KR101960450B1 - 당근 Hsp17.7 유전자를 포함하는 사카로미세스 속 미생물을 이용하여 산물을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

당근 Hsp17.7 유전자를 포함하는 사카로미세스 속 미생물을 배양하여 산물을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

당근 Hsp17.7 유전자를 포함하는 사카로미세스 속 미생물을 이용하여 산물을 생산하는 방법{Method of producing product using microorganism containing Daucus carota Hsp17.7 gene}

당근 Hsp17.7 유전자를 포함하는 사카로미세스 속 미생물을 배양하여 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

열 충격 단백질(Heat shock protein, 이하 'HSP'라 함)은 열과 무생물적 스트레스 하에서 발현되는 단백질이다. 그들은 그들의 분자량에 기초하여 5종의 다른 계열로 분류된다: HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, 및 작은 HSP(small HSP: sHSP) (12-42 kDa). sHSP는 식물에서 풍부하고 다양하게 존재한다. sHSP는 Drosophila melanogaster에서 4 종, 사람(Homo sapiens)에서 10 종, Caenorhabditis elegans에서 16 종, 및 Arabidopsis thaliana에서 19 종이 발견되었다. 이들은 식물들에서 무생물적 스트레스에 대해서 증가된 내성을 줄 수 있는 것으로 여겨진다.

대표적 산업 미생물인 효모는 다양한 재조합 단백질 생산에 이용되며, 이때 산물의 특징에 따라 알칼리 조건에서의 배양이 요구되는 경우가 있다. Muramatsu 등 (Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 108, No. 1, 52-55, 2009)의 보고에 의하면, 파르네솔은 화장품과 다양한 건강보조식품 (카로티노이드, 토코페롤, 및 코엔자임 Q10)의 원료이다. 효모의 경우 세포 배양액으로 파르네솔을 분비하여 파르네솔의 산업적 생산에 이용되는데, pH 7-8의 알칼리 조건에서 배지로 분비되는 파르네솔의 양이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, 알칼리 내성 균주가 유용하게 이용될 수 있을 것으로 예상된다.

Sheikh 등 (Biosci. Biotechnol. Biochem., 77(7), 1397-1402, 2013)의 연구에 의하면, 에탄올 발효를 위한 효소적 가수분해의 효율을 높이기 위하여, 셀룰로오스를 함유한 기질을 알칼리 전처리(alkaline pretreatment)를 실시하여 반응이 일어나는 내부의 표면적을 늘이고 중합을 낮추게 된다. 알칼리 환경에 내성을 지니는 효모 세포주는 알칼리 처리된 가수분해의 발효에 보다 유리할 것으로 기대된다.

Lu 등 (J.Basic Microbiol. 2014, 54, 378-385)의 연구에 의하면, 산업적 촉매로 매우 활발하게 이용되고 있는 알칼리 프로테아제(alkaline protease)의 생산을 위하여 알칼리에 내성을 지니는 미생물을 발굴하는 연구가 계속되고 있다. 재조합 단백질 생산에 활발히 이용되고 있는 효모의 알칼리 내성 세포주는 유용하게 이용될 수 있을 것으로 예상된다.

그러나, 당근 Hsp17.7 유전자가 도입된 사카로미세스 속 미생물, 및 상기 미생물이 알칼리에 내성을 갖는지에 대하여 전혀 개시된 바가 없다.

일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열과 85 % 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 유전적 변이를 포함하는 미생물을 염기성 pH를 갖는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 산물을 생산하는 방법으로서, 상기 미생물은 사카로미세스 속 미생물인 것인 방법을 제공한다.

본 명세서에 있어서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드가 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), BLASTP(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign^TM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다. 본 명세서에서 달리 언급이 없으면 상기 프로그램을 실행하는데 사용되는 파라미터의 선택은 아래와 같을 수 있다: Ktuple=2, Gap Penalty=4, 및 Gap length penalty=12.

일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열과 85 % 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 유전적 변이를 포함하는 미생물을 염기성 pH를 갖는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 산물을 생산하는 방법으로서, 상기 미생물은 사카로미세스 속 미생물인 것인 방법을 제공한다.

상기 폴리펩티드는 당근 (Daucus carota L.) 유래의 열충격 단백질 Hsp17.7 일 수 있다. 상기 유전적 변이는 상기 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 유전적 변이는 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. 상기 카피 수를 증가시키는 것은 외부로부터 상기 유전자를 도입하는 것일 수 있다. 상기 도입은 형질전환, 형질도입, 형질감염, 또는 전기천공이 포함될 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70 % 이상, 75 % 이상,80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 97 % 이상, 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.

상기 유전적 변이는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 상기 미생물의 게놈 중에 도입된 것일 수 있다. 상기 유전자는 상기 게놈과 상동 재조합에 의하여 도입된 것일 수 있다. 상기 유전자는 4번 염색체의 STB3 유전자와 SEC7 유전자 사이에 삽입된 것일 수 있다. 상기 유전적 변이는 TEF 프로모터, 당근 Hsp17.7 유전자, 및 TRP1 유전자가 작동 가능하게 연결된 DNA 구조체가 게놈 중에 도입된 것일 수 있다.

상기 사카로미세스 속 미생물은 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

상기 미생물은 상기 산물 생산 경로를 구성하는 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 배양하는 단계 전에, 상기 산물 생산 경로를 구성하는 효소를 코딩하는 유전자를 상기 미생물에 도입하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 산물은 알칼리 조건에서, 알칼리가 아닌 조건에 비하여 더 많이 생산되는 것, 더 안정한 것, 또는 배양 중 알칼리 배지를 사용할 필요가 있거나 알칼리 배지를 사용하는 것이 유리한 것일 수 있다. 상기 유리한 것은 기수적인 것뿐만 아니라 경제적 관점에서 유리한 것을 포함할 수 있다.

상기 산물은 알코올, 아미노산, 또는 단백질일 수 있다. 상기 알코올은 C1-C20 알코올, 예를 들면, C1-C15 알코올, C1-C10 알코올, 또는 C1-C6 알코올일 수 있다. 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 1,4-부탄디올, 펜탄올, 헥산올, 또는 파르네솔일 수 있다. 파르네솔은 비환 세스퀴테르펜 알코홀(acyclic sesquiterpene alcohol)인 15-탄소 유기 화합물이다. 상기 아미노산은 리신, 트레오닌, 아르기닌, 또는 트립토판일 수 있다. 상기 단백질은 항체, 효소, 또는 호르몬일 수 있다. 상기 산물은 알코올, 또는 알칼리 프로테아제(alkaline protease)인 것일 수 있다. 상기 배지는 셀룰로오스의 알칼리 가수 분해물을 포함하는 것일 수 있다.

상기 미생물은 산물 생산 경로를 구성하는 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 산물이 알코올인 경우, 상기 유전자는 효소코드(EC) 1.1.1.1에 속하는 효소를 코딩하는 것일 수 있다. 상기 유전자는 알코올 데히드로게나제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자일 수 있다. 산물이 파르네솔인 경우, 상기 유전자는 파르네솔을 생합성하는 데 필요한 효소를 코딩하는 것일 수 있다. 산물이 알칼리 프로테아제인 경우, 상기 유전자는 알칼리 프로테아제를 코딩하는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 산물을 생산하는 것은 특정 산물을 형성하는 것이면 어느 것이나 포함된다. 따라서, 상기 생산은 상기 미생물에 의하여 특정 물질을 생물 전환되어 얻어질 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 생물 전환은 환경에 독성인 물질을 다른 물질로 변환하는 것을 포함한다.

상기 방법에 있어서, 상기 염기성 pH는 7.0 초과, 7.1 이상, 7.2 이상, 7.3 이상, 7.4 이상, 7.5 이상, 7.6 이상, 7.7 이상, 7.8 이상, 7.9 이상, 8.0 이상, 8.1 이상, 8.2 이상, 8.3 이상, 8.4 이상, 8.5 이상, 7.0 초과 10.0 이하, 7.5 내지 10.0, 7.5 내지 9.5, 7.5 내지 9.0, 또는 7.5 내지 8.5일 수 있다.

상기 염기성 pH는 배양의 전 기간, 배양의 10 % 이상, 20 % 이상, 30 % 이상, 40 % 이상, 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상의 기간 동안 유지되는 것일 수 있다. 상기 염기성 pH는 산물 생산기(production stage) 동안 유지되는 것일 수 있다.

또한, 상기 미생물은 상기 산물을 분해하거나 그 농도를 감소시키는 경로를 구성하는 효소 또는 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화 또는 감쇄된 것일 수 있다.

상기 배양하는 단계는 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는, 당원으로서 예를 들면, 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프락토오스, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있다. 상기 배지는 질소원으로서 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있다. 상기 배지는 인원으로서 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 포함할 수 있다. 상기 배지는 예를 들면, 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양에서 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질 또는 적절한 전구체가 배양물에 첨가될 수 있다. 상기 물질은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식으로 예를 들면, 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 상기 배양은 호기 조건에서 수행하는 것일 수 있다.

상기 방법은, 얻어진 배양물로부터 산물을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리는 산물에 따라 다를 수 있다. 예를 들면, 상기 산물이 알코올인 경우, 증류를 수행하는 것이 포함될 수 있다. 예를 들면, 상기 산물이 단백질인 경우, 배양액을 원심분리, 또는 여과하여 세포를 분리하고, 세포 파쇄, 침전, 투석, 이온 또는 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 배양은 호기 배양으로서 상기 배지는 글루코스를 탄소원으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 호기 배양은 대기와 접촉시키는 상태에서 배양하거나, 또는 배지 중에서 공기와 같은 산소 함유 기체를 불어넣어는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 호기 배양은 배양물을 교반하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 호기 배양에서 산소 농도는 공기 중 포화 농도의 50% 이상, 예를 들면, 50% 내지 100%, 50% 내지 150%, 또는 100% 내지 200%를 포함하는 것일 수 있다. 상기 배지 중 글루코스는 1 내지 20 (w/v)%, 1 내지 15 (w/v)%, 1 내지 10 (w/v)%, 5 내지 20 (w/v)%, 5 내지 15 (w/v)%, 5 내지 10 (w/v)%, 또는 3 내지 10 (w/v)%일 수 있다.

도 1은 pH 8에서 배양된 형질도입된 효모 세포의 생장을 나타낸 도면이다.
도 2는 pH 8에서 25 시간 동안 배양된 형질도입된 효모 세포의 배양물을 찍은 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : 게놈에 당근 Hsp17 .7 유전자가 도입된 형질전환 효모 세포의 제작

사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 세포의 게놈에 당근 Hsp17.7 유전자(이하 'DcHsp17.7'라 함)를 도입하여, 형질전환 세포를 제작하였다. 구체적 과정은 다음과 같다.

1. DNA 구조체 생성

Saccharomyces cerevisiae (S288C)에 당근 Hsp17.7 유전자를 삽입하고 발현시키기 위하여, DNA 구조체를 설계하였다. 상기 DNA 구조체는 번역 연장 인자 유전자 프로모터(translational elongation factor gene promoter)(TEF)(NCBI accession no.: NC_001148.4)(서열번호 3)-당근 Hsp17.7 유전자(NCBI accession no.: X53851: 서열번호 2)-포스포리보실 안트라닐레이트 이소머라제 유전자(phosphoribosyl-anthranilate isomerase gene)(TRP1)(NCBI accession no.: V01341.1)(서열번호 4)가 순서대로 연결된 것으로서 양 말단에는 삽입 부위의 서열이 인접하여 있다(flanked). TRP1 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는다. TRP1 유전자는 영양성분 요구성 마커(auxotrophic marker), 즉 성장시 트립토판을 요구하는 마커로서 형질도입된 세포(transgenic cell)을 선택할 수 있도록 한다. S288C 균주에서 Trp 유전자는 불활성화되어 있으며, 상기 균주는 트립토판을 만들지 못하며 배지에 반드시 트립토판을 넣어주어야 생존가능하다. 상동 재조합으로 하기 TEF-Hsp17.7-Trp1이 성공적으로 삽입된 세포는 트립토판을 만들 수 있어서 트립토판이 없는 배지에 도말하여 세포를 선발하게 된다. 상기 삽입 부위는 4번 염색체의 STB3 유전자와 SEC7 유전자 사이이다. STB3 유전자(NCBI accession number: NM_001180476)는 리보솜 RNA 가공 요소-결합 단백질(ribosomal RNA processing element-binding protein)을 코딩하고, SEC7 유전자(NCBI accession number: NM_001180477)는 ADP-리보실화 인자에 대한 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(guanine nucleotide exchange factor for ADP ribosylation factors)를 코딩한다.

상기 구조체는 TEF 유전자는 pTEF-MF 벡터(Dualsystems Biotech AG, Schlieren, Switzerland)를 주형으로 하여 PCR에 의하여 증폭되었다. 당근 Hsp17.7 유전자는 2 내지 3 개월 된 당근 (Daucus carota L. Mussangochon) 잎 조직으로부터 G-spinGenomic DNA Extraction Kit(Intron, 한국)를 사용하여 추출된, 당근 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의하여 증폭되었다. TRP1 유전자는 pBS1479 벡터(Euroscarf, Frankfurt, Germany)를 주형으로 한 PCR에 의하여 증폭되었다. PCR은 모두 98 ℃ 30 초 동안 1회, 98 ℃에서 10 초, 60 ℃에서 30 초, 및 72 ℃에서 1 분을 35 회, 및 4 ℃에서 10 분 동안 수행되었고, 사용되는 프라이머는 아래 표와 같다. 이들 프라이머들은 각각 서로 겹치는 서열을 갖거나 삽입 부위 서열을 갖고 있다.

표적	명칭	서열번호
TEF 유전자	포워드	6
	리버스	7
당근 Hsp17.7 유전자	포워드	8
	리버스	9
TRP1 유전자	포워드	10
	리버스	11

증폭된 3개 단편 즉, TEF 유전자, 당근 Hsp17.7 유전자, 및 TRP1 유전자는 프라이머 및 어닐링 단계 없이 2 단계 PCR(98 ℃ 30 초 동안 1회, 98 ℃에서 10 초, 및 72 ℃에서 1 분을 35 회, 및 4 ℃에서 5 분 동안)에 의하여 연결되었다.

2. 효모에서 상동 재조합

1절에서 만들어진 TEF promoter-DcHsp17.7 유전자-TRP1 유전자의 DNA 구조체를 LiAc/SS-Carrier DNA/PEG Transformation (Gietz and Schies, Nat Protoc 2:31-34, 1995) 프로토콜에 따라 S. cerevisiae (S288C) 게놈에 상동 재조합에 의하여 삽입시켰다. trp1이 돌연변이 된 S. cerevisiae를 YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 25 ml에서 O.D600에서 0.6까지 배양한 후, 4 ℃ 3,000 ×g로 5 분간 원심 분리하였다. 원심 분리된 세포 펠렛은 멸균 증류수로 세척한 후 다시 4 ℃ 3,000 ×g로 5 분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 100 mM Lithium acetate (Junsei, Tokyo, Japan; CH3COOLi·2H2O; LiAc)을 1 ml 넣고 세포 펠렛을 현탁시키고 에펜도르프 튜브(e-tube)로 옮겼다. 15초 간 원심분리한 후, 상층액을 버리고 다시 200 ㎕의 100 mM LiAc를 넣고 펠렛을 현탁시켰다. 그 결과, 세포는 능력화 세포(competent cell)로 된다. 이 능력화 세포를 포함하는 상기 세포 현탁물 50 ㎕씩에 240 ㎕의 50% PEG (Sigma)와 1.0 M LiAc 36 ㎕, 5 ㎕의 ssDNA (salmon sperm carrier DNA; 10 mg/ml; Invitrogen, Carlsbad, USA), 및 1 ㎍의 상기 DNA 구조체를 넣어준 후 보르텍싱(vortexing)으로 잘 섞어주었다. 30 ℃에서 225 rpm으로 30 분간 배양한 후, DNA 구조체를 세포 내로 도입하기 위하여, 세포에 42 ℃에서 20 분 동안 열 충격을 주었다. 그런 다음 5,900 ×g로 15초 동안 원심분리한 후 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 세포 펠렛을 0.5 ml의 멸균 증류수 중에서 재현탁시키고 200 ㎕를 trp을 포함하지 않은 YPD 아가 플레이트에 도말하여 30 ℃에서 2-3 일 동안 배양하였다.

3. 당근 Hsp17 .7의 이종 발현

Hsp17.7 유전자의 게놈 삽입을 확인하기 위해, 효모 세포주를 밤새 배양하고 YPD 배지로 1:10^-3 희석하고, OD600이 0.6에 도달할 때까지 흔들면서 (225 rpm) 30 ℃에서 계속 배양하였다. 변형되지 않은 균주 S288C (야생형)를 대조군으로 사용하였다. 전체-세포(whole-cell) PCR은 세포주에 대해 Hsp17.7 유전자 특이적 프라이머 세트, TEF-Hsp17.7_F 및 TRP1-Hsp17.7_R (표 1)를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음).

상기 형질 전환 효모 세포주에서 Hsp17.7 단백질 축적을 면역 블롯 분석(immunoblot analysis)을 사용하여 확인하였다. 단백질을 추출하기 위하여, OD600 = 0.6의 효모 세포 배양물을 상기한 바와 같이 얻었고, 이 세포 배양물 25 ml를 4 ℃에서 5 분 동안 3000 x gn에서 원심분리하였다. 다음으로, 세포 펠렛을 멸균된 물로 세척하고, 원심 분리하고, 용해 완충액 (25 mM 트리스-HCl pH 6.8, 300 mM NaCl, 25 mM β-메르캅탄, 0.5 mM 페닐메틸술포닐 플루오리드 및 0.5 mM 벤즈아미딘)에 녹이고, 유리 구슬과 함께 보르텍스하였다 (45 초 보르텍싱 및 얼음 상 30 초의 10 회 반복).

15,700 x gn, 4 ℃에서 5 분간 원심 분리한 후, 상층액 중의 단백질 농도는Bradford assay에 의하여 측정되었다. 시료 당 동일한 양의 단백질 (40 μg)을 SDS-PAGE 겔 (17 %) 상에서 분리하고(resolved) 폴리비닐리덴 디플루오리드 (PVDF) 막에 전기 블로팅(electroblotted)(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)하였다. 면역 블롯 분석은 당근 Hsp17.7에 대하여 생성된 폴리클로날 항체를 사용하여 ECL Plus Wetern Blotting Detection Reagents (GE Healthcare)의 프로토콜에 따라 수행하였다.

그 결과, 상기 형질도입된 효모 세포에서 500 bp 크기의 당근 Hsp17.7 유전자에 해당하는 PCR 산물이 증폭된 반면, 야생형에서는 증폭되지 않았다. 또한, 면역 블록 분석에서, 상기 형질도입된 효모 세포에서 당근 Hsp17.7 단백질이 축적되었다. 이는 상기 형질도입된 효모 세포가 당근 Hsp17.7을 지속적으로 축적한다는 것을 나타낸다.

4. 당근 Hsp17 .7 유전자가 도입된 효모 세포의 염기성 환경에서의 성장

당근 Hsp17.7 유전자로 상기 형질도입된 효모 세포를 염기성 배지 중에서 배양하여 세포 생장 및 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

구체적으로, 야생형 S288C 균주, 대조군으로서 이 균주에 연어 정자 담체 DNA(salmon sperm carrier DNA)만이 형질도입된 S288C 균주, 및 상기 형질도입된 효모 세포를 YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 25 ml에서 30 ℃에서 O.D600에서 0.6까지 배양한 후, YPD 배지로 1:10^-3 희석하고 NaOH를 첨가하여 배지의 pH를 8.0으로 맞추고 흔들면서 (225 rpm) 30 ℃에서 계속 배양하였다. 이때 한 시간 간격으로 OD600을 측정하였다.

또한, 콜로니 형성 단위(colony forming unit: CFU)를 측정하기 위하여, 배양물의 OD600이 0.6이 되었을 때, YPD 배지로 1:10^-4 희석하여 얻어진 100 μl의 희석된 배양물을 pH 8.0의 YPD 아가 배지가 깔려 있는 플레이트에 도말하였다. 다음으로, 30 ℃에서 1-2일 정도 배양한 후 CFU를 측정하였다.

도 1은 pH 8에서 배양된 형질도입된 효모 세포의 생장을 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 형질도입된 효모 세포는 야생형 및 대조군에 비하여 현저하게 높은 세포 농도를 보였다.

표 2는 pH 8에서 세포 생존율을 나타낸 것이다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 형질도입된 효모 세포는 야생형 및 대조군 균주에 비하여 현저하게 높은 생존율을 보였다.

균주	CFU(야생형 균주를 pH에서 배양한 CFU 대비 %)
야생형	70.9
대조군	75.0
형질도입된 효모 세포	114.1

도 2는 pH 8에서 25 시간 동안 배양된 형질도입된 효모 세포의 배양물을 찍은 사진이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 야생형 균주에 비하여 상기 형질도입된 효모 세포의 배양물이 현저하게 탁하여 생장이 높음을 알 수 있다.

상기한 바와 같이, 상기 형질도입된 효모 세포는 염기성 pH 조건에서 야생형 균주에 비하여 높은 생장률을 보일 수 있고, 염기성 pH에서 야생형 균주에 비하여 높은 생존율을 갖는다. 따라서, 상기 형질도입된 효모 세포는 알칼리 조건에서 배양하여 산물을 생산하거나 물질을 전환시키는데 사용될 수 있다.

<110> Sangmyung University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method of producing product using microorganism containing Daucus carota Hsp17.7 gene <130> PN119077KR <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> Daucus carota L. <400> 1 Met Ser Ile Ile Pro Ser Phe Phe Gly Gly Arg Arg Ser Asn Val Phe 1 5 10 15 Asp Pro Phe Ser Leu Asp Val Trp Asp Pro Phe Lys Asp Phe Pro Leu 20 25 30 Val Thr Ser Ser Ala Ser Glu Phe Gly Lys Glu Thr Ala Ala Phe Val 35 40 45 Asn Thr His Ile Asp Trp Lys Glu Thr Pro Gln Ala His Val Phe Lys 50 55 60 Ala Asp Leu Pro Gly Leu Lys Lys Glu Glu Val Lys Val Glu Leu Glu 65 70 75 80 Glu Gly Lys Val Leu Gln Ile Ser Gly Glu Arg Asn Lys Glu Lys Glu 85 90 95 Glu Lys Asn Asp Lys Trp His Arg Val Glu Arg Ser Ser Gly Lys Phe 100 105 110 Leu Arg Arg Phe Arg Leu Pro Glu Asn Ala Lys Val Asp Glu Val Lys 115 120 125 Ala Ala Met Glu Asn Gly Val Leu Thr Val Thr Val Pro Lys Val Glu 130 135 140 Ile Lys Lys Pro Glu Val Lys Ala Ile Asp Ile Ser Gly 145 150 155 <210> 2 <211> 474 <212> DNA <213> Daucus carota <400> 2 atgtcgatca ttccaagctt ttttggaggc cggagaagca acgttttcga cccattctct 60 cttgatgtat gggatccttt caaagatttt cctcttgtta cctcctctgc ctctgagttc 120 ggaaaagaga ctgcagcgtt tgtcaatacg cacattgact ggaaggagac tccccaggct 180 catgtgttca aggccgatct tccagggctg aagaaagaag aggtgaaggt agagcttgaa 240 gaaggaaagg ttcttcagat cagcggagag aggaacaaag agaaggagga gaagaacgac 300 aagtggcacc gagtggaacg cagcagtggc aaatttctga ggaggttcag gcttccagag 360 aatgcaaagg tggatgaggt gaaagctgct atggagaatg gggtgttgac tgttactgtt 420 ccaaaggtgg agatcaagaa gcccgaggtc aaggccattg atatttctgg ttaa 474 <210> 3 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEF promoter <400> 3 gagctcatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt tctcggactc 60 cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt cccctctttc 120 ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa aagagaccgc 180 ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt tctttttctt 240 gaaaattttt ttttttgatt tttttctctt tcgatgacct cccattgata tttaagttaa 300 taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt acaacttttt 360 ttacttcttg ctcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaagttttc tagaactagt 420 aaaaga 426 <210> 4 <211> 905 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP1 cassette <400> 4 agcttgatat cgaattcctg cagcccgggg gatccactag ttctagagcg gccgcggaac 60 gatcattcac tatatatata tcaatttata tatacgtatg tgtaattgaa gaaagatacg 120 ttttttcctc tattgagagg cctgctggat gaatagcttt accttttcta aatccttgat 180 accatcagtc tctactcctc cacttacatc gacaccgatc gcatttggta acatattaat 240 ggcaacagaa acgttatcag gattcaatcc accagcgata atgaatttta tctcgggatg 300 acttgcagac caactggaaa ttgcactcca attcaatttc tcaccagtgc caccttcacc 360 agaatcgaac aacgtcagca cattgtctac gtgttcatac aggtccagta gtaattcaca 420 atcctgtggg aacctggaac ctcttaatga ttggaattga agatgggatc aaagatctgt 480 attctttaat atcttcatct ccatgtaatt gtatcacatc tagattatat tcgtggtaca 540 gttgaaggac atcatcaacg gactgatttc taaacacccc gactagttta gtacctttca 600 cgttctcttg ttggtgaact gcagttgaaa tacctttcgc aagagggtag ctcgctcaga 660 gtacccaagt aaatgattag taaactgatg tttgatagtt caatttttca atgaaataac 720 cttatattaa aattgatatt actattatac aaaaataaag aataaaggat ttgagtttat 780 acataaaata ccattattat ttgttcagtg agagataccg gggtatatgg gatgtgtgta 840 gtgataccat gcaatcatgt atcaaacatg ggcccggtac ccaattcgcc ctatagtgag 900 tcgta 905 <210> 5 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP1 amino acid sequence <400> 5 Ser Leu Ile Ser Asn Ser Cys Ser Pro Gly Asp Pro Leu Val Leu Glu 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asn Asp His Ser Leu Tyr Ile Tyr Gln Phe Ile Tyr Thr 20 25 30 Tyr Val Leu Lys Lys Asp Thr Phe Phe Pro Leu Leu Arg Gly Leu Leu 35 40 45 Asp Glu Leu Tyr Leu Phe Ile Leu Asp Thr Ile Ser Leu Tyr Ser Ser 50 55 60 Thr Tyr Ile Asp Thr Asp Arg Ile Trp His Ile Asn Gly Asn Arg Asn 65 70 75 80 Val Ile Arg Ile Gln Ser Thr Ser Asp Asn Glu Phe Tyr Leu Gly Met 85 90 95 Thr Cys Arg Pro Thr Gly Asn Cys Thr Pro Ile Gln Phe Leu Thr Ser 100 105 110 Ala Thr Phe Thr Arg Ile Glu Gln Arg Gln His Ile Val Tyr Val Phe 115 120 125 Ile Gln Val Gln Phe Thr Ile Leu Trp Glu Pro Gly Thr Ser Leu Glu 130 135 140 Leu Lys Met Gly Ser Lys Ile Cys Ile Leu Tyr Leu His Leu His Val 145 150 155 160 Ile Val Ser His Leu Asp Tyr Ile Arg Gly Thr Val Glu Gly His His 165 170 175 Gln Arg Thr Asp Phe Thr Pro Arg Leu Val Tyr Leu Ser Arg Ser Leu 180 185 190 Val Gly Glu Leu Gln Leu Lys Tyr Leu Ser Gln Glu Gly Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Val Pro Lys Met Ile Ser Lys Leu Met Phe Asp Ser Ser Ile Phe 210 215 220 Gln Asn Asn Leu Ile Leu Lys Leu Ile Leu Leu Leu Tyr Lys Asn Lys 225 230 235 240 Glu Arg Ile Val Tyr Thr Asn Thr Ile Ile Ile Cys Ser Val Arg Asp 245 250 255 Thr Gly Val Tyr Gly Met Cys Val Val Ile Pro Cys Asn His Val Ser 260 265 270 Asn Met Gly Pro Val Pro Asn Ser Pro Tyr Ser Glu Ser 275 280 285 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggcgccacga taagaaattt acgaccggga atgttgcgga gctcatagct tcaaaatg 58 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tggaatgatc gacattcttt tactagttct ag 32 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctagaactag taaaagaatg tcgatcattc ca 32 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggaattcgat atcaagcttt aaccagaaat atc 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gatatttctg gttaaagctt gatatcgaat tcc 33 <210> 11 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cggaaatata cgctccatct ggcaggaaac ataggctgct acgactcact ataggg 56

Claims (12)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열의 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 유전적 변이를 포함하는 미생물을 염기성 pH를 갖는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 산물을 생산하는 방법으로서, 상기 미생물은 사카로미세스 속 미생물인 것인 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변이는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 것인 방법.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변이는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 상기 미생물의 게놈 중에 도입된 것인 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 유전자는 4번 염색체의 STB3 유전자와 SEC7 유전자 사이에 삽입된 것인 방법.
6. 청구항 4에 있어서, 상기 유전적 변이는 TEF 프로모터, 당근 Hsp17.7 유전자, 및 TRP1 유전자가 작동 가능하게 연결된 DNA 구조체가 게놈 중에 도입된 것인 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 상기 산물 생산 경로를 구성하는 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 방법.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 배양하는 단계 전에, 상기 산물 생산 경로를 구성하는 효소를 코딩하는 유전자를 상기 미생물에 도입하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 산물은 알코올, 아미노산, 또는 단백질인 것인 방법.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 알코올은 C1-C20의 알코올이고, 상기 단백질은 알칼리 프로테아제(alkaline protease)인 것인 방법.
11. 청구항 1에 있어서, 상기 pH는 7.5 내지 10.0인 것인 방법.
12. 청구항 1에 있어서, 상기 배지는 셀룰로오스의 알칼리 가수 분해물을 포함하는 알칼리성 배지인 것인 방법.

Images