KR100947376B1 - 이스트 ｇａｌ８０ 결핍주를 이용한 재조합 단백질의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GAL1 결핍주에서 보다 재조합 단백질의 발현율과 세포성장이 우수하며 GAL1 결핍주와는 달리 고 비용기질인 갈락토스 없이도 배양이 가능한 GAL80 결핍 변이주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 변이주를 사용하여 유가식 배양에서 고농도 세포배양과 고효율 재조합 단백질 생산이 가능한 발현 조건의 구축에 관한 것이다. 나아가, 이 GAL80 결핍 변이주를 사용한 재조합 유전자 발현 시스템을 대량 배양에 적용함으로써 산업적으로 이용 가능하도록 하는 것에 관한 것이다.

GAL1, GAL2, 재조합 단백질, 유가식 배양

Description

이스트 ＧＡＬ８０ 결핍주를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법{A method for producing a Recombinant protein using a GAL80 Deficient Yeast Strain}

본 발명은 사카로미세스 세레비지에의 GAL80 유전자를 결핍시킨 변이주를 사용하여 재조합단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

인류의 보건복지가 향상됨에 따라 난치성 질환의 치료를 위한 고순도의 단백질성 의약품의 수요가 급증하면서 의약용 재조합 단백질이 건강관련 생명공학 분야에서 차지하는 비중이 커지고 있다. 초기 의약용 단백질 생산은 인체 조직이나 혈액등에서 분리하였으나, 이는 2차 감염이나 질병 관련 인자의 잔류 가능성으로 인해 비교적 안전한 재조합 의약품으로 바뀌고 있다. 이 때문에 대안으로 제시되었던 동물세포 배양 역시 질병 인자가 존재하는 문제로 인해 이를 대신할 수 있는 방법으로 전통 미생물로서 유전학적, 생리 화학적 특징이 잘 알려져 있어 다양한 기술에 이용이 가능한 대장균과 효모가 재조합 단백질 대량 생산을 위해 사용되고 있다.

이들 중 재조합 단백질 생산에 있어서 효모를 이용한 단백질 발현분비 시스템은 여러 가지 장점을 가진다. 효모는 단세포 진핵생물 (unicellular eukaryote)로 서 저렴한 비용으로 손쉽게 대량 배양이 가능하고 대장균과 같은 원핵세포 발현 (prokaryotic expression) 시스템과는 달리 글리코실화 등 합성 후 수식이 가능하여 특히 진핵세포 유래의 단백질 생산에 적합하다. 또한 대장균 등 발현시스템과는 달리 거의 대부분의 경우 가용성 발현이 가능하여 응집체(aggregates)를 형성하지 않으며 단백질 분비경로가 잘 발달하여 재조합 단백질을 분비 발현함으로써 최종 산물의 분리정제(down stream processing)가 복잡하지 않은 장점을 가진다(Romanos 등, Yeast 8, 423-488 (1992)).

특히 효모 사카로미세스 세레비지에는 안전성이 입증된 GRAS (Generally Regarded as Safe) 생물체로서 추가적인 장점을 제공하며, 연구의 역사도 매우 오래되어 전통적 유전학 기법이 매우 잘 발달됨으로써 유전적 조작이 용이하다. 또한 최근에는 지놈 염기서열 분석도 완료되어 마이크로 어레이 분석 등의 최신기법을 사용하여 연구가 가능하므로 재조합 단백질 발현에 가장 많이 사용되는 시스템 중 하나이다.

사카로미세스 세레비지에 변이주에서 갈락토스 이용에 관련되는 GAL1, GAL10 및 GAL7 유전자 프로모터는 사카로미세스 세레비지에 변이주에서 가장 강력한 활성을 가지는 프로모터로서 재조합 단백질의 생산에 폭 넓게 사용되어 왔다. 특히 이들 프로모터들은 포도당에 의해 전사가 억제되고 갈락토스에 의해 신속히 전사가 유도되어 약 1000배 이상의 발현이 유도되는 기작을 가지고 있어 재조합 단백질의 유도발현에 많이 사용되어 왔다.

그러나 이러한 장점에도 불구하고 사카로미세스 세레비지에 야생형 변이주를 숙주 세포로 하여 GAL 프로모터를 사용하는 발현시스템을 이용하는데에는 많은 양의 갈락토스가 소모된다. 왜냐하면 갈락토스가 유도물질로서 일정 농도 이상 반드시 존재하여야 하는데 갈락토스는 또한 탄소원으로 계속 대사되며 소모되기 때문이다. 또한 갈락토스는 포도당에 비하여 30 - 100배 정도 비싼 물질로서 대량 발효에 사용하기에는 매우 비싼 단점이 있어 왔다. 또한 실제적으로 갈락토스를 지속적으로 공급할 경우 탄소원에 비한 질소원의 결핍으로 세포의 대사과정이 변화하면서 단백질 분해 효소들의 활성이 촉진되어 분비 발현된 단백질이 분해되는 등의 문제가 있어 외래 단백질 발현시 갈락토스의 최적농도를 결정하는 데에도 어려움이 있다. 이를 부분적으로 해결하기 위한 방법으로서 GAL1 결핍 변이주를 사용하는 방법이 개발된바 있는데(Kang HA 등, Biotechnol. Bioeng. 89, 619-629 (2005)), 갈락토스 대사의 첫 과정인 갈락토키나아제(galactokinase)를 코딩하는 GAL1 유전자를 결손시켜 갈락토스를 대사하지 못하는 변이주를 이용시 갈락토스를 탄소원으로 사용할 수가 없고 오로지 유도물질로만 사용하기 때문에, 상당히 적은양의 갈락토스만으로도 단백질의 발현을 계속적으로 유도할 수가 있다.

그러나 GAL1 결핍 변이주의 경우 갈락토스가 소모되지 않는 장점이 있는 반면 여전히 일정 농도 이상의 갈락토스가 유도물질로서 존재하여야 하므로 상대적으로 값싼 산업용 효소 등의 재조합단백질의 대규모 발효에는 여전히 문제가 남아 있었다.

이를 근본적으로 해결하기 위해서는 갈락토스가 유도물질로서 존재하지 않는 경우에도 GAL 유전자가 발현될 수 있는 시스템이 가장 바람직하다. 최근 사카로미세스 세레비지에 갈락토스 대사 경로 유전자의 변이주에 관한 연구에서 이러한 가능성이 제시된 바 있는데, 이를 이해하기 위하여 GAL 유전자 발현 기작에 대하여 살펴보면 다음과 같다 (Verma 등, Biotechnol. Appl. Biochem. 39, 89-97 (2004); Ostergaard 등, FEMS Yeast Research 1, 47-55 (2001)).

GAL 유전자의 발현은 3가지 조절 단백질, Gal4p, Gal80p, Gal3p에 의해 조절된다. Gal4p가 GAL 유전자의 프로모터 부위에 있는 UAS(upstream activation sequence)에 결합하여야 GAL 유전자가 발현되는데, 갈락토스가 존재하지 않으면 Gal80p가 Gal4p와 상호작용하여 Gal4p의 결합이 저해 (repression) 받게 된다. 한편 갈락토스가 존재하는 경우에는 Gal3p가 Gal80p의 Gal4p에 대한 저해를 풀어주어 GAL 유전자가 발현되게 한다. 반면 포도당이 존재하는 경우 갈락토스에 의한 GAL 유전자의 전사를 저해하게 되는데, 이는 포도당이 Gal4p의 농도를 감소시켜 GAL 유전자의 전사를 중지시키는데에 기인한다. 또한 MIG1p는 GAL4 URS (upstream repression sequence)에 결합함으로써 전사를 방해하여 GAL 유전자의 전사를 저해한다. 따라서 GAL 유전자의 상태는 Gal4p의 유효성 (포도당 존재시), 혹은 Gal80p에 의해 Gal4p의 전사능을 변화시킴으로써 조절된다.

야생주에서 GAL 유전자는 3 가지 상태로 존재한다. 포도당이 존재할 경우 GAL 스위치는 MIG1p에 의한 GAL4 억제, Gal80p에 의한 GAL 유전자 억제에 의하여 off 상태로 된다. 글리세롤과 락테이트 존재 시와 같은 비유도-비억제 조건에서는 Gal80p가 DNA에 결합 되어 있는 Gal4p와 상호작용하여 저해 상태가 된다. 갈락토스 존재 시에는 활성화된 Gal3p가 Gal80p를 세포질(cytosol)에 격리하여 Gal80p의 핵으로부터 세포질로의 이동을 가능케 함으로써 GAL 유전자가 발현된다. GAL80 결핍 변이주에서는 단지 2가지 상태만 존재하게 되는데, 포도당 존재 시에는 오프(off) 상태가 되고 포도당이 없어지면 발현된다. 따라서 유도물질로서 갈락토스가 필수적이지 않게 된다(Verma 등, Biotechnol. Appl. Biochem. 39, 89-97 (2004); Ostergaard 등, FEMS Yeast Research 1, 47-55 (2001)).

이와 같이, 갈락토스 대사과정에 관여하는 GAL 유전자의 조절에 대한 많은 연구가 이루어져 왔고 GAL 스위치에 대한 이해도 많이 이루어져 왔다 (Sil AK 등, Prot. Expr. Purif. 18, 2020-212 (2000)). 또한 GAL80 결핍주를 이용하여 주정발효나 맥주발효시 원료에 많이 들어 있는 갈락토스를 포도당에 의한 이용저해 없이 원활하게 이용하는 데에 사용한 사례 (Ostergaard S. 등, Nat. Biotechnol. 18, 1283-1286 (2000) 등 실제 산업적으로 유용한 공정에 사용한 사례가 있다. 그러나 실제 재조합단백질 생산에 기존의 숙주세포 사용에 비하여 어떻게 혹은 어떤 정도로 유용한지에 대한 자세한 연구보고는 없는 실정이었다. 최근 사카로미세스 세레비지에 변이주의 여러 가지 결핍 변이들의 GAL1 유전자의 발현에 대한 영향을 조사 한 연구 보고에 의하면 (Stagoj 등. FEMS Microbiology Letters 244, 105-110 (2005)), 갈락토스 대사와 관련되는 28개 유전자의 결핍 변이주에서 GAL1 프로모터에 연결된 형광단백질 GFP 유전자의 발현율을 형광 강도를 측정함으로써 조사한 결과, GAL1 결핍주에서 대조구 대비 2.4배의 가장 높은 발현 증가를 보였고 GAL80 결핍주에서는 이 보다 상당히 낮은 1.3배의 증가만을 관찰할 수 있었다. 이때 세포성장은 GAL1 결핍주보다 GAL80 결핍주가 2배 정도 우수한 것으로 나타났다. 따라서 단위 세포당 단백질 발현율은 GAL1 결핍주의 경우가 GAL80 결핍주보다 더욱 현저히 높은 것으로 보고되었다. 한편 GAL3, GAL4, MTH1 유전자 결핍주에서는 전혀 단백질 발현이 이루어지지 않았으며 GAL7, GAL10 및 GAL3 결핍주의 성장은 갈락토스 배지에서 적당치 않은 것으로 나타났다. 그러나 이러한 변이주들의 실제 재조합 단백질 생산에 대한 응용성, 특히 대량 생산을 요구하는 산업효소를 생산하기 위한 대규모 배양 시에 안정적으로 갈락토스 첨가 없이 조업이 가능한지에 대한 자세한 연구는 없었다.

본 발명자들은 사카로미세스 세레비지에 변이주와 GAL 프로모터를 사용하여 재조합 단백질을 생산하는 연구를 수행하여 왔으며, 사카로미세스 세레비지에 변이주와 GAL 유전자 프로모터를 사용함에 있어서 갈락토스를 첨가하지 않고 효율적으로 재조합단백질을 생산할 수 있는 방법에 대하여 연구하던 중, 최근에 보고된 바와는 달리 GAL1 결핍주보다 GAL80 결핍주에서의 재조합단백질의 발현율이 더욱 높은 경우를 발견하게 되었다. 또한 GAL80 결핍주를 사용함으로써 GAL1 결핍주에서보 다 발현율과 세포성장이 우수하고 GAL1 결핍주에서 필요로 하는 일정량의 갈락토스도 필요하지 않으며 유가식 배양에서도 고농도 세포배양과 고효율 재조합 단백질 생산이 가능한 발현시스템을 구축함으로써 본 발명을 완성하였다.

또한 GAL80 변이주에 MIG1 결핍을 추가로 도입하지 않는 경우 포도당 존재 하에서는 발현이 저해되고 포도당이 소모되면 발현이 일어남을 확인하였는데, 통상의 발효조건 및 유가식 배양의 실시조건에서는 포도당의 농도가 발현을 저해하지 않는 충분히 낮은 농도로 유지되는 것에 착안하여 MIG1 결핍의 도입 없이 GAL80 결핍만 가지는 변이주를 사용함으로써 고효율의 발현이 가능함을 확인하여, 목표 단백질을 발효후반부 정지기에 발현시킬 수 있는 후기 발현 시스템을 구축함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 사카로미세스 세레비지에의 GAL80 결핍주를 이용한 재조합 단백질의 생산과 이를 산업적으로 적용하기 위한 발현 시스템 구축을 그 목적으로 한다.

산업적으로 적용 가능한 재조합 단백질 생산주를 개발하기 위해 사카로미세스 세레비지에의 GAL80 결핍주를 제조하였으며, 이 변이주를 이전에 재조합 단백질에 사용하였던 숙주와 비교시 재조합 단백질 생산에서의 유용성을 확인하였다. 또한 이를 유가식 배양에 적용하여 고효율 재조합 단백질 생산이 가능한 발현 시스템을 구축함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 첫 번째 양태로서, GAL80 유전자를 결핍시킴으로써 고효율로 재조합 단백질의 발현을 유도할 수 있는 효모 변이주를 제공한다.

상기 효모는 사카로미세스 세레비지에인 것이 바람직하나 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 즉, 사카로미세스 세레비지에 및 사카로미세스 세레비지에와 갈락토스 대사 경로 및 조절 유전자가 동질 유전자인 효모라면 사용이 가능하다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 미국 국립보건원에서 분양받은 사카로미세스 세레비지에 2805(Y2805)를 숙주로 하여 이의 GAL80 유전자가 결핍된 변이주(Y2805 △ gal80)를 제조하고, 이를 대한민국 대전시 유성구 어은동에 소재한 한국생명공학연구원 내 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에 수탁번호 KCTC 11162BP로서 2007년 7월 30일자로 기탁하였다. GAL80 유전자의 염기 서열은 SGD(Saccharomyces Genome Database)를 통하여 얻었으며, 서열번호 2 내지 5의 프라이머를 사용하여 증폭한 후 사용하였다. 이후 GAL80 유전자의 파쇄는 당해 분야에 잘 알려진 유전자 팝-아웃 기술을 이용하였으며 이를 도 1에 나타내었다. 이와 같이 하여 제작된 GAL 프로모터 발현용 변이주는 표 1에 나타난 바와 같다. 표1에 나타난 바와 같이, 본원 실시예에서는 GAL80 유전자가 결핍된 변이주 외에도, 포도당 대사에 관여하는 MIG1p, MIG2p 및 MIG1p와 GAL6 유전자를 추가로 결핍시킨 변이주를 제작하여 생장속도 및 활성을 비교하였다. 또한 대조구로서 기존에 알려진 GAL1 유전자를 결핍시킨 변이주(△GAL1)를 제조하여 활성을 비교하였다. 후술할 바와 같이, 본 발명에 따라 GAL80 유전자가 결핍된 변이주(△GAL180)는 기존의 GAL1 유전자를 결핍시킨 변이주에 비해 갈락토스가 없는 배지에서 성장속도 및 재조합 단백질 발현량이 훨씬 높게 나타남으로써, 값비싼 갈락토스를 사용할 필요 없이 고농도로 재조합 단백질을 생산할 수 있게 한다. 갈락토스를 필요로 하지 않는 상기 변이주의 이용은 특히 대량 배양 시스템 적용 시에 매우 유리한 바, 본원 실시예에 자세히 기술된 바와 같이, 본 발명은 이러한 대량 배양 공정에서의 상기 변이주의 고농도 배양 가능성 및 높은 재조합 단백질 발현 양상을 확인하였다.

본 발명의 두 번째 양태에서는, 상기 △GAL80 변이주를 숙주로 활용한 재조합 단백질 분비 변이주 및 이의 제조방법을 제공한다. 상기 변이주는 특히, 갈락토스가 없는 배지에서 재조합 단백질을 고농도로 분비, 발현할 수 있음을 특징으로 한다. 이와 같은 변이주는 상기 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 △GAL80 변이주에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 구체적 으로는, 효모 변이주의 GAL80 유전자를 파쇄시키고, 상기 변이주에 외래 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터를 형질전환함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 상기 형질전환 등은 당해 분야에 통상의 지식을 가진 기술자에게 잘 알려진 다양한 기술을 적절히 선택 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 캔디다 앤타크티카(Candida antarctica) 유래의 리파제 B 단백질(CALB)의 변이체인 CalB14 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 상기 △GAL80 변이주에 도입하여 리파제 변이 단백질 GalB14을 발현, 분비하는 효모 변이주를 제조하였다. 상기 CalB14 변이 리파제 단백질은 본 발명자들에 의해 이전에 개발되어 특허등록(한국등록특허 475133호)된 단백질이며 이의 아미노산 서열은 서열번호 1과 같다. CalB14 발현 벡터를 리튬/아세테이트(lithium/acetate)법을 통하여 표 1에 나타낸 각 변이주에 형질전환하였으며, 이를 YPD 액체 배지에서 배양하여 CalB 활성도를 측정하였다. 이를 통해 △Gal1 변이주 및 △Gal80 변이주가 CalB14 발현 효율이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 3). 그러나, 갈락토스가 존재하지 않는 배지에서 대량 배양시에는 △Gal1 변이주 보다 본 발명에 따른 △Gal80 변이주가 높은 CalB14 발현 효율을 보였다. 한편, 포도당 대사에 관여하는 MIG1p, MIG2p 및 MIG1p과 Gal6 등을 추가 결핍시킨 변이주의 경우 CalB14 별현 활성을 거의 보이지 않는 것으로 나타났다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, △Gal80 변이주를 이용한 재조합 단백질의 생산방법, 특히 재조합 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.

이전 연구에서는 △Gal1과 △Gal80의 재조합 단백질의 발현을 측정하였을때 △Gal1가 △Gal80 보다 높은 발현율을 보이나 세포 성장은 △Gal80이 우수한 것으로 나타났으며, 이 결과에 따라 단위 세포당 발현율이 △Gal1이 △Gal80 보다 높은것으로 보고 되었다. 그러나 이 연구는 고 비용 기질인 갈락토스가 존재하는 배지 조성하에서 시행된 실험으로 대량 배양에 적용시 높은 비용 부담을 안게 된다는 단점이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 표 2와 3에서 제시한 배지 조성을 이용하여 대규모 유가식 배양을 시행한 결과, 고 비용 기질인 갈락토스가 존재하지 않는 배지에서는 △Gal80 변이주가 배양 후 균체의 양과 리파제 활성에 있어 △Gal1 변이주에 비해 5L 배양시 약 59%, 300L 배양시 약 66% 정도 증가함을 확인하였다(도 4-7). 이와 같이, 갈락토스를 첨가하지 않은 배지에서 △Gal80 변이주가 여러 규모의 발효조에서 모두 △Gal1 변이주 보다 1.5 배 가량 높은 CalB14 발현율을 보임에 따라, 본 발명에서는 재조합 유전자를 생산하기 위한 가장 우수한 변이주로 △Gal80 변이주를 선정하였다. 또한, 이를 이용하여 2,500L 발효조에서 대량 생산 시험을 수행함으로써, 본 발명에 따른 상기 변이주의 대량 배양 가능성을 검증하였다(도 8).

이와 같이, 본 발명에 따른 GAL80 결핍주는 종래의 GAL1 결핍주 보다 발현율과 세포 성장이 우수하고 GAL1 결핍주의 배양에 필수적인 고비용 기질인 갈락토스를 필요로 하지 않으므로, 저렴한 비용으로 고농도 세포배양 및 고효율 재조합 단백질 생산이 가능하다. 따라서, 본 발명은 의학 분야뿐만 아니라 동물 사료 제 조, 제빵산업, 모직, 포도주 산업, 폐수처리 등 수많은 산업분야에서 재조합 단백질의 생산을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 이로써 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

( 실시예 )

1. GAL 유전자 결핍주의 제조

갈락토스 대사 관련 유전자들의 결핍 변이주 제조를 위한 모균주는 미국 국립보건원으로부터 입수한 사카로미세스 세레비지에 2805(Y2805)(Sohn JH 등, J Microbiol. Biotechnol. 1, 266-273 (1991) (Choi ES 등, Appl. Microbiol. Biotechnol 42, 587-594 (1994))를 사용하였다. GAL80 결핍 변이주를 제조하기 위하여 gal80 ORF(open reading frame) 염기서열을 SGD(Saccharomyces Genome Database)에서 얻어 PCR을 이용하여 유전자를 확보하였고, 도 1과 같이 당해 분야에 잘 알려진(Johnston M. 등, Meth. Enzymol. 350, 290-315 (2002)) 유전자 팝-아웃 기술을 이용하여 GAL80 결핍 변이주를 제조하였다.

구체적으로, GAL80 유전자 ORF의 상류에서 350bp 정도와 하류 350bp 정도의 DNA 조각을 얻기 위해 사카로미세스 세레비지에의 게놈 DNA를 주형으로 primer DH1(서열번호 2: 5'-atg gac tac aac aag aga tc-3')과 DH2(서열번호 3: 5'-ggc gac cac acc cgt cct gtg caa ggg ccc att cta cga a-3')를 이용하여 상류 DNA 조 각을 PCR (polymerase chain reaction)을 통해 증폭하고, 같은 방법으로 하류 DNA 조각을 primer DH3(서열번호 4: 5'-gcg atg ctg tcg gaa tgg acc agt gga act aga gca aacg-3') 및 DH4(서열번호 5: 5'-tta taa act ata atg cga ga-3')를 이용하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 밴드를 아가로즈 젤 상에서 에디디윰 브로마이드(ethidium bromide) 염색을 통해 확인하고 gel purification kit (Bioneer)를 이용하여 정제하였다. 정제한 상류 DNA 조각과 하류 조각을 각각 URA3 유전자가 포함된 pop-out casette에 연결하기 위해 primer DH1과 u200r을 통해 합성신장 PCR을 하였고, 하류 DNA 조각과 연결하기 위해서는 primer u200f와 DH4를 이용하였다. 확보한 DNA 조각을 Y2805 야생주(wt)에 형질전환하기 위해 리튬/아세테이트(lithium/acetate)법 (Hill J. 등, Nucleic Acids Res. 16, 5971 (1991))을 이용하였다. UD 고체 배지에서 형성된 콜로니를 고체 배지에 다시 옮긴 후 각 클론에 형질전환이 정확히 되었는지 확인하기 위해 primer DH1과 u200r을 이용하여 PCR을 통해 확인하였다.

확인된 클론을 선택압이 없는 고영양 배지인 YPD 액체 배지에서 1시간 가량 배양한 후 이것을 5-FOA (5-fluoro-orotic acid) 고체 배지에서 URA3 유전자가 pop out된 콜로니를 얻고 새로운 5-FOA 고체 배지로 옮긴 후 primer DH1과 DH4를 이용하여 PCR을 통해 확인하였다. 이때 primer-jumping에 의해 잘못된 결과를 얻게 되는 것을 방지하기 위해 연장 시간을 3분 이상으로 반응하였다.

상기한 방법과 동일하게 GAL1 유전자가 결핍된 변이주 Y2805Δgal1, GAL80 유전자 및 MIG1 유전자가 동시에 결핍된 변이주 Y2805Δgal80Δmig1, GAL80 유전자와 MIG1 유전자 및 GAL6 유전자가 동시 결핍된 변이주 Y2805Δgal80Δmig1Δgal6 및 GAL80 유전자와 MIG1 유전자 및 MIG2 유전자가 동시 결핍된 변이주 Y2805Δgal80Δmig1Δmig2를 제조하였다. 이들의 유전자형을 하기 표 1에 나타내었다.

균주	유전자형
Y2805wt Y2805Δgal1 Y2805Δgal80 Y2805Δgal80Δmig1 Y2805Δgal80Δmig2 Y2805Δgal80Δmig1Δgal6	MATa pep4 :: HIS3 prb -△1.6R can1 his3 -20 ura3 -52 gal1 :: Tc190 gal80 :: Tc190 gal80 :: Tc190 mig1 :: Tc190 gal80 :: Tc190 mig2 :: Tc190 gal80 :: Tc190 mig1 :: Tc190 gal6 :: Tc190

2. 숙주 세포의 생장

효모의 특정 유전자의 활성을 파괴하는 경우 세포의 성장이 느려지는 경우가 자주 발생한다. 재조합단백질을 과발현하기 위해서는 우선적으로 숙주 세포의 생장이 매우 중요하다. 따라서 본 연구에서 제조된 개량 변이주의 생장을 먼저 측정하였다. 3 ㎖ YPD 액체배지에 각 변이주를 접종하고 1일간 키운 후 250 ㎖ flask에 25 ㎖ YPD를 넣고 각 변이주의 흡광도(O.D.600)가 1.0이 되도록 접종하였다. 분광분석계의 유효 측정범위에 들어갈 수 있도록 100 분의 1로 희석을 하여 측정한 결과는 도 2와 같다.

결과에서 보는 바와 같이, Y2805Δgal80Δmig2 균주의 경우는 상대적으로 다른 변이주에 비해 생장이 상당히 뒤쳐져 본 실험에서 사용할 숙주에서 배제하였다. Δgal1은 Y2805 야생주(wt)에 비해 생장이 떨어지지만 Δgal80, Δgal80Δmig1 및 Δgal80Δmig1Δgal6 은 생장속도에 있어 Y2805 wt와 큰 차이가 나지 않았다.

3. 결핍 변이주를 이용한 재조합 단백질의 발현 확인

재조합 단백질 발현에는 본 발명자들이 최근 특허등록한 화학합성 등에 유용성이 큰 산업용 효소 캔디다 앤타르티카 리파제 B 유전자(CalB)의 변형체인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CalB14를 사용하였다(대한민국 등록특허 제475133호 참조).

상기 CalB14 단백질을 코딩하는 유전자를, GAL10 프로모터와 TFP3라는 분비인자를 가지는 효모 발현벡터에 클로닝한 벡터 pYGT3-CalB14(대한민국 등록특허 제697310호 참조)를 리튬/아세테이트(lithium/acetate) 법을 이용하여 Y2805 wt, Y2805Δgal1, Y2805Δgal80, Y2805 Δgal80Δmig1 및 Y2805Δg al 80Δmig1Δgal6 변이주에 형질 전환하였다. 이들의 배양을 위해서 모든 변이주를 YPD 3 ㎖에 접종하여 1일간 키운 후 250 ㎖ 플라스크에 25 ㎖의 배지에 O.D.600에서 측정한 값이 1.0이 되도록 접종하였다. 이때 사용한 배지는YP (2% 효묘 추출물 및 1% 펩톤)를 기본으로 2% 글루코스 (모든 Δgal80 변이주), 또는 1% 글루코스 및 1% 갈락토스 (Y2805wt), 또는 2% 글루코스 및 0.3% 갈락토스(Δgal1 변이주)를 사용하였다. 각각의 배지에 균체를 접종 한 후 24 시간, 36 시간 그리고 48 시간 시점에 각 변이주의 O.D.600을 측정하였고 CalB14 활성도는 아래와 같이 pNPP로 측정하였다(도 3).

리파제의 활성 측정은 발색시약인 p-니트로페닐 팔미테이트(p-nitrophenyl palmitate) (pNPP)를 사용하였다. 10 μl의 10 mM pNPP, 40 μl 에틸 알콜 및 950 μl 50mM pH 7.5 트리스 완충액이 조합된 반응액 1 ml에 적절히 희석된 20 μl의 효소용액을 넣고 10분간 반응 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 리파제 활성 1 unit는 1분당 1 μmole의 pNP기를 유리시키는 효소의 활성으로 정의하였다.

Y2805 wt은 매우 빠른 속도로 생장하였고, 빠른 생장률로 인해 포도당의 고갈이 빠른 시간내에 이뤄지고 총 균체의 양이 충분히 증가한 상황에서 갈락토스에 의한 유도 발현이 초반에 급격히 일어난 것으로 판단된다. 이에 반해 Δgal1 및 Δgal80 변이주는 wt 변이주보다는 생장은 조금 느렸으나 큰 차이는 보이지 않았고, 플라스크 배양에서는 포도당의 소모가 비교적 더디고 pH 조절도 어려워 정확한 발현 양상을 구분하기 힘들기 때문에 이후 실험에서는 발효조를 운용하며 두 변이주의 발현양상을 비교하였다. Δgal80Δm i g1 변이주와 Δgal80Δmig1Δgal6의 경우에는 CalB 활성이 거의 나타나지 않았다.

4. Δ gal1 변이주를 이용한 리파제 CalB 생산

GAL1 유전자가 결여된 변이주를 이용하여 리파제 CalB14의 대량생산을 위해서 5L 발효조를 이용한 유가식 배양을 수행하였다. 실시예 3에서 기술한 발현벡터로 형질전환된 △ gal1 변이주를 사용하였고 배지조성은 표 2에 나타내었다. 초기 포도당 농도를 20g/L로 하였으며, 포도당이 모두 고갈되고 대사 부산물인 에탄올이 모두 소비된 후에 포도당이 함유된 공급배지를 배양 끝까지 단계적 증가방식(stepwise feeding method)으로 발효조에 공급하였다. 배양 중 균체 농도가 30 OD가 되었을 때 (20시간) 유도물질인 갈락토스를 총 배양액의 0.3%가 유지되도록 7.5g을 일시적으로 공급하였다. 배양결과 균체의 농도는 배양말기에 64 OD (건조중량, 15.4g/L) 까지 증가하였고 리파제의 활성은 6,868 U/L까지 증가하였다 (도 4).

5. △ gal80 변이주를 이용한 리파제 CalB 생산

실시예 3에서 기술한 리파제 발현 벡터로 형질 전환된 △ gal80 변이주의 5L 발효조를 이용한 유가식 배양을 통해서 리파제의 대량생산을 유도해 보았다. 배지 조성은 △ gal1 변이주 이용시 사용한 것과 같으나 유도물질로서 갈락토스를 첨가하지 않았다. 초기 포도당 농도를 20 g/L로 하였으며 포도당이 모두 고갈되고 대사 부산물인 에탄올이 다 소비된 후에 포도당이 함유된 공급배지를 배양 끝까지 단계식 배양 방법으로 공급하였다. 배양결과 균체의 농도는 배양 말기에 80 OD (건조중량, 19.2g/L)까지 증가하였고, 리파제의 활성은 10,951 U/L까지 증가하였다 (도 5). 이값은 △ gal1 변이주에 비해 약 59% 향상된 값으로써 △g al 80 변이주가 △ gal1 변이주에 비하여 재조합 단백질 생산성도 높고 비싼 기질인 갈락토스도 필요로 하지 않음을 확인하였다.

6. △ gal1 변이변이주를 이용한 300리터 발효조 규모에서의 리파제 생산

재조합 CalB14를 대량생산하기 위하여 전술한 바와 같이 △ gal1 변이주와 △g al 80 변이주를 이용하였다. 앞의 실험에서 5L 발효조에서 △ gal80 변이주가 갈락토스를 전혀 첨가하지 않아도 리파제를 대량 생산할 수 있음을 확인한 바 있지만 큰 규모의 발효조에서는 리파제 발현이 안정적이지 않을 수도 있기 때문에 △ gal1 변이주와 △ gal80 변이주를 사용하여 각각 보다 큰 규모의 발효조에서 리파제의 안정적 발현 여부를 비교 분석하였다. 이 변이주의 산업화를 위해 300L 규모 이상의 발효조에서는 값싼 공업용 배지를 사용하였다.

실시예 4에서 얻어진 5L 발효조의 결과와 300L 발효조로 스케일 업(scale up)하기 위하여 측정한 교반 시간 및 산소전달 속도 등을 토대로 재조합 △ gal1 변이주를 300L 발효조에서 스케일 업을 수행하였다. 사용된 배지 조성은 표 3에 나타내었으며 모든 배지를 값싼 공업용 배지를 사용하였다. 배양조건은 온도 30^oC, pH 5.5으로 하였다. 초기에 교반 속도는 100 rpm, 통기량은 0.5 vvm으로 시작하여 단계적으로 증가시켰다.

종균배양은 50L 발효조에 20L 작업 부피(working volume)로하여, 온도 30^oC, pH 5.5에서 24시간 동안 배양하였다. 본 배양인 300L 발효조에서는 120L 작업 부피(working volume)를 사용하였다. 실시예 4의 5L 발효와 같이 종균 접종 후 초기 포도당이 고갈되고 대사 부산물인 에탄올이 모두 소비된 후에 포도당이 함유된 공급 배지를 배양 끝까지 단계적 증가 방법으로 공급하였다. 배양 중 균체 농도가 40 OD가 되었을 때 (22시간), 유도물질인 갈락토스를 총 배양액의 0.3%가 유지되도록 450 g을 일시적으로 공급하였다. 배양결과 균체의 농도는 배양 말기에 112 OD (dry cell weight, 26.9g/L) 까지 증가하였고, CalB14의 활성은 11,016 U/L까지 증가하였다 (도 6). 5L 발효보다 균체는 2배 이상 증가하였으며 아울러 리파제의 발현양도 2배 이상 증가하였다.

7. △ gal80 변이주를 이용한 300 리터 발효조 규모에서의 리파제 생산

재조합 △ gal80 변이주를 사용하여 300L 발효조에서 배양을 수행하였다. 사용된 배지 조성과 종균배양 및 300L의 배양조건은 △ gal1 변이주를 이용한 300L 발효와 동일하게 하였다. 단지 300L 배양중 리파제의 발현을 유도하기 위하여 갈락토스를 첨가하지는 않았다.

종균 접종 후, 초기 포도당이 고갈되고 대사 부산물인 에탄올이 모두 소비된 후에 포도당이 함유된 공급 배지¹를 배양 끝까지 단계적 증가 방법으로 공급하였다. 배양결과, 균체의 농도는 배양 말기에 136 OD (건조중량, 32.6g/L) 까지 증가하였고 CalB의 활성은 16,632 U/L까지 증가하였으며, 또한 5L 발효와 유사하게 △ gal1 변이주와 비교하였을 때 CalB 리파아제의 활성이 66 % 증가하였다 (도 7).

8. 2,500L 발효조에서의 리파제 CalB 생산

위에서 서술한 바와 같이 갈락토스의 첨가 없이 △ gal80 변이주를 이용 시 5L 발효조와 실험적 규모의 300L 발효조 모두에서 △ gal1 변이주보다 CalB의 활성이 1.5배 이상 높게 생산됨을 알 수가 있었다. 따라서, 최종적으로 가장 우수한 변이주로 △ gal80 변이주를 선정하였으며 2,500L 발효조에서의 CalB 대량생산 시험을 수행하였다.

사용된 배지조성은 300L의 발효에서와 동일하며 모든 배지를 값싼 공업용 배지를 사용하였다. 배양조건은 온도 30^oC, pH 5.5으로 하였다. 초기에 교반 속도는 80 rpm, 통기량은 0.5 vvm으로 시작하여 단계적으로 증가시켰다.

종균배양은 300L 발효조에 150L 작업 부피(working volume)로하여 온도 30^oC, pH 5.5에서 17시간 동안 배양하였다. 본배양인 2,500L 발효조에서는 1,000L 작업 부피(working volume)를 사용하였다. 앞 절의 5L와 300L 발효에서와 같이 종균 접종 후 초기 포도당이 고갈되고 대사 부산물인 에탄올이 모두 소비된 후에 포도당이 함유된 공급 배지를 배양 끝까지 단계적 증가 방법으로 공급하였다. 배양결과 균체의 농도는 배양 말기에 106 OD (건조중량, 25.4g/L) 까지 증가하였고 CalB의 활성은 19,438 U/L까지 증가하였다 (도 8).

도 1은 GAL80 결핍주를 제작하기 위한 효모 유전자(사카로미세스 세레비지에 2085)의 유전자 파괴과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.

도 2는 상기 유전자 파괴과정을 통하여 제작된 개량 변이주를 YPD 액체 배지에서 1주일간 배양 후 각 변이주의 흡광도를 측정하여 개량 변이주의 생장을 측정한 것이다.

도 3은 다양한 결핍변이주를 배양하여 pNPP를 통해 CalB14 분비를 측정하여 비교한 그림이다.

도 4는 △GAL1 변이주를 이용한 CalB 리파제 생산을 위한 5L 유가식 배양과 이에 따른 변이주의 흡광도와 활성을 나타낸 그림이다.

도 5는 △GAL80 변이주를 이용한 CalB 리파제 생산을 위한 5L 유가식 배양과 이에 따른 변이주의 흡광도와 활성을 나타낸 그림이다.

도 6은 △GAL1 변이주를 이용한 CalB 리파제 생산을 위한 300L 유가식 배양과 이에 따른 변이주의 흡광도와 활성을 나타낸 그림이다.

도 7은 △GAL80 변이주를 이용한 CalB 리파제 생산을 위한 300L 유가식 배양과 이에 따른 변이주의 흡광도와 활성을 나타낸 그림이다.

도 8은 상기 배양을 통해 우수성이 입증된 △GAL80 변이주를 선정하여 2,500L 발효조에서 CalB 대량생산을 위한 글루코즈 섭식률과 교반속도 및 배양시 변이주의 흡광도, 분비 리파제 활성, 및 특이적 활성을 나타낸 그림이다.

<110> Korea Research Institure of Bioscience & Biotechnology <120> A method for Producing a Recombinant Protein using a GAL80 Deficient Yeast Strain <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CalB mutant <400> 1 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DH1 forward primer for upstream DNA amplification <400> 2 atggactaca acaagagatc 20 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DH2 reverse primer for upstream DNA amplification <400> 3 ggcgaccaca cccgtcctgt gcaagggccc attctacgaa 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DH3 forward primer for down stream DNA amplificaton <400> 4 gcgatgctgt cggaatggac cagtggaact agagcaaacg 40 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DH4 reverse primer for downstream DNA amplification <400> 5 ttataaacta taatgcgaga 20

Claims (12)

1. a) 효모의 GAL80 유전자를 파쇄시키고,

   b) 상기 GAL80 유전자가 파쇄된 효모 변이주에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 변이 리파제 B 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터를 형질전환하는 것을 포함하는, 갈락토스가 없는 배지에서 높은 효율로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 변이 리파제 B 단백질을 발현하는 변이주의 제조 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 효모의 MIG1 유전자는 파쇄시키지 않는 것을 특징으 로 하는 변이주의 제조 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 효모가 사카로미세스 세레비지에이거나 또는 사카로미세스 세레비지에와 갈락토스 대사 경로 및 조절 유전자가 동질유전자인 효모인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 효모가 사카로미세스 세레비지에 2805(Y2805)인 것을 특징으로 하는 방법.
5. a) 사카로미세스 세레비지에의 GAL80 유전자를 파쇄시키고,

   b) 상기 GAL80 유전자가 파쇄된 변이주에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 변이 리파제 B 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하고,

   c) 상기 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 변이주를 갈락토스가 없는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 변이 리파제 B 단백질의 제조 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 GAL80 유전자가 파쇄된 변이주가 수탁번호 KCTC 11162BP의 사카로미세스 세르비지에 변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 변이 리파제 B 단백질이 캔디다 앤타크티카 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 삭제
9. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 생물반응기(bioreactor)를 이용하여 상기 변이주를 대량 배양하는 단계를 포함하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 배양은 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 5 항에 있어서, 상기 변이주의 MIG1 유전자는 결손시키지 않음으로써 포도당이 소모된 후인 정지기에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 변이 리파제 B 단백질이 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 삭제

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