CN101255448A - 高产率和高产量制造木糖醇的方法 - Google Patents
高产率和高产量制造木糖醇的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101255448A CN101255448A CNA2007100850576A CN200710085057A CN101255448A CN 101255448 A CN101255448 A CN 101255448A CN A2007100850576 A CNA2007100850576 A CN A2007100850576A CN 200710085057 A CN200710085057 A CN 200710085057A CN 101255448 A CN101255448 A CN 101255448A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- xylitol
- wood sugar
- substratum
- described manufacturing
- dehydrogenase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了通过利用产木糖醇微生物的木糖醇脱氢酶缺陷突变体，高产率和高产量制造木糖醇的方法。该目标通过阻断或灭活目的基因的表达，修饰产木糖醇微生物的代谢途径而得以实现，所述微生物优选天然的同化木糖的酵母和真菌。
Description
技术领域
本发明涉及高产率和高产量制造木糖醇的方法，更具体地，涉及利用产木糖醇微生物的木糖醇脱氢酶缺陷突变体高产率和高产量制造木糖醇的方法。
背景技术
木糖醇，一种五碳糖醇，在食品和糖果工业中用作天然甜味剂。它有抑制牙龋菌变形链球菌(Streptococcus mutans)生长的抗龋齿疗效(参见：
K.K.，J.Appl.Nutr.，44：16-28(1992))。其甜度与蔗糖相等，并且可以重量对重量的基准代替蔗糖。当溶解于水中时，木糖醇具有低粘度和负热效应，并且不需要胰岛素来调节代谢。由于这些优点，木糖醇在食品工业中的应用正在快速增长。
当前，通过化学还原主要从木材水解产物衍生的D-木糖来大规模生产木糖醇。D-木糖是在木质纤维素中发现的主要戊糖，并且是第二位最丰富的天然糖(参见：Ladisch，M.R..，et al.，Enzyme Microb.Technol.，5：82-102(1983))。传统的木糖醇生产方法包括四个步骤：植物材料的酸水解，纯化水解产物得到纯D-木糖，D-木糖氢化作用得到木糖醇以及和木糖醇的结晶化(参见：Aminoff，C.，et al.，In Counsell，J.N.(ed.).Xylitol.Applied Science Publishers，London，p.1-9(1978))。但是，纯D-木糖的纯化是高成本并造成污染的步骤(参见：Kind，V.B.，etal.，Gidroliz.Lesokhim.Promst.，3：11-12(1987))。另外，用Raney镍金属催化剂在高温高压下将D-木糖氢化为木糖醇很危险并引起污染(参见：
L.，et al.，In Advances in Food Research，Vol.28，edsChishester，C.O.，Mrak，E.M.和Stewart，G..，Academic Press，New York，pp.373-403(1982))。
现有的传统木糖醇生产方法的缺点，包括高污染水平和废物处理的顾虑，激发了研究者去开发其生产的替代途径。最具吸引力的方法之一是生物生产。生物生产不需要高纯度的底物D-木糖，并且是安全环保的方法。木糖醇由天然同化(assimilating)木糖的酵母和真菌，如管囊酵母(Pachysolen tannophiulus)、季也蒙氏假丝酵母(Candidaguilliermondii)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)和热带假丝酵母(Candida tropicalis)产生(参见：Dahiya，J.S.，Can.J.Microbiol.，37：14-18(1991)，Yahashi，Y.，et al.，J.Ferment.Bioeng.，81：148-152(1996)，Kim，S.Y.，et al.，Food Sci.Biotechnol.，7：282-285(1998)，Morimoto，S.，et al.，J.Ferment.Technol.，64：219-225(1986))。
虽然据报告假丝酵母(Candida sp.)是最具活性并因而可能是最有用的菌株，但是由于与底物D-木糖(木糖醇的低产率昂贵原料)有关的高生产成本，木糖醇的工业化生产尚待实现。为开发更低成本的生产方法所进行的努力包括采用对溶解氧的控制(参见：Kim，S.Y.等的美国专利5,686,277(1997))。但是，在工业化规模中将溶解氧控制在0.8-1.2％的水平并不容易，结果是，木糖醇产率低于70％，并且生产率不能实现经济效益。
为了解决这些问题，本领域一直存在对利用代谢工程构建高产率和高产量的产木糖醇的新型菌株的需要。
发明概述
本发明提供了利用产木糖醇微生物的木糖醇脱氢酶缺陷突变体，高产率和高产量地制造木糖醇的方法。该目的通过阻断或灭活目的基因的表达，修饰产木糖醇微生物的代谢途径来实现，所述微生物优选天然同化木糖的酵母和真菌。
因此，本发明的主要目的是通过利用木糖醇脱氢酶的表达被部分木糖醇脱氢酶基因的缺失、替换或添加所阻断的遗传修饰的微生物，提供高产率和高产量制造木糖醇的方法。
附图说明
本发明的上述和其他目的和特征从下文的描述结合附图将更为显而易见，其中：
图1是酵母中木糖代谢的示意图。
图2是pXYL2-Ura3的限制性酶切图谱。质粒pXYL2-Ura3用于阻断热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因。缩写：xy12，木糖醇脱氢酶基因；Ura3，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因。
图3是在2.5升发酵罐中，热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因阻断的突变体的木糖醇发酵分布图。甘油用作初始细胞生长和辅因子再生的共底物。符号：●，细胞干重；○，D-木糖；
，甘油；
，木糖醇。
图4是显示输氧速率(OTR)对木糖醇生产动力学的影响的分布图。虚线和实线分别指示D-木糖和木糖醇浓度。符号：，OTR，10mmolO21-1h-1(300rpm)；○，OTR，24mmol O21-1h-1(400rpm)；●，OTR，42mmol O2l-1h-1(500rpm)。
图5是热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因阻断的突变体在2.5升发酵罐中的补料(fed-batch)培养分布图。■，细胞干重；●，葡萄糖；○，D-木糖；
，甘油；
，木糖醇。
图6是热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因阻断的突变体在2.5升发酵罐中的补料培养分布图。■，细胞干重；●，葡萄糖；○，D-木糖；
，甘油；
，木糖醇。
发明详述
I.产木糖醇微生物的遗传修饰
本发明提供了制造木糖醇的方法，包括在含有木糖、碳源、氮源和微量元素的培养基中培养产木糖醇微生物的木糖醇脱氢酶缺陷突变体，直至培养基中所含的木糖被完全消耗的步骤，所述突变体的木糖醇脱氢酶的表达被部分木糖醇脱氢酶基因的缺失、替换或添加所阻断。产木糖醇微生物包括天然同化木糖的酵母和真菌，优选假丝酵母并更优选利用季也蒙氏假丝酵母(Candida guillermodi)、近平滑假丝酵母或热带假丝酵母。碳源、氮源和微量元素没有特别限制。在优选的实施方案中，甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、纤维二糖或这些材料的混合物被用作木糖醇生产的细胞生长和辅因子再生的碳源，酵母提取物用作氮源，磷酸二氢钾、七水硫酸镁或这些材料的混合物用作微量元素。另外，产木糖醇菌株的发酵条件不受特别限制。在优选的实施方案中，发酵温度的范围从20℃至40℃。
更具体的描述如下：
通常，在制造木糖醇的生物方法中，用同化木糖的酵母和真菌从木糖生产木糖醇。如图1所示，多数同化木糖的酵母经两个酶氧化还原反应，用木糖还原酶(EC1.1.1.21)和木糖醇脱氢酶(EC1.1.1.9)利用木糖(参见：Alexander，M.A.，et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，29：478-486(1988))。木糖还原酶催化D-木糖还原成木糖醇，木糖醇脱氢酶催化木糖醇氧化成D-木酮糖。D-木酮糖被木酮糖激酶转化为5-磷酸D-木酮糖，然后进入磷酸戊糖途径。木糖醇脱氢酶需要NAD作为辅因子，而木糖还原酶则利用NAD(P)H。因此，木糖同化作用的整体效率与木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的活性相关联。在利用木糖的酵母，具柄毕赤氏酵母(Pichia stipitis)中，木糖还原酶和木糖醇脱氢酶分别由XYL1和XYL2编码(参见：Amore，R.，et al.，Gene，109：89-97(1991)，
P.，et al.，Curr.Genet.，18：493-500(1990))。
由木糖制造木糖醇的主要的产率限制因素是木糖醇在细胞生长和维持中的消耗。因此，如果从木糖醇向D-木酮糖的代谢步骤通过使相应的酶，木糖醇脱氢酶的失活而阻断，并且如果补充细胞生长和辅因子再生的共底物，则木糖醇的产率应该达到理论上100％的水平。
为了分析木糖醇脱氢酶基因XYL2的DNA序列，利用基于具柄毕赤氏酵母中XYL2基因的序列设计的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)，从热带假丝酵母的基因组DNA扩增部分推测的XYL2基因。纯化扩增的DNA片段并插入pGEM-T Easy中。对部分XYL2基因进行测序，随后测定完整的核苷酸序列。利用XYL2基因的DNA序列，通过缺失、替换或添加，构建不能表达酶活性的修饰的木糖醇脱氢酶基因。然后，构建基因阻断的质粒pXYL2-Ura3。将用pXYL2-Ura3扩增的线性阻断DNA片段插入宿主菌株热带假丝酵母中，并选择其木糖醇脱氢酶基因被同源重组所灭活的突变体。
II.木糖醇的生产
在含有50ml木糖醇发酵培养基的250ml烧瓶中对遗传修饰的菌株的木糖醇的生产进行评估。木糖醇发酵培养基由D-木糖、葡萄糖、酵母提取物、磷酸二氢钾和七水硫酸镁组成。修饰的菌株以100％的产率将D-木糖转化为木糖醇。但是，并非培养基中的所有D-木糖都转化为木糖醇，表明被修饰的菌株消耗的所有D-木糖都被转化为木糖醇，木糖醇生产受到缺乏木糖还原酶所需的辅因子的限制，因为木糖醇不能被进一步代谢再生辅因子。
木糖醇生产期间，为了辅因子再生，需要另外的共底物碳源，因而筛选各种碳源用于木糖醇生产的效率。在含有50ml木糖醇发酵培养基和各种共底物的250ml烧瓶中进行木糖醇发酵。虽然细胞在含有葡萄糖作为共底物的培养基中生长最好，但是在用甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖和纤维二糖作为共底物时木糖醇的生产更有利。特别是，在甘油用作共底物时，培养基中的所有D-木糖都转化为木糖醇。
当热带假丝酵母的遗传修饰突变体用甘油作为共底物分批培养时，培养基中的D-木糖在大约48小时内被完全消耗，并产生产率98.3％和容积产率0.97gl-1h-1的木糖醇。但是，在补料培养的情况下，培养基中的D-木糖在大约14-15小时内被消耗，并产生产率为97-100％和容积产率为3.48gl-1h-1的木糖醇。结果是，这表明了补料培养生产木糖醇比分批培养更有效。
另一方面，在搅拌速度300-500rpm和输氧速率(OTR)10-42mmolO2l-1h-1的条件下，补料培养热带假丝酵母的突变体时，木糖醇产量在1.4-3.5g l-1h-1的范围内变动，木糖醇产率不变。特别是，在搅拌速度500rpm和输氧速率(OTR)42mmol O2l-1h-1的条件下，木糖醇的产量最大。但是，在搅拌速度300rpm和输氧速率(OTR)42mmol O2l-1h-1的条件下进行补料培养工作的情况下，木糖醇产量没有明显降低。结果是，可以得出结论，搅拌速度和输氧速率(OTR)影响甘油同化速率和随后的木糖醇生产速率。
为了低成本生产木糖醇，通过利用玉米芯的水解产物，补料培养热带假丝酵母的遗传修饰突变体，所述玉米芯水解产物是一种主要含有木糖成分的废料，能给出与利用纯D-木糖相似的木糖醇产率。因此，已发现玉米芯的水解产物代替D-木糖，能以低成本方式用作生产木糖醇的底物。
本发明通过下列实施例进一步进行说明，所述实施例不能用于限制本发明的范围。
实施例1：构建热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶缺陷突变体
用总DNA提取试剂盒制备热带假丝酵母的基因组DNA。部分XYL2基因经聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。所用引物的DNA序列如下所示：
引物XYL2-F：5’-aatggtcttgggtcacgaatcc-3’(SEQ ID NO：1)
引物XYL2-R：5’-gctctgaccaagtcgtaggcttc-3’(SEQ ID NO：2)
产生的片段用PCR产物纯化试剂盒提纯，然后插入pGEM-T Easy载体中(PROMEGA，USA)。然后，在克隆在pGEM-T Easy载体中的XYL2基因片段的两端，导入BamHI限制性酶的两个靶位点，形成的质粒称作pGEM-XYL2。用引物Ura3-F和Ura3-R，通过PCR利用热带假丝酵母的基因组DNA扩增1.2-kb的URA3基因。所用引物的DNA序列如下所示：
引物Ura3-F：5’-ggatccattctagatgatctggtttggattgttggag-3’(SEQ IDNO：3)
引物Ura3-R：5’-ggatccatctcgagtcatgagaactaaactagcag-3’(SEQ IDNO：4)
如图2所示，PCR扩增的URA3基因被插入到pGEM-XYL2中产生pGEM-Ura3。转化热带假丝酵母的线性DNA用PCR以引物XYL2-F和XYL2-R进行扩增。产生的DNA片段XYL2-URA3-XYL2用作阻断盒。热带假丝酵母用阻断盒转化，并在YNB板(6.7g l-1的无氨基酸酵母氮源，20g l-1葡萄糖和15g l-1琼脂)上选择。选择的转化株既在YNB板上又在含木糖作为唯一碳源的木糖板(6.7g l-1的无氨基酸酵母氮源，20g l-1D-木糖，和15g l-1琼脂)上孵育。选择可以在YNB上生长但不能在木糖板上生长的突变体，并以PCR证实所选突变体的遗传修饰。结果，突变体的木糖醇脱氢酶基因(称为“BS-xdh”)被成功阻断。
实施例2：用遗传修饰菌株生产木糖醇
将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3ml YM培养基(3g l-1酵母提取物，3g l-1麦芽提取物，5g l-1菌胨(bactopeptone)和20g l-1葡萄糖)的15ml试管中，并用震荡培养器以30℃和200rpm孵育12小时。将1ml所述种子培养物接种在含有50ml木糖醇生产培养基(50g l-1D-木糖醇，10g l-1葡萄糖，10g l-1酵母提取物，5g l-1磷酸二氢钾和0.2g l-1七水硫酸镁)的250ml烧瓶中，并用震荡培养器在30℃和200rpm孵育36小时。每隔6小时取样(样品1-7)。
分别分析样品1-7的干细胞浓度(每升培养基的细胞干重)以及D-木糖和木糖醇浓度。用分光光度计(Shimadzu，Japan)在600nm处由样品的光密度计算细胞干重。用高压液相色谱(HPLC，Waters，USA)分析D-木糖、木糖醇和各种共底物的浓度，条件是使用Sugar-Pak I柱(Waters)，水为流动相，柱温90℃，流速0.5ml min-1。结果示于表1。
表1
如表1所示，BS-xdh将12.5g l-1木糖转化为12.5g l-1木糖醇。木糖醇产率为100％。但是，24小时后，培养基中的D-木糖不再转化为木糖醇，木糖醇的生产停止。D-木糖向木糖醇的转换率仅为28％，该结果表明全部的D-木糖并没有被有效代谢，木糖醇生产受到木糖还原酶所需的辅因子缺乏的限制。
实施例3：筛选辅因子再生的共底物
将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3ml YM培养基(3g l-1酵母提取物，3g l-1麦芽提取物，5g l-1菌胨和20g l-1葡萄糖)的15ml试管中，并用震荡培养器以30℃和200rpm孵育12小时。将1ml所述种子培养物接种在含有50ml各种木糖醇生产培养基(50g l-1D-木糖，示于下表2的10g l-1的各种碳源，10g l-1酵母提取物，5g l-1磷酸二氢钾和0.2g l-1七水硫酸镁)的250ml烧瓶中，并用震荡培养器以30℃和200rpm孵育96小时。
发酵结束后，以前述方式测定产生的干细胞(A)、消耗的各种底物(B)、消耗的D-木糖(C)和产生的木糖醇(D)的浓度。从培养基中超过初始D-木糖浓度的消耗的D-木糖浓度计算D-木糖转化率(E)，从产生的超过消耗的D-木糖浓度的木糖醇浓度计算产率(F)。结果示于表2中。
表2
如表2所示，当甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖或纤维二糖用作共底物时，可以实现超过90％的木糖醇产率，并且这些共底物的转化率高于葡萄糖(28％)。特别是，当甘油是共底物时，更有助于木糖醇产生。甘油用作共底物时，产率和D-木糖的转化率分别为100％和90％。因而，甘油被选作木糖醇生产的最佳共底物。
实施例4：用甘油作共底物的木糖醇生产(I)
将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3ml YM培养基的15ml试管中，并用震荡培养器在30℃和200rpm孵育12小时。将1ml种子培养物接种在含有50ml木糖醇生产培养基(50g l-1D-木糖醇，10g l-1甘油，10g l-1酵母提取物，5g l-1磷酸二氢钾和0.2g l-1七水硫酸镁)的250ml烧瓶中，并用震荡培养器在30℃和200rpm孵育60小时。在0、6、12、18、24、36、48和60小时分别获取样品(样品11-18)。按照实施例2的描述分析干细胞浓度，D-木糖、甘油和木糖醇的浓度。结果示于表3中。
表3
如表3所示，48小时BS-xdh将47.4g l-1D-木糖转化为46.6g l-1木糖醇。培养基中所有D-木糖被成功转化为木糖醇。该结果表明，用甘油作为共底物，充分供应木糖还原酶所需的辅因子，D-木糖被有效转化并生成木糖醇。另外，木糖醇产量和产率分别为0.97g l-1h-1和98.3％。
实施例5：用甘油作共底物的木糖醇生产(II)
将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3mlYM培养基的15ml试管中，并用震荡培养器在30℃和200rpm孵育12小时。将1ml所述种子培养基接种在含有50ml YM培养基的250ml烧瓶中，并用震荡培养器在30℃和200rpm孵育12小时。
将50ml所述种子培养物在pH4.5和30℃下，接种在含有1L补充了20g l-1甘油的木糖醇生产培养基的2.5升发酵罐(KoBiotech，Korea)中。按照实施例2的描述分析细胞干重、D-木糖、甘油和木糖醇浓度。结果示于图3中。
图3是当甘油用作唯一碳源时，细胞干重、D-木糖、甘油和木糖醇浓度随时间改变的分布图。实心圆(●)指细胞干重，空心圆(○)指D-木糖浓度，实心倒三角(
)指甘油浓度，空心倒三角(
)指木糖醇浓度。
用于经木糖还原酶将D-木糖还原为木糖醇的辅因子通过甘油作为唯一碳源的同化作用再生。发酵在14小时时终止，木糖醇的终浓度为48.8g l-1。木糖醇产量和产率分别为3.48g l-1h-1和98％。
实施例6：输氧速率对木糖醇生产动力学的影响
将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3ml YM培养基的15ml试管中，并用震荡培养器在30℃和200rpm孵育12小时。将1ml所述种子培养物接种在含有50ml YM培养基的250ml烧瓶中，并用震荡培养器在30℃和200rpm孵育12小时。
将50ml所述种子培养物在pH4.5和30℃下接种在含有1L补充了20g l-1甘油的木糖醇生产培养基的2.5升发酵罐(KoBiotech，Korea)中。发酵试验在搅拌速度为300、400和500rpm，1.0vol.vol-1.min-1(vvm)通风条件下进行。300、400和500rpm的输氧速率(OTR)分别为10、24、42mmol O2l-1h-1。木糖醇和D-木糖的浓度变化采用实施例2所述的方法，在不同的OTR条件下，随时间推移进行分析(参见：图4)。虚线和实线指D-木糖和木糖醇的浓度，实心倒三角(
)指OTR，10mmol O2l-1h-1(300rpm)；空心圆(○)指OTR，24mmol O2l-1h-1(400rpm)；实心圆(●)指OTR，42mmol O2l-1h-1(500rpm)。
木糖醇的容积产率取决于搅拌速度和OTR，并且在1.4-3.5g.l-1.h-1的范围内变动，而木糖醇产率不取决于搅拌速度和OTR，并且在97％和100％的范围之间。在搅拌速度500rpm和OTR 42mmol O2l-1h-1时，容积产率最大，但是在搅拌速度300rpm和OTR 42mmol O2l-1h-1的补料培养条件下，并不降低很多。这表明搅拌速度和OTR影响甘油同化率和随后的木糖醇生产。当BS-xdh将D-木糖转化为木糖醇时，充分的氧气供应对于辅因子的快速再生是必需的，并导致高木糖醇产率。这表明BS-xdh的木糖醇产率受到OTR的显著影响。
之前的研究已发现，当溶解氧的水平控制在0.8％和1.2％之间时，用非代谢工程化的近平滑假丝酵母的木糖醇产率和容积产率最大(参见：Kim，S.Y.等美国专利5,686,277(1997))。但是，在工业规模上控制0.8-1.2％水平的溶解氧是不容易的，并且结果是，木糖醇产率低于70％并且产率不能实现经济效率。本实施例6显示的结果证实了代谢工程化的突变体BS-xdh以几乎是理论产率的97-100％产生木糖醇而与O2输送速率无关。这提示突变体的木糖醇产率产生自通过阻断木糖醇脱氢酶基因而阻断木糖代谢，而不是来自细胞胞质中的氧化还原失衡。另外，在限制氧气的条件下，细胞质中合成的用于氧化还原平衡的副产物如乙醇和甘油不会在培养基中蓄积，因为培养基中充分供应了氧气。
实施例7：用补料培养生产木糖醇(I)
含D-木糖作为主要成分的玉米芯的半纤维素水解产物是工业化制造木糖醇的有经济价值的原材料，因其作为木糖醇前体比纯D-木糖价廉得多。另外，在回收过程例如浓缩和结晶化中，高浓度的木糖醇也很重要。因而，为提高利用玉米芯的木糖醇终浓度，进行补料培养。
将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3ml YM培养基的15ml试管中，并用震荡培养器在30℃和200rpm孵育12小时。将1ml所述种子培养基接种在含有50ml YM培养基的250ml烧瓶中，并用震荡培养器在30℃和200rpm孵育12小时。
将50ml所述种子培养物接种在含有1L包括20g l-1甘油的木糖醇生产培养基的2.5升发酵罐(KoBiotech，Korea)中，并在pH4.5和30℃下培养。玉米芯水解产物用来制备木糖醇生产培养基(100g l-1D-木糖，7g l-1葡萄糖，13g l-1L-阿拉伯糖，30g l-1甘油，10g l-1酵母提取物，5gl-1磷酸二氢钾和0.2g l-1七水硫酸镁)。当D-木糖浓度降至10g l-1的水平时，加入200ml补料溶液(feeding solution)(500g l-1D-木糖，35gl-1葡萄糖，65g l-1L-阿拉伯糖，30g l-1甘油)。
如实施例2描述的方法，随时间推移分析细胞干重和葡萄糖、D-木糖、甘油和木糖醇的浓度(参见：图5)。实心方块(■)表示细胞干重，实心圆(●)表示葡萄糖浓度，空心圆(○)表示D-木糖浓度，实心倒三角(
)表示甘油浓度，空心倒三角(
)表示木糖醇浓度。如图5所见，81小时消耗的D-木糖的总量为167g l-1，从D-木糖得到的99％产率的木糖醇终浓度为165g l-1。
实施例8：用补料培养生产木糖醇(II)
将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3mlYM培养基的15ml试管中，并用震荡培养器在30℃和200rpm孵育12小时。将1ml所述种子培养物接种在含有50ml YM培养基的250ml烧瓶中，并用震荡培养器在30℃和200rpm孵育12小时。
将50ml所述种子培养物接种在2.5升发酵罐(KoBiotech，Korea)中，所述发酵罐含有1L包括20g.l-1甘油的木糖醇生产培养基，并在pH4.5和30℃下培养。玉米芯水解产物用来制备木糖醇生产培养基(50g l-1D-木糖，4g l-1葡萄糖，7g l-1L-阿拉伯糖，20g l-1甘油，10g l-1酵母提取物，5g l-1磷酸二氢钾和0.2g l-1七水硫酸镁)。当D-木糖浓度降至10g l-1的水平时，加入100ml补料溶液(500g l-1D-木糖，35g l-1葡萄糖，65g l-1L-阿拉伯糖，30g l-1甘油)。
由实施例2描述的方法，随时间推移而分析细胞干重和葡萄糖、D-木糖、甘油和木糖醇的浓度(参见：图6)。实心方块(■)表示细胞干重，实心圆(●)表示葡萄糖浓度，空心圆(○)表示D-木糖浓度，实心倒三角(
)表示甘油浓度，空心倒三角(
)表示木糖醇浓度。如图6所见，96小时消耗的D-木糖的总量为186g l-1，木糖醇终浓度和木糖醇产率分别为184g l-1和99％。
序列表
<110>韩国科学技术院
(Korean Advanced Institute of Science and Technology)
<120>高产率和高产量制造木糖醇的方法
(METHOD FOR MANUFACTURING XYLITOL WITH HIGH-YIELD AND
HIGH-PRODUCTIVITY)
<130>SPI070850-47
<160>4
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>1
aatggtcttg ggtcacgaat cc 22
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>2
gctctgacca agtcgtaggc ttc 23
<210>3
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>3
ggatccattc tagatgatct ggtttggatt gttggag 37
<210>4
<211>35
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>4
ggatccatct cgagtcatga gaactaaact agcag 35
Claims (9)
1. 一种制造木糖醇的方法，包括在含有木糖、碳源、氮源和微量元素的培养基中培养产木糖醇微生物的木糖醇脱氢酶缺陷突变体，直至培养基中所含的木糖被完全消耗的步骤，所述突变体的木糖醇脱氢酶的表达被部分木糖醇脱氢酶基因的缺失、替换或添加所阻断。
2. 权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中产木糖醇微生物是假丝酵母(Candida sp.)。
3. 权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中的假丝酵母是季也蒙氏假丝酵母(C.guillermondi)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)或热带假丝酵母(C.tropicalis)。
4. 权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中的碳源是甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、纤维二糖或其混合物。
5. 权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中的氮源是酵母提取物。
6. 权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中的微量元素是磷酸二氢钾、七水硫酸镁或其混合物。
7. 权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中的木糖醇脱氢酶缺陷突变体在20℃至40℃下培养。
8. 权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中在搅拌速度为300-500rpm，输氧速率(OTR)为10mmol O2 l-1 h-1至42mmol O2 l-1 h-1的条件下补料培养木糖醇脱氢酶缺陷突变体。
9. 权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中木糖以玉米芯水解产物的形式添加到培养基中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007100850576A CN101255448A (zh) | 2007-02-28 | 2007-02-28 | 高产率和高产量制造木糖醇的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007100850576A CN101255448A (zh) | 2007-02-28 | 2007-02-28 | 高产率和高产量制造木糖醇的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101255448A true CN101255448A (zh) | 2008-09-03 |
Family
ID=39890549
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2007100850576A Pending CN101255448A (zh) | 2007-02-28 | 2007-02-28 | 高产率和高产量制造木糖醇的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101255448A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101676399B (zh) * | 2008-09-17 | 2011-12-28 | 山东福田药业有限公司 | 生物转化玉米芯生产木糖醇的工艺方法 |
| CN102712894A (zh) * | 2010-10-06 | 2012-10-03 | 韩国科学技术院 | 导入阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物及使用所述微生物生产木糖醇的方法 |
| US10759727B2 (en) | 2016-02-19 | 2020-09-01 | Intercontinental Great Brands Llc | Processes to create multiple value streams from biomass sources |
-
2007
- 2007-02-28 CN CNA2007100850576A patent/CN101255448A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101676399B (zh) * | 2008-09-17 | 2011-12-28 | 山东福田药业有限公司 | 生物转化玉米芯生产木糖醇的工艺方法 |
| CN102712894A (zh) * | 2010-10-06 | 2012-10-03 | 韩国科学技术院 | 导入阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物及使用所述微生物生产木糖醇的方法 |
| CN102712894B (zh) * | 2010-10-06 | 2015-02-18 | 韩国科学技术院 | 导入阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物及使用所述微生物生产木糖醇的方法 |
| US10759727B2 (en) | 2016-02-19 | 2020-09-01 | Intercontinental Great Brands Llc | Processes to create multiple value streams from biomass sources |
| US11840500B2 (en) | 2016-02-19 | 2023-12-12 | Intercontinental Great Brands Llc | Processes to create multiple value streams from biomass sources |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Krishnan et al. | Fermentation kinetics of ethanol production from glucose and xylose by recombinant Saccharomyces 1400 (pLNH33) | |
| Wang et al. | Glycerol production by microbial fermentation: a review | |
| US8753837B2 (en) | Designer Oxyphotobacteria and greenhouse distillation for photobiological ethanol production from carbon dioxide and water | |
| Oh et al. | Increase of xylitol production rate by controlling redox potential in Candida parapsilosis | |
| Merli et al. | Acetic acid bioproduction: The technological innovation change | |
| JP2011522563A (ja) | 嫌気的微生物発酵によるブタンジオールの製造 | |
| CN102712894B (zh) | 导入阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物及使用所述微生物生产木糖醇的方法 | |
| TWI450963B (zh) | 具高木醣消耗率之分離酵母菌株及使用該菌株製造酒精之方法 | |
| US7745177B2 (en) | Method for manufacturing xylitol with high-yield and high-productivity | |
| CN101255448A (zh) | 高产率和高产量制造木糖醇的方法 | |
| CN101323838B (zh) | 一种重组酿酒酵母及其在生产木糖醇中的应用 | |
| CN102144029A (zh) | 表达醛糖-1-差向异构酶的微生物 | |
| US7820414B2 (en) | Xylitol dehydrogenase-inactivated and arabinose reductase-inhibited mutant of Candida tropicalis, method of producing high-yield of xylitol using the same, and xylitol produced thereby | |
| Winkelhausen et al. | Xylitol production from d‐xylose at different oxygen transfer coefficients in a batch bioreactor | |
| CN111304138B (zh) | 一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌及构建方法与应用 | |
| KR101599997B1 (ko) | 신규한 고온 효모 피키아 길리에르몬디 y-2 및 이의 용도 | |
| KR101576183B1 (ko) | 부산물을 이용한 에리스리톨 제조 방법, 에리스리톨 생산성이 우수한 모닐리엘라 폴리니스 변이 균주 및 이의 이용 | |
| US20080124767A1 (en) | Production and Secretion of Sucrose in Photosynthetic Prokaryotes (Cyanobacteria) | |
| Yeo et al. | Construction of genetically engineered Candida tropicalis for conversion of l-arabinose to l-ribulose | |
| KR100730315B1 (ko) | 자일리톨의 고수율 생산방법 | |
| KR20090013617A (ko) | 자일리톨 탈수소효소가 불활화되고 아라비노스 환원효소의 활성이 억제된 캔디다 트로피칼리스 변이주와 그것을 이용한 자일리톨 고수율 생산방법 | |
| KR101815004B1 (ko) | 혼합당을 이용할 수 있는 재조합 미생물 및 이를 이용한 바이오에탄올의 제조방법 | |
| Gloria et al. | Physiology of Ethanol Production by Yeasts | |
| JP3007615B1 (ja) | カンジダトロピカリスを用いたキシリトール製造のための発酵法 | |
| Chan | Optimization and scale-up production process of 2, 3-butadeniol from maltodextrin by metabolically engineered klebsiella oxytoca KMS005 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: (strain) BNR Enterprise Assignor: (strain) LPBIO Contract fulfillment period: 2008.1.7 to 2027.1.27 Contract record no.: 2008990000223 Denomination of invention: Method for producing xylitol with high yield and high yield Granted publication date: unauthorized License type: Exclusive license, sub license Record date: 20080730 Assignee: Qitaihe Hong Hong xylitol Co., Ltd. Assignor: (strain) BNR Enterprise Contract fulfillment period: 2008.4.2 to 2013.4.1 Contract record no.: 2008990000224 Denomination of invention: Method for producing xylitol with high yield and high yield Granted publication date: unauthorized License type: General permission Record date: 20080730 |
|
| LIC | Patent licence contract for exploitation submitted for record |
Free format text: EXCLUSIVE LICENCE; TIME LIMIT OF IMPLEMENTING CONTACT: 2008.1.7 TO 2027.1.27 Name of requester: (CORPORATION)BNR ENTERPRISE Effective date: 20080730 Free format text: COMMON LICENCE; TIME LIMIT OF IMPLEMENTING CONTACT: 2008.4.2 TO 2013.4.1 Name of requester: HONGCHEN XYLITOL CO., LTD., QITAIHE CITY Effective date: 20080730 |
|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20100129 Address after: Daejeon Metropolitan City, South Korea Applicant after: KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Address before: Daejeon Metropolitan City, South Korea Applicant before: KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Co-applicant before: LPBIO Co. |
|
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20080903 |