CN114369541A - 一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用 - Google Patents

一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用。该方法包括步骤01、构建酿酒酵母yG010；步骤02、替换酿酒酵母yG010基因组中的内源脂肪酸合成酶FASI的启动子，得到重组酿酒酵母yG011；步骤03、替换酿酒酵母yG011基因组中MvaE的表达启动子。本发明通过调控酵母细胞内源脂肪酸合成酶FASI的表达水平及内源甲羟戊酸合成通路(MVA)中MvaE酶的表达水平来解决合成路径中对前体乙酰辅酶A不均衡竞争及分配的问题，达到高产大麻萜酚酸的目的。

Description

一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法 和应用
技术领域
本发明涉及合成生物学技术领域基因工程改造技术，更具体地，本发明涉及在酿酒酵母中通过甲羟戊酸合成通路中酶 MvaE 及内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平构建的高产大麻二酚酸的菌株构建方法和应用。
背景技术
大麻二酚酸 CBGA 是合成物中的重要前体化合物，其从头生物合成途径如附图 1所示。
在合成大麻二酚酸 CBGA 的途径中，三条中间产物的合成路径同时利用前体乙酰辅酶 A（如附图 1 所示）。由于对乙酰辅酶 A 的竞争能力不同导致了乙酰辅酶 A 在三条通路中的不平衡分配结果，进而影响到终产物 CBGA 的合成。
因此，市面上亟需一种能够解决上述一个或者多个问题的一种在酿酒酵母中通过甲羟戊酸合成通路中酶 MvaE 及内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平构建的高产大麻二酚酸的菌株构建方法和应用。
发明内容
为解决现有技术中存在的一个或者多个问题，本发明提供了一种在酿酒酵母中通过甲羟戊酸合成通路中酶 MvaE 及内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平构建的高产大麻二酚酸的菌株构建方法和应用。
本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母的构建方法，所述方法包括：
步骤 01、构建酿酒酵母 yG010，在高产大麻萜酚酸菌株 yG003 基因组中采用pTDH3 启动子表OAC 基因；
步骤 02、替换酿酒酵母 yG010 基因组中的内源脂肪酸合成酶FASI 的启动子，得到重组酿酒酵母yG011。
在一些实施例中，所述方法包括：
步骤 03、以重组酿酒酵母 yG011 的基因组为模板，替换基因组中的 MvaE 酶的启动子，得到系列重组酿酒酵母 yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。
在一些实施例中，所述步骤 02 包括：
步骤 21、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到上游同源臂 FAS1-Up 片段；
步骤 22、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到下游同源臂 FAS1-Down 片段；
步骤 23、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到 pHXT1片段；
步骤 24、将 FAS1-Up 、pHXT1、FAS1-Down 作为插入片段转化至酿酒酵母yG010中，获得调控FASI 表达水平的重组酿酒酵母 yG011。
在一些实施例中，所述步骤 03 包括：
步骤 31、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到上游同源臂 MvaE-Up 片段；
步骤 32、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到下游同源臂 MvaE-Down 片段；
步骤 33、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到 pHXK1
等启动子片段；
步骤 34、将 MvaE-Up、pHXK1 等启动子片段、MvaE-Down 作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得调控 MvaE 表达水平的系列重组酿酒酵母 yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。
在一些实施例中，所述步骤 03 包括：
步骤 31、以初始酿酒酵母yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到上游同源臂 MvaE-Up 片段；
步骤 32、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到下游同源臂 MvaE-Down 片段；
步骤 33、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到 pHXK1等启动子片段；
步骤 33、MvaE-Up、pHXK1 等启动子片段、MvaE-Down 作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得调控 MvaE 表达水平的系列重组酿酒酵母 yG012、yG013、yG014、yG015、yG016、yG017、yG018。
在一些实施例中，所述的调控 FASI 表达水平的重组酿酒酵母的构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350 法；
所述醋酸锂/PEG3350 法的步骤包括：将酿酒酵母接种到 1xYPD 培养基中使起始OD 值为 0.2，培养 4-4.5 h，根据构建菌株数，通过离心、洗涤后收集细胞；
插入片段的用量为：每 5 OD 酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用 50μL DNA 混合物悬浮该细胞，50μL DNA 混合物由 2μg 所述插入片段、250 ng 工具质粒以及足量 ddH2O混合而成；
插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
在一些实施例中，所述调控 MvaE 表达水平的重组酿酒酵母的构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350 法；
所述醋酸锂/PEG3350 法的步骤包括：将酿酒酵母接种到 1xYPD 培养基中使起始OD 值为 0.2，培养 4-4.5 h，收集细胞，根据构建菌株数，通过离心、洗涤后收集细胞；
插入片段的用量为：每 5 OD 酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用 50μL DNA 混合物悬浮该细胞，50μL DNA 混合物由 2μg 所述插入片段、250 ng 工具质粒以及足量 ddH2O混合而成；
插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
本发明公开了一种优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母，所述重组酿酒酵母通过上述的构建方法构建而成。
本发明还公开了一种重组酿酒酵母在产大麻萜酚酸中的应用。
本发明的有益效果是：本发明通过调控酵母细胞内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平及内源甲羟戊酸合成通路（MVA）中 MvaE 酶的表达水平来解决合成物路径中对前体乙酰辅酶 A 不均衡竞争及分配的问题，达到高产大麻萜酚酸的目的。
附图说明
图 1 为大麻萜酚酸在酿酒酵母中的合成途径；
图 2 为替换 FAS1 启动子菌株 yG010 基础上 MvaE 启动子替换菌株的大麻二酚酸 CBGA 产率比较；
图 3 为替换 FAS1 启菌株 yG011 基础上 MvaE 启动子替换菌株的大麻二酚酸CBGA 产率比较。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加浅显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
本发明公开了一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母的构建方法，所述方法包括：
步骤 01、构建酿酒酵母 yG010，在高产大麻萜酚酸菌株yG003 基因组中采用pTDH3 启动子表OAC 基因；
步骤 02、替换酿酒酵母 yG010 基因组中的内源脂肪酸合成酶FASI 的启动子，得到重组酿酒酵母yG011。
在一些实施例中，所述方法包括：
步骤 03、以重组酿酒酵母 yG011 的基因组为模板，替换基因组中的 MvaE 酶的启动子，得到系列重组酿酒酵母 yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。
在一些实施例中，所述步骤 02 包括：
步骤 21、以初始酿酒酵母yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到上游同源臂 FAS1-Up 片段；
步骤 22、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到下游同源臂 FAS1-Down 片段；
步骤 23、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到 pHXT1片段；
步骤 24、将 FAS1-Up 、pHXT1、FAS1-Down 作为插入片段转化至酿酒酵母yG010中，获得调控FASI 表达水平的重组酿酒酵母 yG011。
在一些实施例中，所述步骤 03 包括：
步骤 31、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到上游同源臂 MvaE-Up 片段；
步骤 32、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到下游同源臂 MvaE-Down 片段；
步骤 33、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到 pHXK1等启动子片段；
步骤 34、将 MvaE-Up、pHXK1 等启动子片段、MvaE-Down 作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得调控 MvaE 表达水平的系列重组酿酒酵母 yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。
在一些实施例中，所述步骤 03 包括：
步骤 31、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到上游同源臂 MvaE-Up 片段；
步骤 32、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到下游同源臂 MvaE-Down 片段；
步骤 33、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到 pHXK1等启动子片段；
步骤 33、MvaE-Up、pHXK1 等启动子片段、MvaE-Down 作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得调控 MvaE 表达水平的系列重组酿酒酵母 yG012、yG013、yG014、yG015、yG016、yG017、yG018。
在一些实施例中，所述的调控 FASI 表达水平的重组酿酒酵母的构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350 法；
所述醋酸锂/PEG3350 法的步骤包括：将酿酒酵母接种到 1xYPD 培养基中使起始OD 值为 0.2，培养 4-4.5 h，根据构建菌株数，通过离心、洗涤后收集细胞；
插入片段的用量为：每 5 OD 酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用 50μL DNA 混合物悬浮该细胞，50μL DNA 混合物由 2μg 所述插入片段、250 ng 工具质粒以及足量 ddH2O混合而成；
插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
在一些实施例中，所述调控 MvaE 表达水平的重组酿酒酵母的构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350 法；
所述醋酸锂/PEG3350 法的步骤包括：将酿酒酵母接种到 1xYPD 培养基中使起始OD 值为 0.2，培养 4-4.5 h，收集细胞，根据构建菌株数，通过离心、洗涤后收集细胞；
插入片段的用量为：每 5 OD 酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用 50μL DNA 混合物悬浮该细胞，50μL DNA 混合物由 2μg 所述插入片段、250 ng 工具质粒以及足量 ddH2O混合而成；
插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
本发明公开了一种优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母，所述重组酿酒酵母通过上述的构建方法构建而成。
本发明还公开了一种重组酿酒酵母在产大麻萜酚酸中的应用。首先对实施例中使用的一系列原料加以说明：
1xYPD 培养基配方：酵母浸膏 10.0g/L，蛋白胨 20.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L。醋酸锂转化混合物：50% W/V PEG3350 260μL，1mol/LLiOAc36μL，
变性鱼精 DNA 10μL（变性鱼精使用前先置于 95℃金属浴变性 5 min）， ddH2O4μL。
缺少尿嘧啶的筛选平板配方：酵母氮源母液 1.7 g/L, 硫酸铵 5g/L，各种氨基酸如表 3 所示，琼脂 20g/L，葡萄糖 20g/L，注：葡萄糖分开灭菌。
表 4 筛选平板中各种氨基酸的含量
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE002
具体地，首先构建 FASI 改造菌株：
首先替换 FAS1 启动子，构建菌株 yG011（pHXT1-FASI）。通过 2xPhantaMaxMasterMix（PhantaDNA 聚合酶）进行 PCR 扩增整合片段。以初始酿酒酵母 yG010 基因组为模板，使用引物 1 和引物 2 扩增获得上游同源臂 FAS1-UP 片段，使用引物 3 和引物4 扩增获得下游同源臂 FAS1-DOWN（pHXT1）片段。使用引物 5 和
引物 6 扩增出片段pHXT1。然后将片段的组合转化到酿酒酵母中。引物 7 和引物
8 用于对重组酿酒酵母进行 PCR 反应，获得菌落 PCR 阳性克隆的菌液，用于基因测序。验证正确后，菌株yG011 构建成功，作为替换 MvaE 启动子的宿主菌。
表 1 替换 FASI 启动子引物序列
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE004
在FAS1 改造基础上构造 MvaE 改造菌株：
通过 2xPhanta Max Master Mix（Phanta DNA 聚合酶）进行 PCR 扩增整合片段。以初始酿酒酵母 yG009 组为模板，使用引物 1 和引物 2 扩增获得上游同源臂MavE-UP片段，使用引物3和引物4扩增获得下游同源臂MvaE-DOWN（pHXK1）片段，使用引物 5 和引物 6扩增出片段pHXK1。然后将片段的组合转化到宿主酿酒酵母 yG011 中，获得菌株 yG024。引物 7 和引物 8 用于对菌株 yG024 进行PCR 反应，获得菌落 PCR 阳性克隆的菌液，用于基因测序。
表 2 替换 MvaE 启动子引物序列
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE006
实验过程中转化操作保持一致，先将宿主菌株在YPD 培养基中活化，即1xYPD 中，30℃，200 rpm 培养过夜。然后接种到新的 1xYPD 培养基中使起始 OD 值为0.2，30℃继续培养 4-4.5 h 后，取 5 OD 菌液，常温 3000 rcf，离心 5 min，弃上清，并用灭菌超纯水洗涤两次，获得酵母细胞；配制 DNA 混合物，每个构建取 5 OD 的菌液获得细胞，并与 50μLDNA 混合物混合，使细胞重悬。在悬浮的细胞中加入醋酸锂转化混合物，经培养后获取细胞，涂布到筛选平板上，获取单菌落，即为重组酿酒酵母，测序验证转化成功后，将重组酿酒酵母进行保存。
表 3 为菌株构建信息
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE008
转化实施例 1
将出发菌株 yG010 接种于 10 mL 液体 YPD 培养基中，30℃、200 rpm 培养过夜。第二天测定菌液OD 值，并取适量菌液接种于 50 mL YPD 培养基中稀释至OD 值为0.2，继续培养 4.5 h。每个构建取 5 OD 菌液，常温 3000 rcf，离心 5 min，弃上清，并用ddH2O 洗涤两次，获得酵母菌细胞。最后用 50μL DNA 混合物（FAS1-Up、FAS1-Down，pHXT1三种片段共 2μg，加 ddH2O 至 DNA 混合物达到50μL）悬浮细胞。然后加入上述醋酸锂转化混合物，混匀。42℃水浴 40 min。25℃，5000 rpm，离心 1 min，弃上清，并用 500μL ddH2O，轻轻吹匀。取 50μL 菌液涂布于上述缺少尿嘧啶的筛选平板上，30℃培养 72h，获得重组酿酒酵母yG011。
转化实施例 2
出发菌株 yG011 接种于 10 mL 液体 YPD 培养基中，30℃、200 rpm 培养过夜。第二天测定菌液 OD 值，并取适量菌液接种于 50 mL YPD 培养基中稀释至 OD 值为 0.2，继续培养 4.5 h。每个构建取 5 OD 菌液，常温 3000 rcf，离心 5 min，弃上清，并用ddH2O 洗涤两次，获得酵母菌细胞。最后用 50μL DNA 混合物（MavE-Up、MvaE-Down，pHXK1三种片段共 2μg，加 ddH2O 至 DNA 混合物达到50μL）悬浮细胞。然后加入上述醋酸锂转化混合物，混匀。42℃水浴 40 min。25℃，5000 rpm，离心 1 min，弃上清，并用 500μL ddH2O，轻轻吹匀。取 50μL 菌液涂布于上述缺少尿嘧啶的筛选平板上，30℃培养 72h，获得重组酿酒酵母yG024。
菌落PCR 及测序验证
待实施例 1 或实施例 2 的筛选平板上长出单克隆菌落后，进行菌落 PCR 及测序验证，具体步骤是：用枪头挑取少量细胞分别置于 20 μL 20 mmol/L NaOH 溶液，涡旋混匀，于金属浴 95℃孵育 20 min，涡旋混匀，取 1μL 菌液作为模板进行菌落 PCR 反应，反应引物为引物 7 和引物 8，比对克隆条带与阴性克隆条带大小，挑选菌落 PCR 阳性克隆的菌液送致金唯智公司进行测序验证。测序正确的菌株进行划线保存和甘油冻存。
重组酿酒酵母菌株培养：
取实施例 1 的单菌落进行培养：
单菌落在 2ml 1xYPD24 孔板 30℃ 550rpm 摇床中过夜培养 16h 后，过夜菌液用 1xYPD 稀释 10 倍后用紫外分光光度计检测菌液 OD，波长设置为 600nm。然后使起始OD=0.2 转接至 3ml 1xYPD 培养液中培养。培养方式为：转接后，每12h 加一次己酸（0.2mM），共五次。每 12h 加一次半乳糖（1% w/v），共六次。培养 84h 后收集 200ul 菌液为样品。
取实施例 2 的单菌落进行培养：
单菌落在 2ml 1xYPD24 孔板中 30℃ 550rpm 摇床中过夜培养 16h 后，过夜菌液用 1xYPD 稀释 10 倍后用紫外分光光度计检测菌液 OD，波长设置为 600nm。然后使起始 OD=0.2 转接至 3ml 1xYPG 培养液（中培养。培养方式为：转接后，每 12h 加一次己酸（0.2mM），共五次。转接后 24h 开始，每 12h 补加一次半乳糖（2% w/v），共五次，终浓度2%。培养 84h 后收集 200ul 菌液为样品。
重组酿酒酵母产 CBGA 检测数据
实施例 1 或实施例 2 采用同样的方法制作检测样品：
样品收集后，根据样品 OD600，先用破壁酶 2U/OD 于 30 度,200rpm 摇床温育处理 60min，然后加入 0.2ml 体积 0.5mm 玻璃珠和 0.4ml 的乙酸乙酯：甲酸
（0.05%），在高速组织研磨仪中，以 70Hz 处理 180s，间隔 30s，重复三次，每次处理后将研磨托盘置于冰上冷却 1min，震荡 15~30s，瞬时离心后，取上层有机层 0.28ml 至1.5ml 离心管中，重复两次，并将收集的上层有机相合并。三次提取的有机层，Evaporation, mode V-AL, 45 C 1 h 挥干至无溶剂残留，用重悬液 AHF(乙腈：H2O：甲酸=80:20:0.05% ,含内标 PHB(对羟基苯甲酸丙酯溶液标准物质)15uM)140ul 重悬，0.22umPVDF 滤膜过滤至液相检测瓶内插管中，作为检测样品。每种样品三个平行。样品准备好之后，用HPLC 进行检测，检测条件见表 5。
表 5：HPLC 检测条件
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE010
表 6：序列表
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE012
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE014
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE016
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE018
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE020
图 2 为替换 FAS1 启动子菌株 yG010 基础上 MvaE 启动子替换菌株的大麻二酚酸 CBGA 产率比较；图 3 为替换 FAS1 启菌株 yG011 基础上 MvaE 启动子替换菌株的大麻二酚酸 CBGA 产率比较。
从图中可以看出，同时改造了 FASI 酶表达水平及 MvaE 表达水平的菌株
5 yG024 高产，达到了改造需求。
综上所述，本发明通过调控酵母细胞内源内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平及甲羟戊酸合成通路（MVA）中 MvaE 酶的表达水平，改造后的工程菌株可以合理地在整个合成通路中分配前体乙酰辅酶 A，即改善丙二酰辅酶 A 和己酰辅酶A 通路对前体乙酰辅酶A的利用，从而平衡合成途径的代谢流，提高大麻二酚酸 CBGA 的产量，本实例中最高达原菌株产量 50 倍。本发明首次通过在酵母中通过调控代谢流提高CBGA 的产量，对CBDA 的生物合成具有十分重要的意义。
以上所述实施例仅表达了本发明的两种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
<120> 一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用
<130> 2022
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tatcttaact gatagtttga tcaaaggggc aaaacgtagg ggcaaacaaa cggaaaaatc 60
gtttctcaaa ttttctgatg ccaagaactc taaccagtct tatctaaaaa ttgccttatg 120
atccgtctct ccggttacag cctgtgtaac tgattaatcc tgcctttcta atcaccattc 180
taatgtttta attaagggat tttgtcttca ttaacggctt tcgctcataa aaatgttatg 240
acgttttgcc cgcaggcggg aaaccatcca cttcacgaga ctgatctcct ctgccggaac 300
accgggcatc tccaacttat aagttggaga aataagagaa tttcagattg agagaatgaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaagg cagaggagag catagaaatg gggttcactt tttggtaaag 420
ctatagcatg cctatcacat ataaatagag tgccagtagc gacttttttc acactcgaaa 480
tactcttact actgctctct tgttgttttt atcacttctt gtttcttctt ggtaaataga 540
atatcaagct acaaaaagca tacaatcaac tatcaactat taactatatc gtaatacaca 600
<210> 2
<211> 560
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcccatagga aatttcttgt gtcagtaata tgtctcgaga aaataataat aattgaatct 60
atttattgaa aagtaaatat ctcgtaaccc ggatgctttg ggcggtcggg ttttgctact 120
cgtcatccga tgagaaaaac tgttcccttt tgccccaggt ttccattcat ccgagcgatc 180
acttatctga cttcgtcact ttttcatttc atccgaaaca atcaaaactg aagccaatca 240
ccacaaaatt aacactcaac gtcatctttc actacccttt acagaagaaa atatccatag 300
tccggactag catcccagta tgtgactcaa tattggtgca aaagagaaaa gcataagtca 360
gtccaaagtc cgcccttaac caggcacatc ggaattcaca aaacgtttct ttattatata 420
aaggagctgc ttcactggca aaattcttat tatttgtctt ggcttgctaa tttcatctta 480
tccttttttt cttttcacac ccaaatacct aacaattgag agaaaactct tagcataaca 540
taacaaaaag tcaacgaaaa 560
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<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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atttctaaag cgcttcttca cctgcaggtt ctgagcccta agaaaaaaaa tttccttggt 120
tgaaaatggc ggaaaaaaaa aattcagaaa aagaaataaa gcacgtgtgc gcggtgtgtg 180
gatgatggtt tcatcattgt caacggcatt ttcgttcttg tggattgttg taaactttcc 240
agaacattct agaaagaaag cacacggaac gtttagaagc tgtcatttgc gttttttctc 300
cagattttag ttgagaaagt aattaaatta ttcttctttt tccagaacgt tccatcggcg 360
gcaaaaggga gagaaagaac ccaaaaagaa ggggggccat ttagattagc tgatcgtttc 420
gaggacttca aggttatata aggggtggat tgatgtatct tcgagaaggg attgagttgt 480
agtttcgttt cccaattctt acttaagttg ttttattttc tctatttgta agataagcac 540
atcaaaagaa aagtaatcaa gtattacaag aaacaaaaat tcaagtaaat aacagataat 600
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<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
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agaacattct agaaagaaag cacacggaac gtttagaagc tgtcatttgc gttttttctc 300
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gaggacttca aggttatata aggggtggat tgatgtatct tcgagaaggg attgagttgt 480
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<210> 5
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<212> DNA
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gcaaaaggga gagaaagaac ccaaaaagaa ggggggccat ttagattagc tgatcgtttc 420
gaggacttca aggttatata aggggtggat tgatgtatct tcgagaaggg attgagttgt 480
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atttctaaag cgcttcttca cctgcaggtt ctgagcccta agaaaaaaaa tttccttggt 120
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gatgatggtt tcatcattgt caacggcatt ttcgttcttg tggattgttg taaactttcc 240
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gcaaaaggga gagaaagaac ccaaaaagaa ggggggccat ttagattagc tgatcgtttc 420
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gatgatggtt tcatcattgt caacggcatt ttcgttcttg tggattgttg taaactttcc 240
agaacattct agaaagaaag cacacggaac gtttagaagc tgtcatttgc gttttttctc 300
cagattttag ttgagaaagt aattaaatta ttcttctttt tccagaacgt tccatcggcg 360
gcaaaaggga gagaaagaac ccaaaaagaa ggggggccat ttagattagc tgatcgtttc 420
gaggacttca aggttatata aggggtggat tgatgtatct tcgagaaggg attgagttgt 480
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tttttggtgg ttccggcttc cttcccgatt ccgcccgcta aacgcatatt tttgttgcct 60
ggtggcattt gcaaaatgca taacctatgc atttaaaaga ttatgtatgc tcttctgact 120
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cccctttttc tgttagacgg tgtcttgatc tacttgctat cgttcaacac caccttattt 360
tctaactatt ttttttttag ctcatttgaa tcagcttatg gtgatggcac atttttgcat 420
aaacctagct gtcctcgttg aacataggaa aaaaaaatat ataaacaagg ctctttcact 480
ctccttgcaa tcagatttgg gtttgttccc tttattttca tatttcttgt catattcctt 540
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ggagatatac aatagaacag ataccagaca agacataatg ggctaaacaa gactacacca 60
attacactgc ctcattgatg gtggtacata acgaactaat actgtagccc tagacttgat 120
agccatcatc atatcgaagt ttcactaccc tttttccatt tgccatctat tgaagtaata 180
ataggcgcat gcaacttctt ttcttttttt ttcttttctc tctcccccgt tgttgtctca 240
ccatatccgc aatgacaaaa aaatgatgga agacactaaa ggaaaaaatt aacgacaaag 300
acagcaccaa cagatgtcgt tgttccagag ctgatgaggg gtatctcgaa gcacacgaaa 360
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ttccagttac ttgaatttga aataaaaaaa agtttgctgt cttgctatca agtataaata 480
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ttctttttct gcacaatatt tcaagctata ccaagcatac aatcaactat ctcatataca 600
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<213> 人工序列
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ttaaactaag actaaccatc ataacttcca aggaattaat cgatatcttg cactcctgat 60
ttttcttcaa agagacagcg caaaggatta tgacactgtt gcattgagtc aaaagttttt 120
ccgaagtgac ccagtgctct tttttttttt ccgtgaagga ctgacaaata tgcgcacaag 180
atccaatacg taatggaaat tcggaaaaac taggaagaaa tgctgcaggg cattgccgtg 240
ccgatctttt gtctttcaga tatatgagaa aaagaatatt catcaagtgc tgatagaaga 300
ataccactca tatgacgtgg gcagaagaca gcaaacgtaa acatgagctg ctgcgacatt 360
tgatggcttt tatccgacaa gccaggaaac tccaccatta tctaatgtag caaaatattt 420
cttaacaccc gaagttgcgt gtccccctca cgtttttaat catttgaatt agtatattga 480
aattatatat aaaggcaaca atgtccccat aatcaattcc atctggggtc tcatgttctt 540
tccccacctt aaaatctata aagatatcat aatcgtcaac tagttgatat acgtaaaatc 600

Claims (10)

1.一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤01、构建酿酒酵母yG010，在高产大麻萜酚酸菌株yG003基因组中采用pTDH3启动子表OAC基因；
步骤02、替换酿酒酵母yG010基因组中的内源脂肪酸合成酶FASI的启动子，得到重组酿酒酵母yG011。
2.根据权利要求1所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤03、以重组酿酒酵母yG011的基因组为模板，替换基因组中的MvaE酶的启动子，得到系列重组酿酒酵母yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。
3.根据权利要求1所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述步骤02包括：
步骤21、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂FAS1-Up片段；
步骤22、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂FAS1-Down片段；
步骤23、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到pHXT1片段；
步骤24、将FAS1-Up、pHXT1、FAS1-Down作为插入片段转化至酿酒酵母yG010中，获得调控FASI表达水平的重组酿酒酵母yG011。
4.根据权利要求2所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述步骤03包括：
步骤31、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂MvaE-Up片段；
步骤32、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂MvaE-Down片段；
步骤33、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到pHXK1等启动子片段；
步骤34、将MvaE-Up、pHXK1等启动子片段、MvaE-Down作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得调控MvaE表达水平的系列重组酿酒酵母yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。
5.根据权利要求2所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述步骤03包括：
步骤31、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂MvaE-Up片段；
步骤32、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂MvaE-Down片段；
步骤33、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到pHXK1等启动子片段；
步骤33、MvaE-Up、pHXK1等启动子片段、MvaE-Down作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得调控MvaE表达水平的系列重组酿酒酵母yG012、yG013、yG014、yG015、yG016、yG017、yG018。
6.根据权利要求1所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述的调控FASI表达水平的重组酿酒酵母的构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350法；
所述醋酸锂/PEG3350法的步骤包括：将酿酒酵母接种到1xYPD培养基中使起始OD值为0.2，培养4-4.5h，根据构建菌株数，通过离心、洗涤后收集细胞；
插入片段的用量为：每5OD酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用50μL DNA混合物悬浮该细胞，50μL DNA混合物由2μg所述插入片段、250ng工具质粒以及足量ddH2O混合而成；
插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
7.根据权利要求2所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述调控MvaE表达水平的重组酿酒酵母的构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350法；
所述醋酸锂/PEG3350法的步骤包括：将酿酒酵母接种到1xYPD培养基中使起始OD值为0.2，培养4-4.5h，收集细胞，根据构建菌株数，通过离心、洗涤后收集细胞；
插入片段的用量为：每5OD酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用50μL DNA混合物悬浮该细胞，50μL DNA混合物由2μg所述插入片段、250ng工具质粒以及足量ddH2O混合而成；
插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
8.一种优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母通过权利要求1所述的构建方法构建而成。
9.一种优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母通过权利要求2所述的构建方法构建而成。
10.一种权利要求8或9所述的重组酿酒酵母在产大麻萜酚酸中的应用。
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