CN116262928A - 一种产3-羟基丙酸的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种产3‑羟基丙酸的工程菌及其构建方法与应用。所述构建方法包括：在宿主菌株中导入MCRC基因和MCRN基因，并将宿主菌株的FAS1基因的启动子PFAS1替换为PHXT1；所述MCRC基因编码的多肽为来源于Chloroflexus aurantiacus的丙二酰‑CoA还原酶的1‑549氨基酸；所述MCRN基因编码的多肽为来源于Chloroflexus aurantiacus的丙二酰‑CoA还原酶的550‑1219氨基酸的突变体N940V/K1106W/S1114R；所述宿主菌株选自酿酒酵母中的任一种。

Description

一种产3-羟基丙酸的工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于微生物代谢工程及工业生物技术领域，涉及一种产3-羟基丙酸的工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
3-羟基丙酸(3HP)被美国能源部列为生物质来源的12种最具价值的平台化合物，3-HP聚合形成聚3-羟基丙酸(poly3-HP)，作为可降解塑料，可减少白色污染。3-HP经脱水可获得丙烯酸，丙烯酸是重要的合成树脂单体，聚合速度非常快，可合成树脂、涂料、橡胶等。3-HP经脱水、腈化可获得丙烯腈，丙烯腈是合成纤维、合成橡胶和合成树脂的重要单体，由丙烯腈制得聚丙烯腈纤维即腈纶(Chen et al.Metab.Eng.,2014,22,104-109)。传统的3-HP合成方法为化学合成法，主要是将3-羟基丙腈加入氢氧化钠溶液中反应，化学法需要用到大量溶剂，不符合环保理念。
3-HP生物合成法可以利用廉价原料，反应条件温和，绿色环保，越来越受到关注。目前生物合成路线主要以生物质来源的糖类或者甘油为原料，通过以微生物细胞为反应器经发酵合成。酿酒酵母是重要的真核模式微生物，遗传背景清晰，代谢工程改造相对容易，而且鲁棒性较强，具有良好的耐酸性能，适合有机酸的工业化生产。然而，目前文献报道的酿酒酵母合成3-HP普遍存在产量低、转化率低的问题，例如摇瓶发酵最高产量为2g/L(Hellgren et al.Metab.Eng.,2020,62,150-160)，发酵罐补料分批发酵最高产量为18.1g/L(Tong et al.Green Chem.2021,23,4502-4509)。
发明内容
本申请从全局代谢构建酵母细胞工厂，实现3-HP高效合成。首先优化3-HP合成酶基因，提高其生物催化效率，并强化中性碳代谢途径提供前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH，使得酿酒酵母中3-HP产量在摇瓶中达到4.4g/L，补料分批发酵达到56.5g/L。并将以上策略在另一种配型酵母中构建，然后将不同配型工程菌交配获得二倍体，3-HP产量在补料分批发酵达到70.2g/L。
根据本申请的一个方面，提供一种产3-羟基丙酸的工程菌的构建方法，通过将MCRC基因和MCRN基因导入酿酒酵母宿主菌株中，同时替换宿主菌株的FAS1基因的启动子，得到的菌株以葡萄糖为底物，合成3-羟基丙酸效率高。
一种产3-羟基丙酸的工程菌的构建方法，所述构建方法包括：
在宿主菌株中导入MCRC基因和MCRN基因，并将宿主菌株的FAS1基因的启动子PFAS1替换为PHXT1；
所述MCRC基因编码的多肽为来源于Chloroflexus aurantiacus的丙二酰-CoA还原酶的1-549氨基酸；
所述MCRN基因编码的多肽为来源于Chloroflexus aurantiacus的丙二酰-CoA还原酶的550-1219氨基酸的突变体N940V/K1106W/S1114R；
所述宿主菌株选自酿酒酵母中的任一种。
可选地，所述MCRC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述MCRN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
可选地，所述在宿主菌株中导入MCRC基因和MCRN基因选自(a)～(c)中的任一种：
(a)将DNA片段PGAL7-MCRN-TDIT1整合到宿主菌株的XI-1位点；将含有PGAL1,10-MCRC-TTDH2的游离型质粒转入宿主菌株；
(b)将DNA片段PGAL7-MCRN-TDIT1整合到宿主菌株的XI-1位点；将含有PGAL1,10-MCRC-TTDH2的游离型质粒转入宿主菌株；将DNA片段PTDH3-MCRN-TFBA1-TDIT1-MCRC-PTDH3整合到宿主菌株的XII-3位点；
(c)将DNA片段PGAL7-MCRN-TDIT1整合到宿主菌株的XI-1位点；将DNA片段PTDH3-MCRN-TFBA1-TDIT1-MCRC-PTDH3整合到宿主菌株的XII-3位点；将DNA片段TFBA1-MCRN-PGAL1,10-MCRC-TDIT1整合到宿主菌株的XII-5位点。
可选地，所述构建方法还包括强化中心碳代谢途径：
将MmACL、RtME、’MDH3、CTP1、MPC1、MPC3、AnACLa、AnACLb、RtCIT1、IDP2、YHM2、GND1、TKL1、TAL1和ZWF1基因导入宿主菌株；
将宿主菌株的PYC1基因的启动子由PPYC1替换为PTEF；
将宿主菌株的PGI1基因的启动子由PPGI1替换为PCOX9；
将宿主菌株的ACC1基因的启动子由PACC1替换为PTEF；
将宿主菌株的IDH2基因的启动子由PIDH2替换为PGSY1。
可选地，所述构建方法还包括强化中心碳代谢途径：
将DNA片段PTPI-MmACL-TFBA1-TCYC1-RtME-PTDH3-PtHXT7-’MDH3-TTDH2-TADH1-CTP1-PPGK1整合到宿主菌株的HIS3位点；
将宿主菌株的PYC1基因的启动子由PPYC1替换为PTEF；
将DNA片段PTPI1-MPC1-TMPC1-TDIT1-MPC3-PPGK1整合到宿主菌株的X-4位点；
将DNA片段TCYC1-AnACLa-PGAL1,10-AnACLb-TADH1整合到宿主菌株的X-2位点；
将DNA片段PTPI1-RtCIT1-TFBA1-TCYC1-IDP2-PTDH3-PTEF1-YHM2-TGAL1整合到宿主菌株的GAL1、GAL7、GAL10基因位点，即整合该DNA片段的同时敲除GAL1、GAL7、GAL10三个基因；
将DNA片段PCOX9-TCYC1-GND1-PTDH3-PtHXT7-TKL1-TTDH2-TADH1-TAL1-PPGK1-PTEF1-ZWF1-TZWF1整合到宿主菌株的PPGI1位点，即整合GND1、TKL1、TAL1和ZWF1基因的同时把PGI1启动子由PPGI1替换为PCOX9；
将宿主菌株的ACC1基因启动子由PACC1替换为PTEF；
将宿主菌株的IDH2基因启动子由PIDH2替换为PGSY1。
可选地，将DNA片段整合到宿主菌株或替换宿主菌株中基因的启动子通过采用CRISPR/Cas9技术实现。
可选地，所述构建方法还包括回补URA3基因。
可选地，所述构建方法还包括细胞融合形成双倍体。
可选地，所述宿主菌株选自酿酒酵母CEN.PK 113-11C、酿酒酵母CEN.PK 110-10C中的任一种。
根据本申请的一个方面，提供根据上述所述的构建方法构建得到的产3-羟基丙酸的工程菌。
根据本申请的一个方面，提供根据上述所述的构建方法构建得到的产3-羟基丙酸的工程菌、上述所述的产3-羟基丙酸的工程菌在制备3-羟基丙酸中的应用。
作为一种实施方案，本发明公开了几株产3-羟基丙酸(3-HP)的酿酒酵母工程菌及其应用。其中酿酒酵母工程菌是以野生型菌株CEN.PK 113-11C(a型)为出发菌株，通过优化丙二酰-CoA还原酶基因的表达和强化中心碳代谢途径获得高效合成3-HP的工程菌株，摇瓶发酵和发酵罐补料分批发酵产量分别达到4.4g/L和56.5g/L。通过在酿酒酵母CEN.PK 110-10C(α型)中构建相同的策略，然后将两株不同配型的工程菌交配获得二倍体工程菌，发酵罐补料分批发酵产量达到70.2g/L。
作为一种实施方案，本申请提供一种产3-HP的酿酒酵母基因工程菌，优化了来源于嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙二酰-CoA还原酶(MCR)基因的表达，将催化3-HP合成的MCR分为N端和C端；并且通过基因组整合代替游离质粒，实现细胞内基因稳定表达。
作为一种实施方案，本申请提供一种产3-HP的酿酒酵母基因工程菌，强化中心碳代谢途径，使更多碳代谢流向3-HP的合成。
作为一种实施方案，本申请提供一种产3-HP的酿酒酵母二倍体工程菌，将a型酿酒酵母3-HP合成策略(优化MCR表达和强化中心碳代谢途径)复制到α型酿酒酵母野生型菌株中，通过两个不同配型的酵母交配获得二倍体菌株。
作为一种实施方案，本申请提供的构建方法，优化了3-HP合成途径限速酶MCR的表达，将MCR拆分为N端(丙二酰辅酶A还原酶，MCRN,1-549氨基酸)和C端(丙二酸半醛还原酶，MCRC,550-1219氨基酸)，并且MCRC采用突变体(N940V/K1106W/S1114R)提高酶催化效率；
作为一种实施方案，本申请提供的构建方法，利用基因组整合代替游离质粒表达MCR基因，在酿酒酵母XI-1位点整合PGAL7启动子表达MCRN(PGAL7-MCRN)，在XII-3整合PTDH3-MCRC+PTDH3-MCRN，在XII-5位点整合MCRC-PGAL1,10-MCRC，从而代替质粒pYX8中MCRC的表达；
作为一种实施方案，本申请提供的构建方法，强化中心代谢途径增加前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH的供给，包括过表达来源于小鼠(Mus musculus)的ATP依赖型柠檬酸裂解酶基因MmACL，来源于圆红冬孢酵母(Rhodospuridium toruloides)的NADP+依赖型苹果酸合成酶基因RtME和柠檬酸合成酶1基因RtCIT1，去除过氧化物酶体信号肽的苹果酸脱氢酶基因’MDH3，柠檬酸转运蛋白基因CTP1，丙酮酸羧化酶1基因PYC1，丙酮酸转运蛋白1和3基因MPC1和MPC3，来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的ATP依赖型柠檬酸裂解酶a和b基因AnACLa和AnACLb，NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶2基因IDP2，柠檬酸/α-酮戊二酸转运蛋白基因YHM2，6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因ZWF1，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因GND1，转酮酶基因TKL1，转醛酶基因TAL1，采用强启动子PGSY1替换IDH2自身启动子强化线粒体NAD+依赖型异柠檬酸脱氢酶基因IDH2表达，采用弱启动子PCOX9替换PGI1自身启动子弱化磷酸葡萄糖异构酶基因PGI1表达，采用强启动子PTEF1替换PYC1自身启动子强化丙酮酸羧化酶基因PYC1表达；采用强启动子PTEF1替换ACC1自身启动子强化乙酰-CoA羧化酶基因ACC1表达；
作为一种实施方案，本申请提供的构建方法，在α型酿酒酵母野生型菌株中整合表达MCR基因(同权利要求5)和中心碳代谢途径基因(同权利要求6)，获得的工程菌与a型工程菌融合获得二倍体菌株。
本申请可取得的有益效果包括：
(1)本申请所提供的产3-羟基丙酸的工程菌的构建方法，优化了3-HP合成酶基因，提高其生物催化效率。
(2)本申请所提供的产3-羟基丙酸的工程菌的构建方法，强化中心碳代谢途径提供前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH，使得酿酒酵母中3-HP产量提高。
(3)本申请所提供的产3-羟基丙酸的工程菌的构建方法，将不同配型工程菌交配获得二倍体，进一步提高了3-HP产量。
附图说明
图1示出了代谢工程改造策略促进酿酒酵母3-HP合成示意图；
图2示出了强化中心碳代谢提高3-HP产量情况；
图3示出了优化MCR表达提高3-HP产量情况；
图4示出了SH14发酵罐补料分批发酵结果；其中A为发酵罐补料分批发酵3-HP产量情况；B为发酵罐补料分批发酵质粒丢失情况；
图5示出了SH18发酵罐补料分批发酵3-HP产量情况；
图6示出了二倍体SH70发酵罐补料分批发酵3-HP产量情况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
酿酒酵母CEN.PK 113-11C、酿酒酵母CEN.PK 110-10C、酿酒酵母S288C可从德国Euroscarf公司购买得到。
本申请代谢工程改造策略促进酿酒酵母3-HP合成示意图如图1所示。
本发明要解决的技术问题是克服目前酵母工程菌的中3-HP生物合成限速酶MCR的效率低和代谢不匹配等难题，从MCR表达优化和全局碳代谢强化增加3-HP的生物合成效率，提供几种3-HP的酵母基因工程菌及其应用。
本发明的第一方面，提供一种产3-HP的酿酒酵母菌株的构建方法，能够显著增加3-HP的产量。
所述构建方法包括：MCR的表达优化，中性碳代谢途径的强化。
在一个具体实施方案中，首先构建CRISPR/Cas9系统，通过融合PCR方法获得完整同源重组片段包含整合位点XI-5的上下游同源臂、启动子PTEF1、终止子TCYC1以CEN.PK113-11C(购自德国Euroscarf公司)基因组为模板扩增获得，Cas9基因及筛选标记抗性KanMX基因分别以pCas9质粒为模板扩增获得，用重叠延伸PCR(OE-PCR)方法将上述片段融合成同源重组片段(融合片段构建过程参考Zhou et al.J Am Chem Soc 2012,134:3234-3241)，将同源重组片段500ng转化酿酒酵母出发菌株CEN.PK 113-11C，获得表达Cas9蛋白的酿酒酵母菌株SH01。然后，基因组XI-1位点整合MCRN，MCRN基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：1)以基因合成质粒为模板扩增获得，上下游同源臂XI-1up和XI-1dw、启动子PGAL7和终止子TDIT2以CEN.PK113-11C基因组为模板扩增获得，将XI-1up、PGAL7、MCRN基因、TDIT1和XI-1dw用OE-PCR方法融合成donor DNA，与gRNA质粒一起转化酿酒酵母SH01(MATa；MAL2-8c；SUC2；his3Δ1；ura3-52；XI-5::PTEF1-Cas9-TCYC1)，涂布到SD+His筛选平板于30℃静置培养2～3天，转化子经液体YPD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用，获得工程菌SH20，下文中酿酒酵母其它基因组编辑工作均遵循相似流程。替换PFAS1启动子为葡萄糖响应型启动子PHXT1，减少脂肪酸合成与3-HP合成对于前体丙二酰-CoA和辅因子NADPH的竞争，分别扩增FAS1启动子(500bp)上下游500bp作为同源臂以及启动子PHXT1，OE-PCR融合获得donor DNA，与FAS1pgRNA一起转化SH20，验证成功获得SH21。为了高表达MCRC，以pYX312质粒(实验室保藏)为骨架，MCRC基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：2)以基因合成质粒为模板扩增获得，启动子PGAL1,10和终止子TTDH2以CEN.PK113-11C基因组为模板扩增获得，将MCRC基因、PGAL1,10和TTDH2用OE-PCR方法融合成donor DNA，与pYX312骨架通过无缝克隆连接成环状质粒并转化大肠杆菌感受态，测序验证正确获得质粒pYX8，转化酿酒酵母获得工程菌SH22，以20g/L葡萄糖为碳源摇瓶发酵，经HPLC检测3-HP产量达到410mg/L。
进一步地，强化中心碳代谢途径，借助CRISPR/Cas9系统，将中心代谢相关酶基因采用不同启动子和终止子组合构建表达盒(表1)，并整合到基因组不同位点上，获得中心碳代谢途径强化的工程菌SH03。
表1.
Figure BDA0003410965610000041
Figure BDA0003410965610000051
在中性碳代谢强化的背景菌SH03基础上整合MCRN，pYX8游离质粒表达MCRC，并替换FAS1启动子为葡萄糖响应型启动子PHXT1，获得工程菌SH11，摇瓶发酵3-HP产量达到1.4g/L，说明强化中性碳代谢途径能够使更多碳代谢流向3-HP合成。
由于MCR是3-HP合成的限速酶，在SH11基础上，基因组整合组成型启动子控制的PTDH3-MCRN+PTDH3-MCRC，获得SH14菌株，摇瓶发酵产量得到2.4g/L，发酵罐补料分批发酵，24h产量达到5.8g/L，之后不再增加，通过稀释涂板发现质粒丢失。因此，为了使基因稳定表达，以基因组双拷贝整合MCRC-PGAL1,10-MCRC代替质粒表达，获得SH17h菌株，摇瓶发酵3-HP产量达到3.6g/L。回补筛选标记URA3基因获得SH18菌株，摇瓶发酵3-HP产量达到4.4g/L，发酵罐补料分批发酵3-HP产量达到56.5g/L。
本发明的第二方面，提供一种产3-HP的酿酒酵母二倍体菌株的构建方法，进一步提高3-HP的产量。
所述构建方法包括：在CEN.PK 110-10C(α型酿酒酵母，购自德国Euroscarf公司)中表达优化的MCR，强化中心碳代谢途径，以及MATa和MATα交配获得二倍体工程菌。
借助CRISPR/Cas9系统，在酿酒酵母CEN.PK 110-10C的XI-5位点整合Cas9蛋白基因，获得SHα01(MATa；MAL2-8c；SUC2；ura3-52；XI-5::PTEF1-Cas9-TCYC1)，然后在XI-1位点整合PGAL7-MCRN-TDIT1，在XII-3整合PTDH3-MCRN-TFBA1-TDIT1-MCRC-PTDH3，在XII-5位点整合TFBA1-MCRN-PGAL1,10-MCRC-TDIT1，替换PFAS1为葡萄糖响应型启动子PHXT1，强化中心碳代谢途径(同表一)，以上操作同上，获得工程菌株SHα23。
分别敲除SH17h的HIS3基因和SHα23的LYS3基因，具体实施方案是：构建靶向HIS3和LYS3基因的gRNA表达质粒，然后扩增HIS3和LYS3基因基因上下游各300bp及HIS3和LYS3基因的ORF框，并通过OE-PCR获得donor DNA。随后，将gRNA表达质粒和donor DNA(各500ng)，通过化学转化法转化分别到酿酒酵母SH17h和SHα23中，分别涂布到筛选平板SD+His和SD+Lys于30℃静置培养2～3天，转化子经液体YPD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株分别命名为SH17和SHα24。进一步地，将工程菌SH17与SHα24分别在YPD培养基中单独培养，然后各取0.5mL菌液混合接种于20mL YPD培养基，培养48h。取发酵液离心，水洗两遍后适当稀释并涂布于SD+URA3固体培养基，长出的单菌落即为二倍体，命名为SH70，发酵罐补料分批发酵3-HP产量达到70.2g/L。
实施例1：MCR表达的优化+替换FAS1启动子为葡萄糖响应型启动子PHXT1(工程菌SH22)
将来源于Chloroflexus aurantiacus的丙二酰-CoA还原酶(MCR)(NCBI中的登录号为WP_012258473.1)拆分为N端(MCRN,1-549)和C端(MCRC,550-1219)，并且MCRC采用高效突变体(N940V/K1106W/S1114R)提高酶催化效率，MCRC和MCRN基因根据酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化并合成，优化后的MCRN的核苷酸序如SEQ ID NO：1所示，优化后的MCRC的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
基因组XI-1位点整合MCRN，MCRN基因以基因合成质粒为模板扩增获得，上下游同源臂XI-1up和XI-1dw、启动子PGAL7和终止子TDIT1以CEN.PK113-11C基因组为模板扩增获得，将XI-1up、PGAL7、MCRN基因、TDIT1和XI-1dw用OE-PCR方法融合成donor DNA：XI-1up-PGAL7-MCRN-TDIT1-XI-1dw，其中XI-1up的序列为如SEQ ID NO：3所示，XI-1dw的序列为如SEQ IDNO：4所示；以pROS10(Addgene购买)为模板，以引物6005(GATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAG，SEQ ID NO：21)扩增guide RNA质粒骨架,引物P1(GCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATC，SEQ ID NO：22)和XI-1gRNA1(AAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCTATCATCGCCGAGAAATTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAG，SEQ ID NO：23，其中下划线部分为XI-1gRNA1的guide RNA序列)扩增片段1，引物P2和XI-1gRNA2(AAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCTCTCGGAGGATTCTTTGCACGTTTTAGAGCTAGAAATAG，SEQ ID NO：24，其中下划线部分为XI-1gRNA2的guide RNA序列)扩增片段2，这3个片段用诺唯赞一步连接酶连接成XI-1gRNA质粒(后面的guide RNA质粒构建过程相同，仅列出20bp的guide RNA序列)，一起转化酿酒酵母SH01(MATa；MAL2-8c；SUC2；his3Δ1；ura3-52；XI-5::PTEF1-Cas9-TCYC1，该菌株是在CEN.PK113-11C基础上整合XI-5::PTEF1-Cas9-TCYC1获得)，涂布到SD+His筛选平板于30℃静置培养2～3天，转化子经液体YPD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用，下文中酿酒酵母其它基因组编辑工作均遵循相似流程。
以CEN.PK 113-11C基因组为模板，PCR扩增启动子葡萄糖响应型启动子PHXT1(位于HXT1基因上游500bp)和PFAS(位于FAS1基因上游500bp)上游300bp作为PFAS1up和下游300bp作为PFAS1dw，通过OE-PCR融合获得donor DNA片段PFAS1up-PHXT1-PFAS1dw，将DNA片段与FAS1pgRNA(guide RNA序列：CTTTTTTTCCATACAATTCA，SEQ ID NO：35)质粒一起转化上一步宿主菌株，将FAS1基因的启动子由PFAS1替换为PHXT1，得到命名为SH21。
为了高表达MCRC，以pYX312质粒为骨架，MCRC基因以基因合成质粒为模板扩增获得，启动子PGAL1,10和终止子TTDH2以CEN.PK113-11C基因组为模板扩增获得，将MCRC基因、PGAL1,10和TTDH2用OE-PCR方法融合获得donor DNA片段PGAL1,10-MCRC-TTDH2，以引物pYX312-F:CTTAATTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAGTTACTCCGCAACGCTTTTCTGAAC(SEQ ID NO：25)和pYX312-R:CCCCGGGGTCGACCTCGAGTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAG(SEQ ID NO：26)扩增pYX312(Addgene购买)骨架，PGAL1,10-MCRC-TTDH2与pYX312骨架通过无缝克隆连接成环状质粒并转化大肠杆菌感受态，测序验证正确获得pYX8，转化酿酒酵母SH21，涂布SD+His筛选平板，于30℃静置培养2～3天，转化子经液体YPD培养基培养后获得工程菌SH22。
实施例2：MCR表达的优化+替换FAS1启动子为葡萄糖响应型启动子PHXT1+中心碳代谢途径的强化(工程菌SH11)
优化酿酒酵母中心碳代谢途径以强化前体丙二酰-CoA和辅因子NADPH的供应，具体过程如下：以CEN.PK113-11C基因组为模板，PCR扩增启动子PTPI、PPGK1、PTDH3、PtHXT7和终止子TCYC1、TTDH2、TADH1、TFBA1和同源臂序列His3up(HIS3基因上游300bp)和His3dw(HIS3基因下游300bp)，分别以基因合成质粒为模板，PCR扩增MmACL(SEQ ID NO：5)、RtME(SEQ ID NO：6)、’MDH3(SEQ ID NO：7)，通过OE-PCR融合获得donor DNA片段HIS3up-PTPI-MmACL-TFBA1-TCYC1-RtME-PTDH3-PtHXT7-’MDH3-TTDH2-TADH1-CTP1-PPGK1-HIS3dw，将DNA片段与His3gRNA(guideRNA序列：CATGCTCTGGCCAAGCATTC，SEQ ID NO：27)质粒一起转化SH01；
以CEN.PK 113-11C基因组为模板，PCR扩增启动子PTEF和PPYC1(位于PYC基因上游500bp)上游300bp作为PPYC1up和下游300bp作为PPYC1dw，通过OE-PCR融合获得donor DNA片段PPYC1up-PTEF-PPYC1dw，将DNA片段与PYC1pgRNA(guide RNA序列：CGAGGACATGATTGCTATCG，SEQID NO：28)质粒一起转化上一步宿主菌株，将PYC1基因的启动子由PPYC1替换为PTEF；
以CEN.PK 113-11C基因组为模板，PCR扩增启动子PTPI1、PPGK1和终止子TMPC1、TDIT1以及X-4up(SEQ ID NO：8)、X-4dw(SEQ ID NO：9)和基因MPC1和MPC3，通过OE-PCR融合获得donor DNA片段X-4up-PTPI1-MPC1-TMPC1-TDIT1-MPC3-PPGK1-X-4dw，将DNA片段与X-4gRNA(guide RNA序列：CGCCATTCAAGAGCAGCAAC，SEQ ID NO：29)质粒一起转化上一步宿主菌株；
以CEN.PK 113-11C基因组为模板，PCR扩增启动子PGAL1,10和终止子TCYC1、TADH1以及X-2up(SEQ ID NO：10)、X-2dw(SEQ ID NO：11)，以黑曲霉Aspergillus niger基因组为模板扩增基因AnACLa(NCBI登录号：XM_001396694.2)和AnACLb(NCBI登录号：XM_025594417.1)，通过OE-PCR融合获得donor DNA片段X-2up-TCYC1-AnACLa-PGAL1,10-AnACLb-TADH1-X-2dw，将DNA片段与X-2gRNA(guide RNA序列：CTCTCGAAGTGGTCACGTGC，SEQ ID NO：30)质粒一起转化上一步宿主菌株；
以CEN.PK 113-11C基因组为模板，PCR扩增启动子PTPI1、PTDH3、PTEF1和终止子TFBA1、TCYC1、TGAL1以及GAL7up(SEQ ID NO：12)、GAL1dw(SEQ ID NO：13)，和基因IDP2、YHM2，以圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides基因组为模板扩增基因RtCIT1，通过OE-PCR融合获得donor DNA片段GAL7up-PTPI1-RtCIT1-TFBA1-TCYC1-IDP2-PTDH3-PTEF1-YHM2-TGAL1-GAL1dw，将DNA片段与GAL10gRNA(guide RNA序列：TCCCAGAAGAATGTCCCTTA，SEQ ID NO：31)一起转化上一步宿主菌株，即整合该DNA片段的同时敲除GAL1、GAL7、GAL10三个基因；
以CEN.PK 113-11C基因组为模板，PCR扩增启动子PCOX9(SEQ ID NO：14)、PTDH3、PTDH3、PPGK1、PTEF1和终止子TCYC1、TTDH2、TADH1TGAL1、TZWF1以及PGI1up(序列号：SEQ ID NO：15)、PGI1dw(SEQ ID NO：16)和基因GND1、TKL1、TAL1和ZWF1，通过OE-PCR融合获得donor DNA片段PGI1up-PCOX9-TCYC1-GND1-PTDH3-PtHXT7-TKL1-TTDH2-TADH1-TAL1-PPGK1-PTEF1-ZWF1-TZWF1-PGI1dw，将DNA片段与PGI1gRNA(guide RNA序列：AACAAAAATCACGATCTGGG，SEQ ID NO：32)质粒一起转化上一步宿主菌株，即整合GND1、TKL1、TAL1和ZWF1基因的同时把PGI1启动子由PPGI1替换为PCOX9；
以CEN.PK 113-11C基因组为模板，PCR扩增启动子PTEF和PACC1(位于ACC1基因上游500bp)上游300bp作为PACC1up和下游300bp作为PACC1dw，通过OE-PCR融合获得donor DNA片段PACC1up-PTEF-PACC1dw，将DNA片段与ACC1pgRNA(guide RNA序列：CTTCAGGTAAACTGTACGAA，SEQID NO：33)质粒一起转化上一步宿主菌株，将ACC1基因的启动子由PACC1替换为PTEF；
以CEN.PK 113-11C基因组为模板，PCR扩增启动子PGSY1和PIDH2(位于IDH2基因上游500bp)上游300bp作为PIDH2up和下游300bp作为PIDH2dw，通过OE-PCR融合获得donor DNA片段PIDH2up-PGSY1-PIDH2dw，将DNA片段与IDH2pgRNA(guide RNA序列：ACAATTTCTTCGCCGAACCT，SEQID NO：34)质粒一起转化上一步宿主菌株，将IDH2基因的启动子由PIDH2替换为PGSY1；
以上获得的菌株为强化中心碳代谢的背景菌，命名为SH03，在SH03中整合XI-1up–PGAL7-MCRN-TDIT1-XI-1dw，获得工程菌SH04；
以CEN.PK 113-11C基因组为模板，PCR扩增启动子葡萄糖响应型启动子PHXT1(位于HXT1基因上游500bp)和PFAS(位于FAS1基因上游500bp)上游300bp作为PFAS1up和下游300bp作为PFAS1dw，通过OE-PCR融合获得donor DNA片段PFAS1up-PHXT1-PFAS1dw，将DNA片段与FAS1pgRNA(guide RNA序列：CTTTTTTTCCATACAATTCA，SEQ ID NO：35)质粒一起转化上一步宿主菌株，将FAS1基因的启动子由PFAS1替换为PHXT1，获得SH09，转化pYX8质粒，获得工程菌SH11。
实施例3：MCR表达的优化+替换FAS1启动子为葡萄糖响应型启动子PHXT1+组成型启动子控制的MCR+中心碳代谢途径的强化(工程菌SH14)
在工程菌SH09的基础上，基因组XII-3位点整合组成型启动子PTDH3控制的MCR，MCRN和MCRC基因分别以基因合成质粒为模板扩增获得，上下游同源臂XII-3up(SEQ ID NO：17)和XII-3dw(SEQ ID NO：18)、启动子PTDH3和终止子TFBA1、TDIT1以CEN.PK113-11C基因组为模板扩增获得，通过OE-PCR方法融合成donor DNA：XII3up-PTDH3-MCRN-TFBA1-TDIT1-MCRC-PTDH3-XII3dw，与XII-3gRNA(guide RNA序列：ATTAACGAGCAGAAAGTTTT，SEQ ID NO：36)质粒一起转化SH09，获得工程菌SH13，转化pYX8质粒，获得工程菌SH14。
实施例4：MCR表达的优化+替换FAS1启动子为葡萄糖响应型启动子PHXT1+组成型启动子控制的MCR+中心碳代谢途径的强化+MCRC整合代替质粒表达(工程菌SH17h)
为了解决质粒丢失的问题，在工程菌SH13的基础上，基因组XII-5位点整合组成型启动子PGAL1,10控制的双拷贝MCRC，MCRC基因以基因合成质粒为模板扩增获得，上下游同源臂XII-5up(SEQ ID NO：19)和XII-5dw(SEQ ID NO：20)、启动子PGAL1,10和终止子TFBA1、TDIT1以CEN.PK113-11C基因组为模板扩增获得，通过OE-PCR方法融合成donor DNA：XII5up-TFBA1-MCRN-PGAL1,10-MCRC-TDIT1-XII5dw，与XII-5gRNA(guide RNA序列：CTGATGTAGGCTCCTTAAAT，SEQ ID NO：37)质粒一起转化SH13，获得工程菌SH17h。
实施例5：MCR表达的优化+替换FAS1启动子为葡萄糖响应型启动子PHXT1+中心碳代谢途径的强化+回补筛选标记HIS3和URA3基因(工程菌SH18)
在基因工程改造完成后，筛选标记便不再需要，为了节约发酵成本以及促进菌株正常生长，原位回补筛选标记基因URA3，以酿酒酵母S288C基因组为模板，扩增URA3基因表达框(基因及其上下游500bp)，一起转化工程菌SH17，获得工程菌SH18。
实施例6：二倍体构建(SH70)
借助CRISPR/Cas9系统，在酿酒酵母CEN.PK 110-10C的XI-5位点整合Cas9蛋白基因，获得SHα01(MATa；MAL2-8c；SUC2；ura3-52；XI-5::PTEF1-Cas9-TCYC1)，然后在XI-1位点整合PGAL7-MCRN-TDIT1，在XII-3整合PTDH3-MCRN-TFBA1-TDIT1-MCRC-PTDH3，在XII-5位点整合TFBA1-MCRN-PGAL1,10-MCRC-TDIT1，替换PFAS1为葡萄糖响应型启动子PHXT1，强化中心碳代谢途径(同表一)，以上操作同上，获得工程菌株SHα23。
分别敲除SH17h的HIS3基因和SHα23的LYS3基因，具体实施方案是：构建靶向HIS3(SEQ ID NO：27)和LYS3(guide RNA序列：CATCAAATTATGATTGAGGA)基因区域的sgRNA表达载体，然后扩增HIS3和LYS3基因基因上下游各300bp及HIS3和LYS3基因的ORF框，并通过OE-PCR获得donor DNA。随后，将gRNA表达载体和基因表达盒(各500ng)，通过化学转化法转化分别到酿酒酵母SH17h和SHα23中，分别涂布到筛选平板SD+His和SD+Lys于30℃静置培养2～3天，转化子经液体YPD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株分别命名为SH17和SHα24。进一步地，将工程菌SH17与SHα24分别在YPD培养基中单独培养，然后各取0.5mL菌液混合接种于20mL YPD培养基，培养48h。取发酵液离心，水洗两遍后适当稀释并涂布于SD+URA3固体培养基，长出的单菌落即为二倍体，命名为SH70。
实施例7：3-HP摇瓶分批发酵
工程菌摇瓶发酵采用基础成分培养基((NH4)2SO4 2.5g/L，KH2PO4 14.4g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，微量金属(3mg/L FeSO4·7H2O，4.5mg/L ZnSO4·7H2O，4.5mg/LCaCl2·2H2O，1mg/L MnCl2·4H2O，0.3mg/L CoCl2·6H2O，0.3mg/L CuSO4·5H2O，0.4mg/LNa2MoO4·2H2O，1mg/L H3BO3，0.1mg/L KI，19mg/L Na2EDTA·2H20)，维生素(0.1mg/L生物素，2mg/L泛酸，2mg/L硫胺素，2mg/L吡哆酸，2mg/L烟酸，0.4mg/L氨基苯甲酸，50mg/L肌醇)，添加20g/L葡萄糖，以KOH调节初始pH为5.6)。活化后的菌株接种至该培养基中，30℃，220rpm培养24h，转接于20mL发酵培养基/100mL摇瓶，初始OD600＝0.2，30℃，220rpm条件下发酵96h，取样测定生物量OD600，并通过HPLC测定3-HP产量。
结果表明，强化中心碳代谢途径提高3-HP产量约4倍(图2)；整合组成型启动子PTDH3控制的MCR能够提高3-HP产量约1倍，说明通过组成型启动子PTDH3和诱导型启动子PGAL1,10共同使用保证基因在葡萄糖消耗前后都能表达，有助于提高生物合成效率(图3)；由于游离质粒在上罐发酵存在严重的质粒丢失现象(图4)，通过双向启动子PGAL1,10整合表达MCR代替游离质粒表达能够提高3-HP产量约50％，说明基因组整合能够保证基因稳定表达；进一步回补筛选标记URA3能够保证菌株无氨基酸添加也能正常生长和生产(图3)。SH18菌株上罐发酵3-HP产量达到56.5g/L(图5)，为目前报道的葡萄糖来源的3-HP最高产量。
实施例8：3-HP发酵罐补料分批料发酵
补料分批发酵采用1L的DasGip平行生物反应器系统，发酵罐初始体积为0.4L。补料分批发酵采用初始培养基((NH4)2SO4 2.5g/L，KH2PO4 14.4g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，微量金属(3mg/L FeSO4·7H2O，4.5mg/L ZnSO4·7H2O，4.5mg/L CaCl2·2H2O，1mg/L MnCl2·4H2O，0.3mg/L CoCl2·6H2O，0.3mg/L CuSO4·5H2O，0.4mg/L Na2MoO4·2H2O，1mg/L H3BO3，0.1mg/L KI，19mg/L Na2EDTA·2H20)，葡萄糖浓度为20g/L)，体积为0.4L，接种OD600＝0.4，pH为5.6。补料培养基采用4×D培养基((NH4)2SO4 2.5g/L，KH2PO4 14.4g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L微量金属(3mg/L FeSO4·7H2O，4.5mg/L ZnSO4·7H2O，4.5mg/L CaCl2·2H2O，1mg/LMnCl2·4H2O，0.3mg/L CoCl2·6H2O，0.3mg/L CuSO4·5H2O，0.4mg/L Na2MoO4·2H2O，1mg/LH3BO3，0.1mg/L KI，19mg/L Na2EDTA·2H20)，葡萄糖浓度为500g/L。补料方式采用脉冲补料，48h之前每4h补加15mL上述补料培养基，48h之后每8h补加15mL上述补料培养基，发酵过程中定期取样测定生物量OD600和乙醇浓度，并通过HPLC测定3-HP产量。
如图5所示，工程菌SH18补料分批发酵3-HP最高产量为56.5g/L。如图6所示，二倍体工程菌SH70补料分批发酵3-HP最高产量为70.2g/L。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 一种产3-羟基丙酸的工程菌及其构建方法与应用
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtctggaa ctggtaggtt ggccggaaag atcgctttga tcaccggagg agccggaaat 60
atcggaagtg aattgactag aagattcttg gccgagggag ctactgttat catctctggt 120
aggaacagag ctaagttgac cgccttggct gaaagaatgc aagctgaggc cggtgtccca 180
gctaaaagga tcgaccttga ggtcatggac ggttctgacc cagttgctgt tagagctggt 240
atcgaagcta ttgttgctag acacggtcag attgacattc ttgtcaataa cgccggttct 300
gccggagccc aaaggagatt ggccgagatc ccacttaccg aagctgaatt gggtcccggt 360
gctgaagaaa ccttgcacgc cagtatcgcc aatcttttgg gaatgggttg gcaccttatg 420
aggattgctg cccctcatat gccagtcgga tctgctgtca tcaacgtcag taccatcttt 480
tctagggccg agtattacgg taggatccca tacgttaccc caaaggccgc cttgaatgct 540
ttgtctcaac ttgccgccag agagttgggt gccagaggta ttagggttaa caccatcttc 600
cccggtccaa tcgagagtga tagaatcaga accgtcttcc aaaggatgga ccagttgaaa 660
ggtaggccag aaggagacac cgcccatcat ttcttgaaca ccatgaggct ttgtagagcc 720
aacgaccaag gtgcccttga aaggagattc ccttctgtcg gagatgttgc tgatgctgcc 780
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ggtatggagc ttccagcttg tagtgagact agtcttcttg ctagaaccga cttgagaact 900
atcgacgcca gtggaagaac caccttgatc tgtgccggag accaaatcga ggaggtcatg 960
gcccttactg gtatgcttag gacttgtgga agtgaggtta tcatcggttt tagaagtgct 1020
gccgctcttg cccagttcga gcaagccgtt aatgagagta ggaggttggc tggagccgac 1080
ttcacccctc ctattgccct tcctttggac ccaagagacc cagccaccat cgatgccgtc 1140
tttgactggg ctggtgagaa tactggtggt attcacgccg ctgttatctt gccagctacc 1200
agtcacgaac cagctccatg cgttattgag gtcgatgacg agagggtctt gaactttttg 1260
gccgacgaaa tcaccggtac catcgtcatt gcttctaggt tggctagata ctggcaaagt 1320
cagagactta cccccggtgc tagggctagg ggtcctaggg tcatcttctt gtctaacggt 1380
gccgaccaga acggaaacgt ctacggaagg atccagagtg ccgccatcgg tcagcttatt 1440
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gttttgccac cagtttgggc caaccagatc gttagattcg ccaatagaag tcttgaagga 1560
ttggagttcg cttgtgcttg gactgcccag cttttgcaca gtcagaggca catcaatgag 1620
attaccttga atatcccagc taatatttaa 1650
<210> 2
<211> 2016
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtctgcta ccactggtgc taggtctgct tctgtcggtt gggctgagtc tttgatcggt 60
ttgcaccttg gaaaagtcgc ccttatcacc ggaggatctg ccggtattgg tggtcagatc 120
ggtaggcttt tggctttgag tggagctaga gtcatgttgg ctgctagaga tagacataag 180
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gaggacagag tccatattgc ccccggttgc gacgtcagta gtgaagccca acttgccgac 300
ttggtcgaaa ggaccctttc tgcctttgga accgtcgact atttgatcaa caatgccggt 360
attgccggtg tcgaagaaat ggtcatcgac atgccagtcg agggatggag gcacaccttg 420
tttgccaact tgattagtaa ttattctttg atgaggaagc ttgccccact tatgaagaag 480
caaggttctg gttatattct taatgtcagt tcttatttcg gtggagagaa ggacgccgcc 540
attccatacc caaatagggc tgactacgcc gttagtaagg ctggacagag agccatggct 600
gaagtctttg ctagattctt gggtccagag atccagatca atgccatcgc ccccggtcca 660
gttgagggag atagacttag gggaactggt gaaaggcccg gtcttttcgc taggagggct 720
agacttatcc ttgagaataa gaggcttaac gaacttcacg ccgctcttat cgctgctgcc 780
agaaccgatg agaggagtat gcacgagttg gtcgaattgc ttttgccaaa cgacgttgcc 840
gccttggaac agaatccagc tgccccaact gctcttaggg agttggctag aaggtttaga 900
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ttgccaaacc caccagaccc tttcttcacc agagcccaaa tcgatagaga ggctagaaag 1080
gttagagacg gtatcatggg aatgttgtac ttgcagagga tgccaaccga atttgatgtt 1140
gccatggcta ccgtttacta cttggctgat agggtcgtct ctggtgaaac cttccatcca 1200
agtggaggtt tgaggtacga gaggacccca accggaggag agcttttcgg tcttccttct 1260
ccagagaggt tggccgaatt ggtcggttct accgtctacc ttattggaga gcacttgacc 1320
gaacatttga atttgcttgc tagagcctac cttgaaaggt acggagccag acaagttgtt 1380
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gaggctggaa gattgatgac catcgtcgct ggagaccaga ttgaggctgc catcgaccaa 1500
gctatcacta gatatggaag acccggtcca gttgtctgta ctcctttcag acctcttcca 1560
accgtccctt tggtcggtag gaaggatagt gactggtcta ccgtcttgag tgaggccgaa 1620
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ggagttgagt ctgaaaggac cgcccagagg atcttgatca accaagttga ccttaccaga 1860
agggctaggg ccgaggaacc tagagatcct cacgaaaggc agcaagaact tgagaggttc 1920
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<210> 3
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttccacgga ataccaagcc cattgcaatg cgatgttagt ttagtggagt ttcttggcat 60
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<210> 5
<211> 3306
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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accacctcag ccatacaaaa cagattcaag tatgcaagag ttacaccaga taccgactgg 120
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gtttgtatct atgcaactag agaaggtgac tatgtcttgt ttcatcacga aggtggtgtt 420
gacgtcggtg acgttgacgc caaagctcaa aagttgttag taggtgttga tgaaaagtta 480
aacacagaag acatcaagag acatttgttg gtacacgccc cagaagataa aaaggaagtt 540
ttggcttcct ttataagtgg tttgtttaat ttctacgaag atttgtactt cacctacttg 600
gaaattaacc ctttagtagt tactaaggat ggtgtctata tattggactt agctgcaaaa 660
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gaagtcttca aggaagaaat gggtatcggt ggtgtattgg gtttgttgtg gttccaaaga 2640
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<210> 6
<211> 1638
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgcctgctc attttgcccc ttcacaacca ttacaaggtg gtccatcccc ttcacaattg 60
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ttggaaaaat ataccttttt ggccggttta agaggtagaa atcctgatgt cttctacggt 180
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tag 303
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<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaactaacc cgatgggaca attactgatc gattgcatta ttaaaggtga taaataatcc 60
tttgttattt gtgcccctta aaattcatat acactttatg tttaattcga caggtataac 120
agaaagaaac aaggaaaaca atgcaattaa tcattaactg caccaacttt tatatgaata 180
tattgtgcta catgtcttaa ttagtcctct gtgaatgagc atcacaaaga atcacgagga 240
aaagattgat tacttaatat tgataggaat cagccgcgga aatggaaatc ttggtaatat 300
aattttaatg cggcacgctg aaaattgatg gcggcctgct aggagcccta ttgattccgc 360
ggaaataggc ggattattac aaacgttgag cattcagcag gtgcggctgt gccttttcac 420
tttcagctaa gatgtttgca agcaagaatt aacagataag ccgcttcgct agtaacgcaa 480
ctcattgtgt ttttaatgga agctaaggat ggttgaaatt atggg 525
<210> 18
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtgtgatag gctctaggaa cgaatattaa tattgggggg gggaaactgg aatgaaatta 60
aacaaaagca aaaaaatcta aaagaagaaa aaaaggagag agagagagag agagagagag 120
agagagagag agagagagag agagagagag agagagagat gagggttatt gataatataa 180
tataataata aaagagaaga tagtagaaaa ggaagaaaga aaaaaaaaaa ttaagatgta 240
ctttaataaa aagagggaaa ttctaaaaag tgcgactgga attagaagaa tgcaggtatt 300
ttgttttctc tcctatgacg gagaaggtaa caaaatcata aaggtaaaat aacaaattaa 360
ttatgatcaa agagaaatgc cctttgtaaa ccgtggtttg taaatgcgtt g 411
<210> 19
<211> 190
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcgaactgcc gtactcgatg ctttatttct cacggtagag cggaagaaca gataggggca 60
gcgtgagaag agttagaaag taaattttta tcacgtctga agtattctta ttcataggaa 120
attttgcaag gttttttagc tcaataacgg gctaagttat ataaggtgtt cacgcgattt 180
tcttgttatg 190
<210> 20
<211> 241
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggagttcacc acgtaatgcc tgtttaagac catcagttaa ctctagtatt atttggtctt 60
ggctactggc cgtttgctat tattcaagtc ttttgtgcct tcccgtcggg taagggagtt 120
atttagggat acagaatcta acgaaaacta aatctcaatg attaactcca tttaatcctt 180
ttttgaaagg caaaagaggt cccttgttca cttacaacgt tcttagccaa attcgcttat 240
c 241
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gatcatttat ctttcactgc ggagaag 27
<210> 22
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatc 59
<210> 23
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc tatcatcgcc gagaaatttg gttttagagc 60
tagaaatag 69
<210> 24
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc tctcggagga ttctttgcac gttttagagc 60
tagaaatag 69
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cttaatttcg aataaacaca cataaacaaa caaagttact ccgcaacgct tttctgaac 59
<210> 26
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccccggggtc gacctcgagt atagtttttt ctccttgacg ttaaagtata g 51
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catgctctgg ccaagcattc 20
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgaggacatg attgctatcg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cgccattcaa gagcagcaac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctctcgaagt ggtcacgtgc 20
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcccagaaga atgtccctta 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacaaaaatc acgatctggg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttcaggtaa actgtacgaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acaatttctt cgccgaacct 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctttttttcc atacaattca 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
attaacgagc agaaagtttt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctgatgtagg ctccttaaat 20

Claims (10)

1.一种产3-羟基丙酸的工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
在宿主菌株中导入MCRC基因和MCRN基因，并将宿主菌株的FAS1基因的启动子PFAS1替换为PHXT1；
所述MCRC基因编码的多肽为来源于Chloroflexus aurantiacus的丙二酰-CoA还原酶的1-549氨基酸；
所述MCRN基因编码的多肽为来源于Chloroflexus aurantiacus的丙二酰-CoA还原酶的550-1219氨基酸的突变体N940V/K1106W/S1114R；
所述宿主菌株选自酿酒酵母中的任一种。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述MCRC基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；
所述MCRN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述在宿主菌株中导入MCRC基因和MCRN基因选自(a)～(c)中的任一种：
(a)将DNA片段PGAL7-MCRN-TDIT1整合到宿主菌株的XI-1位点；将含有PGAL1,10-MCRC-TTDH2的游离型质粒转入宿主菌株；
(b)将DNA片段PGAL7-MCRN-TDIT1整合到宿主菌株的XI-1位点；将含有PGAL1,10-MCRC-TTDH2的游离型质粒转入宿主菌株；将DNA片段PTDH3-MCRN-TFBA1-TDIT1-MCRC-PTDH3整合到宿主菌株的XII-3位点；
(c)将DNA片段PGAL7-MCRN-TDIT1整合到宿主菌株的XI-1位点；将DNA片段PTDH3-MCRN-TFBA1-TDIT1-MCRC-PTDH3整合到宿主菌株的XII-3位点；将DNA片段TFBA1-MCRN-PGAL1,10-MCRC-TDIT1整合到宿主菌株的XII-5位点。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括强化中心碳代谢途径：
将MmACL、RtME、’MDH3、CTP1、MPC1、MPC3、AnACLa、AnACLb、RtCIT1、IDP2、YHM2、GND1、TKL1、TAL1和ZWF1基因导入宿主菌株；
将宿主菌株的PYC1基因的启动子由PPYC1替换为PTEF；
将宿主菌株的PGI1基因的启动子由PPGI1替换为PCOX9；
将宿主菌株的ACC1基因的启动子由PACC1替换为PTEF；
将宿主菌株的IDH2基因的启动子由PIDH2替换为PGSY1；
优选地，所述构建方法还包括强化中心碳代谢途径：
将DNA片段PTPI-MmACL-TFBA1-TCYC1-RtME-PTDH3-PtHXT7-’MDH3-TTDH2-TADH1-CTP1-PPGK1整合到宿主菌株的HIS3位点；
将宿主菌株的PYC1基因的启动子由PPYC1替换为PTEF；
将DNA片段PTPI1-MPC1-TMPC1-TDIT1--MPC3-PPGK1整合到宿主菌株的X-4位点；
将DNA片段TCYC1-AnACLa-PGAL1,10-AnACLb-TADH1整合到宿主菌株的X-2位点；
将DNA片段PTPI1-RtCIT1-TFBA1-TCYC1-IDP2-PTDH3-PTEF1-YHM2-TGAL1整合到宿主菌株的GAL1、GAL7、GAL10基因位点，即整合该DNA片段的同时敲除GAL1、GAL7、GAL10三个基因；
将DNA片段PCOX9-TCYC1-GND1-PTDH3-PtHXT7-TKL1-TTDH2-TADH1-TAL1-PPGK1-PTEF1-ZWF1-TZWF1整合到宿主菌株的PPGI1位点，即整合GND1、TKL1、TAL1和ZWF1基因的同时把PGI1启动子由PPGI1替换为PCOX9；
将宿主菌株的ACC1基因的启动子由PACC1替换为PTEF；
将宿主菌株的IDH2基因的启动子由PIDH2替换为PGSY1。
5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，将DNA片段整合到宿主菌株或替换宿主菌株中基因的启动子通过采用CRISPR/Cas9技术实现。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括回补URA3基因。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括细胞融合形成双倍体。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述宿主菌株选自酿酒酵母CEN.PK113-11C、酿酒酵母CEN.PK 110-10C中的任一种。
9.根据权利要求1～8任一项所述的构建方法构建得到的产3-羟基丙酸的工程菌。
10.根据权利要求1～8任一项所述的构建方法构建得到的产3-羟基丙酸的工程菌、权利要求9所述的产3-羟基丙酸的工程菌在制备3-羟基丙酸中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114369541A (zh) * 2020-11-23 2022-04-19 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用
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