CN114369613A - 一种通过改造半乳糖启动子构建高产cbga合成的酵母菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株及其构建方法和应用。该方法包括构建菌株yG003,将酿酒酵母菌株yG003中的半乳糖启动子相关的gal80敲除，得到酿酒酵母菌株yG004；在酿酒酵母菌株yG004基础上进行半乳糖启动子改造，敲除gal1/10/7，保护敲除gal80和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG006；在酿酒酵母菌株yG006基础上进行半乳糖启动子改造，敲除mig1，保护敲除gal80、mig1和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG007。本发明通过改造半乳糖启动子，使gal1调控基因的表达不依赖于半乳糖诱导，解决半乳糖诱导导致的菌株生长延迟问题，不影响甚至提高半乳糖启动子gal1调控的基因的表达，增加了目标产物CBGA的产量，极大降低大规模培养菌株时半乳糖的成本，对CBGA的工业生产具有十分重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学技术领域，通过基因工程，将半乳糖启动子进行改造，获得一株高产CBGA的重组酿酒酵母菌株，本发明涉及酵母菌株中半乳糖启动子改造构建及其构建方法和应用。
背景技术
酿酒酵母中参与半乳糖代谢的有关GAL基因的转录是被紧密调控的,它们在没有半乳糖或有葡萄糖的培养条件下不被表达，而在葡萄糖被耗尽，半乳糖存在条件下，其表达水平可提高约1000倍[1,2]，半乳糖启动子gal1是分子生物学中对基因进行过表达非常常见的可诱导的强启动子。但是受半乳糖诱导表达调控的改造菌株培养通常需要以最适合菌株生长的碳源—葡萄糖条件下培养至高浓度，然后切换至半乳糖进行诱导表达目的基因，而不同碳源切换培养会出现生长延迟，同时，半乳糖作为碳源被菌体消耗后，降低其诱导作用，需不断补加以维持其诱导作用，且半乳糖价格相对葡萄糖高出很多，大规模培养菌株的过程会极大增加成本。
已有研究发现，将半乳糖启动子进行改造，使gal1启动子调控的目的基因不依赖半乳糖诱导调控，同时又可以过表达目的基因，更高效地合成目的产物。如 Fang wang等为了在酵母细胞中过表达异戊二烯合酶(ISPS)，将该基因用gal1启动子过表达，同时过表达半乳糖调控的gal4，通过敲除gal 1/7/10和gal 80，消除受gal1调控的基因表达对半乳糖诱导的依赖，最终将异戊二烯产率从6.0 mg/L提高到23.6mg/L，提高近四倍[3]。YujiaZhao等为了提高酵母合成齐墩果酸的产率，通过敲除半乳糖代谢基因GAL80和GAL1使3-羟基-3-甲基戊二酸还原酶、角鲨烯合成酶和2,3-氧化烯合成酶进一步过表达，结合发酵优化，最终使齐墩果酸的产量增加到606.9±9.1mg/L，比报道的最高产量高7.6倍。
因此，市面上亟需一种能够解决上述一个或者多个问题的一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株及其构建方法和应用。
发明内容
为解决现有技术中存在的一个或者多个问题，本发明提供了一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株及其构建方法和应用。
本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，所述方法包括：
步骤01、构建酿酒酵母菌株yG003,将酿酒酵母菌株yG003中的半乳糖启动子相关的gal80敲除，得到酿酒酵母菌株yG004；
步骤02、在酿酒酵母菌株yG004基础上进行半乳糖启动子改造，敲除 gal1/10/7，保护敲除gal80和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG006；
步骤03、在酿酒酵母菌株yG006基础上进行半乳糖启动子改造，敲除 mig1，保护敲除gal80、mig1和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG007。
在一些实施例中，所述步骤01包括：步骤11、以酿酒酵母菌株 cen.pk2-1c的基因组为模板，通过引物Fgal80-Up和Rgal80up(Dp)将PCR扩增得到gal80位点上游同源臂片段gal80-Up；通过引物Fgal80Dp和 Rgal80Dp(UP)将PCR扩增得到gal80位点下游同源臂片段gal80-Down。PCR条件：40cycle，PCR反应体系均为50ul：2xphanta酶25ul，F-primer1.25ul， R-primer 1.25ul，DNA模板1ul，ddH2O 21.5ul；
步骤12、以酿酒酵母菌株cen.pk2-1c的基因组为模板，通过PCR扩增得到gal80位点下游同源臂片段gal80-Down；
步骤13、以可识别并切割位gal80点的pCUT-gal80(Ura)质粒为工具质粒；步骤14、将gal80-Up、gal80-Down、pCUT-gal80(Ura)质粒作为插入片段
转化至酿酒酵母中，获得敲除gal80的重组酿酒酵母。在一些实施例中，所述步骤02包括：
步骤21、以酿酒酵母菌株cen.pk2-1c的基因组为模板，通过引物 FUp_Gal1和RUp_Gal1(Dp)将PCR扩增得到gal1/10/7位点上游同源臂片段 gal1/10/7-Up；通过引物FDp_Gal(Up)和RDp_Gal将PCR扩增得到 gal1/10/7位点下游同源臂片段gal1/10/7-Down片段；
步骤22、以可识别并切割位点gal1/10/7的pCUT-gal1/10/7-1d(Ura) 质粒为工具质粒；
步骤23、将gal1/10/7-Up、gal1/10/7-Down、pCUT-gal1/10/7-1d(Ura)
质粒作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得敲除gal1/10/7的重组酿酒酵母。在一些实施例中，所述步骤03包括：
步骤31、以敲除mig1的酿酒酵母菌株的基因组为模板，通过引物Fmig1 val和Rmig1 val将PCR扩增得到mig1位点敲除片段；
步骤32、以可识别并切割位点mig1的pCUT-mig1-3a(Ura)质粒为工具质粒；
步骤33、将mig1位点敲除片段、pCUT-mig1-3a(Ura)质粒作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得敲除mig1的重组酿酒酵母。
在一些实施例中，所述构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂 /PEG3350法。
在一些实施例中，所述醋酸锂/PEG3350法包括：
将酿酒酵母接种到YPD培养基中稀释至OD值为0.1-0.3，培养至少4.5h，收集细胞，将含有所述插入片段与工具质粒的转化液与细胞混合，40℃-50℃培养孵育，然后收集细胞；
所述的半乳糖启动子改造的重组酿酒酵母的构建方法中，插入片段的用量为：每5OD酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用50μL DNA混合物悬浮该细胞， 50μL DNA混合物由2μg所述插入片段、250ng工具质粒以及足量ddH2O 混合而成；
所述的半乳糖启动子改造的重组酿酒酵母的构建方法中，插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
在一些实施例中，将酿酒酵母接种到YPD培养基中稀释至OD值为0.2，培养至少4.5h，收集细胞，将含有所述插入片段与工具质粒的转化液与细胞混合，42℃培养孵育，然后收集细胞。
本发明还公开了一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株，所述重组酿酒酵母菌株通过上述的构建方法构建而成。
本发明还公开了一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株在产大麻萜酚酸中的应用。
本发明的有益效果是：本发明首次通过改造半乳糖启动子，使gal1调控基因的表达不依赖于半乳糖诱导，解决半乳糖诱导导致的菌株生长延迟问题，不影响甚至提高半乳糖启动子gal1调控的基因的表达，增加了目标产物CBGA 的产量，极大降低大规模培养菌株时半乳糖的成本，对CBGA的工业生产具有十分重要的应用价值。
附图说明
图1为大麻二酚酸在酿酒酵母中的合成途径；
图2为将菌株yG003为对照组，在YPG条件下CBGA的检测数据对比图；
图3为将菌株yG003为对照组，在YPD条件CBGA的检测数据对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加浅显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
本发明提供了一种半乳糖启动子改造的重组酿酒酵母的构建方法，将半乳糖gal1调控基因的表达所依赖的gal80、mig1及半乳糖代谢所需的 gal1/10/7敲除，获得高产CBGA的重组酿酒酵母。
所述的半乳糖启动子改造重组酿酒酵母的构建方法中包括以下步骤：
(1)如表一所示，以含有大麻二酚酸CBGA合成途径的yG003为出发菌株，第一步将半乳糖启动子相关的gal80敲除，得到单敲菌株yG004；
(2)在yG004基础上进行半乳糖启动子改造，敲除mig1，保护敲除gal80 和mig1得到的菌株yG005；
(3)在yG004基础上进行半乳糖启动子改造，敲除gal1/10/7，保护敲除 gal80和gal1/10/7得到的菌株yG006；
(4)在yG006基础上进行半乳糖启动子改造，敲除mig1，保护敲除gal80、 mig1和gal1/10/7得到的菌株yG007。
表一：构建菌株
| 构建菌株 | 宿主 | 基因描述 |
| yG003 | 含大麻萜酚酸CBGA合成途径 | |
| yG004 | yG003 | Deletion of gal 80 |
| yG005 | yG004 | deletion of mig1，gal80 |
| yG006 | yG004 | deletion of gal1/10/7，gal80 |
| yG007 | yG006 | deletion of gal80、mig1、gal1/10/7 |
所述的半乳糖启动子改造的重组酿酒酵母的构建方法中，转化的一种方式包括以下步骤，所用引物序列见表二：
(1)以酿酒酵母菌株cen.pk2-1c的基因组为模板，通过引物Fgal80-Up 和Rgal80up(Dp)将PCR扩增得到gal80位点上游同源臂片段gal80-Up；通过引物Fgal80Dp和Rgal80Dp(UP)将PCR扩增得到gal80位点下游同源臂片段 gal80-Down。PCR条件：40cycle，PCR反应体系均为50ul：2xphanta酶25ul， F-primer 1.25ul，R-primer 1.25ul，DNA模板1ul，ddH2O 21.5ul；
(2)以酿酒酵母菌株cen.pk2-1c的基因组为模板，通过PCR扩增得到gal80 位点下游同源臂片段gal80-Down；
(3)以可识别并切割位gal80点的pCUT-gal80(Ura)质粒为工具质粒；
(4)将gal80-Up、gal80-Down、pCUT-gal80(Ura)质粒作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得敲除gal80的重组酿酒酵母；
(5)以酿酒酵母菌株cen.pk2-1c的基因组为模板，通过引物FUp_Gal1和 RUp_Gal1(Dp)将PCR扩增得到gal1/10/7位点上游同源臂片段gal1/10/7-Up和通过引物FDp_Gal(Up)和RDp_Gal将PCR扩增得到gal1/10/7位点下游同源臂片段gal1/10/7-Down片段；
(6)以可识别并切割位点gal1/10/7的pCUT-gal1/10/7-1d(Ura)质粒为工具质粒；
(8)将gal1/10/7-Up、gal1/10/7-Down、pCUT-gal1/10/7-1d(Ura)质粒作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得敲除gal1/10/7的重组酿酒酵母；
(9)以敲除mig1的酿酒酵母菌株的基因组为模板，通过引物Fmig1 val 和Rmig1val将PCR扩增得到mig1位点敲除片段；
(10)以可识别并切割位点mig1的pCUT-mig1-3a(Ura)质粒为工具质粒；
(11)将mig1位点敲除片段、pCUT-mig1-3a(Ura)质粒作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得敲除mig1的重组酿酒酵母。
表2引物序列
| 引物名称 | 序列 |
| Fgal80-Up | gcctgtctacaggataaagacggg |
| Rgal80up(Dp) | actgggggccaagcacagggcaagatgcttgacgggagtggaaagaacgg |
| Fgal80Dp | agttggtttcccgttctttccactcccgtcaagcatcttgccctgtgcttg |
| Rgal80Dp(UP) | aaatatgacccccaatatgagaaattaaggctag |
| FGAL80val | aataatatcctatattttcttcatttaccgg |
| Rgal80val | tactaaggaaatttgatatttcaaatgtagtatg |
| FUp_Gal1 | GGAAAATAAAGTAGTAATAACGATACC |
| RUp_Gal1(Dp) | TATTAAGTAGTTGAAGCATGTATGAACTATGACATCATTATCTGTAAATCTGATTC |
| FDp_Gal(Up) | GAATCAGATTTACAGATAATGATGTCATAGTTCATACATGCTTCAACTAC |
| RDp_Gal | AAACACCCAAGATTGATTTGTC |
| Fgal7/10/1val | CTTGGCTCATTTCCATTTGAGG |
| Rgal7/10/1val | AACGAAACCGTACCCAATCC |
| Fmig1 val | CTTGACGTGTAGAAGATTGACG |
| Rmig1 val | ACTTCAGCATCAACAAGCGA |
| Fsmig1 | CACCCCAGTACTCATTAACG |
| F-GAL7_up | CGTAATAAACTTCAACAGAGCC |
所述的半乳糖启动子改造重组酿酒酵母的构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350法。出发的酿酒酵母选择菌株yG003。
所述的半乳糖改造的重组酿酒酵母的构建方法中，醋酸锂/PEG3350法的步骤包括：将酿酒酵母接种到YPD培养基中稀释至OD值为0.2，培养至少4.5h，收集细胞，将含有所述插入片段与工具质粒的转化液与细胞混合，42℃培养孵育，然后收集细胞。
所述的半乳糖启动子改造的重组酿酒酵母的构建方法中，插入片段的用量为：每5OD酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用50μL DNA混合物悬浮该细胞， 50μL DNA混合物由2μg所述插入片段、250ng工具质粒以及足量ddH2O混合而成。
所述的半乳糖启动子改造的重组酿酒酵母的构建方法中，插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
第二方面，本发明提供了采用上述构建方法得到的半乳糖启动子改造的重组酿酒酵母。
第三方面，本发明提供了上述重组酿酒酵母发酵生产CBGA的应用。下面对本发明的培养、样品提取及检测进行描述。
本发明菌株培养：构建菌株的单菌落在2ml 1xYPD(葡萄糖2％w/v，酵母提取物1％w/v，蛋白胨2％w/v)24孔板中，在30度550rpm摇床中过夜培养 16h左右，过夜菌液用1xYPD稀释10倍后，采用紫外分光光度计检测菌液浓度OD600，然后转接至3ml培养液中，起始OD＝0.2，按照表A/B/C/D四种培养基条件下30度550rpm摇床中进行培养。培养基分别为YPG(半乳糖2％w/v，酵母提取物1％w/v，蛋白胨2％w/v)和YPD(葡萄糖2％w/v，酵母提取物1％w/v，蛋白胨2％w/v)。培养期间添加1mM己酸产大麻萜酚酸，培养84h收集200ul 样品进行产物分析。
样品提取检测：加入0.2ml体积0.5mm玻璃珠和2倍体积的乙酸乙酯进行提取。在高速组织研磨仪中处理180s，间隔30s，重复三次，瞬时离心后，取上层有机层至1.5ml离心管中，加入乙酸乙酯重复震荡萃取两次，收集的上层有机相。在旋转蒸发仪上挥干至无溶剂残留，用80％乙腈/H2O溶剂(含0.05％甲酸)重悬，0.22um PVDF滤膜过滤至液相检测瓶内插管中，作为检测样品。
样品CBGA检测：样品准备好之后，用安捷伦液相质谱分析仪器HPLC1290 进行检测CBGA产物定量，色谱柱型号为Poroshell 120EC-C18柱，3.0x100mm， 2.7um，分析柱稳维持恒定40摄氏度，检测条件见表三。以出发菌株yG003作为对照，用CBGA标样作为参照进行分析。
表3：HPLC检测条件
本专利首次通过改造半乳糖启动子，使gal1调控基因的表达不依赖于半乳糖诱导，解决半乳糖诱导导致的菌株生长延迟问题，不影响甚至提高半乳糖启动子gal1调控的基因的表达，增加了目标产物CBGA的产量，极大降低大规模培养菌株时半乳糖的成本，对CBGA的工业生产具有十分重要的应用价值。
下面我们通过一些具体地实施方式，来对本发明进一步阐述，首先我们对实施例中使用的一系列原料加以说明：
YPD培养基配方：葡萄糖2％w/v，酵母提取物1％w/v，蛋白胨2％w/v。
YPG培养基配方：半乳糖2％w/v，酵母提取物1％w/v，蛋白胨2％w/v。
醋酸锂转化混合物：50％W/V PEG3350 260μL，1mol/L LiOAc 36μL，变性鱼精DNA10μL(变性鱼精使用前先置于95℃金属浴变性5min)，ddH2O 4μL。
缺少尿嘧啶的筛选平板配方：酵母氮源母液1.7g/L,硫酸铵5g/L，各种氨基酸如表4所示，琼脂20g/L，葡萄糖20g/L，注：葡萄糖和半乳糖单独115°灭菌30min。
表4筛选平板中各种氨基酸的含量
案例一：敲除gal80菌株yG004产大麻萜酚酸CBGA
敲除gal80菌株yG004菌株按照YPG培养方式：单菌落在2ml 1xYPD(葡萄糖2％w/vw/v，酵母提取物1％w/v，蛋白胨2％w/v)培养16h左右，转接至培养基为YPG(半乳糖2％w/v，酵母提取物1％w/v，蛋白胨2％w/v)3ml进行培养，间隔12h补加己酸0.2mM，补加5次，培养84h收集200ul样品。对照菌株 yG003同样条件下培养。取样检测得到的OD600,yG003为4.93，yG004为4.52, 说明敲除gal80不影响菌株生长，目的化合物大麻萜酚酸CBGA，yG003样品产率为16.6uM，yG004样品产率为28.9uM，比出发菌株高出74％，见图2所示。
案例二：敲除gal80、mig1、gal1/10/7菌株yG007产大麻萜酚酸CBGA
敲除gal80、mig1、gal1/10/7菌株yG007菌株按照YPD培养方式：单菌落在2ml1xYPD(葡萄糖2％w/v w/v，酵母提取物1％w/v，蛋白胨2％w/v)培养 16h左右，转接至培养基为1xYPD 3ml进行培养，间隔12h补加己酸0.2mM，补加5次，培养84h收集200ul样品。对照菌株yG003同样条件下培养。取样检测得到的OD600。yG003为2.82，yG007为4.38,说明半乳糖改造后菌株生长提高。在YPD培养条件下，无半乳糖诱导，目的化合物大麻萜酚酸CBGA，yG003 样品产率为4.5uM，yG007样品产率为45.5uM，比出发菌株高出10倍左右，见图3所示。
尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，本专利保护敲除
gal80得到的菌株yG004，保护敲除gal80和mig1得到的菌株yG005，保护敲除gal80和gal1/10/7得到的菌株yG006，保护敲除gal80、mig1和 gal1/10/7得到的菌株yG007。
本发明首次通过改造半乳糖启动子，使gal1调控基因的表达不依赖于半乳糖诱导，解决半乳糖诱导导致的菌株生长延迟问题，不影响甚至提高半乳糖启动子gal1调控的基因的表达，增加了目标产物CBGA的产量，极大降低大规模培养菌株时半乳糖的成本，对CBGA的工业生产具有十分重要的应用价值。
以上所述实施例仅表达了本发明的两种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
<120> 一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株及其构建方法和应
用
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<211> 1308
<212> DNA
<213> 半乳糖启动子
<400> 1
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atgacaagtt cgtacttttc caggataaat gcaatggttt tcaataatat tccagagcaa 720
gagctgatag atgagcgtgg taaccgattg ggccagcgag tcccaaagac agtaccggat 780
catcttttat tccaaggcac attgttaaat ggcaatgttc cagtgtcatg cagtttcaaa 840
ggtggcaaac ctaccaaaaa atttaccaaa aatttggtca ttgacattca cggtaccaag 900
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<210> 2
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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gagagtaaaa gcaagtccaa agtagctgcg aagtcagagg cgccaagacc acatgcttgt 120
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attcctattg ctattgctcc gaaagaaaat tcaagtcgat cttctacaag aaaaggtaga 480
aaaaccaaat tcgaaatcgg cgaaagtggt gggaatgacc catatatggt ttcttctccc 540
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atgaactacc aaacttcatc cgcttccact gctttgtctt cgttgagcaa tagccatagt 660
ggcagtagac tgaaactgaa cgcgttatcg tccctacaaa tgatgacgcc cattgctagc 720
agtgcgccaa ggactgtttt catagacggt cctgaacaga aacaactaca acaacaacaa 780
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gattttcaag gattgaacaa tgcaaatcca aacaacaatg gaagtctcag agcacaaact 900
cagagttccg tacagttgaa gagaccaagt tcagttttaa gtttgaacga cttgttggtt 960
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agtggtacga atttgcacac tttggggtat gtaatgaacc aaaatcactt gcatttctcc 1200
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ccaagggtga atatgattaa tactgctata tccacccaac aaacccccat ttctcagtcg 1440
gattcacaag ttcaagaact ggaaacatta ccacccataa gaagtttacc gttgcccttc 1500
ccacacatgg actga 1515
<210> 3
<211> 1587
<212> DNA
<213> 半乳糖启动子
<400> 3
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cattatctac aaagactgta a 1101
Claims (9)
1.一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤01、构建酿酒酵母菌株yG003,将酿酒酵母菌株yG003中的半乳糖启动子相关的gal80敲除，得到酿酒酵母菌株yG004；
步骤02、在酿酒酵母菌株yG004基础上进行半乳糖启动子改造，敲除gal1/10/7，保护敲除gal80和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG006；
步骤03、在酿酒酵母菌株yG006基础上进行半乳糖启动子改造，敲除mig1，保护敲除gal80、mig1和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG007。
2.根据权利要求1所述的通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤01包括：
步骤11、以酿酒酵母菌株cen.pk2-1c的基因组为模板，通过引物Fgal80-Up和Rgal80up(Dp)将PCR扩增得到gal80位点上游同源臂片段gal80-Up；通过引物Fgal80Dp和Rgal80Dp(UP)将PCR扩增得到gal80位点下游同源臂片段gal80-Down。PCR条件：40cycle，PCR反应体系均为50ul：2xphanta酶25ul，F-primer1.25ul，R-primer1.25ul，DNA模板1ul，ddH2O21.5ul；
步骤12、以酿酒酵母菌株cen.pk2-1c的基因组为模板，通过PCR扩增得到gal80位点下游同源臂片段gal80-Down；
步骤13、以可识别并切割位gal80点的pCUT-gal80(Ura)质粒为工具质粒；
步骤14、将gal80-Up、gal80-Down、pCUT-gal80(Ura)质粒作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得敲除gal80的重组酿酒酵母。
3.根据权利要求1所述的通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤02包括：
步骤21、以酿酒酵母菌株cen.pk2-1c的基因组为模板，通过引物FUp_Gal1和RUp_Gal1(Dp)将PCR扩增得到gal1/10/7位点上游同源臂片段gal1/10/7-Up；通过引物FDp_Gal(Up)和RDp_Gal将PCR扩增得到gal1/10/7位点下游同源臂片段gal1/10/7-Down片段；
步骤22、以可识别并切割位点gal1/10/7的pCUT-gal1/10/7-1d(Ura)质粒为工具质粒；
步骤23、将gal1/10/7-Up、gal1/10/7-Down、pCUT-gal1/10/7-1d(Ura)质粒作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得敲除gal1/10/7的重组酿酒酵母。
4.根据权利要求1所述的通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤03包括：
步骤31、以敲除mig1的酿酒酵母菌株的基因组为模板，通过引物Fmig1val和Rmig1val将PCR扩增得到mig1位点敲除片段；
步骤32、以可识别并切割位点mig1的pCUT-mig1-3a(Ura)质粒为工具质粒；
步骤33、将mig1位点敲除片段、pCUT-mig1-3a(Ura)质粒作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得敲除mig1的重组酿酒酵母。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350法。
6.根据权利要求5所述的通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述醋酸锂/PEG3350法包括：
将酿酒酵母接种到YPD培养基中稀释至OD值为0.1-0.3，培养至少4.5h，收集细胞，将含有所述插入片段与工具质粒的转化液与细胞混合，40℃-50℃培养孵育，然后收集细胞；
所述的半乳糖启动子改造的重组酿酒酵母的构建方法中，插入片段的用量为：每5OD酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用50μL DNA混合物悬浮该细胞，50μL DNA混合物由2μg所述插入片段、250ng工具质粒以及足量ddH2O混合而成；
所述的半乳糖启动子改造的重组酿酒酵母的构建方法中，插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
7.根据权利要求2所述的通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，将酿酒酵母接种到YPD培养基中稀释至OD值为0.2，培养至少4.5h，收集细胞，将含有所述插入片段与工具质粒的转化液与细胞混合，42℃培养孵育，然后收集细胞。
8.一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株，其特征在于，所述重组酿酒酵母菌株通过权利要求1-7中任意一项所述的构建方法构建而成。
9.一种权利要求8所述的通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株在产大麻萜酚酸中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202011319525.3A CN114369613A (zh) | 2020-11-23 | 2020-11-23 | 一种通过改造半乳糖启动子构建高产cbga合成的酵母菌株及其构建方法和应用 |
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Publications (1)
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| PB01 | Publication | ||
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