CN106086082B - 一种改良重组大肠杆菌生产9-癸烯醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改良重组大肠杆菌生产9‑癸烯醇的方法，所述重组大肠杆菌中的宿主菌株和表达质粒均被改造成能够实现组成型表达。本发明制备9‑癸烯醇的过程中，其产物的回收率高，可达95%，反应条件温和，不使用重金属及有机溶剂，对环境友好，同时对具有C=C的化合物的生物转化具有重要意义，能够很好的满足工业化的生产需求。

Description

一种改良重组大肠杆菌生产9-癸烯醇的方法
技术领域
本发明适用于生物化工领域，特别涉及一种改良重组大肠杆菌生产9-癸烯醇的方法。
背景技术
9-癸烯醇是一类具有玫瑰香味的不饱和脂肪醇，主要用途是作为日化香精配方的原料和表面活性剂的成分。其具有广阔的工业应用前景。
目前，国内外还没有采用生物制造方法来进行9-癸烯醇的生产，主要还是以一些化学制备方法为主。采用化学合成的方法来制备9-癸烯醇，主要是由石油衍生而来的1,10-癸二醇进行脱水制备。美国Elevance可再生技术公司开发了一种以9-癸烯酸甲酯作为底物，在各类催化剂和辅助试剂如2-乙基己酸锌、硼氢化钠、聚(二甲基硅氧烷)、氢氧化钾等的作用下合成9-癸烯醇。但是由于C＝C不饱和双键的存在，化学法制备9-癸烯醇需要用到一些贵重的金属催化剂，而且立体选择性并不是很理想，不仅提高了制备成本还增加了后期分离提取的难度。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种改良重组大肠杆菌生产9-癸烯醇的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种改良重组大肠杆菌生产9-癸烯醇的方法，所述重组大肠杆菌中的宿主菌株和表达质粒均被改造成能够实现组成型表达。
优选地，所述宿主菌株的改造可以通过以下任一一种方式来实现：
1)大肠杆菌中所有的编码转录抑制蛋白的基因lacI被敲除；
2)大肠杆菌中所有的乳糖操纵基因lacO被敲除。
优选地，所述表达质粒的改造可以通过以下任一一种方式来实现：
3)将参与9-癸烯醇生物转化的羧酸还原酶、醛还原酶及脂肪酸甲酯水解酶三个酶置于组成型启动子T5之后；
4)将强启动子trc系列的诱导型表达质粒上的lacI基因去掉，再将上述3个酶置于启动子Trc之后。
本发明采用的另一个技术方案为一种改良重组大肠杆菌生产9-癸烯醇的方法，所述重组大肠杆菌中的脂肪酸甲酯水解酶的表达通过如下方法得到强化的：
a)通过蛋白质工程技术优化位于编码脂肪酸甲酯水解酶基因起始密码前的25位核苷酸序列，优化得到的核苷酸序列为GTTAAATTTTTATAGGAGTTCAGTT；
b)对所述羧酸还原酶基因的第三个氨基酸，通过点突变技术将Ser突变为Arg，使羧酸还原酶的蛋白表达量和活力与优化后的所述脂肪酸甲酯水解酶的活力相平衡。
本发明采用的另一个技术方案为一种改良重组大肠杆菌生产9-癸烯醇的方法，所述大肠杆菌中的NADPH的供给通过以下一种或多种方式得到提高：
ⅰ)敲除葡萄糖代谢路径中编码6-磷酸果糖激酶的基因pfkA；
ⅱ)敲除葡萄糖代谢路径中编码磷酸葡萄糖异构酶基因pgi；
ⅲ)强化表达葡萄糖代谢路径中编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶的基因zwf。
优选地，强化表达葡萄糖代谢路径中编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶的基因zwf，其采用的启动子为T5。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：将本发明的改良重组大肠杆菌菌株应用到9-癸烯醇的制备过程中，其产物的回收率高，反应条件温和，不使用重金属及有机溶剂，对环境友好，同时对具有C＝C的化合物的生物转化具有重要意义。且这里，对宿主基因组上相关基因进行改造，如转录抑制蛋白基因的敲出、修饰蛋白基因表达利用强启动子提高表达量，或是糖酵解路径和磷酸戊糖途径相关基因敲除或者过表达提高NADPH供给等以提高产量；其次，将重组表达质粒上的基因进行点突变提高蛋白表达量，或是蛋白质工程技术优化甲酯水解酶基因的RBS序列，以及将重组质粒由诱导型表达改为组成型表达等等，不仅节约了成本，还大大提高了底物添加量和产物产量；将操纵子整合到基因组上也具有有效发挥生物转化的功能，改良后的生物转化体系更好地满足了工业化生产需求。
附图说明
附图1为9-癸烯酸甲酯到9-癸烯醇转化过程示意图；
图2为实施例3中改造宿主转化相应质粒后摇瓶发酵比较图；
图3为实施例4中利用2％葡萄糖为碳源的重组菌W3110/pJ01发酵结果图；
图4为实施例4中利用2％甘油为碳源的重组菌WJ2/pJ02发酵结果图；
图5为实施例5中ushA基因敲除对菌体生长的影响结果图；
图6为实施例6中部分糖酵解和戊糖磷酸路径及改造示意图；
图7为实施例8中蛋白质工程构建脂肪酸甲酯水解酶RBS文库筛选优势重组菌株复筛结果图；
图8为实施例8中RBS文库筛选菌株摇瓶发酵结果图；
图9为GC检测实施例11中组成型表达和MsCar基因突变重组菌株发酵比较结果图；
图10为HPLC检测实施例11中组成型表达和MsCar基因突变重组菌株发酵比较结果图；
图11为实施例12中的2个菌株发酵过程GC检测结果图；
图12为实施例12中的2个菌株发酵过程HPLC检测结果图。
具体实施方式
实施例1W3110(entDT5)宿主的构建
entD全名磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，主要功能修饰载体蛋白，即将辅酶A上的4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移到载体蛋白保守的丝氨酸残基侧链羟基上，使载体蛋白由无活性的脱辅基(apo-)形式转变为活性全蛋白(holo-)形式。作为修饰蛋白，entD的表达量不需要很高，但是W3110基因组自身含有的entD基因表达又不够，可能是启动子较弱的原因，因此将W3110基因组上的entD基因更换启动子，强化其表达，减少质粒上操纵子的大小，提高质粒的稳定性以及质粒表达给宿主带来的压力。
W3110(entDT5)菌株构建以Red重组法完成。
首先，以pKD4质粒为模板，利用引物对T5-in-F/KD4-R(引物见表1)，PCR扩增得到含上游同源臂的Kan-FRT片段；然后以含T5启动子的质粒为模板，利用引物对T5-F1/T5-in-R(引物见表1)，PCR扩增T5启动子及RBS序列；最后将上述扩增得到的2个片段以等摩尔量进行混合，利用引物对T5-in-F/T5-in-R进行重叠PCR扩增得到两端含同源臂的Kan-FRT-T5重组片段。
然后，制备电转化感受态细胞：将质粒pKD46转入W3110，30℃过夜培养得到单克隆W3110/pKD46接种于含100ng/mL Amp的LB试管。次日，按照1：100接种至30ml含100ng/mLAmp及20mM L-阿拉伯糖的LB液体培养基，30℃、200rpm培养2h左右OD600＝0.25时，补加L-阿拉伯糖20mM，继续诱导培养1h，使pKD46上的Exo、Bet和Gam三个蛋白充分表达，然后收集菌体进行电转感受态制备；电转感受态制备过程：1)培养好的菌体冰上预冷10min，然后4000rpm、4℃离心10min，弃上清；2)用预冷10％甘油离心洗涤菌体，4000rpm、4℃离心10min，弃上清；3)重复2)操作2次；4)加入10％甘油浓缩100倍，分装80ul/管。
最后，电转化、验证：1)电转化：将上述扩增的Kan-FRT-T5片段约200ng加入要上述感受态细胞，混匀，转入0.1cm电击杯中，用电击仪作电转化。电击条件：200Ω，25μF，电击电压1.8kV，电击时间为5ms，电击后迅速加入1ml的LB，37℃，200rpm培养1h，之后涂于含50ng/mL kan的LB平板，37℃过夜培养。2)转化子验证：电转化得到的转化子进行菌液PCR验证，引物分别为T5-200-F/Kan-R、kan-F/T5-200-R，验证正确的转化子进行化转感受态制备，并转化质粒pCP20，涂布含Amp抗性的平板。30℃过夜培养后得到的单克隆接种于含20ng/ml Cm的LB试管，30℃培养4h后转接到LB无抗性液体培养基试管继续培养4h后升温42℃，培养过夜，然后进行涂布LB平板，得到的单克隆分别点板于LB+Amp、LB+Cm以及LB+Kan确认抗性片段消除成功，最后通过引物T5-200-F/T5-200-R进行菌液PCR验证，得到菌株W3110(entDT5)重组菌株，后续命名WJ1(参见表4)。
实施例2W3110(ΔlacI，entDT5)宿主的构建
W3110基因组上的lacI基因编码乳糖操纵子的DNA-binding转录抑制因子蛋白，重组质粒pJ01为trc启动子，质粒本身也带有lacI基因。lacI基因表达产物是一种阻遏物，会与lacO操纵基因结合，抑制后续结构基因的转录，若是在发酵过程添加诱导剂IPTG或乳糖，它们会与阻遏物结合，改变其构型使其无法与操纵基因结合，后续结构基因可以正常转录和翻译。因此将基因组lacI基因进行敲除，可以在后续尝试重组质粒由诱导型表达转向组成型表达，节省发酵过程诱导剂IPTG的成本。
W3110(ΔlacI，entDT5)以Red重组法完成构建，构建过程与上述WJ1基本类似。
首先，利用引物对lacI-K-F/lacI-K-R(引物见表1)以pKD4质粒为模板，扩增含敲除lacI上下游同源臂的Kan-FRT重组片段，并进行纯化回收；
然后，制备WJ1/pKD46电转化感受态细胞；
最后，电转化Kan-FRT片段约200ng到WJ1/pKD46电转化感受态细胞，涂布Kan抗性平板，利用引物对lacI-200-F/Kan-R、kan-F/lacI-200-R(引物见表1)验证转化子，消抗后的转化子利用引物对lacI-200-F/lacI-200-R进行确认，最终构建得到W3110(ΔlacI，entDT5)重组菌株，此改造宿主后续命名WJ2(参见表4)。
采用WJ2菌株，加入到5L的发酵罐中进行发酵，期间采用流加的方式加入底物9-癸烯酸甲酯达367g/L，发酵完全后，测得最终产物9-癸烯醇110g/L，基本接近理论值。
表1基因敲除验证引物表
实施例3WJ1/pJ02、WJ2/pJ02重组菌株摇瓶发酵比较
上述构建的WJ1、WJ2菌株制备感受态细胞，转化重组质粒pEZ07-MsCar-alrA-lcaE7(即pJ02)，分别涂布含100ng/mL Spe抗性的LB平板，得到重组菌株WJ1/pJ02和WJ2/pJ02。将2个菌株连同对照菌株W3110/pJ01一起进行摇瓶发酵，比较entD基因在基因组上强化表达和质粒上表达的差异以及lacI敲除对此转化过程的影响，同时本发明中的摇瓶发酵从原来的LB+1％甘油培养基改为以葡萄糖为碳源的M9改良发酵培养基。具体发酵过程如下：
首先，分别接种上述3个重组菌的3个不同转化子接种于5mL添加100ng/mLSpe抗性的LB培养基，于33℃、200rpm培养过夜。次日，分别取过夜培养的菌液100ul加入到2mL含Spe抗性的LB培养基，33℃、200rpm培养3h左右，全部加入到20mL的改良M9发酵培养基中，改良M9发酵培养基配方及微量元素TM2母液成分详见表2。然后，转接过后于37℃、200rpm培养4-5h，每瓶加入诱导剂IPTG使其终浓度为1mM，同时加入300ul底物9-癸烯酸甲酯(约10g/L)，继续37℃、200rpm培养过夜。最后，发酵过夜后分别取出400uL发酵液于2mL离心管中，加入1200uL的氯仿，将离心管置于涡旋振荡器上剧烈震荡，从发酵液中萃取出反应剩余的9-癸烯酸甲酯，中间产物9-癸烯酸，9-癸烯醛和产物9-癸烯醇，震荡5-10min后将离心管在12000rpm离心1min，吸取下层0.22um有机滤膜进行GC检测，检测底物转化率以及各物质的所占的比例，GC检测结果见图2。
从图2中可看出，各重组菌株的比较：1)菌株WJ1/pJ02和对照菌W3110/pJ01以葡萄糖为碳源的改良培养基中发酵，发酵结束后残留底物和生成产物面积百分比相差不大，但是说明重组菌株WJ1/pJ02发酵结束OD600达8.0左右，而对照菌W3110/pJ01发酵结束OD600达6.5左右，说明lacI基因的敲除对9-癸烯酸甲酯的转化影响不大，而且有助于提高菌体量，较大的菌体量也是提高转化率的一个有利因素；2)三个重组菌株的比较显示WJ2/pJ02产物9-癸烯醇比例最高，说明entD基因在基因组上强化表达可以有效的替代其在质粒上表达，说明改造宿主WJ2效果较好。
表2摇瓶发酵培养基配制及TM2母液成分如表2-1与2-2所示：
表2-1
表2-2
实施例4碳源对重组菌株WJ2/pJ02发酵生物转化的影响
在上述实施例3中以葡萄糖作为碳源进行摇瓶发酵，在之前的研究中采用的是LB+1％甘油作为发酵培养基进行，因此将上述实施例3中的WJ2/pJ02菌株置于不同碳源的改良培养基进行发酵，比较不同碳源对重组菌株发酵生物转化的影响。
发酵菌株为W3110/pJ01和WJ2/pJ02，发酵培养基分别为2％葡萄糖或2％甘油为碳源的发酵培养基，培养过程与实施例3基本一致，摇瓶发酵结果分别见图3与图4。
用两个重组菌株比较不同碳源对9-癸烯酸甲酯生物转化的影响，图3为W3110/pJ01发酵结果，图4为WJ2/pJ02发酵结果，结果显示：相同底物浓度下，以甘油作为碳源，底物9-癸烯酸甲酯残留量基本明显降低，WJ2/pJ02底物残留2％左右，而且产物9-癸烯醇的比例均有提高，达80％以上；而以葡萄糖作为碳源，底物9-癸烯酸甲酯均大部分未反应完全，产物比例也仅在60％左右；而且与之前研究中采用LB+1％甘油为发酵培养基相比，以这两两种碳源的无机盐培养基进行发酵，基本没有9-癸烯酸可以检测到，上述结果说明：1)无机盐培养基之前研究中采用的TB培养基或是LB+1％甘油发酵效果效果好很多；2)无机盐培养基以甘油作为碳源能有效的提高9-癸烯酸甲酯到9-癸烯醇的生物转化效率，可能是葡萄糖代谢较快，产酸过多等原因部分影响了转化效率，因此后续摇瓶比较以甘油作为碳源，由于葡萄糖作为碳源比甘油更为经济，后续关于基因改造以葡萄糖作为碳源也会继续进行研究。
实施例5W3110(ΔlacI，entDT5，ΔushA)宿主的构建及摇瓶发酵
W3110基因组上有ushA基因，它编码一种周质蛋白，有文献报道此基因敲除可以适当提高菌株在基本培养基的生长速度，提高率15％-25％左右，这对于我们上罐发酵利用葡萄糖为碳源具有一定的优势，可以在有效提高菌体浓度的前提下提高生物转化率，因此在WJ2宿主的基础上进行ushA基因敲除的改造。
W3110(ΔlacI，entDT5，ΔushA)以Red重组法完成构建，构建过程与上述WJ2构建过程lacI基因敲除基本类似。首先，利用引物对ushA-K-F/ushA-K-R(引物见表1)以pKD4质粒为模板，扩增含敲除lacI上下游同源臂的Kan-FRT重组片段，并进行纯化回收。然后，制备WJ2/pKD46电转化感受态细胞。最后，电转化Kan-FRT片段约200ng到WJ2/pKD46电转化感受态细胞，涂布Kan抗性平板，利用引物对ushA-200-F/Kan-R、kan-F/ushA-200-R验证转化子，消抗后的转化子利用引物对ushA-200-F/ushA-200-R(引物见表1)进行确认，最终构建得到W3110(ΔlacI，entDT5，ΔushA)重组菌株，后续命名WJ3(参见表4)。
宿主WJ3制备划转感受态细胞，转化质粒pJ02，得到重组菌株WJ3/pJ02，以WJ2/pJ02作为对照菌株，进行摇瓶发酵，发酵培养基以2％葡萄糖作为碳源。转化率检测发酵过程与上述基本一致。生长曲线测定：重组菌株WJ3/pJ02、WJ2/pJ02分别接种试管培养过夜，次日按照起始菌浓1转接到20ml发酵培养基中，于37℃、200rpm培养，每间隔2.5h取样进行OD600检测，直到菌浓稳定。
生长曲线测定结果见图5，结果显示ushA基因敲除没有明显提高菌体生长速率，反而在前期菌体生长速率减慢，而且发酵结果后检测底物和产物的结果显示敲除前后基本没有差别，说明ushA基因的敲除在我们生物转化过程中没有起到积极的作用。
实施例6糖酵解路径部分弱化或完全阻断方式提高NADPH的供给
9-癸烯酸甲酯到9-癸烯醇的生物转化过程见图1，其中MSCAR基因编码的羧酸还原酶是此转化过程的关键限速酶，但是需要NADPH作为辅酶。在以葡萄糖作为碳源的微生物代谢过程中，NADPH主要是通过戊糖磷酸途径(PPP)生成，戊糖磷酸途径是葡萄糖直接氧化脱氢和脱羧，脱氢酶的辅酶不是NAD+而是NADP+，因此代谢过程会产生大量NADPH作为还原力以供生物合成用，但在实际代谢过程中，葡萄糖通过糖酵解途径(EMP)和PPP降解的比例分别55-70％和30-45％。因此，在需大量NADPH还原力的全细胞生物转化过程中，使葡萄糖主要通过磷酸戊糖途径降解是一种主要的改进措施。文献报道有通过敲除pgi或者pfkA等基因提高NADPH供给，部分EMP和PPP代谢路径见图6。
首先采用部分弱化EMP路径。W3110基因组上有pfkA基因，它编码6-磷酸果糖激酶基因，是葡萄糖代谢过程的关键限速酶之一，主要是催化6-磷酸果糖磷酸化生成1,6-二磷酸果糖，据文献报道此基因敲除可部分弱化EMP路径，从而使PPP路径的代谢增加，提高NADH的积累。因此进行宿主改造，敲除pfkA基因，构建菌株W3110(ΔlacI，entDT5，ΔpfkA)。以Red重组法完成构建，构建过程与上述WJ2构建过程lacI基因敲除基本类似。首先，利用引物对pfkA-K-F/pfkA-K-R(引物见表1)以pKD4质粒为模板，扩增含敲除lacI上下游同源臂的Kan-FRT重组片段，并进行纯化回收。然后，制备WJ2/pKD46电转化感受态细胞。最后，电转化Kan-FRT片段约200ng到WJ2/pKD46电转化感受态细胞，涂布Kan抗性平板，利用引物对pfkA-200-F/Kan-R、kan-F/pfkA-200-R(引物见表1)验证转化子，消抗后的转化子利用引物对pfkA-200-F/pfkA-200-R进行确认，最终构建得到W3110(ΔlacI，entDT5，ΔpfkA)重组菌株，后续命名WJ4(参见表4)。
此外还可以用完全阻断EMP路径。W3110基因组上有pgi基因，编码磷酸葡萄糖异构酶，它可逆的催化6-磷酸葡萄糖与6-磷酸果糖的相互转化，从而将葡萄糖降解推向EMP途径。而敲除pgi将阻止葡萄糖EMP途径降解，使葡萄糖通过PPP来降解，从而增加NADPH的合成。W3110(ΔlacI，entDT5，Δpgi)构建以Red重组法完成构建。首先，利用引物对pgi-K-F/pgi-K-R(引物见表1)以pKD4质粒为模板，扩增含敲除lacI上下游同源臂的Kan-FRT重组片段，并进行纯化回收。然后，制备WJ2/pKD46电转化感受态细胞。最后，电转化Kan-FRT片段约200ng到WJ2/pKD46电转化感受态细胞，涂布Kan抗性平板，利用引物对pgi-200-F/Kan-R、kan-F/pgi-200-R验证转化子，消抗后的转化子利用引物对pgi-200-F/pgi-200-R进行确认，最终构建得到W3110(ΔlacI，entDT5，Δpgi)重组菌株，后续命名WJ5(参见表4)。
WJ4和WJ5分别制备感受态细胞，转化质粒pJ02，得到重组菌株WJ4/pJ02和WJ5/pJ02，并以WJ2/pJ02作为对照菌株进行摇瓶发酵，以葡萄糖为碳源。发酵结果显示WJ2/pJ02菌浓达7.5，WJ4/pJ02和WJ5/pJ02的菌浓分别为6.0和4.3，说明pgi基因的敲除对菌体生长有很大影响，可能是pgi基因敲除可能导致6-磷酸葡萄糖积累，从而影响ptsG(Fusedglucose-specific PTS enzyme IIBC components)mRNA的稳定性，最终减慢葡萄糖进入细胞的速率；此外三个菌株均没有检测到9-癸烯酸，WJ2/pJ02产物比例72％，WJ4/pJ02和WJ5/pJ02的产物9-癸烯醇分别为67％和49％。这些结果若按照1OD的菌量转化率计算，两个基因敲除后均有助于提高以葡萄糖为碳源进行的9-癸烯酸甲酯的生物转化，说明无论是磷酸葡萄糖异构酶基因pgi的敲除还是6-磷酸果糖激酶基因的敲除都可以有效的减弱或是阻断EMP路径，有助于使葡萄糖更多的流向PPP途径，从而提高细胞NADPH积累。说明后续葡萄糖为碳源可以进行此相关的宿主改造。
实施例7强化表达基因组上葡萄糖6-磷酸脱氢酶zwf基因
由实施例6结果可以看出，基因pgj敲除菌株虽然产物得率有一定程度提高，说明PPP途径NADPH的积累对提高MSCAR的活性比较积极的促进作用，但是菌体生长速度减慢太多，不能有效的提高生物转化速率。W3110基因组上有zwf基因是编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶，催化葡萄糖6-磷酸转化为6-磷酸葡萄糖酸-δ-内酯，高度严格的以NADPH+作为电子受体，是PPP途径的关键酶之一，有研究报道zwf基因过表达有助于增大PPP路径葡萄糖流量。因此，构建W3110(ΔlacI，entDT5，Δpgi，zwfPtrc)菌株十分必要，一方面是强化葡萄糖6-磷酸脱氢酶zwf基因表达来降低6-磷酸葡萄糖的积累，另一方面也直接增加葡萄糖更多的通过PPP进行代谢。
W3110(ΔlacI，entDT5，Δpgi，zwfPtrc)的构建也是Red重组法完成，与实施例1构建过程类似。首先构建基础质粒，将Kan-FRT与Trc启动子放在一个质粒上，命名pKan-Trc。利用引物对pKD4-NdeI-F/pKD4-R将含Frt位点的Kan-Frt片段扩增下来，同时利用引物对将Trc启动子利用引物对Trc-F/Trc-HindIII-R从质粒pTrc99A上扩增下来，然后将pEZ10克隆质粒进行NdeI/HindIII双酶切和切胶回收，得到的酶切载体与回收后Kan-Frt和Trc片段混合后进行EZ重组，最终得到质粒pKan-Trc。然后进行基因组zwf基因启动子敲除同时敲入含启动子Kan-FRT-Ptrc片段。利用引物对pTrc-K-F/pTrc-K-R(引物见表1)扩增得到含同源臂的Kan-FRT-Ptrc同源敲除片段，并进行纯化回收。然后，制备WJ5/pKD46电转化感受态细胞。最后，电转化Kan-FRT-Ptrc片段约200ng到WJ5/pKD46电转化感受态细胞，涂布Kan抗性平板，利用引物对zwf-200-F/Kan-R、kan-F/zwf-200-R验证转化子，消抗后的转化子利用引物对进行确认，最终构建得到W3110(ΔlacI，entDT5，Δpgi，zwfPtrc)重组菌株，后续命名WJ6(参见表4)。制备感受态细胞，转化质粒pJ02，得到重组菌株WJ6/pJ02。
按照上述摇瓶发酵过程，将重组菌株WJ6/pJ02进行发酵，WJ5/pJ02作为对照菌株，葡萄糖为碳源。摇瓶结果显示重组菌株WJ5/pJ02发酵结束后，底物9-癸烯酸甲酯残留20％左右，产物9-癸烯醇65％左右；而重组菌株WJ6/pJ02发酵结束后底物残留15％左右，产物增加值70％，副产物不变，而且菌浓液稍微有所增加。上述结果说明强化基因组上zwf基因的表达有助于提高转化率，可能是zwf基因的表达使葡萄糖向PPP路径的速度提高，说明基因组上一些基因的敲除和过表达对以葡萄糖为碳源进行发酵有促进作用。
实施例8蛋白质工程优化羧酸还原酶和甲酯水解酶的表达
脂肪酸甲酯到脂肪醇的生物转化过程见图1，整个过程涉及3个酶：脂肪酸甲酯水解酶、羧酸还原酶以及醛还原酶。羧酸还原酶是整个反应过程的一个限速酶，主要是还原甲酯水解酶催化产物脂肪酸；但甲酯水解酶也有可能表现酯合成或者酯交换的功能，在羧酸还原酶活未及时将脂肪酸还原成脂肪醛的情况下可能会造成一些副产物的形成，因此平衡酯还原酶和羧酸还原酶的表达对提高底物转化率和纯度尤为重要。
通过蛋白质工程技术，使甲酯水解酶在不同的RBS序列下控制酯水解酶的表达，通过检测产物9-癸烯酸甲酯和副产物含量，比较获得能显著提高底物产量的重组菌株。
首先，制备WJ2电转化感受态细胞：挑取重组菌株单克隆WJ2到LB液体试管，37℃过夜培养。次日，按照1：100接种至50ml无抗性LB液体培养基，37℃、200rpm培养2.5h左右至OD600＝0.8时，制备电转化感受态细胞：1)培养好的菌体冰上预冷10min，然后4000rpm、4℃离心10min，弃上清；2)用预冷10％甘油离心洗涤菌体，4000rpm、4℃离心10min，弃上清；3)重复2)操作2次；4)加入10％甘油浓缩100倍，分装80ul/管。
然后，准备pEZ07-MsCar-alrA-RBSx-lcaE7酶连片段：利用引物对LcaE7-EcoRI-F/LcaE7-HinIII-R(引物见表3)扩增两边分别带EcoR I/Hind III酶切位点的含不同RBS序列的的酯水解酶片段RBSx-lcaE7，纯化回收后与载体pEZ07-MsCar-alrA一起进行EcoR I/Hind III双酶切，分别回收后，利用T4 DNA连接酶于22℃进行连接，连接体系20ul，然后进行过柱回收。最后向上述电转化感受态细胞加入5ul纯化后的连接液体，进行电转化，并涂布含100ng/mL Spe的抗性平板，若平板转化子个数超过90个，则进行孔板筛选实验。
最后进行孔板初筛实验：1)预培养：用牙签分别挑取上述电转化后的单克隆于含100ul的LB+Spe的96-微孔板，其中6个为positive control和6个negative control，1个为空白不挑菌，透气膜封口。于96-孔板摇床30℃、250rpm，75％湿度过夜培养，一般培养16-20h即可达到饱和；2)转接：过夜培养的孔板菌液吹打混匀，然后取10ul转接至190ul TB+Spe的96-浅孔板，30℃、250rpm，75％湿度培养2.5h；3)诱导：加入16ul稀释的IPTG加入到96浅孔板，至终浓为0.4mM，25℃、250rpm，75％湿度诱导培养3h，每个孔添加10ul底物9-癸烯酸甲酯(终浓度8g/L)，继续培养过夜，18h进行制样检测；4)样品制备：向反应微孔板直接加入乙腈(稀释8倍)，用枪吹打混匀，移到深孔板，4000rpm离心10min，取上清加入到过滤板中离心，然后进行GC检测。结果见图7。
图7中GC结果显示的是初筛得到的10株较好的重组菌株。首先，这10个孔的转化基本都有底物残留，基本都比对照多一半，虽然也有酸残留，但是比例比对照少了一半，关于脂肪酸的比例较大，有可能是文献报道的发酵过程采用TB培养基，营养过于丰富，使酯酶的表达或是酶活得以提高；而且，产物比例基本上比对照菌株高出15％到24％；此外，脂肪酸的比例也减少了很多，脂肪酸含量的减少一方面降低了对细胞的毒性，另一方面结果也显示了副产物的含量明显降低。这些结果说明RBS文库的构建和筛选一定程度上使脂肪酸甲酯水解酶的活力得到了一些下调，以便于更好的匹配酸还原酶的活力。
对上述复筛得到的10个孔的重组菌株摇瓶发酵比较，以以上述M9改良培养基作为发酵培养基，2％甘油作为碳源，发酵过程1mM IPTG诱导，并添加底物9-癸烯酸甲酯300ul(约10g/L)，发酵结束后进行HPLC检测产物9-癸烯醇的含量，结果见8。图7结果显示，从9-癸烯醇的含量测定结果可以看出，初筛得到的10株重组菌株中WJ2/pEZ07-MsCar-alrA-lcaE7-A4、WJ2/pEZ07-MsCar-alrA-lcaE7-A9、WJ2/pEZ07-MsCar-alrA-lcaE7-A12以及WJ2/pEZ07-MsCar-alrA-lcaE7-B2等得到的产物含量相差不大，分别为4.38g/L、4.13g/L、4.12g/L、4.16g/L，后续分别命名为其中WJ2/pJ03、WJ2/pJ04、WJ2/pJ05、WJ2/pJ06。后续重组质粒的构建在以上基础上进行深入研究。
表3质粒构建引物表
实施例9羧酸还原酶基因定点突变重组质粒的构建
有文献报道，羧酸还原酶基因MsCar的第3位氨基酸由丝氨酸突变为精氨酸可以有效提高羧酸还原酶的蛋白表达量，可能也会有效的提高9-癸烯酸甲酯到9-癸烯醇的转化率，因此构建重组质粒pEZ07-MsCar3-alrA-lcaE7-A9，即pJ07。
首先，以pJ04质粒为模板，利用引物对MsCar3-NcoI-F/MsCAR-XhoI-R、AlrA-XhoI-F/AlrA-EcoRI-R和LcαE7-32-EcoRI-F/LcαE7-R-HindIII(引物见表3)，分别扩增两端带有酶切位点的MsCAR、AlrA以及LcαE7片段，PCR产物进行回收后分别利用引物中带有的酶切位点进行双酶切，得到NcoI-MsCAR-XhoI、XhoI-AlrA-EcoRI以及EcoRI-lcαE7-HindIII。然后，将NcoI-MsCAR3-XhoI与NcoI/XhoI双酶切的pEZ07进行连接，转化TG1感受态细胞，得到pEZ07-MsCAR3，然后将pEZ07-MsCAR3用Xho I和Hind III进行双酶切后，与两片段XhoI-alrA-EcoRI、EcoRI-lcαE7-HindIII一起进行连接转化，最终将转化子提取质粒，酶切验证和测序确认构建成功重组质粒pJ07。最后将构建得到的重组质粒pJ07转化WJ2感受态细胞，得到重组菌株WJ2/pJ07。
实施例10组成型表达重组质粒的构建
上述构建的重组菌株在发酵过程都需要添加IPTG或者乳糖作为诱导剂，一方面提高了生产成本，另一方面诱导剂的添加使工业生产操作更为繁琐，而且增大了染菌的可能性，因此让重组质粒由诱导型转变为组成型，既可以节约成本，也能简化实际工业化的操作过程。
首先，构建组成型基础重组质粒，利用扩环自连接的方式进行构建。分别在pEZ07质粒lacI基因两端设计引物对pEZ08-F/pEZ08-R，引物5’端分别带有EcoRV的GAT和ATC碱基。利用引物对pEZ08-F/pEZ08-R以质粒pEZ07为模板扩增得到片段，将PCR产物加入DpnI进行模板消化，然后进行回收，得到的产物利用T4DNA连接酶进行连接，后转化TG1感受态细胞。挑取得到的克隆进行质粒提取和酶切验证，正确的转化子质粒送样测序，测序引物08-YZ-F，最终构建得到无lacI基因的基础质粒pEZ08。
然后，构建重组质粒pEZ08-MsCar-alrA-lcaE7-A9、pEZ08-MsCar3-alrA-lcaE7-A9，即pJ08和pJ09。以pJ04质粒为模板，利用引物对MsCAR-NcoI-F/MsCAR-XhoI-R、MsCAR3-NcoI-F/MsCAR-XhoI-R、alrA-XhoI-F/LcαE7-R-HindIII，分别扩增两端带有酶切位点的MsCAR、MsCAR3、以及alrA-lcαE7片段，3个PCR产物进行回收后分别利用引物中带有的酶切位点进行双酶切，得到NcoI-MsCAR-XhoI、NcoI-MsCAR3-XhoI以及XhoI-AlrA-lcαE7-HindIII。首先将NcoI-MsCAR-XhoI和NcoI-MsCAR3-XhoI分别与NcoI/XhoI双酶切的pEZ08进行连接和转化，得到pEZ08-MsCAR和pEZ08-MsCAR3，然后将pEZ08-MsCAR和pEZ08-MsCAR3分别用XhoI和HindIII进行双酶切后，并分别与片段XhoI-alrA-lcαE7-HindIII一起进行连接转化大肠杆菌TG1感受态细胞，最终得到的转化子提取质粒后进行酶切验证，确认构建得到重组质粒pJ08和pJ09。
最后将构建得到的重组质粒pJ08和pJ09分别转化WJ2感受态细胞，得到重组菌株WJ2/pJ08、WJ2/pJ09。
表4重组质粒或改造宿主索引表
实施例11诱导型表达、组成型表达及基因突变重组菌株摇瓶发酵比较
将实施例9和实施例10中构建的重组菌株WJ2/pJ07、WJ2/pJ08、WJ2/pJ09进行摇瓶发酵，同时以WJ2/pJ04作为对照菌株。4个菌株分别接种于5mL添加100ng/ml Spe抗性的LB培养基，于33℃、200rpm培养过夜。次日，分别取过夜培养的菌液100ul加入到2mL含Spe抗性的LB培养基，33℃、200rpm培养3h左右，全部加入到20mL的改良以2％甘油作为碳源的M9发酵培养基中，每个菌株挑取3个不同的转化进行摇瓶发酵比较。转接后于37℃、200rpm培养4-5h，WJ2/pJ04、WJ2/pJ07等重组菌株摇瓶中加入诱导剂IPTG使其终浓度为1mM，诱导一系列基因的表达，同时加入300ul底物9-癸烯酸甲酯(约12g/L)；WJ2/pJ08、WJ2/pJ09重组菌株为组成型质粒表达，因此不添加诱导剂，直接加入底物300ul；均置于37℃、200rpm发酵过夜。次日，发酵摇瓶每瓶分别取出400uL发酵液于2mL离心管中，加入1.2mL的氯仿，萃取样品离心后过膜进行GC检测；同时取样1ml发酵液漩涡震荡均匀，加入10ul甲酸溶液，准确量取100uL发酵液加入900uL无水乙醇，漩涡震荡3min后超声15min，过0.22um有机滤膜进行HPLC检测，测定产物9-癸烯醇的含量。
检测结果见图9和图10。图9为GC检测结果，结果显示发酵结束后四个菌株的产物9-癸烯醇比例基本都在90％左右，底物残留3％左右，副产物基本在8％左右，这些结果基本可以显示组成型表达可以有效替代诱导型表达，但是无论是组成型表达还是诱导型表达重组菌株，MsCar点突变前后的差别不是很大，仅副产物的比例稍微有些波动。图10为HPLC检测结果，确认9-癸烯醇的含量，从结果可以看出4个菌株的9-癸烯醇含量基本都在5.0g/L左右，但是相对MsCar点突变重组菌株中9-癸烯醇的含量而言，无论是组成型表达还是诱导型表达都比没有突变的稍高一点，但是高出的幅度不是很明显，可能在上罐条件下才能较好的确认。
上述发酵结果显示：1)MsCar基因3S-3R点突变可能对生物转化效率的提高有一定的作用，但是还需要罐上放大确认；2)组成型表达可以替代诱导型表达，不仅节约诱导剂的成本，也能避免诱导剂对菌体的毒性，对于后面发酵放大也提供了便利。
实施例12组成型和诱导型表达重组菌株5L罐发酵比较
种子培养基：LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、自来水定容2L，自然pH)，灭菌锅内121℃，20-30分钟。
发酵培养基：甘油25g/L、(NH4)2SO4 20g/L、KH2PO4 2g/L、NaCl 1g/L、MgSO4·7H2O1g/L、柠檬酸铁0.094g/L、CaCl·2H2O 0.14g/L、ZnCl2 0.01g/L、微量元素TM2 1mL(母液配方见表1)。
补料成分：甘油、氨水、磷酸氢二钾
分别挑取活化的单菌落WJ2/pJ04和WJ2/pJ08接入含100mg/L壮观霉素的LB试管中，200rpm，30℃培养过夜；次日，按照1％的量转接到含壮观霉素的100mL LB摇瓶中，33℃，200rpm培养4h左右，以5％接种量将摇瓶种子液接入含2L发酵培养基的5L发酵罐中。发酵参数控制为：温度33℃，通过氨水维持发酵过程pH 6.8，溶氧30％，通风量8L/min，搅拌转速开始200，后与溶氧偶联。发酵开始4h后加入，WJ2/pJ04发酵罐加入IPTG至发酵终浓度为1mM，进行诱导，WJ2/pJ08发酵罐不用添加IPTG诱导。转接发酵罐后第5个小时开始添加底物9-癸烯酸甲酯，发酵8h开始补加甘油，控制发酵液甘油0.6-1g/L左右。发酵过程中定时取样进行GC检测，通过底物残留量以及9-癸烯酸的残留量调整底物的添加速率，通过转化率的变化以及副产物含量波动决定发酵是否结束。此外，前期发酵罐优化过程发现，在发酵过程中，通过添加磷酸氢二钾增加菌体活力，可以有效延长发酵时间。发酵48h左右，2罐均出现转速下降现象，每罐中添加磷酸氢二钾1mL，以增加菌体活力，随后在WJ2/pJ04菌株发酵罐在50h、56h、66h再进行补加，发酵67h转化率下降，低于90％，发酵结束，共添加底物353g，此时罐体体积2.4L；WJ2/pJ04菌株发酵罐在50h、56h、64h等分别添加一定量的磷酸氢二钾，68h转化率下降，低于90％，发酵结束，共添加底物367g，此时罐体体积2.52L。
两个菌株发酵过程GC和HPLC检测结果见图11和图12。如图11两个菌株发酵过程GC监测结果显示，整体比例和趋势基本一致：1)整个发酵过程产物9-癸烯醇的含量基本维持在90％以上，菌株WJ2/pJ04发酵66h转化率降至90％，发酵结束，而菌株WJ2/pJ08发酵到68h转化率降至90％，发酵结束；2)底物9-癸烯酸甲酯的含量基本在1％以内，中间产物9-癸烯酸的比例基本都1％左右；3)发酵过程中副产物的含量都是小幅度波动，但是整体上是一个上升趋势，在发酵快结束时副产物含量明显提高至7％左右，两个菌株基本类似，为保证产物纯度，在监测到产物转化率下降的情况下及时停止底物添加。如图12两个菌株发酵过程HPLC检测产物9-癸烯醇含量，两个菌株发酵过程随着时间延长，产物含量在持续增加，直到发酵结束，最终WJ2/pJ04发酵结束时9-癸烯醇达105g/L，WJ2/pJ08发酵结束时9-癸烯醇达110g/L。
上述GC和HPLC结果与之前的摇瓶比较结果一致，说明构建的组成新表达重组菌株可以有效的取代诱导性表达，在菌株生长和转化效率上基本不会有影响，而且还有可能会更好，而且考虑到工业生产的操作便利性和成本，组成型表达重组菌株WJ2/pJ08更有优势。
实施例12操纵子整合到基因组重组菌株的构建及摇瓶发酵
作为工业生产菌株，重组质粒在发酵过程中稳定性及表达量对基因转化水平和菌体生长速率的影响都是重要考虑的因素。作为质粒表达的重组菌株，首先在发酵过程中需要添加抗生素维持质粒的稳定，但在工业生产上，抗生素的添加不仅增加成本，而且使操作更加麻烦；其次，质粒表达过程启动子的强弱、拷贝数的高低以及目标蛋白的过表达都会影响会对菌体生长速率以及转录水平产生抑制，从而对生产有一定的影响。但是文献报道，操纵子整合到基因组上表达对菌体生长和基因转录水平基本没有影响，而且基因组上的表达更为稳定和方便。因此，操纵子整合到基因组上进行表达是工业菌株的一个发展趋势。
大肠杆菌基因组上有fhuA基因，编码蛋白作为高铁色素的转运蛋白，而且还是噬菌体T5、T1和UC-1等的受体，因此此基因的敲除可能会有效的菌株感染噬菌体的几率，在工业生产过程也是很有必要的。
本专利中利用Red重组的方法将操纵子Ptrc-MsCar-alrA-lcaE7整合到改造菌株WJ2基因组上。
首先，构建pEZ08-MsCar-alrA-lcaE7-KanFRT，即pJ10。首先利用引物对Kan-HindIII-F/Kan-SalI-R以质粒pKD4为模板，扩增两端分别带同源臂的Kan-FRT片段，直接进行过柱纯化后与HindIII/SalI双酶切的pJ04质粒进行无缝克隆重组，然后进行感受态细胞转化，得到的转化子提取质粒后进行酶切验证，构建成功质粒pEZ08-MsCar-alrA-lcaE7-KanFRT，即pJ10。
然后，利用引物fhuA-Kin-F/fhuA-Kin-R，以质粒pJ10为模板，扩增两端分别带有50bp同源臂的敲入片段Ptrc-MsCar-alrA-lcaE7-KanFRT，进行纯化后约200ng片段加入WJ2/pKD46电转化感受态细胞，混匀，转入0.1cm电击杯中，用电击仪作电转化。复苏后涂于含50ng/mL kan的LB平板，37℃过夜培养。
最后，将得到的转化子利用两端引物fhuA-200-F/TRC-R、K2/fhuA-200-R进行验证转化子验证，验证正确的转化子进行化转感受态制备，并转化质粒pCP20，涂布含Cm抗性的平板。30℃过夜培养后得到的单克隆接种于含20ng/ml Cm的LB试管，30℃培养4h后转接到LB无抗性液体培养基试管继续培养4h后升温42℃，培养过夜，然后进行涂布LB平板，得到的单克隆分别点板于LB+Amp、LB+Cm以及LB+Kan确认抗性片段消除成功，最后通过引物fhuA-200-F/TRC-R进行菌液PCR验证，得到菌株W3110(ΔlacI，entDT5，ΔfhuA::Ptrc-MsCar-alrA-lcaE7)重组菌株，后续命名WJ7。
将WJ7和对照菌株WJ2/pJ08进行摇瓶发酵，按照实施例3的摇瓶发酵过程进行。碳源为20g/L甘油，底物9-癸烯酸甲酯浓度12g/L，发酵时间20h。发酵结束后，WJ7和对照菌株WJ2/pJ08两菌株进行菌浓测定，分别为10.4和9.5，整合到基因组的偏好。此外GC检测底物转化情况，产物9-癸烯醇的比例分别为89％和93％，副产物比例都是5％左右，而且HPLC结果显示，WJ7和对照菌株WJ2/pJ08最终得到的9-癸烯醇含量分别为4.56g/L和4.7g/L，这些结果说明操纵子整合到基因组上可以正常表达和实现生物转化，而且生物转化的效率与质粒表达相比相差不大，但是从稳定定和便利性上考虑，整合到基因组上更为有价值。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种改良重组大肠杆菌生产9-癸烯醇的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌中的宿主菌株和表达质粒均被改造成能够实现组成型表达，其中以9-癸烯酸甲酯为底物，依次经酯水解酶lcaE、羧酸还原酶MsCar、醛还原酶alrA作用；菌株为强化entD基因在基因组上表达的菌株；
所述宿主菌株的改造通过以下方式来实现：
大肠杆菌中所有的编码转录抑制蛋白的基因lacI被敲除；
所述表达质粒的改造通过以下方式来实现：
将强启动子Trc系列的诱导型表达质粒上的lacI基因去掉，再将编码所述酯水解酶lcaE、羧酸还原酶MsCar、醛还原酶alrA的基因置于启动子Trc之后。
2.一种改良重组大肠杆菌生产9-癸烯醇的方法，其特征在于，以9-癸烯酸甲酯为底物，依次经酯水解酶lcaE、羧酸还原酶MsCar、醛还原酶alrA作用；菌株为强化entD基因在基因组上表达的菌株，大肠杆菌中所有的编码转录抑制蛋白的基因lacI被敲除；所述重组大肠杆菌中的脂肪酸甲酯水解酶的表达通过如下方法得到强化的：
对所述羧酸还原酶基因的第三个氨基酸，通过点突变技术将Ser突变为Arg，使羧酸还原酶的蛋白表达量和活力与优化后的所述脂肪酸甲酯水解酶的活力相平衡。
3.一种改良重组大肠杆菌生产9-癸烯醇的方法，其特征在于，以9-癸烯酸甲酯为底物，依次经酯水解酶lcaE、羧酸还原酶MsCar、醛还原酶alrA作用；菌株为强化entD基因在基因组上表达的菌株，大肠杆菌中所有的编码转录抑制蛋白的基因lacI被敲除；所述大肠杆菌中的NADPH的供给通过以下一种或多种方式得到提高：
ⅰ）敲除葡萄糖代谢路径中编码6-磷酸果糖激酶的基因pfkA；
ⅱ）敲除葡萄糖代谢路径中编码磷酸葡萄糖异构酶基因pgi；
ⅲ）强化表达葡萄糖代谢路径中编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶的基因zwf。
4.根据权利要求3所述的改良重组大肠杆菌生产9-癸烯醇的方法，其特征在于，强化表达葡萄糖代谢路径中编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶的基因zwf，其采用的启动子为T5。
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