CN1875096A - 优化nadph消耗性生物合成途径的微生物菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及优化的微生物菌株，用于具有NADPH消耗性生物合成途径的分子的生物转化生产。本发明的菌株可以用于NADPH消耗性生物转化方法。所述菌株的特征在于一种或多种NADPH氧化活性受到限制。

Description

优化NADPH消耗性生物合成途径的微生物菌株
NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)以它的还原形式NADPH参与细胞内涉及具有脱氢酶和还原酶活性的酶的氧化还原反应。
本发明涉及优化的微生物菌株，以便通过生物转化以NADPH消耗生物合成途径生产物质。根据本发明的菌株可用于NADPH消耗生物转化工艺。根据本发明定义的菌株可以是原核的或者真核的。优选的实施方案中，原核菌株是大肠杆菌菌株。进一步的实施方案中，真核菌株是酵母菌株，具体而言是酿酒酵母。
本发明还涉及通过使根据本发明优化的菌株的生长在适当的培养基中而进行生物转化来制备物质的方法，优化的菌株也包含对制备这种物质必需的遗传元件。
生物转化方法已经发展到可以大量而低成本地生产所需物质，同时可以有效的使用工业和农业上的副产品。
下面是用活体内生物转化生成所需物质的两种主要方法：
1)发酵，微生物通过发酵从简单碳源产生一种物质(例如，WO0102547，描述了谷氨酸棒杆菌在葡萄糖存在下发酵生成赖氨酸)。
2)微生物通过生物转换将给定共底物转换成感兴趣物质(例如，WO0012745，描述了R-哌啶衍生物的生成，和WO0068397，描述了塔格糖的生成)。共底物不被同化，区别于用于单独生成生物转换必需的生物物质和NADPH的碳源。
生物转化方法的改进涉及各种因素，如温度、氧化、培养基成分、恢复方法等等。也可以修饰微生物以增加感兴趣物质的生成和/或排出。
发酵方法中，例如可以通过改变基因调控或通过修饰基因以改变参与的酶的特征，或者通过优化辅因子的再生来改进生物合成途径。
生物转换方法中重点放在减少副产物的形成和优化参与生物转换步骤的辅因子的再生上。
在参与生物转化的辅因子中，NADPH对下列物质的生成尤其重要，氨基酸(例如精氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸)、维生素(例如泛酸盐、维生素K1、生育酚)、芳香物(例如WO9401564)、多元醇(例如木糖醇)、多胺(例如亚精胺)、羟基酯(例如4-氯-3-羟基丁酸乙酯)和其它高附加值的物质。
本发明涉及利用具有NADPH消耗性生物合成途径生产物质的优化微生物菌株。
不去尝试优化每个生物转化中微生物的NADPH/NADP+比率，发明者选择产生改进的微生物，以获得不同的NADPH/NADP+比率，改进的微生物随后用于进行NADPH消耗性生物转化。
根据本发明，微生物菌株是表示同物种的一系列微生物，包括该物种的至少一种微生物。因而所描述的菌株的特征适用于该种类的所有微生物。同样地，所描述的任何一个微生物菌株的特征也适用于整个微生物系列。
根据本发明优化的微生物包括细菌、酵母和丝状霉菌，具体而言细菌和酵母属于下列物种：曲霉属、芽孢杆菌属、短杆菌属、梭状芽孢杆菌属、棒状杆菌属、埃希氏菌属、葡萄糖杆菌属、青霉菌属、毕赤酵母属、假单胞菌属、红球菌属、酵母菌属、链霉菌属、黄单胞菌属、假丝酵母属物种。
下面描述了大肠杆菌和酿酒酵母的NADPH/NADP+比率优化原则。同一原则同样适用于所有在有氧条件下生长的微生物。
NADPH/NADP+比率优化的原则在于限制参与NADPH氧化的酶活性，和/或促进还原NADP+的酶活性。参与NADPH氧化的酶活性被还原反应限制，具体而言，通过将那些活性，尤其是如醌氧化还原酶和/或可溶性转氢酶的活性灭活而限制。通过调整经过磷酸戊糖循环的碳流量和/或改进至少一种酶的辅因子专一性增强利于NADP+还原的酶活性，从而使其对NADP的利用优先于其惯用辅因子NAD。
根据本发明优化的菌株通过分子生物学方法获得。那些本领域的技术人员知道用于改变微生物遗传特性的方案。这些方法都有据可查，并且是技术人员容易操作的(Sambrook et al，1989 Molecular cloning：a Iaboratory manual.2nd Ed.Cold SpringHarbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York.)。
用于限制酶活性的方法包括用适当的方法改变表达它的基因，例如通过引起相关基因的编码部分的突变，或者改变启动子区域，具体而言就是用一个减少基因表达的序列来替换它。
用于灭活酶的方法包括用适当的方式灭活相关基因表达的产物，或者抑制相关基因的表达，或者删除至少相关基因的一部分以阻止其表达(例如，删除其表达所必需的部分或全部启动子区域)，或者导致表达产物失去它的功能(例如，删除相关基因的编码部分)。
优选地，删除基因包括去除那个基因，而且如果需要，选择一个便于鉴别的标记基因代替它，分离和提纯根据本发明优化的菌株。
大肠杆菌基因的灭活优选通过同源重组实现(Datsenko K.A.，Wanner B.L.(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645)。方案的原理简要叙述如下：将线性片段导入细胞，所述线性片段在活体内获得，包括两个旁侧基因区域和定位于这两个区域之间的至少一个选择基因(通常是抗生素抗性基因)。这个片段因此含有灭活基因。随后通过在选择性培养基上铺板来选择发生了重组事件并整合有导入片段的细胞。然后选择经历了双重重组事件的细胞，该细胞中灭活基因替代了野生基因。为了加速双重重组的检出，这个方案可以用阳性和阴性选择系统进行改进。
酿酒酵母基因的灭活也是优选通过同源重组进行(Baudin et al.，Nucl.Acids Res.21，3329-3330，1993；Wach et al.，Yeast 10，1793-1808，1994；Brachmann et al.，Yeast.14：115-32，1998)。
促进酶活性的方法包括通过适当的方式稳定相关基因表达的产物，例如通过减小它对变构效应物的灵敏性，或者通过增强基因的表达以增加产生的酶量。
基因的超表达可以通过在原位用强启动子或诱导型启动子替换基因的启动子来实现。作为替代方案，将复制的质粒(单拷贝或多拷贝)导入细胞，其中超表达的基因由适当的启动子控制。在大肠杆菌修饰的情况下，例如，可以用启动子Plac-o、Ptrc-o和ptac-o三种删除了乳糖操纵子(lacO)而构成的强细菌启动子。在酿酒酵母修饰的情况下，例如，可以用启动子Ppgk、Padhl、Pgal1、Pgal10。
本方法可用于改变酶的辅因子专一性，以使它对NADP的利用优先于NAD，包括改变使那种酶表达的基因序列(Bocanegra，J.A.Scrutton，N.S.；Perham，R.N.(1993)Creation of an NADP-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex byprotein engineering.Biochemistry 32：2737-2740)。
根据发明优化的菌株，即有增强的NADP+还原能力的菌株，通过一种或多种NADPH氧化酶活性的衰减或失活来表现其特征，NADPH氧化酶活性具体而言是醌氧化还原酶和/或可溶性转氢酶的活性。
下面列出了一些NADPH氧化酶活性和基因的非限制性的实例：
  酶活性   EC编号   大肠杆菌基因   酿酒酵母基因
  醇脱氢酶   1.1.1.2   yahK   ADH6
  醛糖还原酶   1.1.1.21   GRE3
  莽草酸脱氢酶   1.1.1.25   aroE   ARO1
  丙酮醛还原酶   1.1.1.78   GRE2p
  γ谷氨酰磷酸还原酶   1.2.1.41   proA   PRO2
  2，4-双烯酰辅酶A还原酶   1.3.1.34   fadH
  谷氨酸脱氢酶   1.4.1.4   gdhA   GDH1，GDH2
  谷氨酸合酶   1.4.1.13   gltB，gltD   GLT1
  亚甲基四氢叶酸脱氢酶   1.5.1.5   folD   ADE3，MIS1
  可溶性转氢酶   1.6.1.1   udhA
  膜结合转氢酶   1.6.1.2   pntA，pntB
  醌氧化还原酶   1.6.5.5   qor   ZTA1
  亚硝酸还原酶   1.7.1.4   nirB，nirD
  亚硫酸还原酶   18.1.2   cysI，cysJ
  甾醇脱甲基酶   1.14.13.70   ERG11
  4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶   1.17.1.2   ispH
  黄素氧还蛋白还原酶   1.18.1.2   fpr
根据本发明优化的菌株(即具有增强的NADP+还原能力)还包括促进一种或多种NADP+还原酶活性的修饰，尤其是经过磷酸戊糖途径设定碳流量的修饰，和/或涉及至少一种酶的辅因子专一性的修饰，以使它对NADP的利用优先于它的惯用辅因子NAD。
在根据本发明优化的促进一种或多种NADP+还原酶活性的菌株(即具有增强的NADP+还原能力)中对修饰易感的活性在下面列出：
  酶活性   EC编号   大肠杆菌基因   酿酒酵母基因
磷酸葡糖异构酶 5.3.1.9 pgi PGI1
  磷酸果糖激酶   2.7.1.11   pfkA，pfkB   PFK1，PFK2
  葡萄糖-6-磷酸脱氢酶   1.1.1.49   zwf   ZWF1
6-磷酸葡糖酸内酯酶 3.1.1.31   SOL1，SOL2，SOL3，SOL4
  6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶   1.1.1.44   gnd   GND1，GND2
  6-磷酸葡萄糖酸脱水酶   4.2.1.12   edd
  苹果酸合酶   2.3.3.9   aceB   DAL7
  异柠檬酸裂合酶   4.1.3.1   aceA   ICL1
  异柠檬酸脱氢酶   1.1.1.42   icd   IDP1，IDP2，IDP3
  异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶   2.7.1.116   aceK
  二氢硫辛酰胺脱氢酶   1.8.1.4   lpd   LPD1
  甘油醛-3-磷酸脱氢酶   1.2.1.12   gapA，gapC   TDH1，TDH2，TDH3
在根据本发明优化的菌株中对修饰易感的酶活性主要是通过大肠杆菌或酿酒酵母中蛋白质或基因的命名来定义的。然而，根据本发明这种用法有更普遍的含义，并且包括其他微生物中相应的酶活性。用大肠杆菌或酿酒酵母中蛋白质或基因的序列，那些本领域的技术人员可以鉴定出大肠杆菌和酿酒酵母以外的微生物中的等效基因。
那些本领域的技术人员熟知鉴别同源序列和它们的同源性百分比的方法，并且尤其包括BLAST程序，它可以在网址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/中用那里显示的默认参数使用。得到的序列然后可以被利用(例如比对)，例如用CLUSTALW程序( http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或者MULTALIN程序( http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)，用它们网址上显示的默认参数使用。
作为替代方案，CD-Search程序( http://www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)可用于鉴别大肠杆菌或酿酒酵母蛋白质序列中的保守性结构域，并用于搜索其他微生物中表现相同结构域的序列。保守性结构域记录在CDD数据库中(Conserveddomain database；Marchler-Bauer A，Anderson JB，DeWeese-Scott C，Fedorova ND，Geer LY，He S，Hurwitz DI，Jackson JD，Jacobs AR，Lanczycki CJ，Liebert CA，LiuC，Madej T，Marchler GH，Mazumder R，Nikolskaya AN，Panchenko AR，Rao BS，Shoemaker BA，Simonyan V，Song JS，Thiessen PA，Vasudevan S，Wang Y，YamashitaRA，Yin JJ，Bryant SH.CDD：a curated Entrez database of conserved domainalignments. Nucleic Acids Research 31：383-387(2003))，其中将数据分组成PFAM或COG类型。
PFAMs(Protein FAMilies database of alignment and hidden Markov models；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是蛋白质序列比对的一个大集合。每个PFAM可以显示多重比对，看蛋白质结构域，评估在生物中的分布，进入其它数据库和显示已知蛋白质结构。
COGs(Clusters of Orthologous Groups of Proteins；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是通过比较代表30种主要系统发育系的43个完全测序的基因组的蛋白质序列获得的。每个COG至少以3条线定义，这样可以识别古老的保守性结构域。
从通过这些不同方法识别的共有序列，可以设计简并寡核苷酸探针以克隆另一种微生物中的相应基因。这些常规分子生物学方法是本领域的技术人员熟知的，例如在Sambrook et al.(1989 Molecular cloning：a laboratory manual.2nd Ed.Cold SpringHarbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York.)中已经描述。
由udhA基因编码的大肠杆菌可溶性转氢酶的蛋白质类似物的编码基因的实例：
  基因   微生物
  sth   棕色固氮菌
  udhA   鼠伤寒沙门氏杆菌LT2
  sthA   铜绿假单孢菌PA01
  sth   荧光假单胞菌
  sthA   恶臭假单孢菌KT2440
  udhA   弗氏志贺氏菌2a str.301
  sthA   霍乱弧菌
  sthA   鼠疫杆菌
由qor基因编码的大肠杆菌醌氧化还原酶的蛋白质类似物的编码基因的实例：
  基因  微生物
  qor  慢生型大豆根瘤菌USDA110
  qor  猪布鲁氏菌1330
  CC3759  新月柄杆菌
  mll0505  百脉根根瘤菌
  qor  结核分枝杆菌H37RV
  qor  铜绿假单孢菌
  ZTA1  酿酒酵母
  SPCC285.01c  粟酒裂殖酵母
  drgA  集胞蓝细菌属PCC6803
  qorA  金黄色葡萄球菌
  TTC0305  嗜热栖热菌HB8
  qor  鼠疫杆菌CO92
根据本发明优化的菌株(即具有增强的NADP+还原能力)特征在于删除至少一个编码NADPH氧化活性的基因，尤其是删除编码醌氧化还原酶的基因(例如qor，ZTA1)和/或编码可溶性转氢酶活性的基因(例如udhA)。
本发明优选的实施方案中udhA和qor基因都被删除。
本发明的具体实施方案中，根据本发明优化的菌株还有特征是删除编码磷酸葡糖异构酶活性(例如pgi，PGI1)和/或磷酸果糖激酶活性(例如pfkA，PFK1)的一个或多个基因。
本发明进一步具体的实施方案中，根据本发明优化的菌株还有特征在于修饰编码二氢硫辛酰胺脱氢酶(例如lpd，LPD1)和/或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如gapA，TDH1)活性的一个或多个基因，这些修饰引起酶优选NADP，而不是它的常见辅因子NAD。
以删除编码磷酸葡糖异构酶和/或磷酸果糖激酶活性的基因为特征的本发明菌株尤其适合于生物转化方法。
为了提高根据本发明优化的微生物中可用的NADPH含量，可以有利的超表达编码下列酶活性之一的至少一个基因：葡萄糖6-磷酸脱氢酶(例如zwf，ZWF1)，6-磷酸葡糖酸内酯酶(例如SOL1)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(例如gnd，GND1)、异柠檬酸脱氢酶(例如icd，IDP1)和膜结合转氢酶(例如pntA)，和/或删除编码下列酶活性之一的至少一个基因：磷酸葡萄糖酸脱水酶(例如edd)、苹果酸合酶(例如aceB，DAL7)、异柠檬酸裂合酶(例如aceA，ICL1)和异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(例如aceK)。
本发明进一步的目的是如前后所述为了生产NADPH而优化的微生物，该微生物还包括编码参与感兴趣物质生物转化的酶活性的一个或多个基因，和一个或多个选择标记基因。
这些基因可以是本发明所优化的菌株自身的，也可以是使用合适的载体经转化导入本发明所优化的菌株内的，这些基因即可以整合到微生物的基因组，也可以是复制型载体，适合的载体携带一个或多个编码参与相关感兴趣物质生物转化的相关酶的基因和/或相关选择标记。
这些基因包括编码参与感兴趣物质生物转化的酶和/或选择标记的核酸序列，该编码序列与选用于生物转化的真核和/或原核细胞中的有效启动子序列结合。载体(或质粒)可以是大肠杆菌和另一种微生物之间的穿梭载体。
优化NADPH/NADP+比率的菌株的选择取决于生物转化的类型(发酵或生物转换)、所考虑生物转换途径中对NADPH的总需求、碳源的性质、生物物质流量需求等等。
如果不能控制碳流量在糖酵解和磷酸戊糖途径之间的分布，必须删除编码磷酸葡糖异构酶和/或磷酸果糖激酶活性的基因。对于发酵或当NADPH需求要求每摩尔输入葡萄糖2摩尔NADP+的最小还原流量时，优选删除编码磷酸葡糖异构酶的基因。对于生物转换或当NADPH需求要求每摩尔输入葡萄糖3-4摩尔NADP+的最小还原流量时，优选删除编码磷酸果糖激酶的基因。当生物转化要求每摩尔输入葡萄糖的最小还原流量大于3摩尔NADP+，尤其是为了优化大肠杆菌菌株Δ(udhA，qor)或大肠杆菌菌株Δ(udhA，qor，pgi)或大肠杆菌菌株Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)，如前面和后面所述，将修饰编码二氢硫辛酰胺脱氢酶和/或甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因。可以进行其它所述修饰，即超表达至少一个编码下列酶活性之一的基因：葡萄糖6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和膜转氢酶，和/或删除至少一个编码下列酶活性之一的基因：6-磷酸葡糖酸脱水酶、苹果酸合酶、异柠檬酸裂合酶或异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶，以精细调节NADPH/NADP+比率的优以满足细胞以及所考虑生物转化方法的需要。
本发明还涉及如前后所述根据本发明优化的菌株的制备方法，其特征在于删除编码醌氧化还原酶或可溶性转氢酶活性的基因，还有可能删除编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶或6-磷酸葡糖酸内酯酶活性的基因，和/或修饰至少一个编码NAD酶的基因，尤其是编码二氢硫辛酰胺脱氢酶或甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因，使得它们优先使用NADP，并且如果需要，删除至少一个编码6-磷酸葡糖酸脱水酶、苹果酸合酶、异柠檬酸裂合酶或异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的基因，这种删除和修饰通过适合的方式进行，和/或特征在于超表达至少一个编码下列活性的基因：葡萄糖6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶或膜转氢酶，这通过使用合适的允许超表达的载体来修饰菌株实现，或通过修饰控制待超表达基因的内源性启动子的强度实现。
本发明的具体实施方案中，根据本发明制备菌株的方法还包括用至少一个合适的载体转化优化菌株，载体包括编码一种或多种参与感兴趣物质生物转化的酶的一个或多个基因，和一个或多个选择标记基因。
本发明进一步的目的还涉及根据本发明优化的这些菌株用于NADPH依赖性生物转化以获得与没有优化NADPH的菌株相比具有更高生物转化产率的用途。
生物转化将使用根据本发明定义的菌株进行，其中将表达编码那些催化NADPH依赖性反应的酶活性的基因。那些本领域的技术人员可以轻易地鉴定这些酶。其中包括下列酶： EC 1.1.1.10 L-木酮糖还原酶、 EC 1.1.1.21甲基乙二醛还原酶、 EC 1.1.1.51 3(或17)β-羟基类固醇脱氢酶、 EC 1.1.1.54烯丙基醇脱氢酶、 EC 1.1.1.80异丙醇脱氢酶、 EC 1.1.1.134 dTDP-6-脱氧-L-塔罗糖4-脱氢酶、 EC 1.1.1.149 20α-羟基类固醇脱氢酶、 EC 1.1.1.151 21-羟基类固醇脱氢酶、 EC 1.1.1.189前列腺素-E29-还原酶、 EC 1.1.1.191吲哚-3-乙醛还原酶、 EC 1.1.1.207(-)-薄荷醇脱氢酶、 EC 1.1.1.234黄烷酮4-还原酶、 EC 1.2.1.50长链脂肪酰基辅酶A还原酶、 EC 1.3.1.4可的松α-还原酶、 EC 1.3.1.23胆甾烯酮5β-还原酶、 EC 1.3.1.70Δ14-甾醇还原酶、 EC 1.4.1.12 2，4-二氨基戊酸脱氢酶、 EC 1.5.1.10形成L-谷氨酸的酵母氨酸脱氢酶、 EC 1.7.1.6偶氮苯还原酶、 EC 1.8.1.5 2-氧代丙基-CoM还原酶(羧化)、 EC 1.10.1.1反苊-1，2-二醇脱氢酶、 EC 1.14.13.7苯酚2-单加氧酶、 EC 1.14.13.12苯甲酸4-单加氧酶、 EC 1.14.13.26磷脂酰胆碱12-单加氧酶、 EC 1.14.13.64 4-羟基苯甲酸1-羟化酶、EC 1.14.13.70甾醇14-脱甲基酶、 EC 1.16.1.5水合钴胺素(aquacobalamine)还原酶、 EC 1.17.1.1 CDP-4-脱氢-6-脱氧葡萄糖还原酶、 EC 1.18.1.2铁氧还蛋白-NADP还原酶。
本发明还涉及生产感兴趣物质的方法，该物质由包括至少一个NADPH依赖性反应的生物合成途径形成，其特征在于，它包括下列步骤：
a)使根据本发明优化的微生物培养物在合适的促进其生长的培养基中生长，培养基中包含通过发酵或生物转换进行生物转化必需的物质，NADPH除外。
b)从培养基中提取感兴趣物质，如果必要进行纯化。
优选地，感兴趣物质可以是氨基酸、维生素、甾醇、类黄酮、脂肪酸、有机酸、多元醇或羟基酯。氨基酸和它们的前体具体包括赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、高丝氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。维生素和它们的前体具体包括泛酸(pantoate)、反-链孢红素、叶绿醌和生育酚。甾醇具体包括角鲨烯、胆固醇、睾酮、黄体酮和可的松。类黄酮具体包括羟苯基丁酮和vestitone。有机酸包括香豆酸和3-羟基丙酸。多元醇包括山梨醇、木糖醇和甘油。羟基酯包括3-羟基丁酸乙酯和4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
在生物转换情况下，方法还包括添加待转化底物的合适的培养基。
上述在根据本发明的方法的步骤b)中提及的培养基包含至少一种可同化的碳水化合物，其可以是多种可同化糖的任一种，例如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、糖蜜或这些糖的副产品。特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一种优选的简单碳源是蔗糖。培养基还可以包含一种或多种有利于微生物生长和/或感兴趣物质生成的物质(例如氨基酸、维生素或矿质盐)。具体而言，大肠杆菌的矿物培养基可以含有与M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32：120-128)、M63培养基(Miller，1992；A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual and Handbook forEscherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)或Schaefer等描述的培养基(1999，Anal.Biochem.270：88-96)同样或近似的组成。
生物转化条件由那些本领域的技术人员设定。具体而言，微生物在20-55℃之间的温度发酵，优选25-40℃之间的温度，并且对于酿酒酵母优选约30℃，对于大肠杆菌优选约37℃。
下列实施例仅限于举例说明，决不限制实施方案或本发明的范围。
实施例1：计算由乙酰乙酸乙酯向3-羟基丁酸乙酯的生物转换的理论最佳产量
                  a)使用大肠杆菌进行生物转换
预测建模使用算法MetOpt-Coli进行，这是由METabolic EXplorer公司研发的化学计量学模型，用这种模型可以确定1)由乙酰乙酸乙酯向3-羟基丁酸乙酯的最大生产量，和2)满足对细胞生长和达到最大生物转换产率必需的生长和氧化还原平衡需要的葡萄糖最佳流量分配。
模型变量的具体设置为1)葡萄糖输入流量为3mmol.g-1.h-1，2)生长速率变量为0、0.15和0.25h-1，3)膜结合转氢酶流量变量(pntAB)小于或等于1mmol.g-1.h-1；膜结合转氢酶流量的限制值根据文献确定(Hanson，1979；Anderlund et al.，1999；Emmerling et al.，2002)，和4)维持流量限制在5-22mmol.g-1.h-1之间。
在所有情况下模型建议删除udhA和qor基因。然而实际上，大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor)]不提供与理论最佳产率相当的产率，这是由于很难维持碳流量在戊糖磷酸途径和糖酵解之间的合理分配，根据生长速率这种分配是变化的。因此，实际上，优选大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)]或[Δ(udhA，qor，pgi)]，它们之间的选择依赖于生物转换过程中菌株的生长速率。
对于根据本发明优化的不同大肠杆菌菌株计算由乙酰乙酸乙酯向3-羟基丁酸乙酯生物转换的理论最佳产率。
  μ＝0   μ＝0.15h-1   μ＝0.25h-1
  Δ(udhA，qor，pgi)   1.82   1.74   1.22
  Δ(udhA，qor，pgi)gapA-NADP-依赖性   4.29   3.64   2.43
  Δ(udhA，qor，pgi)lpd-NADP-依赖性   5.67   3.46   1.99
  Δ(udhA，qor，pgi)gapA-NADP-依赖性lpd-NADP-依赖性 6.86 4.96 3.33
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)   6.76   4.65   0.19
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)gapA-NADP-依赖性   8.16   5.54   1.02
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)lpd-NADP-依赖性   8.33   5.60   1.77
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)gapA-NAD P-依赖性lpd-NADP-依赖性 9.33 6.38 2.60
优化NADP+还原能力的大肠杆菌菌株将乙酰乙酸乙酯生物转换为3-羟基丁酸乙酯的
                      理论最佳产率(摩尔/摩尔葡萄糖)
为了进一步提高根据本发明优化的菌株的理论最佳产率，还可以进行另外的修饰，例如超表达至少一个基因，它们可以是zwf、gnd、pntA、pntB或icd，和/或删除至少一个基因，它们可以是edd、aceA、aceB或aceK。
                       b)使用酿酒酵母进行生物转换
预测建模使用算法MetOpt-Scere进行，这是由本公司研发的化学计量学模型，用这种模型可以确定1)由乙酰乙酸乙酯向3-羟基丁酸乙酯的最大产率，并且2)为满足对细胞生长和达到最大生物转换产率必需的生长和氧化还原平衡需要的葡萄糖最佳流量分配。
模型变量的具体设置为1)葡萄糖输入流量为3mmol.g-1.h-1，2)生长速率变量为0、0.15和0.25h-1，3)维持流量小于或等于22mmol.g-1.h-1，4)醛脱氢酶反应(ALD2、ALD3、ALD6)是不可逆的，并且设定方向为：乙酸+NAD(P)H→乙醛+NAD(P)，和5)没有与udhA或phtA，B相当的活性。
模型允许区隔化线粒体和过氧化物酶体。
所有情况下，模型建议删除编码氧化NADPH的酶的基因，尤其是基因ZTA1。然而实际上，酿酒酵母菌株[ΔZTA1]不提供与理论最佳产率相当的产率，这是由于很难维持碳流量在戊糖磷酸途径和糖酵解之间的合理分配，因为这种分配是随生长速率变化的。实际上优选使用酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)]或[Δ(ZTA1，PGI1)]，它们之间的选择依赖于生物转化过程中菌株的生长速率。
对于根据本发明优化的不同酿酒酵母菌株计算由乙酰乙酸乙酯向3-羟基丁酸乙酯生物转换的理论最佳产率。
  μ＝0   μ＝0.15h-1   μ＝0.25h-1
  Δ(ZTA1，PGI1)   2.42   2.00   1.73
  Δ(ZTA1，PGI1)TDH1，2，3-NADP-依赖性   4.22   3.50   3.03
  Δ(ZTA1，PGI1)LPD1-NADP-依赖性   4.08   3.29   2.77
  Δ(ZTA1，PGI1)TDH1，2，3-NADP-依赖性LPD1-NADP-依赖性 6.17 5.01 4.23
  Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)   12.00   8.18   5.64
  Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)TDH1，2，3-NADP-依赖性   12.00   9.11   7.19
  Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)LPD1-NADP-依赖性   12.00   8.44   6.06
  Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)TDH1，2，3-NADP-依赖性LPD1-NADP-依赖性 12.00 9.28 7.46
优化NADP+还原能力的酿酒酵母菌株将乙酰乙酸乙酯生物转换为3-羟基丁酸乙酯的
                      理论最佳产率(摩尔/摩尔葡萄糖)
为了进一步提高根据本发明优化的菌株的理论最佳产率，还可以进行另外的修饰，例如超表达至少一个基因，它们可以是ZWF、SOL1、SOL2、SOL3、SOL4、GND1、GND2、IDP1、IDP2或IDP3，和/或删除至少一个基因，它们可以是ICL1或DAL7。
             实施例2：大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor)]的构建
udhA基因的灭活通过同源重组实现，使用Datsenko和Wanner描述的方法(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：6640-6645)。
该方法包括插入抗生素(氯霉素)抗性盒并同时删除大多数相关基因。为此目的合成一对寡核苷酸，每个包含100pb组成，其中80pb(小写)和待删除基因同源，20pb(大写)和氯霉素抗性盒同源。
DudhAF
ggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgtcgaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG
DudhAR
CccagaatctcttttgtttcccgatggaacaaaattttcagcgtgcccacgttcatgccgacgatttgtgcgcgtgccagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
质粒pKD3携带的抗生素盒通过使用寡核苷酸DudhAF和DudhAR的PCR进行扩增。获得的PCR产物随后通过电穿孔导入大肠杆菌菌株[pKD46]，该菌株携带编码Red重组酶的基因，这是一种催化同源重组的酶。随后选择氯霉素抗性转化子，并通过使用寡核苷酸UdhAF和UdhAR的PCR分析检查抗性盒的插入。
UdhaF
Ggccgctcaggatatagccagataaatgac
UdhaR
Gcgggatcactttactgccagcgctggctg
随后除去氯霉素抗性盒。为此，将携带作用于氯霉素抗性盒FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组体菌株。一系列的42℃温度下的培养之后，抗生素抗性盒的缺失通过使用寡核苷酸UdhAF和UdhAR的PCR分析进行检测。
基因qor的灭活通过相同方法用下列寡核苷酸进行：
DqorF
ggtggcccggaagtacttcaagccgtagagttcactcctgccgatccggcggagaatgaaatccaggtcgaaaataaagcCATATGAATATCCTCCTTAG
DqorR
cgcccggctttccagaatctcatgcgcacgctgcgcatccttcagcggatatttctgctgctcggcgacatcgaccttaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
QorF
Cgcccaacaccgactgctccgcttcgatcg
QorR
cagcgttatgaccgctggcgttactaaggg
因为实践的原因同时删除两个基因是有用的。为此，每个基因用不同的抗生素抗性盒替换(例如udhA对氯霉素和qor对卡那霉素)。
这样获得的是大肠杆菌[Δ(udhA，qor)]。
实施例3：构建质粒pSK-PgapA-GRE2p，导入大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor)]
             并将乙酰乙酸乙酯生物转换为3-羟基丁酸乙酯
质粒pSK-PgapA是通过在载体pBluescript-SK(pSK)中插入启动子gapA构建的。为此，大肠杆菌的启动子gapA通过聚合酶Pwo从染色体DNA扩增。
然后将获得的PCR产物用限制酶HindIII消化并与经限制酶HindIII消化和去磷酸化的载体pSK连接，得到质粒pSK-PgapA。载体pSK载有大肠杆菌的复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
质粒pSK-PgapA随后导入大肠杆菌DH5α来验证构建。质粒pSK-PgapA中启动子gapA随后使用寡核苷酸通用M13正向引物测序来确认该构建。
质粒pSK-PgapA-GRE2p通过在质粒pSK-PgapA中插入基因GRE2p构建。为此，酿酒酵母的基因GRE2p通过聚合酶Pwo使用下列寡核苷酸从染色体DNA扩增。
Ome119_GRE2F(NdeI)
Acgtacgtgg catatgtcagtcagttttcgtttcaggtgctaacggg
Ome120_GRE2R(PstI)
Acgtac ctgcagttatattctgccctcaaattttaaaatttggg
获得的PCR产物随后通过限制酶NdeI-PstI消化并与经限制酶NdeI-PstI消化和去磷酸化的载体pSK-PgapA连接，得到质粒pSK-PgapA-GRE2p。质粒pSK-PgapA载有大肠杆菌的复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
质粒pSK-PgapA-GRE2p随后导入大肠杆菌DH5α来验证构建。质粒pSK-PgapA-GRE2p中的基因GRE2p随后使用寡核苷酸通用M13反向引物和通用M13正向引物测序来确认此构建。
已验证的质粒通过电穿孔导入大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor)](实施例2)。
随后使获得的大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor)pSK-PgapA-GRE2p]在含有葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培养基中生长。大肠杆菌菌株[pSK-PgapA-GRE2p]也在同样条件下生长。
当完成生长时比较下列变量：
-每个菌株在生物转换阶段的生物量的时间曲线。
-胞外培养基中生成的3-羟基丁酸乙酯的量。
-细胞内积聚的3-羟基丁酸乙酯的量。
-3-羟基丁酸乙酯的生产速率。
-葡萄糖/3-羟基丁酸乙酯产率。
已经发现大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor)pSK-PgapA-GRE2p]得到的3-羟基丁酸乙酯产量大于未优化菌株。
实施例4：大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi)pSK-PgapA-GRE2p]的构建和乙酰乙酸
                    乙酯向3-羟基丁酸乙酯的生物转换
基因pgi的灭活是在大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor)](实施例2)中使用实施例2描述的方法进行的，并用下列寡核苷酸：
DpgiF
ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DpgiR
gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAG
pgiF
gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc
pgiR
cggtatgatttccgttaaattacagacaag
构建在丰富培养基(例如LB培养基)中进行。质粒pSK-PgapA-GRE2p随后通过电穿孔导入获得的菌株(实施例3)，产生的大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi)pSK-PgapA-GRE2p]在丰富培养基上选出。
上面获得的菌株随后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培养基上生长。大肠杆菌菌株[pSK-PgapA-GRE2p]在相同条件下生长。
当完成生长时比较下列变量：
-每个菌株在生物转换阶段的生物量时间曲线。
-胞外培养基中生成的3-羟基丁酸乙酯的量。
-细胞内积聚的3-羟基丁酸乙酯的量。
-3-羟基丁酸乙酯的生产速率。
-葡萄糖/3-羟基丁酸乙酯产率。
已经观察到大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi)pSK-PgapA-GRE2p]得到的3-羟基丁酸乙酯产量大于未优化菌株。
  molEHB/mol葡萄糖
  MG 1655 pSK-PgapA-GRE2p   0.75
  MG1655Δ(udhA，qor，pgi)pSK-PgapA-GRE2p   2.12
实施例5：大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，edd)pSK-PgapA-GRE2p]的构建和乙酰
                      乙酸乙酯向3-羟基丁酸乙酯的生物转换
基因edd的灭活是在大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi)](实施例4)中使用实施例2描述的方法进行的，并用下列寡核苷酸：
DeddF(1932582-1932499)
CgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatagaacaagcgaaaacttcgaccgttcatcgttcgcagttggcatgcggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DeddR(1930866-1930943)
cgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcccacgcgtgacgcgctcaggtcaggaatgtgcggttcgcgagcagccCATATGAATATCCTCCTTAG
EddF(1932996-1932968)
Gggtagactccattactgaggcgtgggcg
EddR(1930439-1930462)
Ccccggaatcagaggaatagtccc
构建在丰富培养基(例如LB培养基)中进行。质粒pSK-PgapA-GRE2p随后通过电穿孔导入获得的菌株大肠杆菌[Δ(udhA，qor，pgi，edd)](实施例3)，产生的大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，edd)pSK-PgapA-GRE2p]在丰富培养基上选出。
上面获得的菌株大肠杆菌[Δ(udhA，qor，pgi，edd)pSK-PgapA-GRE2p]随后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培养基上生长。大肠杆菌菌株[pSK-PgapA-GRE2p]在相同条件下生长。
当完成生长时比较下列变量：
-每个菌株在生物转换阶段的生物量时间曲线。
-胞外培养基中生成的3-羟基丁酸乙酯的量。
-细胞内积聚的3-羟基丁酸乙酯的量。
-3-羟基丁酸乙酯的生产速率。
-葡萄糖/3-羟基丁酸乙酯产率。
我们观察到大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，edd)pSK-PgapA-GRE2p]的3-羟基丁酸乙酯产量大于未优化菌株。
实施例6：大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)pSK-PgapA-GRE2p]的构建和乙
                     酰乙酸乙酯向3-羟基丁酸乙酯的生物转换
基因pfkA和pfkB的灭活是在大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor)](实施例2)中使用实施例2描述的方法和下列寡核苷酸进行的：
DpfkAF
ggt gtg ttg aca agc ggc ggt gat gcg cca ggc atg aac gcc gca att cgc ggg gtt cgt tct gcg ctgaca gaa ggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DpfkAR
TtcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgcttcatgttttcgatagcgtcgatgatgtcgtggtgaaccagctgCATATGAATATCCTCCTTAG
PfkAF
Cgcacgcggcagtcagggccgacccgc
PfkAR
ccctacgccccacttgttcatcgcccg
DpfkBF(1804421-1804499)
gcgccctctctcgatagcgcaacaattaccccgcaaatttattcccgaaggaaaactgcgctgtaccgcaccggtgttcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DpfkBR(1805320-1805241)
gcgggaaaggtaagcgtaaattttttgcgtatcgtcatgggagcacagacgtgttccctgattgagtgtggctgcactccCATATGAATATCCTCCTTAG
PfkBF(1803996-1804025)
tggcaggatcatccatgacagtaaaaacgg
PfkBR(1805657-1805632)
gccggttgcactttgggtaagccccg
构建在丰富培养基(例如LB培养基)中进行。质粒pSK-PgapA-GRE2p随后通过电穿孔导入获得的菌株大肠杆菌[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)](实施例3)，产生的大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)pSK-PgapA-GRE2p]在丰富培养基上选出。
上面获得的菌株大肠杆菌[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)pSK-PgapA-GRE2p]随后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培养基上生长。大肠杆菌菌株[pSK-PgapA-GRE2p]在相同条件下生长。
当完成生长时比较下列变量：
-每个菌株在生物转换阶段的生物量时间曲线。
-胞外培养基中生成的3-羟基丁酸乙酯的量。
-细胞内积聚的3-羟基丁酸乙酯的量。
-3-羟基丁酸乙酯的生产速率。
-葡萄糖/3-羟基丁酸乙酯产率。
我们观察到大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)pSK-PgapA-GRE2p]的3-羟基丁酸乙酯产量大于未优化菌株。
  molEHB/mol葡萄糖
  MG 1655 pSK-PgapA-GRE2p   0.75
  MG1655Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)pSK-PgapA-GRE2p   3.46
实施例7：大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)plpd*，pSK-PgapA-GRE2p]的构建
                     和乙酰乙酸乙酯向3-羟基丁酸乙酯的生物转换
除了初始菌株用实施例4中描述的大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi)]代替野生菌株以外，使用实施例2描述的方法删除编码NAD依赖性的二氢硫辛酰胺脱氢酶的基因lpd，该酶参与丙酮酸盐脱氢酶多酶复合体。修饰后菌株的构建和选择在丰富培养基(例如LB培养基)中进行。获得的菌株是大肠杆菌[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)]。
另外构建质粒p-lpd*，该质粒允许超表达NADP依赖性二氢硫辛酰胺脱氢酶。有多种修饰酶辅因子专一性的可能方式。例如，Bocanegra et al.(1993)报道了创建NADP依赖性二氢硫辛酰胺脱氢酶的一种方法。
质粒p-lpd*和pSK-PgapA-GRE2p随后通过电穿孔导入大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)]。作为替代方案，lpd*可以克隆到pSK-PgapA-GRE2p上，得到的质粒pSK-PgapA-GRE2p-lpd*随后通过电穿孔导入大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)]。修饰后菌株的构建和选择是在丰富培养基(例如LB)中进行。
获得的大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)pSK-PgapA-GRE2p，p-lpd*]随后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培养基上生长。大肠杆菌菌株[pSK-PgapA-GRE2p]在相同条件下生长。
当完成生长时比较下列变量：
-每个菌株在生物转换阶段的生物量时间曲线。
-胞外培养基中生成的3-羟基丁酸乙酯的量。
-细胞内积聚的3-羟基丁酸乙酯的量。
-3-羟基丁酸乙酯的生产速率。
-葡萄糖/3-羟基丁酸乙酯产率。
我们观察到大肠杆菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)pSK-PgapA-GRE2p，p-lpd*]的3-羟基丁酸乙酯产量大于未优化菌株。
                实施例8：质粒pRSGK-GRE2p的构建
质粒pYGK通过在载体pBluescript-SK(pSK)中插入载体pYPG2的启动子Ppgk、多克隆位点和终止子cyc1构建。为此，启动子Ppgk、多克隆位点和终止子cvc1使用聚合酶Pfu Turbo从载体pYPG2扩增。获得的PCR产物随后使用限制酶SacII-NotI消化，并与使用限制酶ApaI-SmaI消化、连接、用限制酶NotI-ScaII消化并去磷酸化的载体pSK连接，得到质粒pYGK。
质粒pYGK随后导入大肠杆菌菌株DH5α来检验构建。质粒pYGK的启动子Ppgk、多克隆位点和终止子cycl使用寡核苷酸通用M13反向引物和通用M13正向引物测序以确定构建。
质粒pYGK-GRE2p通过在质粒pYGK中插入基因GRE2p构建。为此，酿酒酵母的基因GRE2p使用聚合酶Pwo从染色体DNA扩增，其中使用下列寡核苷酸：
Ome376_Gre2 pYGK F(SmaI)
Acgtacgt cccccgggaaaatgtcagttttcgtttcaggtgc
Ome377_Gre2 pYGK R(ApaI)
ACGTAC GGGCCCTTATATTCTGCCCTCAAATTTTAAAATTGGG
获得的PCR产物随后使用限制酶ApaI-SmaI消化，并与经限制酶ApaI-SmaI消化和去磷酸化的载体pYGK连接，得到质粒pYGK-GRE2p。
质粒pYGK-GRE2p随后导入大肠杆菌菌株DH5α来检验构建。质粒pYGK-GRE2p的基因GRE2p使用寡核苷酸通用M13反向引物和通用M13正向引物测序以确定构建。
通过使用限制酶NotI-SacII消化质粒pYGK-GRE2p和pRS426，然后连接，最终获得质粒pRSGK-GRE2p。
实施例9：酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1)pRSGK-GRE2p]的构建和乙酰乙酸乙酯向3-
                    羟基丁酸乙酯的生物转换
基因ZTA1的灭活是通过插入标记(抗生素抗性，营养缺陷型)同时删除大多数相关基因进行的。使用的技术如Brachmann et al.描述(Designer deletion strainsderived from Saccharomyes cerevisae S288C：a useful set of strains and plasmids forPCR-mediated gene disruption and other applications，Yeast，1998，14：115-32)。也可以使用Wach et al.描述的方法(New heterologous modules for classical orPCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae，Yeast，1994，10：1793-1808)。
在所有情况下获得最终酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1)]，然后向其中导入质粒pRSGK-GRE2p(实施例8)。
作为替代方案，还可以将质粒pRSGK-GRE2p导入可用的Δ(ZTA1)菌株，例如菌株EUROSCARF Y33183(基因型：BY4743；Mat a/α；his3D1/his3D1；leu2D0/leu2D0；lys2d0/LYS2；MET15/met15D0；ura3D0/ura3D0；YBR046c::kanMX4/YBR046c::kanMX4)。之后可以在孢子形成以后回收酿酒酵母纯合体菌株[Δ(ZTA1)pRSGK-GRE2p]。
获得的酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1)pRSGK-GRE2p]随后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培养基上生长。
酿酒酵母对照菌株[pRSGK-GRE2p]在同样条件下生长。
当完成生长时比较下列变量：
-每个菌株在生物转换阶段的生物量时间曲线。
-胞外培养基中生成的3-羟基丁酸乙酯的量。
-细胞内积聚的3-羟基丁酸乙酯的量。
-3-羟基丁酸乙酯的生产速率。
-葡萄糖/3-羟基丁酸乙酯产率。
我们发现酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1)pRSGK-GRE2p]的3-羟基丁酸乙酯产量大于未优化菌株。
实施例10：酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PGI1)pRSGK-GRE2p]的构建和乙酰乙酸乙
               酯向3-羟基丁酸乙酯的生物转换
基因PGI1的灭活在酿酒酵母[Δ(ZTA1)pRSGK-GRE2p]中使用实施例9描述的方法和下列寡核苷酸进行：
Dpgi1F
CCAACGCAGACCGCTGCCTGGCAGGCACTACAGAAACACTTCGATGAAATGAAA
GACGTTACGATCGCCGATCTTTTTGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
Dpgi1R
GCGCCACGCTTTATAGCGGTTAATCAGACCATTGGTCGAGCTATCGTGGCTGCTGA
TTTCTTTATCATCTTCAGCTCTGCATATGAATATCCTCCTTAG
Pgi1F
GCGGGGCGGTTGTCAACGATGGGGTCATGC
Pgi1R
CGGTATGATTTCCGTTAAATTACAGACAAG
作为替代方案，可以使用可用的Δ(PGI1)菌株，例如菌株EUROSCARF Y23336(Mat a/α；his3D1/his3D1；leu2D0/leu2D0；lys2D0/LYS2；MET15/met15D0；ura3D0/ura3D0；YBR196c::kanMX4/YBR196c)。该菌株随后用质粒pRSGK-GRE2p转换(实施例8)，并且使用实施例9描述的方法删除基因ZTA1。
获得的酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PGI1)pRSGK-GRE2p]随后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培养基上生长。
酿酒酵母对照菌株[pRSGK-GRE2p]在同样条件下生长。
当完成生长时比较下列变量：
-每个菌株在生物转换阶段的生物量时间曲线。
-胞外培养基中生成的3-羟基丁酸乙酯的量。
-细胞内积聚的3-羟基丁酸乙酯的量。
-3-羟基丁酸乙酯的生产速率。
-葡萄糖/3-羟基丁酸乙酯产率。
我们发现酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PGI1)pRSGK-GRE2p]的3-羟基丁酸乙酯产量大于未优化菌株。
实施例11：酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)pRSGK-GRE2p]的构建和乙酰乙酸乙酯向3-羟基丁酸乙酯的生物转换
使用实施例9描述的方法和下列寡核苷酸删除酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1)]中的基因PFK1和PFK2，：
Dpfk1F
ATGCAATCTCAAGATTCATGCTACGGTGTTGCATTCAGATCTATCATCACAAATGA
TGAAAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCG
Dpfk1R
TTTGTTTTCAGCGGCTAAAGCGGCTACCTCAGCTCTCAACTTTAATCTACCGGACA
GGATGGGCCACTAGTGGATCTGATATC
Pfk1 int F
GCTTTCTTAGAAGCTACCTCCG
Pfk1 int R
GAACCGACAAGACCAACAATGG
Pfk2 int F
CAGTTGTACACTTTGGACCC
Pfk2 int R
GATCAGCACCAGTCAAAGAACC
该菌株随后用质粒pRSGK-GRE2p转换(实施例8)。
获得的酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)pRSGK-GRE2p]随后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培养基上生长。
酿酒酵母对照菌株[pRSGK-GRE2p]在同样条件下生长。
当完成生长时比较下列变量：
-每个菌株在生物转换阶段的生物量时间曲线。
-胞外培养基中生成的3-羟基丁酸乙酯的量。
-细胞内积聚的3-羟基丁酸乙酯的量。
-3-羟基丁酸乙酯的生产速率。
-葡萄糖/3-羟基丁酸乙酯产率。
我们发现酿酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)pRSGK-GRE2p]的3-羟基丁酸乙酯产量大于未优化菌株。
  molEHB/mol葡萄糖
  S.酿酒酵母[pRSGK-GRE2p]   进行中
  S.酿酒酵母[Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)pRSGK-GRE2p]   进行中
实施例12：使用优化大肠杆菌生产3-羟基丁酸乙酯的代谢模型比较实验值和预测值
我们发现预测性建模(实施例1)和实施例3、4、5、6、7、9、10和11中的实验结果紧密相关。
上面的实施例1-11是本发明的具体应用，并不限制本发明的范围。那些本领域的技术人员可以轻易的适应性改变这些实施例，用于由NADPH依赖性合成形成的物质的生物转化。验证了算法MetOpt和通过优化NADPH/NADP+比率来优化NADPH依赖性生物转化过程的策略；因此本专利要求保护所有可以使用MetOpt或其任何派生物建模和预测的、使用大肠杆菌、酿酒酵母或任何其它微生物进行NADPH依赖性生物转化的应用。
实施例13：大肠杆菌发酵过程中理论最佳产量的计算
实施例12显示本公司研发的MetOpt模型可用于生物转换，并将更普遍的用于生物转化，例如发酵。
例如，MetOpt-Coli模型应用于通过在根据本发明优化的大肠杆菌菌株内发酵葡萄糖来生产半胱氨酸或3-羟基丙酸。使用的参数和实施例1中相同，也就是：1)葡萄糖输入流量3mmol.g-1.h-1，2)生长速率变量0、0.15和0.25h-1，3)膜结合转氢酶流量(pbtAB)变量小于或等于1mmol.g-1.h-1；膜结合转氢酶流量的限制值根据文献确定(Hanson，1979；Anderlund et al.，1999；Emmerling et al.，2002)，和4)维持流量限制于5-22mmol.g-1.h-1之间。
                      a)通过葡糖糖发酵生产半胱氨酸的情况
  μ＝0   μ＝0.15h-1   μ＝0.25h-1
  Δ(udhA，qor，pgi)   0.66   0.37   0.09
  Δ(udhA，qor，pgi)gapA-NADP-依赖性   0.78   0.37   0.09
  Δ(udhA，qor，pgi)lpd-NADP-依赖性   0.78   0.37   0.09
  Δ(udhA，qor，pgi)gapA-NADP-依赖性lpd-NADP-依赖性 0.78 0.37 0.09
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)   0.40   0.18   0.01
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)gapA-NADP-依赖性   0.62   0.30   0.06
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)lpd-NADP-依赖性   0.71   0.36   0.13
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)gapA-NADP-依赖性lpd-NADP-依赖性 0.77 0.42 0.17
             优化NADP+还原能力的大肠杆菌菌株发酵生产半胱氨酸
                      的理论最佳产率(摩尔/摩尔葡萄糖)
为了进一步提高根据本发明优化的菌株的理论最佳产率，可以进行另外的修饰，例如超表达至少一个基因，它们可以是zwf、gnd、pntA、pntB或icd，和/或删除至少一个基因，它们可以是edd、aceA、aceB或aceK。
实际上，为了获得这样的产率必须对根据本发明优化的菌株做其它修饰，例如如专利WO0127307描述的超表达基因cysB，或如专利EP0885962描述的修饰基因cvsE。
b)通过葡糖糖发酵生产3-羟基丙酸的情况
生产3-羟基丙酸在含有编码3-羟基丙酸合成途径酶的基因的大肠杆菌菌株内进行，所述酶例如绿色丝状菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙二酰辅酶A还原酶(Hügler et al.，Journal of Bacteriology，2002，184：2404-2410)。
  μ＝0   μ＝0.15h-1 μ＝0.25h-1
  Δ(udhA，qor，pgi)   1.33   0.79 0.30
  Δ(udhA，qor，pgi)gapA-NADP-依赖性   1.76   0.99 0.30
  Δ(udhA，qor，pgi)lpd-NADP-依赖性   1.82   0.99 0.30
  Δ(udhA，qor，pgi)gapA-NADP-依赖性lpd-NADP-依赖性 1.82 0.99 0.30
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)   1.62   0.66 0.03
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)gapA-NADP-依赖性   1.76   0.79 0.07
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)lpd-NADP-依赖性   1.79   0.84 0.07
  Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)gapA-NADP-依赖性lpd-NADP-依赖性 1.79 0.84 0.07
优化NADP+还原能力的大肠杆菌菌株发酵生产3-羟基丙酸的理论最佳产率(摩尔/摩尔葡萄糖)
为了进一步提高根据本发明优化的菌株的理论最佳产率，可以进行另外的修饰，例如超表达至少一个基因，它们可以是zwf、gnd、pntA、pntB或icd，和/或删除至少一个基因，它们可以是edd、aceA、aceB或aceK。
实施例14：酿酒酵母发酵过程中的理论最佳产量的计算；生产氢化可的松的应用
实施例12显示本公司研发的MetOpt模型可用于生物转换，并将更普遍的用于生物转化，例如发酵。
例如，MetOpt-Scere模型应用于通过在根据本发明优化的酿酒酵母菌株内经葡萄糖发酵生产氢化可的松。使用的参数和实施例1中相同，也就是：1)葡萄糖输入流量3mmol.g-1.h-1，2)生长速率变量0、0.15和0.25h-1，3)维持流量小于或等于22mmol.g-1.h-1，4)醛脱氢酶(ALD2，ALD3，ALD6)的反应是不可逆的，并设置方向为：乙酸+NAD(P)H→乙醛+NAD(P)，和5)没有与udhA或udhB相当的活性。
该模型允许区隔化线粒体和过氧化物酶体。
此结果证明了根据本发明所做的每个突变对于改进NADPH生成以及改进氢化可的松生产流量的真实贡献。
氢化可的松的生产在含有编码氢化可的松合成途径酶的基因的酿酒酵母菌株内实现(Szczebara et al.，2003，Nature biotechnology，21：143-149)。
  μ＝0   μ＝0.15h-1   μ＝0.25h-1
  Δ(ZTA1，PGI1)   0.12   0.08   0.06
  Δ(ZTA1，PGI1)TDH1，2，3-NADP-依赖性   0.21   0.14   0.10
  Δ(ZTA1，PGI1)LPD1-NADP-依赖性   0.20   0.14   0.10
  Δ(ZTA1，PGI1)TDH1，2，3-NADP-依赖性LPD1-NADP-依赖性 0.21 0.14 0.10
             优化NADP+还原能力的大肠杆菌菌株发酵生产氢化可的松
                      的理论最佳产率(摩尔/摩尔葡萄糖)
已经删除了基因PFK1和PFK2的菌株不能生产氢化可的松，甚至可能是没有活力的。这是因为氢化可的松的生产相对于NADPH需求来说更受限于碳需求。一种解决方案是使在酵母内弱表达转氢酶型活性。然而，建模显示氢化可的松的生产将不会象删除PGI1基因时那样高。
为了进一步提高根据本发明优化的菌株的理论最佳产量，可以进行另外的修饰，例如超表达至少一个基因，它们可以是ZWF、SOL1、SOL2、SOL3、SOL4、GND1、GND2、IDP1、IDP2或IDP3，和/或删除至少一个基因，它们可以是ICL1或DAL7。
                               参考文献
·Anderson，E.H.(1946)Growth requirements of virus-resistant mutants of Escherichiacoli strain″B″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32：120-128
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·Bocanegra，J.A.Scrutton，N.S.；Perham，R.N.(1993)Creation of an NADP-dependentpyruvate dehydrogenase multienzyme complex by protein engineering.Biochemistry32：2737-2740
·Brachmann CB，Davies A，Cost GJ，Caputo E，Li J，Hieter P，Boeke JD.(1998)Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C：a useful setof strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.Yeast.14：115-32.
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·Sambrook et al.(1989 Molecular cloning：a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring
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·Wach，A.；Brachat，A.；Pohlmann，R.；and Philippsen，P.(1994)New heterologousmodules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae，Yeast 10，1793-1808，1994.
                            序列表
<110>  代谢探索者公司
<120>  优化NADPH消耗性生物合成途径的微生物菌株
<130>  D21726
<150>  FR 0313056
<151>  2003-11-06
<160>  38
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  100
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  1
ggtgcgcgcg tcgcagttat cgagcgttat caaaatgttg gcggcggttg cacccactgg     60
ggcaccatcc cgtcgaaagc catatgaata tcctccttag                          100
<210>  2
<211>  100
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  2
cccagaatct cttttgtttc ccgatggaac aaaattttca gcgtgcccac gttcatgccg     60
acgatttgtg cgcgtgccag tgtaggctgg agctgcttcg                          100
<210>  3
<211>  30
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  3
ggccgctcag gatatagcca gataaatgac                                      30
<210>  4
<211>  30
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  4
gcgggatcac tttactgcca gcgctggctg                                      30
<210>  5
<211>  100
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  5
ggtggcccgg aagtacttca agccgtagag ttcactcctg ccgatccggc ggagaatgaa     60
atccaggtcg aaaataaagc catatgaata tcctccttag                          100
<210>  6
<211>  100
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  6
cgcccggctt tccagaatct catgcgcacg ctgcgcatcc ttcagcggat atttctgctg     60
ctcggcgaca tcgaccttaa tgtaggctgg agctgcttcg                          100
<210>  7
<211>  30
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  7
cgcccaacac cgactgctcc gcttcgatcg                                      30
<210>  8
<211>  30
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  8
cagcgttatg accgctggcg ttactaaggg                                      30
<210>  9
<211>  43
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  9
acgtacgtgg catatgtcag ttttcgtttc aggtgctaac ggg                       43
<210>  10
<211>  44
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  10
acgtacctgc agttatattc tgccctcaaa ttttaaaatt tggg                      44
<210>  11
<211>  100
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  11
ccaacgcaga ccgctgcctg gcaggcacta cagaaacact tcgatgaaat gaaagacgtt     60
acgatcgccg atctttttgc tgtaggctgg agctgcttcg                          100
<210>  12
<211>  100
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  12
gcgccacgct ttatagcggt taatcagacc attggtcgag ctatcgtggc tgctgatttc     60
tttatcatct ttcagctctg catatgaata tcctccttag                          100
<210>  13
<211>  30
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  13
gcggggcggt tgtcaacgat ggggtcatgc                                      30
<210>  14
<211>  30
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  14
cggtatgatt tccgttaaat tacagacaag                                      30
<210>  15
<211>  102
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  15
cgcgcgagac tcgctctgct tatctcgccc ggatagaaca agcgaaaact tcgaccgttc     60
atcgttcgca gttggcatgc ggtgtaggct ggagctgctt cg                       102
<210>  16
<211>  98
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  16
cgcaaggcgc tgaataattc acgtcctgtt cccacgcgtg acgcgctcag gtcaggaatg     60
tgcggttcgc gagcagccca tatgaatatc ctccttag                             98
<210>  17
<211>  29
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  17
gggtagactc cattactgag gcgtgggcg                                       29
<210>  18
<211>  24
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  18
ccccggaatc agaggaatag tccc                                            24
<210>  19
<211>  100
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  19
ggtgtgttga caagcggcgg tgatgcgcca ggcatgaacg ccgcaattcg cggggttgtt     60
cgttctgcgc tgacagaagg tgtaggctgg agctgcttcg                          100
<210>  20
<211>  100
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  20
ttcgcgcagt ccagccagtc acctttgaac ggacgcttca tgttttcgat agcgtcgatg     60
atgtcgtggt gaaccagctg catatgaata tcctccttag                          100
<210>  21
<211>  27
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  21
cgcacgcggc agtcagggcc gacccgc                                         27
<210>  22
<211>  27
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  22
ccctacgccc cacttgttca tcgcccg                                         27
<210>  23
<211>  99
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  23
gcgccctctc tcgatagcgc aacaattacc ccgcaaattt atcccgaagg aaaactgcgc     60
tgtaccgcac cggtgttcgt gtaggctgga gctgcttcg                            99
<210>  24
<211>  100
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  24
gcgggaaagg taagcgtaaa ttttttgcgt atcgtcatgg gagcacagac gtgttccctg     60
attgagtgtg gctgcactcc catatgaata tcctccttag                          100
<210>  25
<211>  30
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  25
tggcaggatc atccatgaca gtaaaaacgg                                      30
<210>  26
<211>  26
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  26
gccggttgca ctttgggtaa gccccg                                          26
<210>  27
<211>  43
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  27
acgtacgtcc cccgggaaaa atgtcagttt tcgtttcagg tgc                       43
<210>  28
<211>  44
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  28
acgtacgggc ccttatattc tgccctcaaa ttttaaaatt tggg                      44
<210>  29
<211>  100
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  29
ccaacgcaga ccgctgcctg gcaggcacta cagaaacact tcgatgaaat gaaagacgtt     60
acgatcgccg atctttttgc tgtaggctgg agctgcttcg                          100
<210>  30
<211>  100
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  30
gcgccacgct ttatagcggt taatcagacc attggtcgag ctatcgtggc tgctgatttc     60
tttatcatct ttcagctctg catatgaata tcctccttag                          100
<210>  31
<211>  30
<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  31
gcggggcggt tgtcaacgat ggggtcatgc                                      30
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<212>  DNA
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cggtatgatt tccgttaaat tacagacaag                                      30
<210>  33
<211>  82
<212>  DNA
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atgcaatctc aagattcatg ctacggtgtt gcattcagat ctatcatcac aaatgatgaa     60
aagcttcgta cgctgcaggt cg                                              82
<210>  34
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tttgttttca gcggctaaag cggctacctc agctctcaac tttaatctac cggacaggat     60
gggccactag tggatctgat atc                                             83
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gctttcttag aagctacctc cg                                              22
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<400>  36
gaaccgacaa gaccaacaat gg                                              22
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<212>  DNA
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cagttgtaca ctttggaccc                                                 20
<210>  38
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<212>  DNA
<213>  合成的寡核苷酸
<400>  38
gatcagcacc agtcaaagaa cc                                              22

Claims (13)

1.微生物菌株，其特征在于，其一种或多种NADPH氧化活性受到限制。
2.根据权利要求1的菌株，其特征在于，其一种或多种NADPH氧化活性通过删除编码醌氧化还原酶和/或可溶性转氢酶的一个或多个基因而受到限制。
3.根据权利要求1和2中任一项的菌株，其特征在于，它还进行了促进一种或多种其NADP+-还原酶活性的修饰。
4.根据权利要求3的菌株，其特征在于，它删除了编码磷酸葡糖异构酶和/或磷酸果糖激酶的一个或多个基因。
5.根据权利要求1-4中任一项的菌株，其特征在于，它还进行了编码二氢硫辛酰胺脱氢酶和/或甘油醛3-磷酸脱氢酶的一个或多个基因的修饰，使得它优先利用NADP。
6.根据权利要求1-5中任一项的菌株，其特征在于，它还超表达编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶、或6-磷酸葡糖酸内酯酶、或6-磷酸葡糖酸脱氢酶、或异柠檬酸脱氢酶或膜结合转氢酶的一个或多个基因。
7.根据权利要求1-6中任一项的菌株，其特征在于，它还删除了编码6-磷酸葡糖酸脱水酶、或苹果酸合酶、或异柠檬酸裂合酶或异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的一个或多个基因。
8.根据权利要求1-7中任一项的菌株，其特征在于，它包含编码参与感兴趣物质生物转化的酶的一个或多个内源性或外源性基因。
9.根据权利要求1-8中任一项的菌株，其特征在于，它包含一个或多个选择标记基因。
10.根据权利要求1-9中任一项的菌株，其特征在于，它选自：曲霉属、芽孢杆菌属、短杆菌属、梭状芽孢杆菌属、棒状杆菌属、埃希氏菌属、葡萄糖杆菌属、青霉菌属、毕赤酵母属、假单胞菌属、红球菌属、酵母菌属、链霉菌属、黄单胞菌属或假丝酵母属物种。
11.制备根据权利要求1-10中任一项的优化菌株的方法，其特征在于，它包括删除编码醌氧化还原酶和/或可溶性转氢酶的一个或多个基因，如果需要，删除编码磷酸葡糖异构酶、或磷酸果糖激酶、或6-磷酸葡糖酸脱水酶、或苹果酸合酶、或异柠檬酸裂合酶或异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的一个或多个基因，和/或修饰编码二氢硫辛酰胺脱氢酶和/或甘油醛3-磷酸脱氢酶的一个或多个基因，使得它优先利用NADP，所述删除和修饰通过适当的方式实行，和/或超表达编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶、或6-磷酸葡糖酸内酯酶、或6-磷酸葡糖酸脱氢酶、或异柠檬酸脱氢酶或膜转氢酶的一个或多个基因，这通过用含有编码一种或多种参与感兴趣物质生物转化的酶的一个或多个基因和/或一个或多个选择标记基因的适当载体转换菌株实现，或通过修饰控制待超表达基因的内源性启动子强度实现。
12.生产由包括至少一个NADPH依赖性步骤的生物合成途径形成的感兴趣物质的方法，其特征在于，包括以下两个步骤：
a)使根据权利要求1-10中任一项优化的微生物培养物在适当的培养基中生长，所述培养基促进其生长并含有通过发酵或生物转换进行生物转化必需的物质，NADPH除外，
b)从培养基中提取感兴趣物质，如果必要进行纯化。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于，所述感兴趣物质是氨基酸、或维生素、或甾醇、或类黄酮、或脂肪酸、或有机酸、或多元醇或羟基酯。
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