KR101175418B1

KR101175418B1 - 신규한 자일리톨 탈수소효소 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법

Info

Publication number: KR101175418B1
Application number: KR1020090116979A
Authority: KR
Inventors: 김일철; 고병삼; 김정회
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2012-08-20
Also published as: KR20110060400A

Abstract

본 발명은 신규한 자일리톨 탈수소효소 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NADP⁺)를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소, 상기 탈수소효소를 발현하도록 형질전환 된 미생물 및 이를 이용한 자일리톨 고수율 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 탈수소효소는 미생물의 자일로스 대사과정에서 생산되는 NADP⁺를 NADPH로 환원시켜 재사용할 수 있도록 하여 추가적인 보조기질의 첨가나 낮은 용존산소 농도의 유지가 없어도 높은 수율로 자일리톨을 생산할 수 있어 자일리톨 생산에 소요되는 비용을 획기적으로 절감할 수 있어 자일리톨 생산에 유용하게 사용할 수 있다.

자일리톨, NADP, 자일리톨 탈수소효소, 캔디다 트로피칼리스

Description

신규한 자일리톨 탈수소효소 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법{Novel xylitol dehydrogenase and method for producing xylitol using the same}

본 발명은 신규한 자일리톨 탈수소효소 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NADP⁺)를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소, 상기 탈수소효소를 발현하도록 형질전환 된 미생물 및 이를 이용한 자일리톨 고수율 생산방법에 관한 것이다.

자일리톨(xylitol)은 오탄당 당알코올로서 설탕과 같은 감미도를 갖고 있으면서 열량은 40% 낮아 설탕을 대체하는 기능성 감미료로 제과산업에 널리 이용되고 있다. 자일리톨은 여러 가지 과일 및 채소에 존재하지만 대체로 극미량으로만 존재하기 때문에 이들로부터 추출하는 것은 산업적으로 경제성이 없다. 그러므로 자일리톨은 옥수수속대, 사탕수수대와 같이 자일로스(xylose)가 많이 함유된 반섬유소(hemicellulose) 가수분해물을 환원시키는 화학적 방법으로 생산되고 있다. 그러나 화학적 방법은 자일로스를 아라비노스, 포도당과 같은 다른 오탄당 및 육탄당 구성물들로부터 분리 및 정제하기가 어렵고 비용이 많이 들며, 이 과정에서 자일로 스의 회수율이 50 ~ 60 % 정도로 낮다. 또한, 수소가스 및 금속촉매를 이용한 고온 고압의 공정이므로 위험성과 폐기물 문제가 존재하는 단점이 있다.

근래에는 이러한 단점을 보완하기 위한 생물학적인 방법에 의한 자일리톨 생산방법이 활발하게 연구되었다. 생물학적인 방법은 화학적인 방법에 비해 원료물질로서 상대적으로 낮은 순도의 자일로스를 이용할 수 있고, 공정자체가 상온 및 상압에서 이루어지므로 안전하며 친환경적인 청정공정이다. 그리하여 고생산성, 고수율의 자일리톨 생산을 위해 다양한 세균(bacteria)과 효모균주(yeast and fungi), 재조합 효모(recombinant yeast)를 통한 자일리톨 생산 연구가 진행되었다(Winkelhausen, E. et al., J. Ferment. Bioeng. 86:1-14, 1998; Granstrom, T. B. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 74:277-281, 2007). 그러나 세균과 재조합 효모균주는 자일로스를 이용하는 대사경로가 약하거나 효율이 좋지 못해 산업적인 자일리톨의 생산에 적합하지 않았다. 하지만 효모 균주 중 캔디다 속 (Candida sp) 균주들은 다른 미생물에 비해 자일리톨의 생산성과 수율이 높아 생물학적 자일리톨 생산에 적합한 균주로 알려져 있다.

지금까지 연구된 바에 의하면, 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis), 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis) 등의 캔디다 속 균주는 도 1에 나타난 바와 같이 세포외부에서 흡수된 자일로스를 자일로스 환원효소(xylose reductase)에 의해 자일리톨로 변환시키고, 이를 자일리톨 탈수소효 소(xylitol dehydrogenase)에 의해 자일룰로스(xylulose)로 전환시키며, 자일룰로스는 다시 자일룰로스 인산화효소(xylulokinase)에 의해 오인산 자일룰로스(xylulose-5-phosphate)로 전환되고, 이는 계속해서 오탄당 인산화 과정(pentose phosphate pathway)를 통해 세포성장과 유지에 이용되는 것으로 알려져 있다(참조: Laplace, J. M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36:158-162, 1991; Hahn-Hagerdal, B. et al., Enzyme Microb. Technol., 16:933-943, 1994). 즉, 자일리톨 생산 균주들은 자일로스를 탄소원으로 이용하여 세포 성장을 하는 것이다.

이때 자일로스 환원효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NADPH; Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)를 보조인자(cofactor)로 이용하고, 자일리톨 환원효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD⁺; Nicotinamide adenine dinucleotide)를 보조인자로 이용한다. 자일로스 환원효소에 의해 자일로스로부터 전환된 자일리톨은 다시 자일리톨 탈수소효소에 의해 자일룰로스로 전환되는데, 배지 내에 산소의 공급이 제한되어 용존산소의 농도가 0.5% 내지 2.0%로 낮게 유지되면 세포 내의 산화환원력 불균형(redox imbalance)이 유발되어 자일리톨 탈수소효소가 필요로 하는 보조인자(cofactor)인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD⁺)의 공급이 부족하게 되고, 자일리톨이 자일룰로스로 전환되는 과정이 억제된다. 그 결과로 자일리톨이 세포 및 배지에 축적되게 되어 50% 내지 60%의 수율로 자일로스로부터 자일리톨이 생산되는 것이다. 즉, 자일리톨 생산 균주를 이용 하여 자일리톨을 생산하는 종래의 기술에서는 산소공급을 제한(limited aeration)함으로써 낮은 용존산소 농도로 조절하는 것이 필수적이다. 그리하여 배지 내의 산소공급을 제한하여 용존산소농도를 낮게 유지시켜 세포 내의 산화환원력 불균형을 의도적으로 유발시킴으로써 자일리톨의 생산성과 수율을 높이는 연구가 활발히 이루어졌다 (참조: Kim, S. Y. et. al., J. Ferment. Bioeng., 83(3):267-270, 1997; 대한민국특허 제1996-030577호).

한국특허공보 제10-0169061호에 따르면 농축된 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis) 균주를 이용해 용존산소(dissolved oxygen)농도를 0.8 % 내지 1.2 %로 조절하여 자일리톨을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 하지만, 산업적 규모의 대용량 발효기를 이용하여 자일리톨을 생산할 경우 용존산소 농도를 위와 같이 낮게 조절하는 것은 사실상 불가능하며, 설사 조절할 수 있다 하더라도 제조수율이 50-60 % 정도에 불과하다. 또한, 한국특허등록공보 제10-0259470호에서, 1% 미만의 DOT(배지내 산소농도를 백분율로 나타낸 수치)로 배지 산소조건을 조절하기 위한 교반속도를 제시하고 있듯이 공정상의 번거로움이 존재한다. 그리고, 한국특허출원 제95-37516호에는 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis)의 자연종으로부터 유발시킨 돌연변이종을 이용한 자일리톨 생산방법에서 배지 내 산소분압의 조절에 의한 자일리톨 최적화에 관하여 개시된 바 있으며, 특허출원 제 95-13638호에는 상기 돌연변이주의 자일리톨의 생산을 위한 최적 배지 및 배양조건에 관하여 개시된 바 있으나 이러한 최적의 조건에서도 자일리톨 수율은 70 %를 넘지 못하였다.

이에, 본 발명자들은 캔디다 속 균주에서 생성된 자일리톨이 자일리톨 탈수소효소에 의해서 다시 자일룰로스로 전환되어 감소된다는 점에 착안하여, 자일리톨 탈수소효소의 활성을 완전히 불활성화시킨 캔디다 트로피칼리스 변이주를 개발하였다(한국특허등록공보 제 10-0730315호). 자일리톨을 자일룰로스로 전환시키는 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)의 작용억제를 위해 세포 내의 산화환원력 불균형을 유발시키기 위한 배지 내의 산소공급제한이 필요한데, 자일리톨 탈수소효소의 활성이 완전히 불활화된 변이주는 자일로스로부터 생산된 자일리톨이 더 이상 세포성장에 이용되지 못하게 하여 산화환원력 불균형 유발의 필요성이 없다. 이 방법으로 97% 내지 98%의 수율로 자일로스를 자일리톨로 생물전환 할 수 있다. 하지만, 자일리톨 탈수소효소가 불활성화된 변이주는 세포 성장 및 보조인자 니코틴아미드 아데딘 디뉴클레이티드 인산(NADPH)의 재생성을 위한 보조기질이 필요하다. 보조기질로는 글리세롤, 과정, 갈락토스와 같은 탄소원이 이용되는데, 그 중 가장 효율이 좋은 글리세롤을 보조기질로 이용할 경우 1 그램의 자일리톨을 생산하기 위해 0.3 그램 내지 0.4 그램의 글리세롤이 필요하다. 보조기질의 가격이 기질인 자일로스에 비해 낮다고 하더라도 이렇게 많은 양의 보조기질 첨가는 생산비용을 증가시킨다. 또한, 산업적 대용량 공정에서 보조기질 공급을 위해 별도의 장치가 필요하기 때문에 생산비용을 증가시킨다. 따라서, 낮은 용존산소 농도의 조절과 보조기질의 공급이 필요 없이 고수율로 자일리톨을 생산할 수 있는 새로운 생산균주를 개발해야 할 필요성이 있다.

본 발명자들은 보조기질의 공급 없이 자일리톨을 생산할 수 있는 방법에 대하여 연구하던 중 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD⁺; Nicotinamide adenine dinucleotide)를 보조인자(cofactor)로 사용하는 자일리톨 환원효소를 보조인자로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NADP⁺)을 사용하는 자일리톨 환원효소로 개량하는 경우 보조기질의 공급 없이 자일리톨의 생산이 가능하다는 것을 밝혀내고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 탈수소효소를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 탈수소효소를 발현하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 자일로스를 포함하는 배지에서 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 자일리톨 생산방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 탈수소효소를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 탈수소효소를 포함하는 미생물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 자일리톨 생산방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 제공한다.

본 발명의 자일리톨 탈수소효소는 363개의 아미노산으로 이루어진 단백질로서 NADP⁺를 보조인자로 사용하여 자일리톨을 자일룰로스로 변환시키는 반응을 촉매 한다.

일반적으로 야생형 자일리톨 탈수소효소는 NAD⁺를 보조인자(cofactor)로 하여 자일리톨을 자일룰로스로 변환하지만, 본 발명의 자일리톨 탈수소효소는 NADP⁺를 보조인자로 하여 자일리톨을 자일룰로스로 변환시킨다.

이러한 본 발명의 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소는 본 발명자들에 의해 최초로 만들어진 것이다. 본 발명의 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.

한편, 상기 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 NADP⁺를 보조인자로 사 용하여 자일리톨을 자일룰로스로 변환시키는 반응을 촉매하는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황 함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 자일리톨 탈수소효소의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP(Green Fluorescent Protein)와　같은　다른　단백질과　융합으로　만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.

본 발명의 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소는 이를 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의한 유전공학적 방법에 의해 제조할 수 있다.　예를 들면, 상기 본 발명의 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소는 본 발명의 단백질를 암호화하는 핵산 서열 또는 그의 단편을 상기 핵산 서열에 작동가능하게 연결되 어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, 생성된 형질전환체를 상기 핵산 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 실질적으로 순수한 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전공학적으로 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Maniatis et al., Molecula Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif. (1991); Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255, 12073-12080 (1980)).

한편 본 발명은 상기 자일리톨 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며 더욱 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 천연에서 분리되거나 당업계에 공지된 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

한편 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

상기 벡터는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있으며 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입시킨 후, 감염(infection), 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction) 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며 더욱 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

한편 본 발명은 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 발현하는 미생물을 제공한다.

본 발명의 미생물은 자일로스를 이용하는 대사경로를 가지는 미생물로 바람직하게는 캔디다 속 미생물일 수 있으며 더 바람직하게는 캔디다 트로피칼리스 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 자일리톨의 생산효율을 높게 하기 위하여 자일리톨 탈수소효소의 활성이 불활성화된 캔디다 트로피칼리스일 수 있으며, 가장 바람직하게는 캔디다 트로피칼리스 ARSdR-16(KCTC-11568BP)일 수 있다.

상기 미생물은 바람직하게는 본 발명의 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환하는 방법에 의해 제공될 수 있다.

상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)를 이용할 수 있다.

한편 본 발명은 자일로스를 포함하는 배지에서 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 발현하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 자일리톨 생산방법을 제공한다.

상기 미생물은 전술한 바와 같이 형질전환 방법에 의해 제작할 수 있다.

바람직하게는 상기 미생물은 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 발현하는, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 자일리톨 탈수소효소를 발현하는 캔디다 트로피칼리스 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 캔디다 트로피칼리스 ARSdR-16(KCTC-11568BP)일 수 있다.

본 발명의 자일리톨 생산방법은 NADPH 재생성을 위한 별도의 보조기질을 첨가할 필요가 없으며 세포내 산화환원력 불균형을 유발하기 위하여 용존산소의 농도를 낮게 유지할 필요가 없으므로 보다 저렴한 생산비용으로 자일리톨을 생산할 수 있으며 생산 효율 또한 높다.

본 발명의 일실시예에서는 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제작하였다. 캔디다 트로피칼리스의 유전체를 수득하여 부위특이적 돌연변이 기술을 이용하여 아미노산 서열이 바뀐 자일리톨 탈수소효소 변이 유전자를 수득하였다. 수득한 유전자를 플라스미드에 넣어 대장균에 도입하여 새로운 재조합 효소(ARSdR)를 대량 발현 시켰다. 보조인자를 NAD⁺와 NADP⁺로 하여 각각 효소의 활성을 계산하여 본 결과 야생형 효소는 NAD⁺가 보조인자로 첨가된 경우 활성이 높았으나 ARSdR은 NADP⁺가 보조인자로 사용된 경우 활성이 높은 것을 확인하였다(실시예 1 참조).

이에 본 발명의 자일리톨 탈수소효소는 NADP⁺를 보조인자로 하는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 발현하는 미생물(ARSdR-16)을 제작하였다. 상기에서 제작된 ARSdR 유전자 DNA를 자일리톨 탈수소효소 활성이 불활성화 된 캔디다 트로피칼리스 변이주(BS-xdh1)에 도입하였다. ARSdR 유전자가 도입된 캔디다 트로피칼리스(ARSdR-16)를 배양후 파쇄하여 효소를 수득하여 실시예 1에서와 같은 방법으로 보조인자를 달리하여 효소의 활성을 측정한 결과 ARSdR-16의 자일리톨 탈수소효소는 NADP⁺가 보조인자로 사용된 경우 효소활성이 월등히 높은 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

이에 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 ARSdR-16는 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 발현하는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 ARSdR-16 균주의 자일리톨 생산성을 확인하였다. 야생형 캔디다 트로피칼리스와 본 발명의 ARSdR-16 균주를 자일리톨 생산배지에서 배양하면서 시간에 따른 자일로스와 자일리톨의 양을 측정하였다. 그 결과 ARSdR-16 균주는 야생형에 비하여 자일리톨 생산수율은 약 21%, 생산성은 19% 향상되었음을 확인하였다.

본 발명의 자일리톨 생산방법은 글리세롤, 포도당 같은 보조기질을 배지에 첨가하거나 자일리톨 생산배지의 용존산소농도를 극히 낮게 유지해야 하는 종래의 필수공정이 필요 없으므로 생산비용을 낮출 수 있으며 고수율, 고생산성으로 자일리톨을 생산할 수 있다.

따라서, 본 발명은 NADP⁺를 보조인자로하는 자일리톨 탈수소효소를 제공한다. 본 발명의 탈수소효소는 미생물의 자일로스 대사과정에서 생산되는 NADP⁺를 NADPH로 환원시켜 재사용할 수 있도록 하여 추가적인 보조기질의 첨가나 낮은 용존산소 농도의 유지가 없어도 높은 수율로 자일리톨을 생산할 수 있어 자일리톨 생산에 소요되는 비용을 획기적으로 절감할 수 있어 자일리톨 생산에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

NADP ⁺ 를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소 제작

<1-1> 부위특이적 돌연변이기술(site-directed mutagenesis)을 이용한 자일리톨 탈수소효소 변이 유전자 제작

캔디다 트로피칼리스의 자일리톨 탈수소효소를 클로닝하기 위해 캔디다 트로피칼리스의 유전체 DNA와 하기의 프라이머쌍을 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)(94℃ 1분, 25회 반복(94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초) 및 72℃ 3분)을 수행하여 1,095bp의 유전자를 수득하였다.

PCR A;

2XDH-FNde1: 5'-cccatatgaccccaaacccatccttag-3' (서열번호 3)

XDH-ARSdR-R: 5'-aactttctgtcggatctggcaacaaccatgactctcttggcac-3' (서열번호 4)

PCR B;

XDH-ARSdR-F: 5'-ttgttgccagatccgacagaaagttgaagatggccggagac-3' (서열번호 5)

2XDH-REcoR2: 5'-atgaattctctggaccgtcaatcaaacatttg-3' (서열번호 6)

PCR A와 PCR B를 수행해 수득한 DNA를 기질로 이용하고 프라이머 2XDH-FNde1, 2XDH-REcoR2를 이용하여 PCR(94℃ 1분, 25회 반복(94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초) 및 72℃ 3분)을 수행하여 4개의 아미노산 서열이 바뀐 자일리톨 탈수소효소 변이 유전자를 수득하였다.

이 때 유전자의 아미노산 서열은 207번 위치의 아스파르트산 잔기를 알라닌으로, 208번 위치의 이소류신을 아르기닌으로, 209번 위치의 페닐알라닌을 세린으로, 그리고 211번 위치의 아스파라긴을 아르기닌으로 전환되었으며, 서열분석을 통 하여 이를 확인하였다.

<1-2> 자일리톨 탈수소효소 변이 유전자

상기 수득한 유전자를 ‘ARSdR'로 명명하고 단백질 과량발현 시스템으로 널리 이용되는 pET21b 플라스미드의 NdeI, BamHI 제한효소 위치 사이에 클로닝한 후 대장균(Escherichia coli) BL21 균주에 도입시키고 LB 배지를 이용해 37℃에서 24시간 배양시켜 새로운 재조합 효소를 과량 발현시켰다. 상기 배양된 세포를 파쇄시켜 얻은 효소액을 이용하여 효소의 활성을 측정하였다. 이 때 효소반응을 위한 버퍼로는 pH 9.5의 카보네이트 버퍼(carbonate buffer), 기질은 자일리톨, 보조인자는 NAD⁺ 또는 NADP⁺를 이용하였다. 분광흡광기를 이용하여 340nm에서의 흡광도의 변화도를 바탕으로 효소의 활성을 계산하였다. 야생형 효소와 ARSdR 효소의 보조인자 특이성은 표 1에 나타낸 바와 같다.

야생형 자일리톨 탈수소효소와 변이된 효소의 보조인자 특이성 분석

효소	효소 활성(U mg^-1)		NADP⁺/NAD⁺(%)	상대적 활성(%)
효소	NAD⁺	NADP⁺	NADP⁺/NAD⁺(%)
야생형	3.50±0.02	0.025±0.01	0.71±0.05	100.0±0.09
ARSdR	0.034±0.001	1.20±0.03	2.83±0.08	34.2±0.06

표 1에서 보는 바와 같이 새로운 자일리톨 탈수소효소 ARSdR은 야생형 효소에 비해 NAD⁺에 대한 활성은 103배 줄어들고, NADP⁺에 대한 활성은 48배 증가하였다. 또한 새로운 효소가 보조인자로 NADP⁺을 이용할 때의 활성이 NAD⁺를 이용할 때의 활성보다 35배 더 높았다.

야생형 캔디다 트로피칼리스의 자일리톨 탈수소효소는 NADP⁺를 보조인자로 이용할 경우의 효소활성이 NAD+를 보조인자로 이용할 경우의 0.71% 였는데, 변이된 효소 ARSdR는 그와는 반대로 NAD⁺를 보조인자로 이용할 경우의 효소활성이 NADP+를 보조인자로 이용할 경우의 2.83% 였다.

따라서 새로운 효소는 의도한 대로 보조인자의 특이성이 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD⁺)에서 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NADP⁺)으로 전환된 것임을 확인하였다.

<실시예 2>

NADP ⁺ 를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 발현하는 미생물(ARSdR-16) 제작

실시예 1에서 수득한 자일리톨 탈수소효소 변이주 ARSdR을 캔디다 트로피칼리스에서 발현시키기 위해 ARSdR 유전자와 하기의 프라이머쌍을 이용한 PCR(94℃ 1분, 25회 반복(94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초) 및 72℃ 3분)을 수행하여 1,095bp의 유전자를 수득하였다.

2XDH-F: 5'-atgaccccaaacccatccttag-3' (서열번호 7)

2XDH-R: 5'-ggaccgtcaatcaaacatttg-3' (서열번호 8)

상기 PCR로 수득한 ARSdR 유전자 DNA를 자일리톨 탈수소효소 활성이 불활성화된 캔디다 트로피칼리스 변이주 BS-xdh1(KCTC 11137bp) (한국특허등록공보 제 10-0730315호)에 도입시켰다. 유전자 도입은 리튬아세트산법에 의하여 이루어졌다. 0.1몰 리튬아세트산과 40% 폴리에틸렌글리콜, 5㎕ 캐리어 DNA, 50㎕의 PCR 산물 및 30㎕의 캔디다 트로피칼리스 BS-xdh1 배양액을 섞고 30℃에서 15분간 정치한 후 얼음에 1분간 정치하고 이를 ARSdR 유전자가 도입된 균주 선별용배지인 자일로스가 유일한 탄소원인 최소배지(효모 질소 (효모 질소 베이스(무 아미노산)) 6.7g/L, 자일로스 20g/L, 한천가루 15g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치배양하였다.

숙주 효모로 사용된 BS-xdh1 균주는 자일로스만 있는 배지에서는 성장하지 못하지만, 자일리톨 탈수소효소가 도입되어 발현된 균주는 자일로스가 포함된 고체배지에서 자랄 수 있으므로, 최소배지에서 성장한 균주를 선별하여 니코틴아미드 아데닌 인산 특이적인 자일리톨 탈수소효소가 발현된 캔디다 트로피칼리스를 수득하였고 이를 ARSdR-16이라 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2009년 9월 30일자로 기탁하였다 (기탁번호 KCTC-11568BP).

야생형 캔디다 트로피칼리스와 변이균주 ARSdR-16을 자일로스 배지(자일로스 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L)를 이용해 30℃에서 24시간 배양시켰다. 상기 배양된 세포를 파쇄시켜 얻은 효소액을 이용하여 효소의 활성을 측정하였다. 이 때 효소반응을 위한 버퍼로는 pH 9.5의 카보네이트 버퍼(carbonate buffer), 기질은 자일리톨, 보조인자는 NAD⁺ 또는 NADP⁺를 이용하였다. 분광흡광기를 이용하여 340nm에서의 흡광도의 변화도를 바탕으로 효소의 활성을 계산하였다. 두 가지 균주의 자일리톨 탈수소효소의 보조인자 특이성은 표 2에 나타낸 바와 같다.

야생형 캔디다 트로피칼리스와 ARSdR-16 변이주의 자일리톨 탈수소효소 보조인자 특이성 분석

균주	효소 활성 (U mg^-1)		NADP⁺/NAD⁺(%)
균주	NAD⁺	NADP⁺	NADP⁺/NAD⁺(%)
야생형	1.87±0.02	0.080±0.04	4.26±0.04
ARSdR-16	0.052±0.013	0.752±0.032	6.86±0.21

표 2에서 보는 바와 같이 야생형 캔디다 트로피칼리스의 세포 내 자일리톨 탈수소효소 활성은 NADP⁺를 보조인자로 이용할 경우가 NAD⁺를 보조인자로 이용할 경우의 4.26% 인 반면, 변이주 ARSdR-16의 세포 내 자일리톨 탈수소효소 활성은 그와는 반대로 NAD⁺를 보조인자로 이용할 경우가 NADP⁺를 보조인자로 이용할 경우의 6.86% 였다.

이 결과로 변이주 ARSdR-16이 니코틴아미드 아데닌 인산 특이적 자일리톨 탈수소효소가 성공적으로 발현된 균주임을 확인하였다.

<실시예 3>

ARSdR-16의 생산성 확인 시험

실시예 2에서 수득한 캔디다 트로피칼리스 변이주 ARSdR-16의 자일리톨 생산성을 확인하는 실험을 수행하였다. 야생형 캔디다 트로피칼리스와 변이주 ARSdR-16을 각각 YM배지(포도당 20g/L, 효모 추출물 3g/L, malt extract 3g/L, bacto-peptone 5g/L) 3㎖에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 진탕배양기에서 12시간 동안 배양하였다.

이어, 위 배양액 1㎖를, 자일리톨 생산배지(자일로스 50g/L, 포도당 10g/L, 효모 추출물 10g/L, 인산이수소칼륨(KH₂PO₄) 5g/L 및 황산마그네슘(MgSO₄7H₂O) 0.2g/L, pH 4.5) 50 ml가 든 삼각플라스크에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 교반(agitation)시키면서 60시간 동안 배양한 다음, 시간의 경과에 따른 자일로스와 자일리톨 농도의 변화를 측정하였다. 이 때 자일로스, 자일리톨의 농도를 측정한 방법은 다음과 같았다. 시료를 원심분리(centrifugation)하여 상등액(supernatant)을 HPLC(Shimazu, Japan) 시스템(Sugar-Pak I column(Waters, USA), refracive index detector(Waters, USA), 용매: 물, 유속: 0.5ml/min, column 온도: 90℃)으로 분석하여 자일로스, 자일리톨의 농도를 측정하였다. 시간에 따른 자일로스 감소와 자일리톨 생산 결과는 표 3 또는 도 2에 나타낸 바와 같다.

야생형 캔디다 트로피칼리스와 변이주 ARSdR-16의 자일리톨 생산 결과

시간(h)	야생형		ARSdR-16
시간(h)	자일로스 농도 (g/L)	자일리톨 농도 (g/L)	자일로스 농도 (g/L)	자일리톨 농도 (g/L)
0	50.0	0.0	50.0	0.0
12	48.3	1.3	48.6	1.7
24	36.4	5.9	38.8	7.9
36	21.1	16.7	27.5	19.5
48	12.5	22.4	14.1	29.3
60	0.0	30.9	0.0	37.4

표 3에서 나타나는 바와 같이, 자일로스 소모속도는 야생형 캔디다 트로피칼리스가 좀 더 빨랐지만 자일리톨 생산속도는 변이주 ARSdR-16이 더 빨랐다. 기질로 사용된 자일로스 50g/L 로부터 생산된 최종 자일리톨 생산농도는 야생형 캔디다 트로피칼리스의 경우 30.9g/L 이었고 변이주 ARSdR-16은 37.4g/L 였다. 자일리톨 생산수율은 야생형 캔디다 트로피칼리스의 경우 61.8% 였고 변이주 ARSdR-16은 74.8% 였다. 또한 자일리톨 생산성은 야생형 캔디다 트로피칼리스의 경우 0.52 g/L/h 였고 변이주 ARSdR-16은 0.62g/L/h 였다.

이로서 본 발명의 니코틴아미드 아데닌 인산 특이적 자일리톨 탈수소효소가 발현된 캔디다 트로피칼리스는 야생형 균주에 비해 자일리톨 생산수율은 약 21%, 생산성은 19% 향상되었음을 확인하였다.

이에 본 발명의 자일리톨 생산방법은 용존 산소농도를 낮게 유지하거나 글리세롤과 같은 보조기질을 추가하는 등의 단계가 없어도 고수율, 고생산성으로 자일리톨을 생산할 수 있음을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 NADP⁺를 보조인자로하는 자일리톨 탈수소효소를 제공한다. 본 발명의 탈수소효소는 미생물의 자일로스 대사과정에서 생산되는 NADP⁺를 NADPH로 환원시켜 재사용할 수 있도록 하여 추가적인 보조기질의 첨가나 낮은 용존산소 농도의 유지가 없어도 높은 수율로 자일리톨을 생산할 수 있어 자일리톨 생산에 소요되는 비용을 획기적으로 절감할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

도 1은 캔디다 트로피칼리스 야생형과 변이주 ARSdR-16의 자일로스 대사흐름도이다.

도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 의한 캔디다 트로피칼리스 야생형과 변이주 ARSdR-16에 의한 자일리톨 생산의 비교 그래프이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel xylitol dehydrogenase and method for producing xylitol using the same <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 363 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> xylitol dehydrogenase <400> 1 Met Thr Pro Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Val Asp Asp Ile Ser 1 5 10 15 Phe Glu Glu Tyr Glu Ala Pro Lys Leu Glu Ser Pro Arg Asp Val Ile 20 25 30 Val Glu Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His Tyr Tyr 35 40 45 Ala His Gly Ser Ile Gly Pro Phe Ile Leu Arg Lys Pro Met Val Leu 50 55 60 Gly His Glu Ser Ala Gly Val Val Ser Ala Val Gly Ser Glu Val Thr 65 70 75 80 Asn Leu Lys Val Gly Asp Arg Val Ala Ile Glu Pro Gly Val Pro Ser 85 90 95 Arg Phe Ser Asp Glu Thr Lys Ser Gly His Tyr His Leu Cys Pro His 100 105 110 Met Ser Phe Ala Ala Thr Pro Pro Val Asn Pro Asp Glu Glu Asn Pro 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Tyr Arg Val Pro Cys Asp Phe Leu Phe 130 135 140 Lys Leu Pro Asp His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Met Val Glu Pro 145 150 155 160 Leu Thr Val Gly Val His Gly Cys Lys Leu Ala Asp Leu Lys Phe Gly 165 170 175 Glu Asp Val Val Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu Thr Ala 180 185 190 Ala Val Ala Arg Thr Ile Gly Ala Lys Arg Val Met Val Val Ala Arg 195 200 205 Ser Asp Arg Lys Leu Lys Met Ala Gly Asp Met Gly Ala Ala Thr His 210 215 220 Thr Phe Asn Ser Lys Thr Glu Gly Asp Tyr Glu Ala Leu Ile Lys Lys 225 230 235 240 Phe Asp Gly Val Gln Pro Ala Val Val Leu Glu Cys Ser Gly Ala Gln 245 250 255 Pro Cys Ile Tyr Met Gly Val Lys Ile Leu Lys Ala Gly Gly Arg Phe 260 265 270 Val Gln Ile Gly Asn Ala Gly Gly Asp Val Asn Phe Pro Ile Ser Asp 275 280 285 Phe Ser Thr Arg Glu Leu Ser Leu His Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Tyr 290 295 300 Gly Asp Tyr Gln Thr Ser Ile Asp Ile Leu Asp Arg Asn Tyr Ala Asn 305 310 315 320 Gly Lys Asp Lys Ala Pro Ile Asp Phe Glu Leu Leu Ile Thr His Arg 325 330 335 Phe Lys Phe Lys Asp Ala Ile Lys Ala Tyr Asp Leu Val Arg Ala Gly 340 345 350 Asn Gly Ala Val Lys Cys Leu Ile Asp Gly Pro 355 360 <210> 2 <211> 1095 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> xylitol dehydrogenase <400> 2 atgaccccaa acccatcctt agtccttaac aaagtcgacg acatctcctt tgaagaatat 60 gaggctccta aactcgagtc cccaagggac gtcattgtcg aagtcaagaa gaccggtatc 120 tgtggttccg atattcacta ctacgcccac ggttccattg gtcctttcat cttgagaaag 180 ccaatggtct tgggccacga gtccgccggt gtcgtttctg ctgtcggcag tgaagtcacc 240 aacttgaaag ttggcgaccg cgtcgctatc gaaccaggtg tgccttccag attcagcgat 300 gagactaaat ccggccacta ccacttgtgc ccacacatgt cctttgctgc tactccacca 360 gtcaacccag acgaagaaaa cccacagggt accttgtgta agtactacag agtcccatgc 420 gactttttgt tcaagttgcc agaccacgtt tccttggaat tgggtgccat ggtcgagcca 480 ttgactgttg gtgtgcacgg atgcaagttg gctgatttga agttcggtga agacgttgtt 540 gttttcggtg ctggtccagt tggtttgttg accgctgccg ttgccagaac cattggtgcc 600 aagagagtca tggttgttgc cagatccgac agaaagttga agatggccgg agacatgggc 660 gctgctaccc acactttcaa ctccaagacc gaaggtgact acgaagcatt gatcaagaag 720 tttgatggtg tccagccagc cgttgttttg gaatgcagtg gtgctcagcc atgtatctac 780 atgggtgtca agatcttgaa ggctggtgga cgatttgtgc aaattggtaa cgctggcggt 840 gatgtcaact tcccaatttc cgacttctcc actagagaat tgtccttgca cggttctttc 900 agatacggtt atggcgacta ccagacttct attgatattt tggacagaaa ctacgccaac 960 ggcaaggaca aggctccaat tgactttgaa ttgttgatca cccacagatt caagttcaaa 1020 gatgccatca aggcttatga cttggttaga gcaggtaacg gtgccgtcaa atgtttgatt 1080 gacggtccag aatag 1095 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2XDH-FNde1: Primer for xylitol dehydrogenase <400> 3 cccatatgac cccaaaccca tccttag 27 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XDH-ARSdR-R: Reverse primer for xylitol dehydrogenase <400> 4 aactttctgt cggatctggc aacaaccatg actctcttgg cac 43 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XDH-ARSdR-F: Forward primer for xylitol dehydrogenase <400> 5 ttgttgccag atccgacaga aagttgaaga tggccggaga c 41 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2XDH-REcoR2: Primer for xylitol dehydrogenase <400> 6 atgaattctc tggaccgtca atcaaacatt tg 32 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2XDH-F: Forward primer for xylitol dehydrogenase <400> 7 atgaccccaa acccatcctt ag 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2XDH-R: Reverse primer for xylitol dehydrogenase <400> 8 ggaccgtcaa tcaaacattt g 21

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소.
제1항의 자일리톨 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
삭제
제1항의 자일리톨 탈수소효소를 발현하는 캔디다 트로피칼리스.
삭제
삭제
제5항에 있어서, 상기 캔디다 트로피칼리스는 캔디다 트로피칼리스 ARSdR-16(KCTC-11568BP)인 것을 특징으로 하는 미생물.
삭제
자일로스를 포함하는 배지에서 NADP⁺를 보조인자로 하는 자일리톨 탈수소효소를 발현하는 제5항 또는 제8항의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 자일리톨 생산방법.