	22
CSL 7 (w/v)%	297	33	22
CSL 9 (w/v)%	315	31	23

그 결과, CSL을 배지 총 양 대비 1(w/v)% 첨가한 경우가 에리스리톨 생산량 및 전환율이 우수함을 확인하였다.

실험예 6. 5L 발효조에서의 에리스리톨 생산 확인

플라스크에서 진행한 결과들을 바탕으로 5L 발효조에서의 양상은 어떤지 확인하는 실험을 진행하였다. 종균(Seed)는 플라스크에서 실험예 3의 조건으로 배양하였으며, 세포성장 시 OD 값이 10이 되는 시점에서 5L 발효조 내(배지용적 3L)에 10(v/v)%를 접종하였다. 배지는 다음과 같은 조건으로 달리하여 배양을 실시하였다.

<배지조건 1>

배지 내 포도당 농도가 450 g/L 가 되도록 하이드롤을 첨가하고, CSL은 배지내 1(w/v)% 농도가 되도록 첨가하여 배양

<배지조건 2>

배지 내 포도당 농도가 450 g/L 가 되도록 하이드롤을 첨가하고, 효모추출물을 배지 내 0.5(w/v)% 농도가 되도록 첨가하여 배양

<배지조건 3>

배지내 포도당 농도가 450 g/L 가 되도록 포도당을 첨가하고, 효모 추출물을 배지 내 0.5(w/v)% 농도가 되도록 첨가하여 배양하는 조건

발효조 조건은 교반속도 600 rpm, 온도 35℃, pH 5.5, 통기량 0.5 vvm으로 유지하여 배양하였다. 포도당 농도는 샘플링하여 분석하면서 확인하였으며, 포도당이 50 g/L로 떨어지면 하이드롤을 사용한 배지조건 1 및 2의 배지는 870 g/L의 포도당이 함유된 하이드롤을, 포도당을 사용한 배지조건 3의 배지는 800g/L의 포도당액을 배양액 내로 피딩(feeding)하여 배양액 내 포도당 농도를 50 g/L 부근으로 유지시켰다. 배양 결과는 표 7에 나타내었다.

배지조건	에리스리톨 (g/L)	전환율(%)	배양시간(h)	생산성(에리스리톨)
1	220	48	146	1.5
2	243	49	126	1.9
3	230	45	146	1.6

그 결과, 하이드롤을 사용한 경우에 포도당을 사용한 경우와 유사하거나 우수한 에리스리톨 생산량, 전환율 및 생산성을 확인할 수 있었다.

실험예 7. CSL 과 효모 추출물을 혼합한 배지에서 에리스리톨 배양

실험예 6의 결과를 바탕으로, CSL과 효모 추출물을 혼합하여 배양을 실시하였다. 효모 추출물을 혼합하는 대신 효모 추출물의 첨가량을 줄였다. 기존 0.5(w/v)%에서 절반인 0.25(w/v)%만을 사용하고, CSL을 기존과 동일하게 1(w/v)%로 하였다. 포도당은 사용하지 않았으며 하이드롤로 모두 대체하였다. 다음 모든 실험에서도 동일하게 하이드롤만 사용하였다. 다른 발효조 조건은 모두 동일하게 진행하였다. 결과는 표 8에 나타내었다.

배지조건	에리스리톨 (g/L)	전환율(%)	배양시간(h)	생산성(g/L-h)
CSL 1(w/v)% + Yeast extract (0.25(w/v)%)	241	48	118	2
Yeast extract (0.5(w/v)%)	218	48	120	1.8

그 결과, CSL 1(w/v)%와 효모 추출물 0.25(w/v)% 첨가한 경우가 에리스리톨 생산량 및 생산성이 우수함을 확인하였다.

실험예 8. 하이드롤 피딩 방법에 따른 에리스리톨 생산

실험을 진행하면서 본 균주가 포도당의 농도에 영향을 받는다는 것을 본 발명자들이 인지하고, 배지에 450 g/L의 포도당이 되도록 하이드롤을 주입하는 것과, 상기 농도보다 낮은 농도로 유지하면서 계속 해당 포도당 농도를 유지하기 위해 배양 기간동안 피딩하는 것이 맞는지 확인하는 실험을 진행하였다. 다른 실험 조건은 아래와 같으며 발효조는 5L에서 실험하였다.

<배양 및 피딩 조건 1>

배양 초기(시작 시) 포도당 농도를 450 g/L가 되도록 하이드롤을 첨가하고, 배양 시 발효조 내 포도당 농도가 50 g/L 이하가 되면 하이드롤을 간헐적으로 피딩하여 배양액 내 포도당 농도를 50 g/L 부근으로 유지시키는 배양 조건

<배양 및 피딩 조건 2>

배양 초기(시작 시) 포도당 농도를 50 g/L가 되도록 하이드롤을 첨가하고, 배양 시 발효조 내 포도당 농도가 50 g/L 이하가 되면 하이드롤을 간헐적으로 피딩하여 배양액 내 포도당 농도를 50 g/L 부근으로 유지시키는 배양 조건

<배양 및 피딩 조건 3>

배양 초기(시작 시) 포도당 농도를 100 g/L가 되도록 하이드롤을 첨가하고, 배양 시 발효조 내 포도당 농도가 50 g/L 이하가 되면 하이드롤을 간헐적으로 피딩하여 배양액 내 포도당 농도를 50 g/L 부근으로 유지시키는 배양 조건

상기와 같이 3가지 실험 조건으로 진행하였다. 다만, 본 실험예에서는 종균을 플라스크에 배양하여 발효조로 옮기지 않고, 발효조에서 종균 배양을 실시하였다. 플라스크에서 종배양한 배양액을 100 g/L 포도당, 0.5% 효모 추출물, 0.35% KNO₃, 0.025% KH₂PO₄, 5ppm MnSO₄, 3ppm Thiamine이 포함된 배지에 20% 접종하여 21시간 배양하였다. 21시간 배양 후, 발효조에 본 배양 시 첨가되는 CSL 1%, Yeast extrac 0.25%, 0.35% KNO₃, 0.025% KH₂PO₄, 5ppm MnSO₄, 3ppm Thiamine를 첨가하고 해당 하이드롤을 농도에 맞게 주입하였다. 이와 같이 종균배양을 하기 때문에 조건 세 가지가 모두 동일하게 종균이 자랐어도 초기에 넣어주는 하이드롤의 양이 다르기 때문에 조건 1의 경우는 다른 조건들에 비해 초기 시작하는 OD가 낮아 래그타임(lag time)이 길어지는 영향이 있다(도 1). 발효조 내에서 종균 배양 시는 32℃, 에리스리톨 발효 시는 35℃에서 배양하였다. 다른 발효조 조건은 상기 예와 동일하다. 실험 결과는 다음 표 9에 나타내었다.

배양 조건	에리스리톨 (g/L)	전환율(%)	배양시간(h)	생산성(g/L-h)
1	249	53	134	1.86
2	254	52	111	2.29
3	251	50	86	2.92

그 결과, 배양 초기 포도당 농도가 50 g/L 또는 100 g/L 되도록 하이드롤을 첨가하고, 배양 시 발효조 내 포도당 농도가 50 g/L 이하가 되면 하이드롤을 간헐적으로 피딩하는 경우가 배양시간이 적음에도 불구하고 하이드롤의 생산량 및 생산성이 우수함을 확인하였다.

실험예 9. 간헐적 피딩을 통한 에리스리톨의 생산

본 발명자들은 간헐적 피딩 방법으로 진행했을 때, 재현성이 나타나는지 확인하기 위해 실험예 8의 <배양 및 피딩 조건 3>의 조건으로 재실험을 진행하였다. 동일한 방법으로 진행하였으며 결과는 표 10와 같다.

실험	에리스리톨 (g/L)	전환율(%)	배양시간(h)	생산성(g/L-h)
1	251	62	79.5	3.16
2	252	58	84	3
3	250	52	84	2.98

그 결과, 실험예 8의 결과와 유사한 결과를 나타내어 재현성이 있음을 확인하였다.

실험예 10. 간헐적 피딩을 통한 에리스리톨의 고생산

상기 실험예 9의 경우는, 에리스리톨의 생산량이 250 g/L가 되는 것이 확인되면 발효를 중단하였다. 하지만, 중단 시에 세포가 사멸 상태도 아니며, 에리스리톨 생산 속도 및 포도당 소모 속도가 줄어들 뿐 여전히 에리스리톨 생산은 진행되고 있는 중이다. 그래서 본 발명자들은 하이드롤 피딩을 더 진행하여, 더 이상 포도당을 이용하지 못할 때까지 발효를 진행하였다. 그 결과는 표 11에 나타내었다.

실험	에리스리톨 (g/L)	전환율(%)	배양시간(h)	생산성(g/L-h)
1	329	57	192	1.71
2	270	62	133.5	2.02
3	327	58	167.5	1.95

그 결과, 에리스리톨의 생산량이 250 g/L가 되는 것면 발효를 중단한 경우에 비하여, 에리스리톨 생산량은 증가하였으며, 전환율은 유사함을 확인하였다.

한국생명공학연구원 미생물자원센터

KCTC12720BP

20141128

<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> Method of producing erythritol using by-products, Moniliella pollinis mutant with high productivity of erythritol and the use of thereof <130> DPP20135828KR <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 521 <212> DNA <213> Moniliella pollinis SYC-ERY1 <220> <221> rRNA <222> (1)..(521) <223> Moniliella pollinis SYC-ERY1 26s rRNA <400> 1 cgggaaagag cccagaatga aaagctcccg tcagggcgca ttgtaatctg gagacgtgcc 60 tcgtgcgggg cggctggact caagtctgct ggaaagcagc atcgtagagg gtgaaaatcc 120 cgtgcttggt ctggctctgc accgtgttgt ggggcgcgct cgacgagtcg cgttgtttgg 180 gaatgcagcg caaagtaggg tggtaaacgc catccaaggc taaatatggg ggagagaccg 240 atagcgaaca agtaccgtga gggaaagatg aaaagaactt tggaaagaga gttaaacagt 300 acgtgaaatt gccaaaaggg aagcgttggc agtcagtacc gcaaggtgtg ccctgtctcc 360 ttttcttccg gaaaggatta cggggtgcac gtggggctca tgtcggtttg cggcggggga 420 gaagtctgtg gggaaggtgg ctcttgcttc ggcaggagtg ttatagccct gcagcggata 480 ctctgccttg cggaccgagg cttaccctcg caagggggta g 521

Claims

질소를 3 내지 10(w/v)% 포함하는 CSL(Corn steep liquor)을 원심분리 또는 침지하여 얻은 상등액을 물과 3:1 내지 1:3 비율로 섞어 배양용 CSL을 준비하는 단계;
상기 배양용 CSL을 포함하는 배지에, 배지 내의 포도당 농도가 5 내지 45(w/v)%가 되도록 하이드롤(hydrol)을 첨가하여 배양용 배지를 제조하는 단계; 및
상기 배양용 배지에서 에리스리톨 생산 균주를 배양하는 단계를 포함하는,
에리스리톨을 제조하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 하이드롤은 포도당을 700 내지 900g/L 포함하는 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지는 CSL을 0.5 내지 5(w/v)% 포함하는 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 30 내지 35℃의 온도에서 이루어지는 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 pH 5 내지 6에서 이루어지는 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 3 내지 10 일간 이루어지는 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 회분식, 유가식, 또는 연속식 형태의 배양인 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 배양 시 발효조 내 포도당 농도가 50 g/L 이하가 되면 간헐적으로 하이드롤을 피딩(feeding)하는 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 하이드롤을 피딩하는 것은, 상기 발효조 내 포도당 농도를 40 내지 100g/L로 유지하는 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지는 효모 추출물(Yeast extract)를 추가로 포함하는 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지는 효모 추출물을 배지 내에 0 초과 내지 0.5(w/v)% 포함하는 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 에리스리톨 생산 균주는 상기 배양하는 단계 전 종균 배양(seed culture) 된 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 종균 배양은 포도당, 질산칼륨(KNO₃), 제1인산칼륨(KH₂PO₄), 황산망간(MnSO₄), 및 티아민(Thiamine)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 배지에서 수행하는 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 종균 배양은 pH 5 내지 6 및 온도 28 내지 32℃ 에서 1 내지 3일간 수행하는 것인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 에리스리톨 생산 균주는 모닐리엘라 폴리니스(Moniliella pollinis), 모닐리엘라 토멘토사 바 폴리니스(Moniliella tomentosa var. pollinis), 모닐리엘라 아세토아부텐스 (Moniliella acetoabutens), 오레오바시디움 속 (Aureobasidium sp.), 트리코스포로노이데스 마디다(Trichosporonoides madida), 칸디다 마그놀리아(Candida magnolia), 토룰라 속(Tolula sp.), 피키아 속(Pichia sp.) 및 슈도지마 츠쿠밴시스 (Pseudosyma tsukubaensis)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 에리스리톨 생산 균주는 모닐리엘라 속 균주인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 에리스리톨 생산 균주는 모닐리엘라 폴리니스인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 에리스리톨 생산 균주는 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주(수탁번호 KCTC12720BP)인,
에리스리톨을 제조하는 방법.
하이드롤(hydrol) 및 질소를 3 내지 10(w/v)% 포함하는 CSL을 원심분리 또는 침지하여 얻은 상등액을 물과 3:1 내지 1:3 비율로 섞은 배양용 CSL을 포함하고,
상기 하이드롤은 배지 내의 포도당 농도가 5 내지 45(w/v)%가 되도록 첨가된 것인,
에리스리톨 생산을 위한 에리스리톨 생산 균주 배양용 배지 조성물.
하이드롤(hydrol) 및 CSL(Corn steep liquor)를 포함하는, 에리스리톨 생산 균주인 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주(수탁번호 KCTC18261P) 배양용 배지 조성물.
에리스리톨 생산 능력이 있는 모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주(수탁번호 KCTC18261P).
모닐리엘라 폴리니스 SYC-ERY1 균주(수탁번호 KCTC18261P)를 포함하는, 에리스리톨 제조용 생촉매 조성물.