KR20120038030A - 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법 - Google Patents

아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20120038030A
KR20120038030A KR1020100097335A KR20100097335A KR20120038030A KR 20120038030 A KR20120038030 A KR 20120038030A KR 1020100097335 A KR1020100097335 A KR 1020100097335A KR 20100097335 A KR20100097335 A KR 20100097335A KR 20120038030 A KR20120038030 A KR 20120038030A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
xylitol
strain
candida
arabinose
arabitol
Prior art date
Application number
KR1020100097335A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101246780B1 (ko
Inventor
김정회
윤병훈
전우영
심우용
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020100097335A priority Critical patent/KR101246780B1/ko
Priority to CA2810915A priority patent/CA2810915C/en
Priority to PCT/KR2011/000346 priority patent/WO2012046924A1/ko
Priority to CN201180003995.1A priority patent/CN102712894B/zh
Priority to US13/391,073 priority patent/US8343736B2/en
Priority to JP2012537831A priority patent/JP5496356B2/ja
Priority to EP11817200.6A priority patent/EP2460871A4/en
Publication of KR20120038030A publication Critical patent/KR20120038030A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101246780B1 publication Critical patent/KR101246780B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 아라비노스 대사경로가 새로이 도입된 자일리톨 생산균주를 이용하여, 자일로스(xylose)와 아라비노스(arabinose)의 혼합 배지에서, 아라비노스를 세포 대사에 이용하게 하여 부산물인 아라비톨(arabitol)의 생성을 억제시킨 효율적인 자일리톨(xylitol) 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 L-arabinose isomerase(araA), L-ribulokinase(araB), L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase(araD) 효소들을 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 균주에서 효율적으로 발현시키기 위하여 유전자 부호 최적화(codon optimization)를 수행한 후, 각각의 유전자를 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터 및 선별마커인 URA3를 포함하는 카세트에 삽입하고, 캔디다 속 균주(Candida sp .)에 도입함으로써, 자일리톨 생산시 정제 및 결정화 과정을 방해하는 아라비톨 생성을 억제하는 자일리톨 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 아라비노스 대사경로가 새로이 도입된 자일리톨 생산균주는 아라비톨 생성을 억제하여 고생산성으로 자일리톨을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법{Xylitol producing microorganism introduced with arabinose metabolic pathway and production method of xylitol using the same}
본 발명은 아라비노스(arabinose) 대사경로가 새로이 도입된 자일리톨(xylitol) 생산균주 및 이를 이용한 효율적인 자일리톨 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 아라비노스(arabinose) 대사경로를 도입하여 자일리톨의 정제 및 결정화를 방해하는 아라비톨(arabitol)의 생성을 억제함과 동시에 아라비노스를 세포성장에 이용하는 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 고생산성으로 자일리톨을 생산하는 방법에 관한 것이다.
자일리톨(xylitol)은 오탄당 당알코올로서 높은 감미도를 가지고 있어 설탕을 대체하는 기능성 감미료로 널리 이용되고 있다. 자일리톨은 감미도가 설탕과 비슷하지만, 체내 섭취 후의 대사과정이 인슐린과 무관하기 때문에, 당뇨병 환자의 설탕 대용 감미료로 사용되고 있다. 특히, 충치유발균인 스트렙토코커스 뮤탄트(Streptococcus mutans)의 생육을 억제하는 특성을 가지고 있어, 충치억제성분으로서도 산업적으로 널리 이용되고 있다.
이러한 자일리톨은 현재 옥수수속대, 사탕수수대와 같이 자일로스(xylose)가 많이 함유된 반섬유소(hemicellulose) 가수분해물을 화학적으로 환원시키는 방법으로 생산되고 있다. 그러나 화학적 방법은 자일로스를 아라비노스, 포도당과 같은 다른 오탄당 및 육탄당 구성물들로부터 분리 및 정제하기가 어렵고 비용이 많이 들며, 이 과정에서 자일로스의 회수율이 50 ~ 60% 정도로 낮다. 또한, 수소가스 및 니켈촉매를 이용한 고온, 고압의 공정이므로 위험성과 환경적 문제가 존재한다는 단점이 있다.
근래에는 이러한 단점을 보완하기 위한 생물학적인 방법에 의한 자일리톨 생산방법이 활발하게 연구되고 있다. 생물학적인 방법은 화학적인 방법에 비해 원료물질로서 상대적으로 낮은 순도의 자일로스를 이용할 수 있고, 공정 자체가 상온 및 상압에서 이루어지므로 안전하며 친환경적인 생산공정이다. 그리하여 고생산성, 고수율의 자일리톨 생산을 위해 다양한 세균(bacteria)과 효모 균주(yeast and fungi), 재조합 효모(recombinant yeast)를 통한 자일리톨 생산 연구가 진행되었다(Winkelhausen, E. et al., J. Ferment . Bioeng. 86:1-14, 1998; Granstrom, T. B. et al., Appl . Microbiol . Biotechnol. 74:277-281, 2007). 그러나 세균과 재조합 효모 균주는 자일로스를 이용하는 대사경로가 약하거나 효율이 좋지 못해 산업적인 자일리톨의 생산에 적합하지 않았다. 하지만 효모 균주 중 캔디다 속(Candida sp.) 균주들은 다른 미생물에 비해 자일로스를 이용하는 능력이 뛰어나기 때문에, 자일리톨의 생산성과 수율이 높아 생물학적 자일리톨 생산에 적합한 균주로 알려져 있다.
지금까지 연구된 바에 의하면, 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis), 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis) 등의 캔디다 속 균주는 세포 외부에서 흡수된 자일로스를 자일로스 환원효소(xylose reductase)에 의해 자일리톨로 변환시키고, 이를 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)에 의해 자일룰로스(xylulose)로 전환시키며, 자일룰로스는 다시 자일룰로스 인산화효소(xylulokinase)에 의해 오인산 자일룰로스(xylulose-5-phosphate)로 전환되고, 이는 계속해서 오탄당 인산화 과정(pentose phosphate pathway)를 통해 세포성장과 유지에 이용되는 것으로 알려져 있다(Laplace, J. M. et al., Appl . Microbiol . Biotechnol., 36:158-162, 1991; Hahn-Hagerdal, B. et al., Enzyme Microb . Technol ., 16:933-943, 1994).
이때, 자일로스 환원효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NADPH; Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)를 보조인자(cofactor)로 이용하고, 자일리톨 탈수소효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(Nicotinamide adenine dinucleotide; NAD+)를 보조인자로 이용한다. 자일로스 환원효소에 의해 자일로스로부터 전환된 자일리톨은 다시 자일리톨 탈수소효소에 의해 자일룰로스로 전환되는데, 배지 내에 산소의 공급이 제한되어 용존산소의 농도가 0.5% 내지 2.0%로 낮게 유지되면 세포 내의 산화환원력 불균형(redox imbalance)이 유발되어 자일리톨 탈수소효소가 필요로 하는 보조인자(cofactor)인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)의 공급이 부족하게 되고, 자일리톨이 자일룰로스로 전환되는 과정이 억제된다. 그 결과로 자일리톨이 세포 및 배지에 축적되게 되어 50~60%의 수율로 자일로스로부터 자일리톨이 생산되는 것이다. 즉, 자일리톨 생산 균주를 이용하여 자일리톨을 생산하는 종래의 기술에서는 산소공급을 제한(limited aeration)함으로써 낮은 용존산소 농도로 조절하는 것이 필수적이다. 그리하여 배지 내의 산소공급을 제한하여 용존산소농도를 낮게 유지시켜 세포 내의 산화환원력 불균형을 의도적으로 유발시킴으로써 자일리톨의 생산성과 수율을 높이는 연구가 활발히 이루어졌다(Kim, S. Y. et al., J. Ferment . Bioeng ., 83(3):267-270, 1997; 대한민국특허 제1996-030577호).
대한민국특허 제10-0169061호에 따르면 농축된 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis) 균주를 이용해 용존산소(dissolved oxygen)농도를 0.8 % 내지 1.2 %로 조절하여 자일리톨을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 하지만, 산업적 규모의 대용량 발효기를 이용하여 자일리톨을 생산할 경우 용존산소 농도를 위와 같이 낮게 조절하는 것은 사실상 불가능하며, 설사 조절할 수 있다 하더라도 제조 수율이 50 ~ 60 % 정도에 불과하다. 또한, 대한민국특허 제10-0259470호에서, 1% 미만의 DOT(배지내 산소농도를 백분율로 나타낸 수치)로 배지 산소조건을 조절하기 위한 교반속도를 제시하고 있듯이 공정상의 번거로움이 존재한다. 그리고, 대한민국특허출원 제95-37516호에는 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis)의 자연종으로부터 유발시킨 돌연변이종을 이용한 자일리톨 생산방법에서 배지 내 산소분압의 조절에 의한 자일리톨 최적화에 관하여 개시된 바 있으며, 대한민국특허출원 제 95-13638호에는 상기 돌연변이주의 자일리톨의 생산을 위한 최적 배지 및 배양조건에 관하여 개시된 바 있으나, 이러한 최적의 조건에서도 자일리톨 수율은 70%를 넘지 못하였다. 이에, 본 발명자들은 캔디다 속 균주에서 생성된 자일리톨이 자일리톨 탈수소효소에 의해서 다시 자일룰로스로 전환되어 감소된다는 점에 착안하여, 자일리톨 탈수소효소의 활성을 완전히 불활성화시킨 캔디다 트로피칼리스 변이주를 개발하였다(대한민국특허 제 10-0730315호). 이전까지는 자일리톨을 자일룰로스로 전환시키는 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)의 작용억제를 위해, 세포 내의 산화환원력 불균형을 유발시키기 위한 배지 내의 산소공급제한이 필요했지만, 자일리톨 탈수소효소의 활성이 완전히 불활성화된 변이주는 자일로스로부터 생산된 자일리톨이 더 이상 세포성장에 이용되지 못하게 하여, 산화환원력 불균형 유발의 필요성이 없다. 이런 방법으로 97% 내지 98%의 수율로 자일로스를 자일리톨로 생물전환할 수 있다.
하지만 자일로스에 대한 자일리톨의 수율은 극대화되었지만, 실제 자일리톨 생산의 원료가 되는 바이오매스 가수분해물은 자일로스 뿐만 아니라 상당량의 아라비노스(arabinose)를 함유하고 있다. 자일리톨 생산균주의 자일로스 환원효소는 아라비노스에 대한 활성도 동시에 가지고 있기 때문에, 바이오매스 가수분해물을 직접 기질로 사용할 경우 아라비톨(arabitol)이 생성되게 된다. 아라비톨은 자일리톨과 같은 5탄당 당알코올로서 분자구조 및 물성이 자일리톨과 유사하여 자일리톨 생산시 정제 및 결정화 과정을 방해하여 생산수율을 저하시키는 부산물이다. 따라서 자일로스와 아라비노스의 혼합 배지를 이용하여 자일리톨 생산시, 아라비톨을 생성시키지 않는 자일리톨 생산기술을 개발해야 할 필요성이 있다.
이에, 본 발명자들은 아라비노스 대사경로에 관여하는 효소들 즉, L-아라비노스 아이소머라이즈(L-arabinose isomerase; araA ), L-리브로키나아제(L-ribulokinase; araB), L-리부로스-5-포스페이트 4-에피머라이제(L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase; araD) 효소들을 캔디다 속(Candida sp.)균주에서 효율적으로 발현시키기 위하여 유전자 부호 최적화(codon optimization)를 수행한 후, 각각의 유전자를 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터 및 선별마커인 URA3를 포함하는 카세트에 삽입하고, 캔디다 속 균주에 도입함으로써, 자일리톨 생산시 정제 및 결정화 과정을 방해하는 아라비톨 생성을 억제하여 자일리톨을 고생산성으로 생산할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 목적은 아라비노스(arabinose) 대사경로가 유도되도록 제작함으로써, 아라비톨(arabitol) 생성의 억제 및 아라비노스를 세포성장을 위하여 이용되도록 자일리톨 생산 수율을 극대화시킨 자일리톨 생산균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 자일리톨 생산균주의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 자일리톨 생산균주를 이용하여 포도당 또는 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 자일리톨을 고생산성으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 아라비노스(arabinose) 대사경로 관련 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 캔디다 속(Candidia sp .) 균주에 도입하여 제조된 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨(xylitol) 생산균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 아라비노스(arabinose) 대사경로 관련 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 캔디다 속(Candidia sp .) 균주에 도입하여 제조된 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨(xylitol) 생산균주 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 자일리톨 생산 균주를 바이오매스 가수분해물 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;
2) 배양된 균주로부터 자일리톨(xylitol)을 생산하는 단계; 및
3) 배양액으로부터 자일리톨를 분리하는 단계를 포함하는, 자일리톨의 대량 생산방법을 제공한다.
본 발명은 아라비노스(arabinose) 대사경로가 새로이 도입된 자일리톨 생산균주를 이용하여, 자일로스(xylose)와 아라비노스의 혼합 배지에서, 아라비노스를 세포 대사에 이용하게 하여 부산물인 아라비톨(arabitol)의 생성을 억제시킨 효율적인 자일리톨(xylitol) 생산방법에 관한 것으로, 자일리톨 생산시 정제 및 결정화 과정을 방해하는 아라비톨 생성을 억제하여 고생산성으로 자일리톨을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 자일리톨(xylitol) 생산균주에 의한 자일로스(xylose) 및 아라비노스(arabinose)의 대사경로도를 나타낸 그림이다.
도 2는 CoAraA, CoAraB 및 CoAraD 발현카세트의 유전자 지도를 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 아라비노스(arabinose) 대사경로 관련 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 캔디다 속(Candida sp .) 균주에 도입하여 제조된 아라비톨(arabitol) 생성이 억제되는 자일리톨(xylitol) 생산균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 1) 내지 3)의 유전자 발현 카세트를 캔디다 속 균주에 도입하여 제조된 아라비톨(arabitol) 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주를 제공한다:
1)프로모터(promoter), L-아라비노스 아이소머라이즈(L-arabinose isomerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터(terminator)로 구성된 유전자 발현 카세트;
2)프로모터, L-리브로키나아제(L-ribulokinase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트; 및
3)프로모터, L-리부로스-5-포스페이트 4-에피머라이제(L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트.
상기 프로모터는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는 프로모터, 상기 L-아라비노스 아이소머라이즈(L-arabinose isomerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 상기 L-리브로키나아제(L-ribulokinase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 상기 L-리부로스-5-포스페이트 4-에피머라이제(L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 터미네이터는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 기탁번호:KCTC 11761bp(기탁기관: 한국생명공학연구원, 기탁일: 2010.09.08)인 것을 특징으로 하는 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주를 제공한다.
상기 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주 PBDAU, LBDAU 또는 EBDAU는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 프로모터(promoter), 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 2로 기재된 염기서열을 갖는 터미네이터(terminator)로 구성된 유전자 발현카세트를 제조하는 단계; 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 프로모터, 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 2로 기재된 염기서열을 갖는 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트를 제조하는 단계; 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 프로모터, 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 2로 기재된 염기서열을 갖는 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트를 제조하는 단계; 및 상기 유전자 발현 카세트를 캔디다 속 균주에 도입하여 제조할 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 캔디다 속 균주는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis) 및 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 캔디다 트로피칼리스는 자일리톨 탈수소효소가 불활성화된 캔디다 트로피칼리스인것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자일리톨 탈수소효소가 불활성화된 캔디다 트로피칼리스는 기탁번호: KCTC 11137bp로 기탁된 균주인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자일리톨 탈수소효소의 활성을 완전히 불활성화시킨 캔디다 트로피칼리스는 자일리톨 생산의 원료가 되는 바이오매스의 가수분해물의 포함되어 있는 아라비노스의 활성도 동시에 가지고 있다. 또한 상기 캔디다 트로피칼리스는 아라비노스를 탄소원으로 이용할 수 있는 대사경로를 가지고 있지 않다. 아라비노스는 세포내로 들어온 후 자일로스 환원효소의 비특이적 활성에 의해 아라비톨로 전환된 후 더 이상 대사하지 못하고 세포 바깥으로 이동하게 된다. 따라서 바이오매스 가수분해물을 직접 기질로 사용할 경우 아라비톨이 생성되게 된다. 아라비톨은 자일리톨과 같은 5탄당 당알코올로서 분자구조 및 물성이 자일리톨과 유사하여 자일리톨 생산시 정제 및 결정화 과정을 방해하여 생산수율을 저하시키는 부산물이다. 따라서 자일로스와 아라비노스의 혼합 배지를 이용하여 자일리톨 생산시, 아라비톨을 생성시키지 않는 자일리톨 생산기술을 개발해야 할 필요성이 있다.
본 발명자들은 박테리아 균주의 아라비노스 대사경로[L-아라비노스 아이소머라이즈(L-arabinose isomerase;araA), L-리브로키나아제(L-ribulokinase; araB), L-리부로스-5-포스페이트 4-에피머라이제(L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase; araD)]를 캔디다 트로피칼리스 BSXDH-3에 도입하여, 아라비노스가 자일룰로스-5-인산으로 전환되어 오탄당인산경로 및 해당경로를 통하여 세포 대사에 이용될 수 있도록 하였다.
본 발명자들은 자일리톨 생산균주 PBDAU, LBDAU 및 EBDAU의 아라비노스 대사경로가 자일리톨의 생산시 정제 및 결정화를 방해하는 아라비톨의 생성을 억제하는지 확인하기 위해, 구축된 균주를 아라비노스 최소배지에 배양하여 시간에 따른 건조균체농도, 아라비노스 소모량 및 아라비톨 생성량을 확인하였다(표 1, 표 2 및 표 3 참조).
그 결과, 대조군인 야생형 캔디다 트로피칼리스는 탄소원으로 아라비노스만 존재하는 최소 배지에서 생장하지 못하는 것을 확인하였고, 자일리톨 생산균주LBDAU는 60시간 동안 1.6 g/L의 건조균체농도만큼 생장하였으며, 4.3 g/L의 아라비노스를 소모하였으므로, 아라비노스는 아라비톨로 전환되지 않고 모두 세포대사에 이용되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군인 자일리톨 탈수소효소의 활성을 불활성화시킨 BSXDH-3은 탄소원으로 아라비노스만 존재하는 최소 배지에서 건조균체는 생장하지 않고, 아라비노스는 소모되지 않았으며, 아라비톨도 생성되지 않은 반면 자일리톨 생산균주 PBDAU는 60시간 동안 2.1 g/L의 건조균체농도만큼 생장하였으며, 5.4 g/L의 아라비노스를 소모하였고, 아라비노스는 아라비톨로 전환되지 않고 모두 세포 대사에 이용되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군인 야생형 캔디다 파랍실로시스는 탄소원으로 아라비노스만 존재하는 최소 배지에서 생장하지 못하는 것을 확인하였고, 자일리톨 생산 균주 EBDAU는 60 시간 동안 1.4 g/L의 건조균체농도만큼 생장하였으며, 4.1 g/L의 아라비노스를 소모하였으므로, 아라비노스는 아라비톨로 전환되지 않고 모두 세포대사에 이용되었음을 확인할 수 있었다.
이로써 본 발명의 아라비노스 대사경로가 새로이 도입된 자일리톨 생산균주는 아라비톨 생성을 억제하여 고생산성으로 자일리톨을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 아라비노스(arabinose) 대사경로 관련 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 캔디다 속(Candida sp .) 균주에 도입하여 제조된 아라비톨(arabitol) 생성이 억제되는 자일리톨(xylitol) 생산균주 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 1) 내지 3)의 유전자 발현 카세트를 캔디다 속 균주에 도입하는 단계를 포함하는 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주 제조방법을 제공한다.
1)프로모터(promoter), L-아라비노스 아이소머라이즈(L-arabinose isomerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터(terminator)로 구성된 유전자 발현 카세트를 제조하는 단계;
2)프로모터, L-리브로키나아제(L-ribulokinase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트를 제조하는 단계; 및
3)프로모터, L-리부로스-5-포스페이트 4-에피머라이제(L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트를 제조하는 단계.
상기 프로모터는 서열번호 1로 염기서열을 갖는 프로모터, 상기 L-아라비노스 아이소머라이즈(L-arabinose isomerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 상기 L-리브로키나아제(L-ribulokinase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 상기 L-리부로스-5-포스페이트 4-에피머라이제(L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 터미네이터는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 기탁번호:KCTC 11761 bp(기탁기관: 한국생명공학연구원, 기탁일: 2010.09.08)인 것을 특징으로 하는 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주 제조방법을 제공한다.
상기 캔디다 속 균주는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis) 및 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 캔디드 트로피칼리스는 자일리톨 탈수소효소가 불활성화된 캔디다 트로피칼리스인것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자일리톨 탈수소효소가 불활성화된 캔디다 트로피칼리스는 키탁번호: KCTC 11137bp로 기탁된 균주인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 한가지 실시태양에서, 상기 서열번호 7, 8 및 9의 유전자 부호를 최적화를 위해 Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)의 데이터를 이용하여 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 L-arabinose isomerase(araA), 대장균 (Escherichia coli)의 L-ribulokinase(araB), L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase(araD)의 유전자 코돈을 캔디다 속 균주(Candida sp .)가 선호하는 코돈으로 교체하여 유전자 CoAraA(서열번호 : 7), CoAraB(서열번호 : 8), CoAraD(서열번호 : 9)를 합성하였다(GENEART, 독일). 최적화된 유전자들을 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터와 선별마커인 URA3 유전자, 선별마커의 제거을 위한 반복서열(glu 또는 arg 유전자)을 포함하는 카세트에 클로닝하여, PGtrpfs2-CoAraA, PAHfs-CoAraB, PAHfs2-CoAraD를 각각 수득한 후, 캔디다 속 균주에 도입하여, CoAraA, CoAraB, 및 CoAraD를 발현하는 변이주 캔디다 트로피칼리스 PBDAU, 캔디다 트로피칼라스 LBDAU 및 변이주 캔디다 파랍실로시스 EBDAU를 수득하였다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 형질전환체 PBDAU, LBDAU 또는 EBDAU를 이용하여 포도당 또는 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 자일리톨을 고생상성으로 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 자일리톨 생산방법은 하기의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 본 발명에 다른 형질전환체를 바이오매스 가수분해물 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;
2) 배양된 균주로부터 자일리톨(xylitol)을 생산하는 단계; 및
3) 배양액으로부터 자일리톨를 분리하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 바이오매스 가수분해물은 옥수수속대 가수분해물, 사탕수수속대 가수분해물, 코코넛 부산물, 및 자작나무의 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 자일로스를 포함하는 모든 바이오매스가 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 탄소원은 포도당 또는 글리세롤인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 균주 배양에 사용되는 모든 탄소원이 사용가능하다.
본 발명자들은 PBDAU, LBDAU 또는 EBDAU의 자일리톨 생산성을 확인하기 위해, 시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨 농도를 측정하였다(표 4, 표 5, 표 6 및 표 7, 표 8 및 표 9 참조). 그 결과, PBDAU의 자일리톨 생산성은 BSXDH-3가 0.55 g/L/h, PBDAU가 0.63 g/L/h인 것으로 나타났으며, PBDAU는 대조군인 BSXDH-3에 비해 15% 높은 자일리톨 생산성이 있는 것을 확인하였고, BSXDH-3은 60시간 동안 11.4g/L의 아라비톨을 생성하는데 반해, PBDAU는 부산물인 아라비톨을 만들지 않고 자일리톨만을 생산하는 것을 확인하였다. 또한, LBDAU의 자일리톨 생산성은 야생형 균주가 0.51 g/L/h, LBDAU가 0.59 g/L/h인 것으로 나타났으며, LBDAU는 대조군인 야생형 균주에 비해 15% 높은 자일리톨 생성성이 있는 것을 확인하였고, 야생형 균주는 60시간 동안 10.3 g/L의 아라비톨을 생성하는데 반해, LBDAU는 부산물인 아라비톨을 만들지 않고 자일리톨만을 생산하는 것을 확인하였다. 또한, EBDAU의 자일리톨 생산성은 야생형 균주가 0.44 g/L/h, EBDAU가 0.49 g/L/h인 것으로 나타났으며, EBDAU는 대조군인 야생형 균주에 비해 12% 높은 자일리톨 생성성이 있는 것을 확인하였고, 야생형 균주는 60시간 동안 9.8 g/L의 아라비톨을 생성하는데 반해, EBDAU는 부산물인 아라비톨을 만들지 않고 자일리톨만을 생산하는 것을 확인하였다.
이로써 본 발명의 아라비노스 대사경로가 새로이 도입된 자일리톨 생산균주는 아라비톨 생성을 억제하여 고생산성으로 자일리톨을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명은 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 글리세알데히드 -3-인산 탈수소효소의 프로모터와 터미네이터 서열 클로닝
캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)의 프로모터와 터미네이터를 클로닝하기 위해, 캔디다 트로피칼리스 유전체 DNA와 하기의 프라이머쌍을 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 1455bp의 프로모터 서열(서열번호: 1)과 309bp의 터미네이터 서열(서열번호: 2)을 확보하였다.
프로모터 PCR[94℃ 30초, 30회 반복(94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 1분 30초), 72℃ 7분]:
PGAP-F(BglII): 5'-agatctaacgtggtatggttgtaagaaac-3'(서열번호: 3); 및
PGAP-R(XbaI_BamHI): 5'-ggatccgcgtctagatgtttaaattctttaattg-3'(서열번호: 4).
터미네이터 PCR[94℃ 30초, 30회 반복(94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 1분), 72℃ 7분]:
TGAP-F(XbaI_Xho): 5'-tctagattgctcgagctatccaacaaactctag-3'(서열번호: 5); 및
TGAP-R(BamHI): 5'-ggatcctctggtttagaagtagggactgtatg-3'(서열번호: 6).
< 실시예 2> araA , araB , araD 유전자 부호 최적화( codon optimization )
Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)의 데이터를 근거로 하여, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 L-아라비노스 아이소머라이즈(L-arabinose isomerase; araA), 대장균(Escherichia coli)의 L-리브로키나아제(L-ribulokinase;araB) L-리부로스-5-포스페이트 4-에피머라이제(L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase; araD)의 유전자 코돈을 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)가 선호하는 코돈으로 교체하여 유전자 서열번호: 7로 기재되는 염기서열 구성된 CoAraA, 서열번호: 8로 기재되는 염기서열로 구성된 CoAraB 및 서열번호: 9로 기재되는 염기서열로 구성된 CoAraD를 합성하였다(GENEART, 독일).
< 실시예 3> CoAraA , CoAraB 및 CoAraD 발현 카세트 및 발현 균주 구축
상기 <실시예 2>에서 합성한 최적화된 유전자들을 글리세롤알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)의 프로모터와 선별마커의 제거를 위한 반복서열(glu 또는 arg 유전자)를 포함하는 카세트에 클로닝하여, PGtrpfs2-CoAraA, PAHfs-CoAraB 및 PAHfs2-CoAraD를 각각 수득하였다(도 2).
<3-1> 자일로스 탈수소효소의 발현이 억제된 형질전환된 캔디다 트로피칼리스의 구축
캔디다 트로피칼리스의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 이용한 PCR(94℃ 1분, 25회 반복(94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초) 및 72℃ 3분)을 수행하여, 캔디다 트로피칼리스의 자일리톨 탈수소효소의 유전자를 증폭하고, 상기 증폭된 캔디다 트로피칼리스의 자일리톨 탈수소효소의 유전자를 pGEM-T easy 벡터(BIONEX, 한국)에 클로닝한 다음, 상기 자일리톨 탈수소효소의 유전자의 중간에 BamHI 좌위를 도입하고, 상기 도입된 BamHI 좌위에 ura3 유전자를 도입하여, 4.7 kb의 형질전환 벡터 pXYL2-Ura3를 수득하였다.
프라이머 F:5'-aatggtcttgggtcacgaatcc-3'(서열번호: 10)
프라이머 R:5'-gctctgaccaagtcgtaggcttc-3'(서열번호: 11)
상기에서 수득한 벡터 pXYL2-Ura3를 캔디다 트로피칼리스에 도입하고, 이를 유라실(uracil)이 결핍된 선별용 고체배지(효모 질소 베이스(무 아미노산) 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 한천가루 15 g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치배양하였다. 그런 다음, 고체배지에서 형성된 콜로니를 자일로스가 포함된 고체배지(효모 질소 베이스(무 아미노산) 6.7 g/L, 자일로스 20 g/L, 한천가루 15 g/L)와 포도당이 포함된 고체배지(효모 질소 베이스(무 아미노산) 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 한천가루 15 g/L)에 각각 접종하여 30℃에서 2일간 정치배양하고, 자일로스가 포함된 고체배지에서는 자라지 못하고, 포도당이 포함된 고체배지에서만 자라는 균주를 선별하여, 자일리톨 탈수소효소가 제거된 캔디다 트로피칼리스를 수득하였다.
<3-2> 캔디다 파랍실로시스의 유라실 영양요구성 돌연변이( Uracil auxotroph) 구축
URA3 유전자를 균주 구축을 위한 선별마커로 사용하기 위하여 캔디다 파랍실로시스 균주에 알킬화제(alkylating agent)로서 돌연변이 유발물질인 EMS(methanesulfonic acid ehtylester)를 처리하여 유라실 영양요구성 돌연변이를 구축하였다.
캔디다 파랍실로시스 균주를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 이어 상기 배양액을 YM 배지 50 ml에 접종하고 30℃에서 200 rpm으로 12시간 동안 진탕 배양한 다음, 상기 배양액 30 ml를 50 ml 튜브(tube)에 옮겨 담은 후 30 ml 미니멀(Minimal) A 버퍼(인산수소이칼륨(K2HPO4) 10.5 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 4.5 g/L, 황산암모늄((NH4)2SO4) 1.0 g/L 및 구연산나트륨(sodium citrate) 0.5 g/L)로 세포를 두 번 세척하고, 세포를 다시 15 ml 미니멀(Minimal) A 버퍼로 리서스펜드(resuspend) 시킨 다음, EMS 450 μl를 첨가하였다. 그후, 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양시키면서 90분 동안 반응시킨 후, 세포를 5 ml 미니멀(Minimal) A 버퍼로 두 번 세척하고 이를 1 ml 미니멀(Minimal) A 버퍼로 리서스펜드(resuspend)하여 5-FOA 고체배지(효모 질소 베이스 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 5-FOA 0.8 g/L, 유라실 0.1 g/L, 한천 가루 15g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치배양하였다. 고체배지에서 형성된 콜로니는 URA3 유전자가 불활화된 균주이며, 이와 같이 유라실 영양요구성 캔디다 파랍실로시스 균주를 수득하였다.
<3-3> 야생형 캔디다 트로피칼리스에서 CoAraA , CoAraB 및 CoAraD 유전자를 발현하는 균주 구축
상기 카세트 PGtrpfs2-CoAraA를 야생형 캔디다 트로피칼리스 균주에 도입하여, 이를 유라실(Uracil)이 결핍된 선별용 고체배지(효모 질소 베이스 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 한천가루 15 g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치배양하였다. 고체배지에서 형성된 콜로니는 카세트가 도입된 균주이며, 이를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 이어 상기 배양액을 5-FOA 고체배지(효모 질소 베이스 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 5-FOA 0.8 g/L, 유라실 0.1 g/L, 한천 가루 15 g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치배양하였다.
고체배지에서 형성된 콜로니는 도입된 URA3 유전자가 제거된 균주이며, 동일한 방법으로 PAHfs-CoAraB, PAHfs2-CoAraD를 차례로 도입하여, CoAraA, CoAraB 및 CoAraD를 발현하는 변이주 캔디다 트로피칼리스 LBDAU를 수득하였다.
<3-4> 자일리톨 탈수소효소가 제거된 캔디다 트로피칼리스에서 CoAraA , CoAraB 및 CoAraD 유전자를 발현하는 균주 구축
상기 수득한 카세트 PGtrpfs2-CoAraA를 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활성화된 캔디다 트로피칼리스 BSXDH-3(기탁번호: KCTC11137bp)에 도입하여, 이를 유라실(Uracil)이 결핍된 선별용 고체배지(효모 질소 베이스 6.7 g/L, 포도당 20 g/L 및 한천가루 15 g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치배양하였다. 고체배지에서 형성된 콜로니는 카세트가 도입된 균주이며, 이를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L 및 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종한 후, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 이어 상기 배양액을 5-FOA 고체배지(효모 질소 베이스 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 5-FOA 0.8 g/L, 유라실 0.1 g/L 및 한천 가루 15 g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치배양하였다.
고체배지에서 형성된 콜로니는 도입된 URA3 유전자가 제거된 균주이며, 상기와 같은 방법으로 PAHfs-CoAraB 및 PAHfs2-CoAraD를 차례로 도입하여, CoAraA, CoAraB 및 CoAraD를 발현하는 변이주 캔디다 트로피칼리스 PBDAU를 수득하였다.
<3-5> 캔디다 파랍실로시스( Candida parapsilosis )에서 CoAraA , CoAraB 및 CoAraD 유전자를 발현하는 균주 구축
상기 수득한 카세트 PGtrpfs2-CoAraA를 URA3 유전자가 불활성화된 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis) 균주에 도입하여, 이를 유라실(Uracil)이 결핍된 선별용 고체배지(효모 질소 베이스 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 한천가루 15 g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치배양하였다. 고체배지에서 형성된 콜로니는 카세트가 도입된 균주이며, 이를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150rpm으로 진탕 배양하였다. 이어 상기 배양액을 5-FOA 고체배지(효모 질소 베이스 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 5-FOA 0.8 g/L, 유라실 0.1 g/L, 한천 가루 15 g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치배양하였다.
고체배지에서 형성된 콜로니는 도입된 URA3 유전자가 제거된 균주이며, 동일한 방법으로 PAHfs-CoAraB, PAHfs2-CoAraD를 차례로 도입하여, CoAraA, CoAraB 및 CoAraD를 발현하는 변이주 캔디다 파랍실로시스 EBDAU를 수득하였다.
< 실시예 4> 도입된 아리비노스 대사 경로의 작동 여부 확인
상기 <실시예 3>에서 수득한 캔디다 트로피칼리스 PBDAU, LBDAU 및 캔디다 파랍실로시스 EBDAU의 아라비노스 대사경로가 제대로 작동하는지 확인하기 위해, 구축된 균주를 아리비노스 최소 배지에서 배양하였다.
<4-1> 야생형 캔디다 트로피칼리스 LBDAU 의 아라비노스 대사 경로의 작동 여부 확인
LBDAU를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L 및 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 이어, 상기 배양액을 아라비노스 최소 배지(아라비노스 20 g/L, 효모 질소 베이스 6.7 g/L, 한천가루 15 g/L) 50 ml에 접종하고, 60시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
시료를 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하고, 미리 분석한 표준곡선으로 환산하여 산출하였다. 또한, 시간에 따른 아라비노스, 아라비톨 농도를 측정하였으며, 측정방법은 다음과 같다. 우선, 시료를 원심분리하여 상등액을 0.2 ㎛필터로 여과한 후, HPLC 시스템[Sugar-Pak I column, HPLC pump, refractive index detector(Waters, 미국), 이동상: 물, 0.5 ml/min, 온도: 90℃]으로 분석하였다.
아라비노스 최소배지에서의 세포 성장 및 아라비노스 소모량과 아라비톨 생성량 분석

시간		 야생형 LBDAU
건조균체
(g/L)		 아라비노스
(g/L)		 아라비톨
(g/L)		 건조균체
(g/L)		 아라비노스
(g/L)		 아라비톨
(g/L)
0 0 20 0 0 20 0
24 0 20 0 0.8 18.9 0
48 0 20 0 1.3 16.5 0
60 0 20 0 1.6 15.7 0
그 결과, 표 1에서보는 바와 같이 대조군인 야생형 캔디다 트로피칼리스는 탄소원으로 아라비노스만 존재하는 최소 배지에서 생장하지 못하는 것을 확인하였고, 따라서 아라비노스를 소모하지 못하고 아라비톨도 생성시키지 못하는 것을 확인하였다. 그러나 LBDAU는 60시간 동안 1.6 g/L의 건조균체농도만큼 생장하였으며, 4.3 g/L의 아라비노스를 소모하였다. 아라비노스는 아라비톨로 전환되지 않고 모두 세포 대사에 이용되었음을 확인할 수 있었다.
따라서 LBDAU에 도입된 아라비노스 대사경로가 성공적으로 작동하고 있음을 확인할 수 있었다.
<4-2> 변이주 캔디다 트로피칼리스 PBDAU 의 아라비노스 대사 경로의 작동 여부 확인
PBDAU를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L 및 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종한 후, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 이어, 상기 배양액을 아라비노스 최소 배지(아라비노스 20 g/L, 효모 질소 베이스 6.7 g/L 및 한천가루 15 g/L) 50 ㎖에 접종하고, 60시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
시료를 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였고, 미리 분석한 표준곡선으로 환산하고 산출하여 시간에 따른 건조균체농도를 측정하였다. 또한, 시간에 따른 아라비노스, 아라비톨 농도를 측정하였으며, 측정 방법은 다음과 같다. 우선, 시료를 원심분리하여 상등액을 0.2 ㎛필터로 여과한 후, HPLC 시스템[Sugar-Pak I 컬럼, HPLC 펌프, refractive index detector(Waters, 미국), 이동상(mobile phase): 물, 0.5 ml/min, 온도: 90℃]으로 분석하였다. 시간에 따른 세포건조균체농도(Drv cell weight) 및 아라비노스 소모량과 아라비톨 생산량은 다음과 같다.
아라비노스 최소 배지에서의 세포 성장 및 아라비노스 소모량과 아라비톨 생산량 분석

시간		 BSXDH-3 PBDAU
건조균체
(g/L)		 아라비노스
(g/L)		 아라비톨
(g/L)		 건조균체
(g/L)		 아라비노스
(g/L)		 아라비톨
(g/L)
0 0 20 0 0 20 0
24 0 20 0 1.0 18.3 0
48 0 20 0 1.8 15.6 0
60 0 20 0 2.1 14.6 0
그 결과, 표 2에서 보는 바와 같이 대조군인 BSXDH-3은 탄소원으로 아라비노스만 존재하는 최소 배지에서 생장하지 못하고, 아리바노스를 소모하지 못하여 아라비톨도 생성시키지 못하는 것을 확인하였다. 그러나 PBDAU는 60시간 동안 2.1 g/L의 건조균체농도 만큼 생장하였으며 5.4 g/L의 아라비노스를 소모하였고 아라비노스는 아라비톨로 전환되지 않고 모두 세포 대사에 이용되었음을 확인하였다.
따라서, PBDAU에 도입된 아라비노스 대사경로가 성공적으로 작동되고 있음을 확인할 수 있었다.
<4-3> 캔디다 파랍실로시스 EBDAU 의 아라비노스 대사 경로의 작동 여부 확인
EBDAU를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종한 후, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 이어, 상기 배양액을 아라비노스 최소 배지 (아라비노스 20 g/L, 효모 질소 베이스 6.7 g/L, 한천가루 15 g/L) 50 ml에 접종하고, 60시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
시료를 분광광도계 (Spectrophotometer)를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였고, 미리 분석한 표준곡선으로 환산하고 산출하여 시간에 따른 건조균체농도를 측정하였다. 또한, 시간에 따른 아라비노스, 아라비톨 농도가 측정하였으며, 측정 방법은 다음과 같다. 우선, 시료를 원심분리하여 상등액을 0.2 필터로 여과한 후, HPLC 시스템[Sugar-Pak I 컬럼(column), HPLC 펌프(pump), refractive index detector(Waters, 미국), 이동상(mobile phase): 물, 0.5 ml/min, 온도: 90℃]으로 분석하였다. 시간에 따른 세포건조균체농도 (Drv cell weight) 및 아라비노스 소모량 및 아라비톨 생성량은 다음과 같다.
아라비노스 최소 배지에서의 세포 성장 및 아라비노스 소모량과 아라비톨 생성량 분석

시간		 야생형 EBDAU
건조균체
(g/L)		 아라비노스
(g/L)		 아라비톨
(g/L)		 건조균체
(g/L)		 아라비노스
(g/L)		 아라비톨
(g/L)
0 0 20 0 0 20 0
24 0 20 0 0.9 19.0 0
48 0 20 0 1.2 17.1 0
60 0 20 0 1.4 15.9 0
그 결과, 표 3에서 보는 바와 같이 대조군인 야생형 캔디다 파랍실로시스는 탄소원으로 아라비노스만 존재하는 최소 배지에서 생장하지 못하고, 아라비노스를 소모하지 못하여 아라비톨도 생성시키지 못했다. 그러나 EBDAU는 60시간 동안 1.4 g/L의 건조균체농도만큼 생장하였으며, 4.1 g/L의 아라비노스를 소모하였다. 아라비노스는 아라비톨로 전환되지 않고 모두 세포 대사에 이용되었음을 확인할 수 있었다.
따라서 EBDAU에 도입된 아라비노스 대사경로가 성공적으로 작동하고 있음을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5> 형질전환체를 이용한 자일리톨의 제조
<5-1> 형질전환체 PBDAU 와 보조기질로 포도당을 이용한 자일리톨의 제조
제조된 형질전환체 PBDAU를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양액을 자일로스 및 아라비노스가 포함된 생산배지(자일로스 30 g/L, 아리비노스 30 g/L, 포도당 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO47H2O) 0.2 g/L) 50 ml에 접종한 후, 60시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였으며, 배양 개시 후 14시, 20시, 26시 및 32시에 각각 포도당 2.5 g/L씩 첨가하였다.
시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아리비노스, 아라비톨 농도를 측정하였으며, 측정 방법은 다음과 같이 수행하였다. 우선, 시료를 원심분리하여 상등액을 0.2 ㎛필터로 여과한 후, HPLC 시스템[Sugar-Pak I 컬럼, HPLC 펌프, refractive index detector(Waters, 미국), 이동상(mobile phase): 물, 0.5 ml/min, 온도: 90℃]으로 분석하였다. 시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스 및 아라비톨의 농도는 다음과 같다.
배양시간에 따른 자일리톨 및 아라비톨 농도 변화

시간		 BSXDH-3 PBDAU
자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)		 자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)
0 27.3 0 28.3 0 27.3 0 28.3 0
6 26.6 0 28.0 0 26.7 0 28.1 0
12 22.8 3.2 27.9 0 22.7 3.6 28.0 0
24 11.7 14.1 25.4 1.7 6.8 20.1 24.7 0
36 4.0 22.4 22.7 4.2 1.0 25.5 21.2 0
42 1.2 25.3 20.9 6.0 0 26.8 20.2 0
48 0 26.5 18.5 8.3 0 27.0 18.5 0
60 0 27.1 15.6 11.4 0 27.0 17.9 0
그 결과, 자일리톨 생산성은 BSXDH-3 0.55 g/L/h, PBDAU 0.63 g/L/h인 것으로 나타났으며, PBDAU는 대조군인 BSXDH-3에 비해 15% 높은 자일리톨 생산성을 보여주었다. 또한 BSXDH-3은 60시간 동안 11.4g/L의 아라비톨을 생성시킨데 반해, PBDAU는 부산물인 아라비톨을 만들어 내지 않고 자일리톨만을 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, PBDAU를 통한 자일리톨 생산방법은 자일리톨 생산시 정제 및 결정화 과정을 방해하는 아라비톨을 생산하지 않으므로 자일리톨 생산수율을 현저히 높일 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
<5-2> 형질전환체 PBDAU 와 보조기질로 글리세롤을 이용한 자일리톨의 제조
제조된 형질전환체 PBDAU를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음 상기 배양액을 자일로스와 아라비노스 및 글리세롤이 포함된 생산배지(자일로스 30 g/L, 아라비노스 30 g/L, 글리세롤 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO47H2O) 0.2 g/L) 50 ml에 접종하고, 36시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨 농도를 측정하였으며, 측정방법은 다음과 같이 수행하였다. 우선, 시료를 원심분리하여 상등액을 0.2 ㎛필터로 여과한 후, HPLC 시스템 Sugar-Pak I column, HPLC pump, refractive index detector(Waters, 미국), 이동상: 물, 0.5 ml/min, 온도: 90℃]으로 분석하였다. 시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨의 농도 변화는 다음과 같다.
배양시간에 따른 자일리톨 및 아라비톨 농도 변화

시간		 BSXDH-3 PBDAU
자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)		 자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)
0 28.3 0 27.8 0 28.3 0 27.8 0
12 25.2 2.5 27.0 0 24.7 3.4 26.4 0
24 13.0 15.1 24.7 2.0 9.0 19.8 25.6 0
36 3.5 25.0 22.6 4.2 0.8 26.7 24.8 0
42 0 27.3 20.3 6.4 0 27.1 24.1 0
그 결과, 자일리톨 생산성은 BSXDH-3가 0.65 g/L/h, PBDAU가 0.74 g/L/h인 것으로 나타났으며, PBDAU는 대조군인 BSXDH-3에 비해 14% 높은 자일리톨 생산성을 보여주었다. 또한 BSXDH-3은 42시간 동안 6.4 g/L의 아라비톨을 생성시킨데 반해, PBDAU는 부산물인 아라비톨을 만들어 내지 않고 자일리톨만을 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, PBDAU를 통한 자일리톨 생산방법은 자일리톨 생산시 정제 및 결정화 과정을 방해하는 아라비톨을 생산하지 않으므로 자일리톨 생산수율을 현저히 높일 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
<5-3> 형질전환체 LBDAU 와 보조기질로 포도당을 이용한 자일리톨의 제조
제조된 형질전환체 LBDAU를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양액을 자일로스와 아라비노스 및 포도당이 포함된 생산배지(자일로스 30 g/L, 아라비노스 30 g/L, 포도당 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO47H2O) 0.2 g/L) 50 ml에 접종하고, 60시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였으며, 14시, 20시, 26시 및 32시에 포도당 2.5 g/L씩 첨가하였다.
시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨 농도를 측정하였으며, 측정방법은 다음과 같다. 우선, 시료를 원심분리하여 상등액을 0.2 ㎛필터로 여과한 후, HPLC 시스템[Sugar-Pak I column, HPLC pump, refractive index detector(Waters, 미국), 이동상: 물, 0.5ml/min, 온도: 90℃]으로 분석하였다. 시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨의 농도 변화는 다음과 같다.
배양시간에 따른 자일리톨 및 아라비톨 농도 변화

시간		 야생형 LBDAU
자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)		 자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)
0 27.5 0 28.0 0 27.5 0 28.0 0
6 26.9 0 28.0 0 27.0 0 28.0 0
12 24.0 2.0 27.5 0 23.5 2.7 27.7 0
24 12.0 12.3 26.3 1.0 11.4 17.0 25.2 0
36 3.3 18.5 23.2 3.8 2.6 21.3 21.5 0
42 1.1 19.1 21.0 5.7 1.0 22.0 19.8 0
48 0 19.4 19.2 7.7 0 22.3 18.6 0
60 0 19.4 16.0 10.3 0 22.3 16.9 0
그 결과, 자일리톨 생산성은 야생형 균주가 0.51 g/L/h, LBDAU가 0.59 g/L/h인 것으로 나타났으며, LBDAU는 대조군인 야생형 균주에 비해 15% 높은 자일리톨 생산성을 보여주었다. 또한 야생형 균주은 60시간 동안 10.3 g/L의 아라비톨을 생성시킨데 반해, LBDAU는 부산물인 아라비톨을 만들어 내지 않고 자일리톨만을 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
<5-4> 형질전환체 LBDAU 와 보조기질로 글리세롤을 이용한 자일리톨의 제조
제조된 형질전환체 LBDAU를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양액을 자일로스와 아라비노스 및 글리세롤이 포함된 생산배지(자일로스 30 g/L, 아라비노스 30 g/L, 글리세롤 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO47H2O) 0.2 g/L) 50 ml에 접종하고, 36시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨 농도를 측정하였으며, 측정방법은 다음과 같다. 우선, 시료를 원심분리하여 상등액을 0.2 ㎛필터로 여과한 후, HPLC 시스템[Sugar-Pak I column, HPLC pump, refractive index detector(Waters, 미국), mobile phase: 물, 0.5ml/min, 온도: 90℃]으로 분석하였다. 시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨의 농도 변화는 다음과 같다.
배양시간에 따른 자일리톨 및 아라비톨 농도 변화
시간 야생형 LBDAU
자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)		 자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)
0 28.5 0 27.7 0 28.5 0 27.7 0
12 23.6 2.3 27.5 0 23.8 3.8 27.7 0
24 11.5 13.5 24.8 1.7 10.2 17.6 26.9 0
36 1.8 20.7 22.5 4.3 1.0 22.7 25.1 0
42 0 20.9 20.5 6.7 0 23.0 23.9 0
그 결과, 자일리톨 생산성은 야생형 균주가 0.58 g/L/h, LBDAU가 0.63 g/L/h인 것으로 나타났으며, LBDAU는 대조군인 야생형 균주에 비해 10% 높은 자일리톨 생산성을 보여주었다. 또한 야생형 균주은 42시간 동안 6.7g/L의 아라비톨을 생성시킨데 반해, LBDAU는 부산물인 아라비톨을 만들어 내지 않고 자일리톨만을 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
<5-5> 형질전환체 EBDAU 와 보조기질로 포도당을 이용한 자일리톨의 제조
제조된 형질전환체 EBDAU를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양액을 자일로스와 아라비노스 및 포도당이 포함된 생산배지(자일로스 30 g/L, 아라비노스 30 g/L, 포도당 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO47H2O) 0.2 g/L) 50 ml에 접종하고, 60시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였으며, 14시, 20 시, 26시, 32시에 포도당 2.5 g/L씩 첨가하였다.
시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨 농도가 측정되었으며, 측정 방법은 다음과 같다. 우선, 시료를 원심분리하여 상등액을 0.2 필터로 여과한 후, HPLC 시스템[Sugar-Pak I 컬럼(column), HPLC 펨프(pump), refractive index detector(Waters, 미국), 이동상(mobile phase): 물, 0.5 ml/min, 온도: 90℃]으로 분석하였다. 시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨의 농도 변화는 다음과 같다.
배양시간에 따른 자일리톨 및 아라비톨 농도 변화

시간
 야생형 EBDAU
자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)		 자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)
0 27.7 0 27.8 0 27.7 0 27.8 0
6 27.0 0 27.8 0 27.5 0 27.8 0
12 24.0 2.1 27.5 0 24.1 2.5 27.2 0
24 13.5 11.1 26.6 0.8 11.1 14.5 26.5 0
36 4.9 16.4 23.5 3.5 3.5 19.7 22.9 0
42 2.5 18.5 21.4 5.5 1.0 20.7 21.3 0
48 1 18.4 18.8 7.3 0 20.7 18.9 0
60 0 18.4 17.5 9.8 0 20.5 17.8 0
그 결과, 자일리톨 생산성은 야생형 균주가 0.44 g/L/h, EBDAU가 0.49 g/L/h인 것으로 나타났으며, EBDAU는 대조군인 야생형 균주에 비해 12% 높은 자일리톨 생산성을 보여주었다. 또한 야생형 균주은 60시간 동안 9.8 g/L의 아라비톨을 생성시킨데 반해, EBDAU는 부산물인 아라비톨을 만들어 내지 않고 자일리톨만을 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, EBDAU를 통한 자일리톨 생산방법은 자일리톨 생산시 정제 및 결정화 과정을 방해하는 아라비톨을 생산하지 않으므로 자일리톨 생산수율을 현저히 높일 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
<5-6> 형질전환체 EBDAU 와 보조기질로 글리세롤을 이용한 자일리톨의 제조
제조된 형질전환체 EBDAU를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양액을 자일로스와 아라비노스 및 글리세롤이 포함된 생산배지(자일로스 30 g/L, 아라비노스 30 g/L, 글리세롤 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO47H2O) 0.2 g/L) 50 ml에 접종하고, 36시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨 농도가 측정되었으며, 측정 방법은 다음과 같다. 시료를 원심분리하여 상등액을 0.2 필터로 여과한 후, HPLC 시스템[Sugar-Pak I 컬럼(column), HPLC 펌프(pump), refractive index detector(Waters, 미국), 이동상(mobile phase): 물, 0.5 ml/min, 온도: 90℃]으로 분석하였다. 시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨의 농도 변화는 다음과 같다.
배양시간에 따른 자일리톨 및 아리비톨 농도 변화


시간		 야생형 EBDAU
자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)		 자일
로스
(g/L)		 자일
리톨 (g/L)		 아라비
노스 (g/L)		 아라
비톨 (g/L)
0 28.0 0 27.5 0 28.0 0 27.5 0
12 26.5 1.3 27.5 0 24.3 3.2 27.6 0
24 13.5 11.9 24.6 1.5 11.8 16.6 24.2 0
36 2.8 17.8 22.5 3.9 2.5 20.2 23.1 0
42 0 20.1 21.1 5.2 0 21.0 23.0 0
그 결과, 자일리톨 생산성은 야생형 균주가 0.49 g/L/h, EBDAU가 0.56 g/L/h인 것으로 나타났으며, EBDAU는 대조군인 야생형 균주에 비해 13% 높은 자일리톨 생산성을 보여주었다. 또한 야생형 균주은 42시간 동안 5.2 g/L의 아라비톨을 생성시킨데 반해, EBDAU는 부산물인 아라비톨을 만들어 내지 않고 자일리톨만을 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, EBDAU를 통한 자일리톨 생산방법은 자일리톨 생산시 정제 및 결정화과정을 방해하는 아라비톨을 생산하지 않으므로 자일리톨 생산수율을 현저히 높일수 있는 것을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC11761BP 20100908
<110> Korea advanced institute of science and technology <120> Xylitol producing microorganism introduced with arabinose metabolic pathway and production method of xylitol using the same <130> 10p-08-25 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 1 aacgtggtat ggttgtaaga aacatattgc aactggagat agcgatcgtt caatttattc 60 cgattttgtg ggggaagtcg cccgctggtg ggcgtgcgcg aatggcaaaa gaaactcgac 120 catgcttttc atcatccctt aacagagcaa tcatatttta aacgttcaag caaaaagaaa 180 cgttggtttc ggctaatgat cacctgaaag gcaaaatcct tccatgtatg aacatgtagg 240 ttattccttt tttttgcaac accctcgggc agttgttcat attcccggaa aacaccacca 300 ctcggggcta agtggaagtt ctacaatccc ggggaaataa ggagccccgg tgagcacgcg 360 cacacaccac cttcacttca ttttgtccga gggaagcagc acgtgaagtc ggaacacgag 420 aggagcattt cttctatttt tttcttctct actgtgagtg catgattata tatgtaatca 480 aaagcgatca acttatggta gggtcgtgca cggcgcaccg ggttccaaaa tgatctgtga 540 gggacaaaat tctttttttt ttccagcatg ccgctggtgg caaataccgt ggtggtatga 600 tgcaccctat gccattgatt cacaccacca ccattaatca acaattgaga gaggacaaaa 660 gtgaactatt ggtggtcgtc aggttatact cgtcagcttc ggaatattac gtcccttcag 720 tttgtgaaat gtcatcctgg cgatgttcga gagagatcag tccgagagcg cgtggtagga 780 gaaacggagc actgcagcaa caaaaaaaaa atccaaaccc aggggggagg aagaagaaca 840 gccagggaaa ttgttcaccg acctgaccgt aaatttgctg ctgaaagaaa cgtgtcaaac 900 aagaccaatt ggctcaattg accctgaggg agtactttgt ctgccaccaa tgcttccacc 960 aaaacgctac ttttgttttg caatcggatg gtgtgggtct ggggtccacc tgttttgtta 1020 agctacagaa ggtggcatat tcctctgatc aggtgctttt tttcggctgc tgctgctcgt 1080 ggtggtgtag tggtagtggt gtgtgtgcgt gtgcgtgagg gaggccgctt tttgctctct 1140 gactcctccc aatcagaagt tgctgtagca gtgaaacaac acaatggatg ataatgcccc 1200 gggcggtgcg tgtccgacac aaaccactac attttttagc tgggagcata ctgccactac 1260 gacccaccca cccatggtca acaaaaaaat tctgacaaat tataaaataa cccttggatt 1320 cccccttgga aaaatttttg gtatttctct ctttcttttc cttttccttt ccctcttctt 1380 tttccctcca tcaatcaatt gacgttcagt aactcaatta attacatcac atccctcaat 1440 taaagaattt aaaca 1455 <210> 2 <211> 309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> teminator <400> 2 ctatccaaca aactctaggg gttgtgcttt ttgaaaaaaa catataggtt ttattgaaat 60 agccacaatg tctgttgaga ggacatttga tttgttttat attatcgtat atgtaccctg 120 gaatatattg cgttttttaa caaaagacaa acaacggtct ttagtttttt tttcaatcaa 180 tcaatgttcg tgatcgtaga gagaaggaga aaaaaagagt aaacataaac aaacatcttt 240 ctttttacaa acgagtacaa gcaacagcca tgtcacaaga tgccatacag tccctacttc 300 taaaccaga 309 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGAP forward primer <400> 3 agatctaacg tggtatggtt gtaagaaac 29 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGAP reverse primer <400> 4 ggatccgcgt ctagatgttt aaattcttta attg 34 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGAP forward primer <400> 5 tctagattgc tcgagctatc caacaaactc tag 33 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGAP reverse primer <400> 6 ggatcctctg gtttagaagt agggactgta tg 32 <210> 7 <211> 1425 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 7 atgttgacca ccggtaagaa agaattctgg ttcgttgttg gttcccaaca cttgtacggt 60 gaagaaacct tggctgaagt tagagcccac gctcaagcta tgaccgatgc tttgaacgaa 120 tccgctgttt tgccataccc attggtcttg caagatttgg ctgtcaacgc tgataagatt 180 acctccatta tgaaggaagt caactacaga gatgaagttg ctggtgttat tacctggatg 240 cacaccttct caccagctaa gatgtggatt agaggtacta agttgttgca aaagccattg 300 ttgcacttgg ctacccaatt caacgaatcc attccatggc caaccattga tatggatttc 360 atgaacttga atcaatccgc tcacggtgat agagaatacg gtttcattaa cgccagattg 420 aagaagcaaa acaaggttgt tgtcggttac tgggaaagac cagaagttca acaacaaatt 480 gctgaatgga tggatgttgc tgttgcttac aacgaatcct tcaacattaa ggttgctaga 540 ttcggtgaca acatgagaaa cgttgctgtt accgaaggtg ataagattga agctcaaatt 600 caattcggtt ggaccgttga ttacttcggt attggtgatt tggtccaata cgtcaacgct 660 gttaccgatg aagaaatcaa cagattgttc gctgaatacg ctgacttgta cgaattcgat 720 tacggtactt actccagaga agattgggaa aagtccgtta aggttcaagc ttcctacgaa 780 attgccatca agagattctt ggatgatggt ggttacaacg ctttcaccac caacttcgaa 840 gatttgtacg gtatgaagca attgccaggt ttggctgttc aaagattgat ggctcaaggt 900 tacggtttcg ctggtgaagg tgattggaaa accgctgctt tggatagatt gttgaaggtt 960 atgtccagaa atcaatccac cggtttcatg gaagattaca cctacgaatt ggctgctggt 1020 caagaatcca tcttgcaatc ccacatgttg gaagttgatc catccttggc ttccaacaag 1080 ccaaagatta tcgtttcccc attgggtatt ggtgacagag aagatccagc tagattggtt 1140 ttcgatggta aggctggtga tggtgttgtt gtttccatgg ctgatttcgg tactcactac 1200 aagttgttga tcaacgaagt ttccgctttc gaaccaaccg ttccagctcc aaacttgcca 1260 gttgctagag ttttgtggga agttaagcca aacttccaag atggtgttaa ggcttggttg 1320 gaaaacggtg gtggtcacca cactgttgtt tctttgttct tgaccaccga tcaaatgatt 1380 acctacgcta agttggtcga cttggaatac gttgttatca agtaa 1425 <210> 8 <211> 1701 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 8 atggctatcg ccattggttt ggatttcggt tccgattccg ttagagcttt ggctgttgat 60 tgtgctaccg gtgaagaaat tgctacctcc gttgaatggt atccaagatg gcaaaagggt 120 caattctgtg atgctccaaa caatcaattc agacaccacc caagagacta cattgaatcc 180 atggaagctg ctttgaaaac cgttttggct gaattgtccg ttgaacaaag agctgctgtt 240 gttggtattg gtgttgattc caccggttcc accccagctc caattgatgc tgatggtaac 300 gttttggctt tgagaccaga attcgctgaa aacccaaacg ctatgttcgt tttgtggaag 360 gatcacaccg ctgttgaaga agctgaagaa attaccagat tgtgtcacgc tccaggtaac 420 gttgattact ccagatatat tggtggtatc tactcctccg aatggttctg ggctaaaatc 480 ttgcacgtta ccagacaaga ttccgctgtt gctcaatccg ctgcttcctg gattgaattg 540 tgtgattggg ttccagcttt gttgtccggt actaccagac cacaagatat tagaagaggt 600 agatgttccg ctggtcacaa gtccttgtgg cacgaatcct ggggtggttt gccaccagct 660 tcattcttcg atgaattgga cccaattttg aacagacact tgccatcccc attgttcacc 720 gatacctgga ccgctgatat tccagttggt actttgtgtc cagaatgggc tcaaagattg 780 ggtttgccag aatccgttgt tatttccggt ggtgctttcg attgtcacat gggtgctgtt 840 ggtgctggtg ctcaaccaaa cgctttggtt aaggttattg gtacttccac ctgtgacatt 900 ttgattgctg ataagcaatc cgttggtgaa agagctgtta agggtatttg tggtcaagtt 960 gatggttccg ttgttccagg ttttattggt ttggaagctg gtcaatccgc tttcggtgat 1020 atctacgctt ggtttggtag agttttgggt tggccattgg aacaattggc tgctcaacac 1080 ccagaattga aaactcaaat caacgcttcc caaaagcaat tgttgccagc tttgaccgaa 1140 gcttgggcta agaacccatc cttggatcac ttgccagttg ttttggattg gttcaacggt 1200 agaagaaccc caaacgctaa tcaaagattg aagggtgtta tcaccgactt gaacttggct 1260 accgatgctc cattgttgtt cggtggtttg attgctgcta ctgctttcgg tgctagagct 1320 attatggaat gtttcaccga tcaaggtatc gctgtcaaca acgttatggc tttgggtggt 1380 attgccagaa agaatcaagt tatcatgcaa gcttgttgtg acgtcttgaa cagaccattg 1440 caaatcgttg cttccgatca atgttgtgct ttgggtgctg ctattttcgc tgctgttgct 1500 gctaaggttc acgctgacat tccatccgct caacaaaaga tggcttccgc tgttgaaaag 1560 accttgcaac catgttccga acaagctcaa agattcgaac aattgtatag aagataccaa 1620 caatgggcta tgtccgctga acaacactac ttgccaacct ccgctccagc tcaagctgct 1680 caagccgttg ctaccttgta a 1701 <210> 9 <211> 696 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 9 atgttggaag atttgaagag acaagtcttg gaagctaact tggctttgcc aaagcacaac 60 ttggttacct tgacctgggg taacgtttcc gctgttgata gagaaagagg tgttttcgtt 120 attaagccat ccggtgttga ttactccgtt atgaccgctg atgatatggt tgttgtttcc 180 attgaaaccg gtgaagttgt tgaaggtact aagaagccat cctccgatac cccaacccac 240 agattgttgt accaagcttt cccatccatt ggtggtatcg ttcacaccca ctccagacac 300 gctaccattt gggctcaagc tggtcaatcc attccagcta ccggtactac ccacgctgat 360 tacttctacg gtactattcc atgtaccaga aagatgaccg atgctgaaat caacggtgaa 420 tacgaatggg aaaccggtaa cgttatcgtt gaaaccttcg aaaagcaagg tattgatgct 480 gctcaaatgc caggtgtttt ggttcactcc cacggtccat tcgcttgggg taagaacgct 540 gaagatgctg ttcacaacgc tatcgttttg gaagaagttg cttacatggg tattttctgt 600 agacaattgg ctccacaatt gccagatatg caacaaacct tgttggataa gcactacttg 660 agaaagcacg gtgctaaggc ttactacggt caataa 696 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pXYL2 <400> 10 aatggtcttg ggtcacgaat cc 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for pXYL2 <400> 11 gctctgacca agtcgtaggc ttc 23

Claims (15)

  1. 아라비노스(arabinose) 대사경로 관련 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 캔디다 속(Candidia sp .) 균주에 도입하여 제조된 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨(xylitol) 생산균주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트는 하기 1) 내지 3)인 것을 특징으로 하는 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주.
    1)프로모터(promoter), L-아라비노스 아이소머라이즈(L-arabinose isomerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터(terminator)로 구성된 유전자 발현 카세트;
    2)프로모터, L-리브로키나아제(L-ribulokinase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트; 및
    3)프로모터, L-리부로스-5-포스페이트 4-에피머라이제(L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 캔디다 속 균주는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis) 및 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 캔디다 속 균주는 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)의 활성을 불활성화시킨 캔디다 트로필칼리스인 것을 특징으로 하는 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주.
  5. 제 1항에 있어서, 자일리톨 생산균주는 기탁번호: KCTC 11761bp로 기재되는 균주인 것을 특징으로 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 캔디다 트로피칼리스 균주는 기탁번호: KCTC 11137bp로 기재되는 균주인 것을 특징으로 하는 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주.
  7. 아라비노스 대사경로 관련 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 캔디다 속 균주에 도입하여 제조된 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨(xylitol) 생산균주 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트는 하기 1) 내지 3)의 유전자 발현 카세트를 캔디다 속 균주에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주 제조방법.
    1)프로모터(promoter), L-아라비노스 아이소머라이즈(L-arabinose isomerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터(terminator)로 구성된 유전자 발현 카세트를 제조하는 단계;
    2)프로모터, L-리브로키나아제(L-ribulokinase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트를 제조하는 단계; 및
    3)프로모터, L-리부로스-5-포스페이트 4-에피머라이제(L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트를 제조하는 단계.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 캔디다 속 균주는 캔디다 구일러몬디, 캔디다 파랍실로시스 또는 캔디다 트로피칼리스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주 제조방법.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 캔디다 속 균주는 자일리톨 탈수소효소의 활성을 불활성화시킨 캔디다 트로필칼리스인 것을 특징으로 하는 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주 제조방법.
  11. 제 7항에 있어서, 자일리톨 생산균주는 기탁번호: KCTC 11761bp로 기재되는 균주인 것을 특징으로 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주 제조방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 자일리톨 탈수소효소가 불활성화된 캔디다 트로피칼리스 균주는 기탁번호: KCTC 11137bp로 기재되는 균주인 것을 특징으로 하는 아라비톨 생성이 억제되는 자일리톨 생산균주 제조방법.
  13. 1) 제 1항의 자일리톨 생산 균주를 바이오매스 가수분해물 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;
    2) 배양된 균주로부터 자일리톨(xylitol)을 생산하는 단계; 및
    3) 배양액으로부터 자일리톨를 분리하는 단계를 포함하는, 자일리톨의 대량 생산방법.
  14. 제 13항에 있어서, 단계 1)의 바이오매스 가수분해물은 옥수수속대 가수분해물, 사탕수수속대 가수분해물, 코코넛 부산물, 및 자작나무의 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자일리톨의 대량 생산방법.
  15. 제 13항에 있어서, 단계 1)의 탄소원은 포도당, 글리세롤, 과당, 갈락토스, 설탕, 만노스, 말토스, 셀로바이오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자일리톨의 대량 생산방법.
KR1020100097335A 2010-10-06 2010-10-06 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법 KR101246780B1 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100097335A KR101246780B1 (ko) 2010-10-06 2010-10-06 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법
CA2810915A CA2810915C (en) 2010-10-06 2011-01-18 Xylitol-producing strain to which an arabinose metabolic pathway is introduced, and method for producing xylitol using same
PCT/KR2011/000346 WO2012046924A1 (ko) 2010-10-06 2011-01-18 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법
CN201180003995.1A CN102712894B (zh) 2010-10-06 2011-01-18 导入阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物及使用所述微生物生产木糖醇的方法
US13/391,073 US8343736B2 (en) 2010-10-06 2011-01-18 Xylitol producing microorganism introduced with arabinose metabolic pathway and production method of xylitol using the same
JP2012537831A JP5496356B2 (ja) 2010-10-06 2011-01-18 アラビノース代謝経路が導入されたキシリトール生産菌株及びそれを用いたキシリトール生産方法
EP11817200.6A EP2460871A4 (en) 2010-10-06 2011-01-18 XYLITOL-PRODUCTIVE MICRO-ORGANISMS IMPROVED IN THE ARABINOSIS MATERIAL CHANGING PATH AND PROCESS FOR THE PREPARATION OF XYLITOL THEREWITH

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100097335A KR101246780B1 (ko) 2010-10-06 2010-10-06 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120038030A true KR20120038030A (ko) 2012-04-23
KR101246780B1 KR101246780B1 (ko) 2013-03-26

Family

ID=45927899

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100097335A KR101246780B1 (ko) 2010-10-06 2010-10-06 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US8343736B2 (ko)
EP (1) EP2460871A4 (ko)
JP (1) JP5496356B2 (ko)
KR (1) KR101246780B1 (ko)
CN (1) CN102712894B (ko)
CA (1) CA2810915C (ko)
WO (1) WO2012046924A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180064053A (ko) * 2016-12-05 2018-06-14 한국과학기술원 엘-아라비노스 기반 엘-리불로스 및 엘-리보스의 제조 방법

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112018000690A2 (pt) 2015-07-13 2018-09-18 MARA Renewables Corporation micro-organismo recombinante, e, métodos para preparar um micro-organismo de metabolização de xilose e para produzir óleo.
CN105062908A (zh) * 2015-08-13 2015-11-18 江南大学 一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其应用
EP3416740B1 (en) 2016-02-19 2021-01-06 Intercontinental Great Brands LLC Processes to create multiple value streams from biomass sources
CA3047841A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Creatus Biosciences Inc. Xylitol producing metschnikowia species
FR3062134B1 (fr) * 2017-01-24 2023-07-21 Lesaffre & Cie Obtention de souches de levure performantes pour la metabolisation de l'arabinose
CN108866120A (zh) * 2017-05-10 2018-11-23 韩国科学技术院 基于l-阿拉伯糖的l-核糖的制作方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE184917T1 (de) * 1992-11-05 1999-10-15 Xyrofin Oy Rekombinante methode und wirt zur herstellung von xylitol
KR0124404B1 (ko) 1994-10-17 1997-12-01 홍건희 자동차용 타이어 가황기에 있어서의 그린타이어 이송장치
KR960030577A (ko) 1995-01-11 1996-08-17 이성희 안테나스위치
KR0169061B1 (ko) 1996-04-30 1999-01-15 정기련 배양조건 최적화를 통한 자일리톨의 제조방법
KR100209295B1 (ko) 1996-09-05 1999-07-15 손 경 식 사람 파필로마바이러스 16형 e6 단백질에 대한 인체의 면역성 조절기능을 가진 펩타이드
KR100259470B1 (ko) 1998-05-30 2000-06-15 유연우 칸디다 트로피칼리스를 이용한 자일리톨의 생산방법
KR20050079751A (ko) 2004-02-06 2005-08-11 한국델파이주식회사 자동차 열교환기용 헤더탱크 어셈블리
WO2005113774A2 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Biotechnology Research And Development Corporation Methods for production of xylitol in microorganisms
KR100730315B1 (ko) 2005-08-30 2007-06-19 한국과학기술원 자일리톨의 고수율 생산방법
WO2007143245A2 (en) * 2006-06-01 2007-12-13 Midwest Research Institute An l-arabinose fermenting yeast
US20100086965A1 (en) * 2006-10-02 2010-04-08 Van Maris Antonius Jeroen Adriaan Metabolic engineering of arabinose-fermenting yeast cells
US7977083B1 (en) * 2006-12-28 2011-07-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method for microbial production of xylitol from arabinose
US7745177B2 (en) 2007-02-22 2010-06-29 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Method for manufacturing xylitol with high-yield and high-productivity
CN101255448A (zh) * 2007-02-28 2008-09-03 韩国科学技术院 高产率和高产量制造木糖醇的方法
US7820414B2 (en) 2007-06-29 2010-10-26 Lpbio Co., Ltd. Xylitol dehydrogenase-inactivated and arabinose reductase-inhibited mutant of Candida tropicalis, method of producing high-yield of xylitol using the same, and xylitol produced thereby
KR20090013617A (ko) * 2007-08-02 2009-02-05 한국과학기술원 자일리톨 탈수소효소가 불활화되고 아라비노스 환원효소의 활성이 억제된 캔디다 트로피칼리스 변이주와 그것을 이용한 자일리톨 고수율 생산방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180064053A (ko) * 2016-12-05 2018-06-14 한국과학기술원 엘-아라비노스 기반 엘-리불로스 및 엘-리보스의 제조 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR101246780B1 (ko) 2013-03-26
JP2013502237A (ja) 2013-01-24
CN102712894B (zh) 2015-02-18
US20120171739A1 (en) 2012-07-05
JP5496356B2 (ja) 2014-05-21
EP2460871A9 (en) 2013-04-17
CA2810915A1 (en) 2012-04-12
US8343736B2 (en) 2013-01-01
CA2810915C (en) 2014-03-11
CN102712894A (zh) 2012-10-03
EP2460871A4 (en) 2013-08-07
WO2012046924A1 (ko) 2012-04-12
EP2460871A1 (en) 2012-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2957640B1 (en) Production of xylitol from glucose by a recombinant strain
KR101246780B1 (ko) 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법
CN110914435B (zh) 产依克多因酵母
US20220259622A1 (en) Construction method and recombinant yeast stain yarrowia lipolytica for xylitol synthesis
US7820414B2 (en) Xylitol dehydrogenase-inactivated and arabinose reductase-inhibited mutant of Candida tropicalis, method of producing high-yield of xylitol using the same, and xylitol produced thereby
US8962287B2 (en) Scyllo-inositol-producing cell and scyllo-inositol production method using said cells
WO2023168244A1 (en) Genetically modified yeast and fermentation processes for the production of 3-hydroxypropionate
US7745177B2 (en) Method for manufacturing xylitol with high-yield and high-productivity
KR101929158B1 (ko) 5&#39;-크산틸산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 5&#39;-크산틸산의 제조방법
KR101149001B1 (ko) 포도당을 보조기질로 이용할 수 있는 자일리톨 생산 균주 및 고생산성 발효 방법
KR101194752B1 (ko) 자일로스 환원효소의 항구적 발현을 이용한 고생산성 자일리톨 생산방법
KR101175418B1 (ko) 신규한 자일리톨 탈수소효소 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법
KR101894984B1 (ko) 환원력이 증가된 캔디다 속 변이 균주 및 이의 용도
KR100730315B1 (ko) 자일리톨의 고수율 생산방법
KR20090013617A (ko) 자일리톨 탈수소효소가 불활화되고 아라비노스 환원효소의 활성이 억제된 캔디다 트로피칼리스 변이주와 그것을 이용한 자일리톨 고수율 생산방법
KR101939398B1 (ko) 엘-아라비노스 기반 엘-리불로스 및 엘-리보스의 제조 방법
WO2023168233A1 (en) Genetically modified yeast and fermentation processes for the production of 3-hydroxypropionate
KR20230147948A (ko) 목질계 바이오매스 공정을 위한 형질전환된 비브리오속 dhg 균주
KR20110078548A (ko) 자일로스 환원효소의 항구적 발현을 이용한 고생산성 자일리톨 생산방법
KR101428799B1 (ko) 영양요구성 마커를 가지는 재조합용 산업 효모, 이를 이용하여 제조된 오탄당 및육탄당 발효가 가능한 재조합 효모, 및 이를 이용한 오탄당 및 육탄당으로부터 에탄올의 제조 방법
KR20180132585A (ko) 엘-아라비노스 기반 엘-리불로스 및 엘-리보스 제조 방법
AU2007203090A1 (en) Xylitol dehydrogenase-inactivated and arabinose reductase-inhibited mutant of Candida Tropicalis, method of producing high-yield of xylitol using the same, and xylitol produced thereby

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160225

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170224

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180226

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200302

Year of fee payment: 8

R401 Registration of restoration