BRPI0415774B1

BRPI0415774B1 - cepa de microorganismos e processos de preparação de cepas otimizadas e de produção de uma molécula de interesse

Info

Publication number: BRPI0415774B1
Application number: BRPI0415774A
Authority: BR
Inventors: Gonzalez Benjamin; Boisart Cédric; Bestel-Corre Gwénaëlle; Chateau Michel; Zink Oliver; Soucaille Philippe; Figge Rainer
Original assignee: Metabolic Explorer Sa
Priority date: 2003-11-06
Filing date: 2004-11-05
Publication date: 2019-12-31
Also published as: EP1680504A1; FR2862068A1; ES2371648T3; WO2005047498A1; CN1875096A; IL174890A0; EP1680504B1; FR2862068B1; ZA200603590B; US8088620B2; US20070087403A1; RU2006119625A; CN103952335B; BRPI0415774A; KR101149566B1; CN103952335A; KR20060132577A; ATE529504T1; JP5553956B2; DK1680504T3

Abstract

"cepa de microorganismos e processos de preparação de cepas otimizadas e de produção de uma molécula de interesse". a presente invenção refere-se a cepas de microorganismos otimizados para a produção por biotransformação, de moléculas tendo vias de biossíntese consumidoras de nadph. as células de acordo com a invenção são utilizáveis nos processos de biotransformação consumidores de nadph. elas são caracterizadas pelo que elas compreendem a limitação de uma ou várias atividade (s) oxidando o nadph.

Description

“CEPA DE MICROORGANISMOS E PROCESSOS DE PREPARAÇÃO DE CEPAS OTIMIZADAS E DE PRODUÇÃO DE UMA MOLÉCULA DE INTERESSE” A NADP (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato) participa, sob sua forma reduzida NADPH, nas reações intracelulares de oxido reduções implicando enzimas com atividade desidrogenase ou reductase. A presente invenção refere-se às cepas de microorganismos otimizada para a produção por biotransformação, de moléculas tendo vias de biossíntese consumidoras de NADPH. AS células de acordo com a invenção são utilizáveis nos processos de biotransformação consumidoras de NADPH. As cepas definidas de acordo com a invenção podem ser procarióticas ou eucarióticas. Em uma forma de realização preferida, a referida cepa procariótica é uma cepa de Escherichia coli. Em uma outra forma de realização, a referida cepa eucariótica é uma cepa de Saccharomyces, particularmente S. cerevisiae. A presente invenção refere-se igualmente a um processo de preparação de moléculas por biotransformação compreendendo a cultura em um meio apropriado de uma cepa otimizada de acordo com a invenção, a referida cepa otimizada compreendendo igualmente os elementos genéticos necessários à preparação da referida molécula.

Os processos de biotransformação forma desenvolvidos para permitir a produção de moléculas em grande quantidade com custos baixos, permitindo, igualmente, a valorização de diferentes sub-produtos industriais ou de agricultura.

Para produzir as moléculas de interesse por biotransformação in vivo, distingue-se duas grandes abordagens: de um lado, a fermentação que permite a produção de moléculas por um microorganismo a partir de uma cepa de carbono simples (por exemplo WO 0102547 que descreve a produção de lisina por fermentação de C. glutamicum na presença de glucose), por outro lado, a bio-conversão por um microorganismo de um co-substrato dado em uma molécula de interesse (por exemplo WO 0012745 que descreve a produção de derivado R-piridma, WO 0068397 que descreve a produção de tagatose). O co-substrato não é assimilável ele é diferente da fonte de carbono que é usada apenas para produzir a biomassa e o NADPH necessário à bioconversão. A melhora de um processo de biotransformação pode ocorrer em diferentes fatores, como a temperatura, a oxigenação, a composição do meio, o processo de recuperação, etc. Pode-se também visar modificar o microorganismo de tal modo que a produção da molécula de interesse e/ou sua excreção seja aumentada.

No quadro de uma fermentação, será buscado, por exemplo, otimizar a via de biossíntese, por exemplo modificando a regulação dos genes ou modificando os genes a fim de modificar as características das enzimas implicadas, ou ainda otimizando a regeneração dos co-fatores.

No quadro da bioconversão, procura-se, com vantagem, reduzir a formação de co-produtos e em otimizar a regeneração de co-fatores implicados em ou nas etapas de bio-conversão.

Dentre os co-fatores implicados nas biotransformações, o NADPH desempenha um parte importante, notadamente para a produção de aminoácidos (por exemplo arginina, prolina, isoleucina, metionina, lisina), de vitaminas (por exemplo pantotenato, filoquinona, tocoferol), de moléculas aromáticas (por exemplo WO 9401564), de polióis (por exemplo xilitol), de poliaminas (por exemplo espermidina), de hidroxiésteres (por exemplo etil-4-cloro-3-hidroxibutirato) ou de outras moléculas com elevado valor agregado. A presente invenção refere-se, portanto, a uma cepa de microorganismos otimizados para a produção de moléculas tendo vias de biossíntese consumidoras de NADPH.

Em vez de tentar otimizar, para cada biotransformação, a relação NADPH/NHADP+ no microorganismo, os inventores optaram pela produção de microorganismos modificados a fim de obter diferentes relações de NADPHZNHADP+, os referidos microorganismos modificados sendo, em seguida, empregados para realizar as biotransformações consumidoras de NADPH.

Por cepa de microorganismos, entende-se, de acordo com a invenção, um conjunto de microorganismos de uma mesma espécie compreendendo, pelo menos, um microorganismo da referida espécie. Assim, as características descritas para a cepa se aplicam a cada um dos microorganismos da referida cepa. Do mesmo modo, as características descritas para um dos microorganismos da cepa serão aplicadas ao conjunto dos referidos microorganismos que a compõem.

Dentre os microorganismos otimizados de acordo com a invenção, cita-se as bactérias e as leveduras, os cogumelos filamentosos e notadamente as bactérias e as leveduras de espécies seguintes Aspergillus sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Gluconobacíer sp., Penicillium sp., Pichia sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharomyces sp., Streptomyces sp., Xanthomonas sp., Candida sp. O princípio de otimização da relação NADPH/NHADP+ é descrito abaixo para E. coli e S. cerevisiae. O mesmo princípio pode ser aplicado de modo similar a todos os microorganismos cultivados em condições aeróbicas. O princípio de otimização da relação NADPH/NHADP+ consiste em limitar as atividades enzimáticas implicadas na oxidação de NADPH, e/ou em favorecer as atividades enzimáticas permitindo a redução de NADP+. Limita-se as atividades enzimáticas implicadas na oxidação de NADPH diminuindo, e mais particularmente inativando, tais atividades, notadamente as atividades de tipo quinona oxidoreductase e/ou transhidrogenase solúvel. Favorece-se as atividades enzimáticas permitindo a redução do NADP+ impondo o fluxo de carbono via o ciclo de pentoses fosfato e/ou modificando a especificidade de co-fator de, pelo menos, uma enzima de tal modo que ela utiliza o NADP preferivelmente ao NAD, seu co-fator habitual.

As cepas otimizadas de acordo com a invenção são obtidas por biologia molecular. O versado na arte conhece os protocolos permitindo modificar o caráter genético dos microorganismos. As técnicas de transformação são documentadas e são bem conhecidas do versado na arte . (Sambrook et al.f 1989 Molecular cloning: a laboratory manual. Segunda edição, Cold Spríng Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).

Os processos permitindo limitar uma atividade enzimática consistem em modificar o gene permitindo sua expressão por um meio apropriado, por exemplo suprindo uma ou várias mutações na parte codificando do gene referido, ou modificando a região promotora, notadamente substituindo a mesma por uma seqüência permitindo diminuir a expressão do gene.

Os processos permitindo inativar uma atividade enzimática consistem em inativar o produto de expressão do gene referido por um meio apropriado, ou então em inibir a expressão do gene em questão, ou ainda em deletar pelo menos uma parte do gene em questão, de modo a que ou sua expressão não ocorre (por exemplo deleção de uma parte ou do conjunto da região promotora necessária à sua expressão), ou que o produto de expressão tenha perdido sua função (por exemplo deleção na parte codificando do gene em questão).

De modo preferido, a deleção de um gene compreendendo a supressão do essencial do referido gene e, conforme o caso, sua substituição por um gene de marcação de seleção permitindo facilitar a identificação, o isolamento e a purificação das cepas otimizadas de acordo com a invenção. A inativação de gene de E. coli é feita preferivelmente por recombinação homóloga (Datsenko, K. A.; Wanner, B. L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natí Acad. Sei. USA 97: 6640 - 6645). O princípio de um protocolo é lembrado brevemente: introduz-se na célula um fragmento linear, obtido in vitro, compreendendo as duas regiões flanqueando o gene e, pelo menos, um gene de seleção entre estas duas regiões (geralmente um gene de resistência a um antibiótico), o referido fragmento linear apresentando, portanto, um gene inativado. Seleciona-se as células tendo sofrido um evento de recombinação e tendo integrado o fragmento introduzido por espalhamento sobre meio seletivo. Seleciona-se, em seguida, as células tendo sofrido um evento de dupla recombinação, nas quais o gene nativo foi substituído pelo gene inativado. Este protocolo pode ser melhorado usando sistemas de seleções positivo e negativo, a fim de acelerar a detecção dos eventos de duplas recombinações. A inativação de um gene junto a S. cerevisiae é feita igualmente preferivelmente por recombinação homóloga (Baudin et al.9 Nucl. Acids Res. 21, 3329 - 3330, 1993; Wach et aí, Yeast 10, 1793 - 1808, 1994; Brachmann et aí, Yeast. 14: 115 - 32, 1998).

Os processos permitindo favorecer uma atividade enzimática consistem em estabilizar o produto de expressão do gene em questão por um meio apropriado, por exemplo diminuindo sua sensibilidade para efetuadores alo-estereoquímicos, ou então aumentar a expressão do referido gene de modo a aumentar a quantidade de enzima. A super-expressão de um gene pode ser efetuada por mudança do promotor deste gene in situ, por um promotor forte ou indutível. De modo alternativo, introduz-se, na célula, um plasmídeo replicativo (simples ou de múltiplas cópias), no qual o gene que se deseja super-expressar está sob o controle do promotor adequado. No caso de modificação de Escherichia coli, pode-se por exemplo utilizar os promotores Plac-Q, Ptrc-o, ptac-o, três promotores fortes bacterianos nos quais o operador lac (lacO) foi deletado para os tomar constitutivos. NO caso de modificações de Saccharmyces cerevisiae, pode-se, por exemplo, utilizar os promotores ¥pgk, Padhl, Pgu/1, Pgút/lO.

Os processos permitindo modificar a especificidade do co-fator de uma enzima de tal modo que ela utilize o NADP preferivelmente ao NAD, consistem em modificar a seqüência do gene permitindo a expressão desta enzima (Bocanegra, J. A. Scrutton, N. S.; Perham, R. N. (1993) Creation of an NADP-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex by protein engineering. Biochemistry 32: 2737 - 2740).

As cepas otimizadas de acordo com a invenção (isto é, capacidade aumentada de redução do NADP+) compreendem a atenuação, até mesmo a inativação, de uma ou várias atividades enzimáticas oxidando o NADPH, e particularmente as atividade de tipo quinona oxidoreductase e/ou transhidrogenase solúvel.

Cita-se, por exemplo, enzimas oxidando o NADPH e sem que esta lista seja limitativa, as atividades e os genes seguintes:______________ As cepas otimizadas de acordo com a invenção (isto é, capacidade aumentada de redução do NADP+) compreendem, igualmente, modificações permitindo favorecer uma ou várias atividade(s) enzimática(s) reduzindo o NADP+ e, particularmente, modificações permitindo impor o fluxo de carbono via o ciclo de pentoses fosfato, e/ou modificações sobre a especificidade de co-fator de, pelo menos, uma enzima, de tal modo que ele utilize o NADP preferivelmente ao NAD, seu co-fator habitual.

As atividades susceptíveis de serem modificadas nas cepas otimizadas de acordo com a invenção (isto é, capacidade aumentada de redução de NADP+) a fim de favorecer uma ou várias atividade (s) enzimática(s) reduzindo o NADP+, são descritas abaixo:_____________________ As atividades enzimáticas susceptíveis de serem codificadas nas cepas otimizadas de acordo com a invenção são definidas principalmente pelo emprego da denominação da proteína ou do gene junto a E. coli ou 5. cerevisiae. No entanto, este emprego tem um significado mais geral de acordo com a invenção e engloba as atividades enzimáticas correspondentes em outros microorganismos. Com efeito, usando as sequências das proteínas e dos genes de E. coli ou S. cerevisiae, o versado na arte é capaz de determinar as proteínas e os genes equivalentes em outros microorganismos que E. coli ou S. cerevisiae.

Os meios de identificação das seqüências homólogas e suas porcentagens de homologia são bem conhecidos do versado na arte, compreendendo notadamente o programa BLAST que pode ser usado a partir do site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros indicados por defaut no site. As seqüências obtidos podem ser então exploradas (por exemplo alinhadas) usando, por exemplo, programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) ou MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl), com os parâmetros indicados por defaut nos sites.

Altemativamente, é possível usar o programa CD-Search (http://www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) que permite a identificação dos domínios conservados nas seqüências de proteínas de E. coli ou S. cerevisiae, e procurar as seqüências de outros microorganismos, apresentando o ou os mesmos domínio(s). Os domínios conservados são relatados na base de dados CDD (Conserved domain database; Marchler-Bauer A, Anderson JB, DeWeese-Scott C, Fedorova ND, Geer LY, He S, Hurwitz Dl, Jackson JD, Jacobs AR, Lanczycki CJ, Liebert CA, Liu C, Madej T, Marchler GH, Mazumder R, Nikolskaya AN, Panchenko AR, Rao BS, Shoemaker BA, Simonyan V, Song JS, Thiessen PA, Vasudevan S, Wang Y, Yamashita RA, Yin JJ, Bryant SH. CDD: a curated Entrez database of conserved domain alignments. Nucleic Acids Research 31: 383 - 387 (2003)) que reagrupa os dados de tipo PFAMN ou COG.

Os PFAM (Protein FAMilies database of alignments and hidden markov models; http://www.sanger.ac.uk/SoftwareZPfam/) representam uma grande coleção de alinhamentos de seqüências de proteínas. Cada PFAM permite visualizar os alinhamentos múltiplos, ver os domínios de proteínas, avaliar a repartição entre os organismos, ter acesso a outras bases de dados, visualizar as estruturas conhecidas de proteínas.

Os COGS (Clusters of Orthologous Groups of proteins: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) são obtidos comparando as seqüências de proteínas provenientes de 43 genomas completamente seqüenciados representando 30 linhagens filogenéticas principais. Cada COG é definido a partir de, pelo menos, três linhagens o que permite, assim, identificar os domínios conservados antigos. A partir de seqüências de consenso identificadas pelos diferentes métodos, é possível projetar sondas de oligonucleotídeos degeneradas permitindo clonar o gene correspondente em um outro microorganismo. Estas técnicas de rotina de biologia molecular são bem conhecidas na arte e descritas, por exemplo, em Sambrook et al. (1989 Molecular cloning: a laboratory manual. Segunda edição Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).

Exemplos de genes codificando para as proteínas análogas à transidrogenase solúvel de E, coli codificada pelo gene udhA'. ___________ Exemplos de genes codificando para as proteínas análogas à quinona oxidoreductase de E. coli codificada pelo gene gor________________ As cepas otimizadas de acordo com a invenção (isto é, capacidade aumentada de redução de NADP+) compreendem a deleção de, pelo menos, um gene codificando para uma atividade oxidante de NADPH, e particularmente, a deleção de um gene codificando para uma quinona oxidoreductase (por exemplo qor, ZTA1) e/ou de um gene codificando para uma atividade transidrogenase solúvel (por exemplo udhÁ).

De acordo com um modo preferencial de realização da invenção, os genes udhA e qor são todos os dois deletados.

De acordo com uma forma de realização particular da invenção, as cepas otimizadas de acordo com a invenção compreendem igualmente a deleção de um ou vários gene(s) codificando para as atividades de fosfoglucose isomerase (por exemplo pgi, PGI1) e/ou fosfofructoquinase (por exemplopfkA, PFK1).

De acordo com outra forma de realização particular da invenção, as cepas otimizadas de acordo com a invenção compreendem igualmente a modificação de um ou vários gene(s) codificando para as atividades de dihidrolipoamida desidrogenase (por exemplo Ipd, LPD1) e/ou gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (por exemplo gapA, TDH1), a modificação consistindo em modificar a preferência da enzima em proveito de NADP em vez de NAD, seu co-fator habitual.

As cepas de acordo com a invenção tendo a deleção de genes codificando para as atividades de fosfoglucose isomerase e/ou fosfofructoquinase são mais particularmente adaptadas pelos processos de biotransformação.

Para aumentar com vantagem a quantidade de NADPH disponível nos microorganismos otimizados de acordo com a invenção, pode-ser igualmente vantajoso super-expressar pelo menos um gene codificando para uma atividade enzimática dentre a glucose 6-fosfato desidrogenase (por exemplo zwf, ZWF1), a 6-fosfogluconolactonase (por exemplo SOL1), a 6-fosfogluconato desidrogenase (por exemplo gnd9 GND1), a isocitrato desidrogenase (por exemplo icd, IDP1) e a transhidrogenase membranosa (por exemplo pntA), e/ou deletar pelo menos um gene codificando para uma atividade enzimática dentre a 6-fosfogluconato desidratase (por exemplo edd), a malato sintase (por exemplo aceB, DAL7), a isocitrato liase (por exemplo aceA, ICL1) e a isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase (por exemplo aceK). A presente invenção tem igualmente por objeto um microorganismo otimizado para a produção de NADPH como definido acima e abaixo, o qual compreende igualmente, um ou vários genes codificando para as atividades enzimáticas implicadas na biotransformação de uma molécula de interesse, assim como um ou vários genes de marcação de seleção.

Estes genes podem ser nativos da cepa otimizada de acordo com a invenção ou ainda introduzidos na cepa otimizada de acordo com a invenção por transformação com um vetor apropriado, seja por integração no genoma do microorganismo ou ainda por um vetor replicativo, o referido vetor apropriado portando um ou vários genes codificando para as referidas enzimas implicadas na biotransformação da referida molécula de interesse e/ou os referidos marcadores de seleção.

Estes genes compreendem uma seqüência de ácido nucleico codificando para uma enzima implicada na biotransformação da molécula de interesse e/ou para um marcador de seleção, a seqüência codificando sendo fundida a seqüências promotoras eficazes na célula procariótica e/ou eucariótica para a biotransformação. O vetor (ou plasmídeo) pode ser um vetor de veículo entre E. coli e um outro microorganismo. A escolha da cepa otimizada para a relação NADPH/NADP+ será determinada em função do tipo de biotransformação (fermentação ou bioconversão), da demanda total de NADPH da via de bioconversão considerada, da natureza da(s) fonte(s) carbonatada(s), da demanda de fluxo de biomassa,... A deleção dos genes codificando para as atividades de fosfoglucose isomerase e/ou fosfofructoquinase deveria se impor quando não se é capaz de controlar a repartição do fluxo de carbono entre a glicólise e a via de pentoses fosfato. A deleção dos genes codificando para a fosfoglucose isomerase será preferivelmente retida pelas fermentações ou quando a demanda de NADPH necessita, no mínimo, de um fluxo de redução de 2 mols de NADP+ por mol de glucose importados. A deleção de genes codificando para a fosfofructoquinase será preferivelmente escolhida para as bioconversões ou quando a demanda em NADPH necessita, no mínimo, um fluxo de redução de 3-4 mols de NADP+ por mol de glucose importada. A modificação, como descrito acima e abaixo, dos genes codificando para as atividades de dihidrolipoamida desidrogenase e/ou gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase será realizada quando as biotransformações necessitarão de um fluxo de redução, no mínimo, superior a 3 mols de NADP+ por mol de glucose importada e notadamente, para otimizar as cepas E. coli Δ (udhA, qor) ou E. coli Δ (udhA, qor, pgi) ou E. coli Δ (udhÁ, qor, pfkA, pfkB). As outras modificações citadas, a saber a super-expressão de pelo menos um gene codificando para uma atividade enzimática dentre a glucose 6-fosfato desidrogenase, a 6-fosfogluconolactonase, a 6-fosfogluconato desidrogenase, a isocitrato desidrogenase e a transhidrogenase membranosa, e/ou a deleção de pelo menos um gene codificando para uma atividade enzimática dentre o 6-fosfogluconato desidratase, a malato sintase, a isocitrato liase e a isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase, poderão ser realizados a fim de afinar a otimização da relação NADPH/NADP+ às necessidades da célula e do processo de biotransformação considerado. A presente invenção refere-se igualmente a um processo de : ......... preparação de cepas otimizadas de acordo com a invenção, como definida acima e abaixo, em que se deleta um gene tomado dentre os codificando para as atividades quinona oxidoreductase e transhidrogenase solúvel e, conforme o caso, deleta-se um gene tomado dentre os codificando para as atividades glucose 6-fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconolactonase, e/ou modifica-se pelo menos um gene codificando as enzimas com NAD, particularmente para as atividades dihidrolipoamida desidrogenase e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, a fim de que elas utilizem preferivelmente NADP, e conforme o caso deleta-se, pelo menos, um gene escolhido dentre os codificando para as atividades 6-fosfogluconato desidratase, malato sintase, isocitrato liase e isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase, estas deleções e modificações sendo realizadas por um meio apropriado, e/ou super-expresso pelo menos um gene escolhido dentre os codificando para as atividades glucose 6-fosfato desidrogenase, 6-fosfogluconolactonase, 6-fosfogluconato desidrogenase, isocitrato desidrogenase e transhidrogenase membranosa, seja transformando a cepa com um vetor apropriado permitindo a super-expressão, seja modificando a força do promotor endógeno controlando o gene a super-expressar.

De acordo com uma forma de realização particular da invenção, o processo de preparação das cepas de acordo com a invenção compreende igualmente a transformação de cepas otimizadas com pelo menos um vetor apropriado compreendendo um ou vários gene(s) codificando uma ou enzima(s) implicadas na biotransformação de uma molécula de interesse, assim como um ou vários genes de marcação de seleção.

Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização destas cepas otimizadas de acordo com a invenção pelas biotransformações NADPH dependentes, permitindo, assim, uma melhora do rendimento de biotransformação em relação a uma cepa não otimizada para o NADPH.

As biotransformações serão realizadas usando cepas definidas ’ · · » de acordo com a invenção em que serão expressos os genes codificando para as atividades enzimáticas catalisando reações NADPH dependentes. O versado na arte saberá identificar facilmente tais enzimas, cita-se por exemplo e sem que esta lista seja limitativa, as enzimas seguintes: EC 1.1.1.10 L-xilulose reductase, EC 1.1.1.21 metilglioxal reductase, EC 1.1.1.51 3 (ou 17) β-hidroxiesteróide desidrogenase, EC 1.1.1.54 álcool alílico desidrogenase, EC 1,1.1,80 isopropanol desidrogenase, EC 1.1.1.134 dTDP-6-deóxi-L-talose 4-desidrogenase, EC 1.1.1.149 20ct-hidroxiesteróide desidrogenase, EC 1.1.1.151 21-hidroxiesteróide desidrogenase, EC 1.1.1.189 prostaglandina-E? 9-reductase, EC 1.1.1.191 indol-3-acetaldeído reductase EC 1.1.1.207 (-)-mentol desidrogenase, EC 1.1.1.234 flavanona 4-reductase, EC 1.2.1.50 acila graxa de cadeia longa-CoA reductase, EC 1.3.1.4 cortisona, α-reductase, EC 1.3.1.23 colestenona 5 β-reductase, EC 1.3.1.70 A14-esterol reductase, EC

1.4.1.12 2,4-diaminopentanoato desidrogenase, EC 1.5.1.10 sacaropina desidrogenase, formando L-glutamato, EC 1.7.1.6 azobenzeno reductase, EC 1.8.1.5 2-oxopropil-CoM reductase (carboxilante), EC 1.10,1.1 trans-acenafteno-l,2-diol desidrogenase, EC 1.14.13.7 fenol 2-monooxigenase, EC 1.14.13.12 benzoato 4-monooxigenase, EC 1.14.13.26 fosfatidilcolina 12-monooxigenase, EC 1.14.13.64 4-hidroxibenzoato 1-hidroxilase, EC 1.14.13.70 esterol 14-demetilase, EC 1.16.1.5 aquacobalamina reductase, EC 1.17.1.1 CDP-4-dehidro-6-deoxiglucose reductase, EC 1.18.1.2 ferredoxina-NADP reductase. A invenção também refere-se a um processo de produção de uma molécula de interesse da qual pelo menos uma das reações da via de biossíntese é NADPH-dependente, caracterizado em que compreende as etapas seguintes: a) colocação em cultura de microorganismos otimizados de acordo com a invenção em um meio de cultura apropriado favorecendo seu crescimento e compreendendo substâncias necessárias para a realização da biotransformação por fermentação ou biotransformação, com a exceção de NADPH, e b) extração da molécula de interesse do meio e conforme o caso purificação.

De modo preferido, a molécula de interesse é escolhida dentre os aminoácidos, as vitaminas, os esteróis, os flavonóides, os ácidos graxos, os ácidos orgânicos, os polióis, os hidroxiésteres. Para os aminoácidos ou seus precursores, cita-se, particularmente, a lisina, a metionina, a treonina, a prolina, o ácido glutâmico, a homoserina, a isoleucina, a valina. Para as vitaminas ou seus precursores, cita-se notadamente o pantoato, a transneurosporena, a filoquinona, os tocoferóis. Para os esteróis, cita-se notadamente o esqualeno, o colesterol, a testosterona, a progesterona, a cortisona. Para os flavonóides, cita-se notadamente a frambinona e a vestitona. Para os ácidos orgânicos, cita-se o ácido cumárico, o ácido 3-hidroxipropiônico. Para os polióis, cita-se o sorbitol, o xilitol, o glicerol. Para os hidroxiésteres, cita-se l-etil-3-hidroxibutirato, o etil-4-cloro-3-hidroxibutirato.

No caso de uma bioconversão, o processo compreende também a adição do substrato para “converter” no meio de cultura apropriado. O meio de cultura citado na etapa b) do processo de acordo com a invenção definido acima compreende, pelo menos, um carboidrato assimilável escolhido dentre diferentes açúcares assimiláveis, como a glucose, a galactose, a sacarose, a lactose, ou os melaços, ou os sub-produtos destes açúcares. Uma fonte de carbono simples mais particularmente preferida é a glucose. Uma outra fonte de carbono simples preferida é a sacarose. O meio de cultura pode, por outro lado, conter uma ou várias substâncias (por exemplo aminoácidos, vitaminas, sais minerais, ...) favorecendo o crescimento do microorganismo e/ou a produção da molécula de interesse. Particularmente, o meio mineral de cultura para E. coli poderá ser de composição idêntica ou similar a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 32: 120 - 128), um meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou um meio como definido por Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88 - 96), A definição das condições de biotransformação é bem conhecida do versado na arte. Fermenta-se notadamente os microorganismos a uma temperatura compreendida entre 20°C e 55°C, preferivelmente entre 25°C e 40°C, mais particularmente cerca de 30°C para S. cerevisiase e cerca de 37°C para E. coli.

Os exemplos só são dados a título de ilustração da invenção e não limitam de nenhum modo a forma de realização nem o escopo da invenção.

Exemplo 1 - Cálculo dos rendimentos ótimos teóricos de bioconversão de etílacetoacetao em etil-3-hidroxibutírato a) bioconversão com E. coli As modelagens previsoras são realizadas usando o algoritmo MetOpt®-Coli, um modelo estequiométrico desenvolvido pela METabolic Explorer, que permite definir 1) o rendimento máximo de produção em etil-3-hidroxibutirato a partir de etilacetoacetato, 2) a melhor distribuição de fluxo a partir de glucose para assegurar as necessidades de crescimento e equilíbrios redox necessárias para o desenvolvimento da célula e atingir o rendimento máximo de bioconversão.

Os parâmetros impostos ao modelo são notadamente 1) um fluxo de importação de glucose a 3 mmol.g^.h"1, 2) uma taxa de crescimento variável de 0, 0.15 e 0.25 h'1, 3) um fluxo da transhidrogenase membranosa Çw/AB) variável e inferior ou igual a 1 mmol.gÃh’1. O valor limite do fluxo da transhidrogenase membranosa é determinado a partir da literatura (Hanson, 1979; Anderlund et aí, 1999; Emmerling et aí, 2002); 4) o fluxo de manutenção foi limitado entre 5 e 22 mmol.g"1.h"1.

Em todos os casos, o modelo sugere a deleção de genes udhA e qor. Na prática, todavia, a cepa E. coli [k(udhA, qor)~\ não permite obter um rendimento equivalente ao rendimento ótimo teórico, porque seria difícil manter a repartição adequada de fluxo de carbono entre a via de pentoses fosfato e a de glicólise, esta repartição sendo variável com a taxa de crescimento. Na prática, prefere-se, portanto, usar as cepas de E. coli [A(udhA, qor, pfkA, pfkB)\ ou [A(udhA, qor, pgi)], a escolha entre estas duas cepas sendo função da taxa de crescimento da cepa quando do processo de bioconversão.

Os rendimentos ótimos teóricos de bioconversão de etilacetoacetao em etil-3-hidroxibutirato foram calculados por diferentes cepas de E. coli otimizadas de acordo com a invenção: Rendimentos ótimos teóricos de bioconversão de etilacetoacetato em etil-3-hidroxibutirato (mol por mol de glucose) por cepas de E. coli otimizadas em sua capacidade de redução de NADP+ A fim de melhorar ainda o rendimento ótimo teórico das cepas otimizadas de acordo com a invenção, as modificações suplementares podem ser levadas em conta, como que a super-expressão de pelo menos um gene escolhido dentre zwf, gnd, pntA, pntB e icd e/ou a deleção de pelo menos um gene escolhido dentre edd, aceA, aceB e acek. b) bioconversão com S. cerevisiae .

As modelagens previsoras são realizadas usando o algoritmo MetOpt®-Scere, um modelo estequiométrico desenvolvido pela emprega, que permite definir 1) o rendimento máximo de produção em etil-3-hidroxibutirato a partir de 1-etilacetoacetato 2) a melhor distribuição de fluxo a partir de glucose para assegurar as necessidades de crescimento e de equilíbrios redox necessário para o desenvolvimento da célula e a espera do rendimento máxima de bioconversão.

Os parâmetros impostos ao modelo são notadamente 1) um fluxo de importação de glucose a 3 mmol.g^.h"1, 2) uma taxa de crescimento variável de 0, 0.15 e 0.25 h'1, 3) um fluxo de manutenção inferior ou igual a 22 mmol.g^.h'1; 4) às reações dos aldeídos desidrogenases (ALD2, ALD3, ALD6) são irreversíveis e impostas no sentido acetato + NAD(P)H acetaldeído + NAD(P); 5) a levedura não possui atividades equivalentes a udhk ou ρζΐ/Α,Β. O modelo permite levar em conta a compartimentalização mitocondrial e peroxissomal.

Em todos os casos, o modelo sugere a deleção de um gene codificando para uma enzima oxidando o NADPH e particularmente do gene ZTA1. Na prática, todavia, a cepa 5. cerevisiae [ΔΖΤΑ1] não permite obter um rendimento equivalente ao rendimento ótimo teórico, porque será difícil manter a repartição adequada de fluxo de carbono entre a via de pentoses fosfato e a de glicólise, esta repartição sendo variável com a taxa de crescimento. Na prática, prefere-se, portanto, utilizar as cepas de 5. cerevisiae [A(ZTA1, PFK1, PFK2)] ou [A(ZTA1, PGI1)], a escolha entre as duas cepas sendo função da taxa de crescimento da cepa quando do processo de bioconversão.

Os rendimentos ótimos teóricos de bioconversão de , *·· ■ etilacetoacetato em etil-3-hidroxibutirato foram calculados para diferentes cepas de S. cerevisiae otimizadas de acordo com a invenção. _______________ Rendimentos ótimos teóricos de bioconversão de etilacetoacetato em etil-3-hidroxibutirato (mol por mol de glucose) pelas cepas de S. cerevisiae otimizadas em sua capacidade de redução de NADP+ A fim de melhorar ainda o rendimento ótimo teórico de cepas otimizadas de acordo com a invenção, as modificações suplementares podem ser levadas em conta, como que a super-expressão de pelo menos um gene escolhido dentre ZWF, SOL1, SOL2, SOL3, SOL4, GND1, GND2, IDP1, IDP2 e IDP3 e/ou a deleção de pelo menos um gene escolhido dentre ICL1, DAL7.

Exemplo 2: Construção de cepa deK coli W(udhA.gor}] A inativação do gene udhA é realizada por recombinação homóloga de acordo com a técnica descrita por Datsenko e Wanner (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97: 6640 - 6645).

Esta técnica consiste em inserir um cassete de resistência a um antibiótico (cloranfenicol) ao mesmo tendo deletando a parte principal do gene em questão. Para isto, sintetiza-se um par de oligonucleotídeos, cada um sendo constituído de 100 bp dos quais 80 pb (minúsculos) são homólogos com o gene a deletar (por exemplo udhA) e 20 pb (maiúsculas) são homólogos com o cassete de resistência a cloranfenicol.

DudhAF ggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgt cgaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG

DudhAR

Cccagaatctcttttgtttcccgatggaacaaaattttcagcgtgcccacgttcatgccgacgatttgtgcgcgtg ccagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG O cassete antibiótico transportado pelo plasmídeo pKD3 é amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos DudhAF e DudhAR. O produto PCR obtido é então introduzido por eletroporação na cepa E. coli [pKD46], que transporta o gene codificando a Red recombinase, enzima catalisando a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao cloranfenicol são então selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificado por uma análise PCR usando os oligonucleotídeos UdhAF e UDhAR: UdhaF

Ggccgctcaggatatagccagataaatgac UdhaR

Gcgggatcactttactgccagcgctggctg O cassete de resistência ao cloranfenicol é em seguida eliminado. Para isto, o plasmídeo pCP20 portador da recombinase FLP atuando ao nível dos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol, é introduzido nas cepas recombinantes para eletroporação. Depois, após uma série de culturas a 42°C, a perda do cassete de resistência a antibiótico é verificada por uma análise PCR com os oligonucleotídeos UdhAF e UdhAR. A inativação do gene qor é realizada de acordo com a mesma técnica usando os oligonucleotídeos seguintes: DqorF ggtggcccggaagtacttcaagccgtagagttcactcctgccgatccggcggagaatgaaatccaggtcgaa aataaagcCATATGAATATCCTCCTTAG

DqorR cgcccggctttccagaatctcatgcgcacgctgcgcatccttcagcggatatttctgctgctcggcgacatcgac cttaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

QorF

Cgcccaacaccgactgctccgcttcgatcg QorR cagcgttatgaccgctggcgttactaaggg Por razões prática, pode ser interessante deletar os dois genes simultaneamente. Para isto, cada gene é substituído por um cassete de resistência a um antibiótico diferente (por exemplo cloranfenicol para udhA e canamicina para qor). A cepa obtida é portanto E. coli [E(udhA, qor)].

Exemplo 3: Construção do plasmídeo pSK-PgapA-GRE2p, introdução na cepa E. coli \E(udhA, qor)] e biotransformação de etilacetoacetato em etil-3-hidroxibutirato O plasmídeo pSK-PgapA é construído por inserção do promotor gapA no vetor pBluescript-SK (pSK). Para isto o promotor gaA de E. coli é amplificado com a polimerase Pwo a partir de DNA cromossômico. O produto PCR obtido é em seguida digerido pela enzima de restrição HincKR e ligada ao vetor pSK digerido pela enzima de restrição HindAAA e desfosforilado para dar o plasmídeo pSK-PgapA. O vetor pSK transporta uma origem de replicação para E. coli e um gene de resistência a ampicilina. O plasmídeo pSK-PgapA-GRE2p é então introduzido na cepa E. coli DH5ot para verificação da construção. O sequenciamento do promotor gapA do plasmídeo pSK-PgapA com o oligonucleotídeo universal Ml3 dianteiro é em seguida realizado para confirmar a construção. O plasmídeo pSK-PgapA-GRE2p é construído por inserção do gene GRE2p no plasmídeo pSK-PgapA. Para isto, o gene GRE2p de Saccharomyces cerevisiae é amplificado com a polimerase Pwo a partir do DNA cromossômico usando os oligonucleotídeos seguintes: Omell9_GRE2F (Ndel) Acgtacgtggçatatgtcagttttcgtttcaggtgctaacggg Omel20_GRE2R (PstI) Acgtacçtgçagttatattctgccctcaaattttaaaatttggg O produto PCR obtido é em seguida digerido pelas enzimas de restrição Ndel - PstI e ligado ao vetor pSK-PgapA digerido pelas enzimas de restrição Ndel - PstI e desfosforilado para dar o plasmídeo pSK-PgapA-GRE2p. O plasmídeo pSK-PgapA transporta uma origem de replicação para E. coli e um gene de resistência a ampicilina. O plasmídeo pSK-PgapA-GRE2p é então introduzido na cepa E. coli DH5a para verificação da construção. O sequenciamento do gene GRE2p do plasmídeo pSK-PgapA-GRE2p com os oligonucleotídeos universais Ml3 reverso e Ml3 dianteiro é em seguida realizado para confirmar a construção. O plasmídeo validado é então introduzido na cepa E. coli [k(udhA, qor)] (exemplo 2) por electroporação. A cepa obtida E. coli [k(udhA, qor) pSK-PgapA-GRE2p] é então cultivada em meio mínimo contendo glucose e etilacetoacetato. Uma cepa de E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] é cultivada nas mesmas condições.

Quando as culturas são obtidas, compara-se: a evolução da biomassa de cada cepa durante a fase de bioconversão, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato produzido no meio extracelular, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato acumulado nas células, • »·» ” a produtividade etil-3-hidroxibutirato, o rendimento glucose/etil-3-hidroxibutirato.

Pode-se observar que a cepa E. coli [A(udhA, qor) pSK-PgapA-GRE2p] apresenta um rendimento de produção de etil-3-hidroxibutirato aumentado em relação à cepa não otimizada.

Exemplo 4: Construção de cepa E. coli \Á(udhA, qor, pgi) pSK-PgapA-GRE2pl e biotransformação de etilacetoacetato em etil-3-hidroxíbutirato A inativação do gene pgi é conduzida na cepa E. coli [A(udhA, qor)} (exemplo 2) usando a técnica descrita no exemplo 2, e os oligonucleotídeos seguintes: DpgiF ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgat ctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

DpgiR gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctct gCATATGAATATCCTCCTTAG

pgiF gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc pgiR cggtatgatttccgttaaattacagacaag A construção é realizada em meio rico (por exemplo LB). Introduz-se então nas cepas obtidas o plasmídeo pSK-PgapA-GRE2p (exemplo 3) por eletroporação, e a cepa resultante E. coli [&(udhA, qor, pgi) pSK-PgapA-GRE2p] é selecionada em meio rico. A cepa obtida é então cultivada em meio mínimo contendo glucose e etilacetoacetato. Uma cepa de E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] é cultivada nas mesmas condições.

Quando as culturas são obtidas, compara-se: a evolução da biomassa de cada cepa durante a fase de bioconversão a quantidade de etil-3-hidroxibutirato produzido no meio extracelular, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato acumulado nas células, a produtividade em etil-3-hidroxibutirato, o rendimento glucose/etil-3-hidroxibutirato.

Pode-se observar que a cepa E. coli [kfudhA, qor, pgi) pSK-PgapA-GRE2p] apresenta um rendimento de produção de etil-3-hidroxibutirato aumentado em relação à cepa não otimizada.

Exemplo 5: Construção de cepa E. coli \Á(adhA, qor, edd) pSK-PgapA-GRE2p1 e biotransformação de etilacetoacetato em etil-3-hidroxibutirato. A inativação do gene edd é conduzida na cepa E. coli [A(udhA, qor, pgi)] (exemplo 4) usando a técnica do exemplo 2, e os oligonucleotídeos seguintes: DeddF (1932582- 1932499) Cgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatagaacaagcgaaaacttcgaccgttcatcgttcgcagttg gcatgcggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

DeddR (1930866 - 1930943) cgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcccacgcgtgacgcgctcaggtcaggaatgtgcggttcgcgag cagccCATATGAATATCCTCCTTAG

EddF (1932996 - 1932968) Gggtagactccattactgaggcgtgggcg EddR (1930439 - 1930462) Ccccggaatcagaggaatagtccc A construção é realizada em meio rico (por exemplo LB).

Introduz-se então a cepa obtida E. coli \k(udhA, qor, pgi, edd)] o plasmídeo pSK-PgapA-GRE2p (exemplo 3) por eletroporação, e a cepa resultante E. coli [Á(udhA, qor, pgi, edd) pSK-PgapA-GRE2p] é selecionada em meio rico. A cepa obtida E. coli [E(udhA, qor, pgi, edd) pSK-PgapA-GRE2p] é então cultivada em meio mínimo contendo glucose e etilacetoacetato. Uma cepa E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] é cultivada nas mesmas condições.

Quando as culturas são obtidas, compara-se a evolução da biomassa de cada cepa durante a fase de bioconversão, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato produzido no meio extracelular, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato acumulada nas células, a produtividade em etil-3-hidroxibutirato, o rendimento glucose/etil-3-hidroxibutirato.

Pode-se observar que a cepa de E. coli [k(udhA, qor, pgi, edd) pSK-PgapA-GRE2p] apresenta um rendimento de produção de etil-3-hidroxibutirato aumentado em relação à cepa não otimizada.

Exemplo 6: Construção de cepa E. coli \k(udhA, qor, vfkA, pfkB) pSK“PgapA-GRE2pl e biotransformação de etilacetoacetato em etil-3-hidroxibutirato. A inativação dos genes pfkA e pfkB é conduzida na cepa de E. coli [k(udhA, qor)] (exemplo 2) usando a técnica descrita no exemplo 2, e os oligonucleotídeos seguintes: DpfkAF ggt gtg ttg aca age ggc ggt gat gcg cca ggc atg aac gcc gea att cgc ggg gtt gtt cgt tet gcg ctg aca gaa ggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

DpfkAR

Ttcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgcttcatgttttcgatagcgtcgatgatgtcgtggtgaacc agctgCATATGAATATCCTCCTTAG

PfkAF

Cgcacgcggcagtcagggccgacccgc PfkAR ccctacgccccacttgttcatcgcccg DpfkBF (1804421 - 1804499) gcgccctctctcgatagcgcaacaattaccccgcaaatttatcccgaaggaaaactgcgctgtaccgcaccggt gttcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

DpfkBR (1805320 - 1805241) gcgggaaaggtaagcgtaaattttttgcgtatcgtcatgggagcacagacgtgttccctgattgagtgtggctgc actccCATATGAATATCCTCCTTAG

PfkBF (1803996 - 1804025) tggcaggatcatccatgacagtaaaaacgg PfkBR (1805657 - 1805632) gccggttgcactttgggtaagccccg A construção é realizada em meio rico (por exemplo LB). Introduz-se então a cepa obtida E. coli \Δ(μάΙιΑ, qor, pfkA, pfkBf] o plasmídeo pSK-PgapA-GRE2p (exemplo 3) por electroporação, e cepa resultante E. coli [ffudhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p] é selecionada em meio rico. A cepa obtida E. coli [A(udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA- GRE2p] é então cultivada em meio mínimo contendo glucose e etilacetoacetato. Uma cepa E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] é cultivada nas mesmas condições.

Quando as culturas são obtidas, compara-se: a evolução da biomassa de cada cepa durante a fase de bioconversão, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato produzido no meio extracelular, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato acumulado nas células, a produtividade em etil-3-hidroxibutirato, o rendimento glucose/etil-3-hidroxibutirato.

Pode-se observar que a cepa E. coli \E(udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p] apresenta um rendimento de produção de etil-3-hidroxibutirato aumentado em relação à cepa não otimizada._____________ Exemplo 7: Construção de cepa E. coli \A(udhA, qor, pgi, Ipd) plpd*, pSK-PgapA-GRE2pl e biotransformação de etilacetoacetato e etil-3-hidroxibutirato O gene Ipd codificando a dihidrolipoamida desidrogenase NAD- dependente, implicada no complexo multi-enzimático piruvato desidrogenase, é deletado usando a técnica descrita no exemplo 2, salvo que a cepa inicial é a cepa E. coli [Á(udhA, qor, pgi)] descrita no exemplo 4 em vez de ser uma cepa selvagem. A construção e a seleção da cepa modificada são realizadas em meio rico (por exemplo LB). A cepa obtida é E. coli [E(udhA, qor, pgi, Ipd)].

Assim, construiu-se o plasmídeo p-Ipd* que permite a super-expressão de uma dihidrolipoamida desidrogenase NADP dependente. Existem diferentes possibilidades para modificar a especificidade de co-fator de uma enzima. Por exemplo Bocanegra et al. (1993) divulgam um método para criar uma dihidrolipoamida desidrogenase NADP dependente.

Os plasmídeos y-lpd* e pSK-PgapA-GRE2p são então introduzidos por eletroporação na cepa E. coli [AÇudhA, qor, pgi, Ipd)], altemativamente, pode-se escolher clonar Ipd* sobre pSK-PgapA-GRE2p; obtém-se, então, o plasmídeo pSK-PgapA-GRE2p-lpd* que se introduz por eletroporação na cepa E. coli [E(udhA, qor, pgi, Ipd)]. A construção e a seleção da cepa modificada são realizadas em meio rico (por exemplo LB). A cepa obtida E. coli ffudhA, qor, pgi, Ipd) pSK-PgapA-GRE2p, p-//?d*)] é então cultivada em meio mínimo contendo glucose e etilacetoacetato. Uma cepa E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] é cultivada nas mesmas condições.

Quando as culturas são obtidas, compara-se: a evolução da biomassa de cada cepa durante a fase de bioconversão, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato produzido no meio extracelular, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato acumulada nas células, a produtividade em etil-3 -hidroxibutirato, o rendimento glucose/etil-3-hidroxibutirato.

Pode-se observar que a cepa E. coli f(udhA, qor, pgi, Ipd) pSK-PgapA-GRE2p, p-//?ri*)] apresenta um rendimento de produção de etil-3 -hidroxibutirato aumentado em relação à cepa não otimizada.

Exemplo 8: Construção do plasmídeo pRSGK-GRE2p O plasmídeo pYGK é construído por inserção do promotor Ppgk, do sítio de multiclonagem e do terminador cycl do vetor pYPG2 no vetor pBluescript-SK (pSK). Para isto, o promotor Ppgk, o sítio de múltipla clonagem e o terminador cycl são amplificados com a polimerase Pfu Turbo a partir do vetor pYPG2. O produto PCR obtido é em seguida digerido pelas enzimas de restrição SacII - Notl e ligado ao vetor pSK digerido pelas enzimas de restrição Apal - Smal, ligado depois digerido pelas enzimas de restrição Notl - SacII e desfosforilado para dar o plasmídeos pYGK. O plasmídeo pYGK é então introduzido na cepa de E. coli DH5ot para verificação da construção. O sequenciamento do promotor Ppgk, do sítio de múltipla clonagem e do terminador cycl do plasmídeo pYGK com os oligonucleotídeos universais Ml3 reverso e M13 dianteiro é em seguida realizado para confirmar a construção. O plasmídeo pYGK-GRE2p é em seguida construído por inserção do gene GRE2p no plasmídeo pYGK. Para isto, o gene GRE2p de Saccharomyces cerevisiae é amplificado com a polimerase Pwo a partir de DNA cromossômico, usando os oligonucleotídeos seguintes: Ome376_Gre2 pYGK F (Smal) Acgtacgtcççççgggaaaaatgtcagttttcgtttcaggtgc Ome377_Gre2 pYGK R (Apal) ACGTACGGGCCCTTATATTCTGCCCTCAAATTTTAAAATTTGGG O produto PCR obtido é em seguida digerido pelas enzimas de restrição Apal - Smal e ligado ao vetor pYGK digerido pelas enzimas de restrição Apal - Smal e desfosforilado para dar o plasmídeo pYGK-GRE2p. O plasmídeo pYGK-GRE2p é então introduzido na cepa E. coli DH5ct para verificação da construção. O sequenciamento do gene GRE2p do plasmídeo pYGK-GRE2p com os oligonucleotídeos universais M13 reverso e M13 dianteiro é realizado para confirmar a construção. O plasmídeo pRSGK-GRE2p é finalmente obtido por digestão dos plasmídeos pYGK-GRE2p e pRS426 com as enzimas de restrição Notl -SacII depois ligação.

Exemplo 9: Construção de cepa S. cerevisiae fA(ZTAl) pRSGK-GRE2pl e biotransformação de etilacetoacetato e etil-3-hídroxibutirato. A inativação do gene ZTA1 é realizada inserindo um marcador (resistência a um antibiótico, auxotrofia), deletando ao mesmo tempo a maior parte do gene em questão. A técnica usada é descrita por Brachmann et al. (Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications, Yeast, 1998, 14: 115 - 32). Pode-se também usar a técnica descrita por Wach et al. (New heterologous modules for classical or PCR- based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae, Yeast, 1994, 10: 1793 -1808).

Em todos os casos, obtém-se uma cepa final de S. cerevisiae [Δ(ΖΤΑ1)], em que o plasmídeo pRSGK-GRE2p (exemplo 8) é então introduzido.

Altemativamente, pode-se também escolher introduzir o plasmídeo pRSGK-GRE2p em uma cepa Δ(ΖΤΑ1) disponível, por exemplo cepa EUROSCARE Y33183 (genotipo: BY4743; Mat a/α; his3Y>\/his3AAY, leu2DQ/leu2D0; lys2DWLYS2; METl5/metl5D0; ura3DQ/ura3O0; YBR046c::kanMX4/YBR046c::kanMX4). É então possível, após esporulação, recuperar uma cepa homozigótica S. cerevisiae [Δ(ΖΤΑ1) pRSGK-GRE2p]. A cepa obtida 5. cerevisiae [Δ(ΖΤΑ1) pRSGK-GRE2p] é em seguida cultivada em meio mínimo contendo glucose e etilacetoacetato. A cepa testemunho S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] é cultivada nas mesmas condições.

Quando as culturas são obtidas, compara-se a evolução da biomassa de cada cepa durante a fase de bioconversão, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato produzido no meio extracelular, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato acumulado nas células, a produtividade em etil-3 -hidroxibutirato, o rendimento glucose/etil-3 -hidroxibutirato.

Pode-se observar que a cepa S. cerevisiae [Δ(ΖΤΑ1) pRSGK-GRE2p] apresenta um rendimento de produção de etil-3-hidroxibutirato aumentado em relação à cepa não otimizada.

Exemplo 10: Construção de cepa 5. cerevisiae ΙΔίΖΤΑΙ, PGI1) pRSGK-GRE2p] e biotransformação de etilacetoacetato em etil-3-hidroxibutirato. A inativação do gene PGI1 é realizada na cepa S. cerevisiae [A(ZTA1) pRSGK-GRE2p] usando a técnica descrita no exemplo 9, e os oligonucleotídeos seguintes: DpgilF

CCAACGCAGACCGCTGCCTGGCAGGCACTACAGAAACACTTCGAT

GAAATGAAAGACGTTACGATCGCCGATCTTTTTGCTGTAGGCTGGA

GCTGCTTCG

DpgilR

GCGCCACGCTTTATAGCGGTTAATCAGACCATTGGTCGAGCTATCG

TGGCTGCTGATTTCTTTATCATCTTTCAGCTCTGCATATGAATATCC

TCCTTAG

PgilF

GCGGGGCGGTTGTCAACGATGGGGTCATGC

PgilR

CGGTATGATTTCCGTTAAATTACAGACAAG

Altemativamente, é possível usar uma cepa A(PGI1) disponível, por exemplo cepa EUROSCARF Y23336 (Mat a/a; his3Dl/his3Dl; leu2D0/leu2D0; lys2D0/LYS2; MET15/metl5D0; ura3D0/ura3D0; YBR196c::kanMX4/YBR196c). A cepa é então transformada pelo plasmídeo pRSGK-GRE2p (exemplo 8) depois a deleção do gene ZTA1 é realizada usando a técnica descrita no exemplo 9. A cepa obtida S. cerevisiae [A(ZTA1, PGI1) pRSGK-GRE2p] é então cultivada em meio mínimo contendo glucose e etilacetoacetato. A cepa testemunho S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] é cultivada nas mesmas condições.

Quando as culturas são obtidas, compara-se: a evolução da biomassa de cada cepa durante a fase de bioconversão, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato produzido no meio extracelular, a quantidade de etil-3-hidroxibutirato acumulada nas células, a produtividade em etil-3-hidroxibutirato, o rendimento glucose/etil-3 -hidroxibutirato.

Pode-se observar que a cepa S. cerevisiae [Δ(ΖΤΑ1, PGI1) pRSGK-GRE2p] apresenta um rendimento de produção de etil-3-hidroxibutirato aumentado em relação à cepa não otimizada.

Exemplo 11: Construção de cepa S. cerevisiae 1A(ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2pl e biotransformação de etilacetoacetato em etil-3-hidroxibutirato Os genes PFK1 e PFK2 são deletados na cepa S. cerevisiae [A(ZTA1)] usando a técnica descrita no exemplo 9, e os oligonucleotídeos seguintes: DpfklF

ATGCAATCTCAAGATTCATGCTACGGTGTTGCATTCAGATCTATCA

TCACAAATGATGAAAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCG

DpfklR

TTTGTTTTCAGCGGCTAAAGCGGCTACCTCAGCTCTCAACTTTAAT

CTACCGGACAGGATGGGCCACTAGTGGATCTGATATC

Pfkl int F

GCTTTCTTAGAAGCTACCTCCG

Pfkl int R

GAACCGACAAGACCAACAATGG

Pfk2 int F

CAGTTGTACACTTTGGACCC

Pfk2 int R

GATCAGCACCAGTCAAAGAACC A cepa é então transformada pelo plasmídeo pRSGK-GRE2p (exemplo 8). A cepa obtida 5. cerevisiae [Δ(ΖΤΑ1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] é então cultivada em meio mínimo contendo glucose e etilacetoacetato. A cepa testemunho S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] é cultivada nas mesmas condições.

Pode-se observar que a cepa 5. cerevisiae [Δ(ΖΤΑ1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] apresenta um rendimento de produção de etil-3-hidroxibutirato aumentado em relação à cepa não otimizada. ____ Exemplo 12: Comparação entres valores experimentais e previsões pelo modelo metabólico para a otimização da produção de etil-3-hidroxi butirato por Escherichia coli Pode-se observar uma boa correlação entre as modelagens previsoras (exemplo 1) e as realizações experimentais descritas nos exemplos 3,4, 5, 6, 7, 9, lOe 11.

Os exemplos 1 a 11 acima são aplicações particulares da patente e não limitam a utilização. O versado na arte saberá facilmente adaptar estes exemplos para a biotransformação de moléculas tendo uma síntese NADPH dependente. O algoritmo MetOPt ® e a estratégia de otimização de um processo de bioconversão NADPH dependente via a otimização da relação NADPH/NADP+ é validado, isto permite aos requerentes, por outro lado, reivindicar uma aplicação expandida a todas as biotransformações NADPH dependentes, que poderão ser modeladas e previstas por MetOpt ® ou um de seus derivados, usando E. coli, S. cerevisiae, ou qualquer outro microorganismo.

Exemplo 13 - Cálculo dos rendimentos ótimos teóricos no quadro de processos de fermentação em E. coli O exemplo 12 mostra que os modelos MetOpt ® desenvolvidos pela empresa são aplicáveis às bioconversões e deveriam mais geralmente se aplicar às biotransformações como as fermentações. A título de exemplos, o modelo MetOpt ® - Coli é aplicado à produção de cisterna ou de 3-hidroxipropionato por fermentação de glucose nas cepas E. coli otimizadas de acordo com a invenção. Os parâmetros usados são os mesmos que no exemplo 1, a saber: 1) um fluxo de importação de glucose a 3 mmol.gÃh'1, 2) uma taxa de crescimento variável de 0, 0.15 e 0.25 lí1, 3) um fluxo da transhidrogenase membranosa (prc/AB) variável e inferior ou igual 1 mmol.gÃh"1. O valor limite de fluxo da transhidrogenase membranosa é determinado a partir da literatura (Hanson, 1979; Anderlund et ai, 1999; Emmerling et al., 2002); 4) o fluxo de manutenção foi limitado entre 5 e 22 mmol.g^.h"1. a) caso da produção de cisteína por fermentação de glucose Rendimentos ótimos teóricos de produção da cisteína pelas cepas de E. coli otimizadas em sua capacidade de redução de NADP+ (mol por mol de glucose) A fim de melhorar ainda o rendimento ótimo teórico de cepas otimizadas de acordo com a invenção,, modificações suplementares podem ser levadas em conta, como a super-expressão de pelo menos um gene escolhido dentre zwf, gnd, pntA, pntB e icd e/ou a deleção de pelo menos um gene escolhido dentre edd, aceA, aceB e aceK.

Na prática, para obter tais rendimentos, outras modificações deverão ser supridas às cepas otimizadas de acordo com a invenção, por exemplo super-expressando o gene cysB como descrito na patente WO 0127307, ou modificando o gene cysE como descrito na patente eP0885962. b) Caso da produção de 3-hidroxipropionato por fermentação de glucose A produção de 3-hidroxipropionato é realizada nas cepas de E. coli contendo os genes codificando para as enzimas da via de síntese de 3-hidroxipropionato, por exemplo malonil-coA reductase de Chloroflexus aurantiacus (Hügler et al., Journal of Bacteriology, 2002, 184: 2404 - 2410).

Rendimentos ótimos teóricos de produção de 3-hidroxipropionato pelas cepas de E. coli otimizadas em sua capacidade de redução de NADP+ (mol por mol de glucose) A fim de melhorar ainda o rendimento ótimo teórico de cepas otimizadas de acordo com a invenção, modificações suplementares podem ser levadas em conta, como a super-expressão de pelo menos um gene escolhido dentre zwf, gnd, pntA, pntB e icd e/ou a deleção de pelo menos um gene escolhido dentre edd, aceA, aceB e aceK.

Exemplo 14 - Cálculo dos rendimentos ótimos teóricos no quadro dos processos de fermentação junto a S. cerevisiae: aplicação à produção de hidrocortisona O exemplo 12 mostra que os modelos MetOpt ® desenvolvidos pela empresa são aplicáveis às bioconversões e deveríam mais geralmente se aplicar às biotransformações como as fermentações. A título de exemplo, o modelo MetOpt ® Scere é aplicado à produção de hidrocortisona por fermentação de glucose nas cepas de S. cerevisiae otimizadas de acordo com a invenção. Os parâmetros usados são os mesmos que para o exemplo 1, a saber 1) um fluxo de importação de glucose a 3 mmol.g^.h"1, 2) uma taxa de crescimento variável de 0, 0.15 e 0.25 h'1, 3) um fluxo de manutenção inferior ou igual a 22 mmol.g^.h’1; 4) as reações dos aldeídos desidrogenase (ALD2, ALD3, ALD6) são irreversíveis e impostas no sentido acetato + NAD(P)H -» acetaldeído + NAD(P); 5) a levedura não possui atividades equivalentes a udhA ou pntkfi. O modelo permite levar em conta a compartimentação mitocondrial e peroxissomal.

Esta representação dos resultado permite evidenciar o suprimento real de cada uma das mutações realizada pela invenção, na melhora da produção de NADPH e, portanto, na melhora do fluxo de produção de hidrocortisona. A produção de hidrocortisona é realizada nas cepas de S. cerevisiae contendo os genes codificando para as enzimas da via de síntese de hidrocortisona (Szczebara et al., 2003, Natureza Biotechnology, 21: 143 - ' 149)._________________________________r______________________________ Rendimentos ótimos teóricos de produção de hidrocortisona pelas cepas de 5. cerevisiae otimizadas em sua capacidade de redução de NADP4" (mol por mol de glucose) As cepas cujos genes PFK1 e PFK2 são deletadas são incapazes de produzir hidrocortisona, mesmo se não forem viáveis. Isto é devido ao fato de que a produção de hidrocortisona, é com vantagem limitada pela demanda de carbono que pela necessidade em NADPH. Uma solução consiste em permitir uma leve expressão de uma atividade de tipo transhidrogenase junto à levedura. No entanto, as modelagens mostram que o fluxo de produção de hidrocortisona não será jamais tão bom como no caso de uma deleção do gene PGI1. A fim de melhorar ainda o rendimento ótimo teórico das cepas otimizadas de acordo com a invenção, modificações suplementares podem ser levadas em conta, como a super-expressão de pelo menos um gene escolhido dentre ZWF, SOL1, SOL2, SOL3, SOL4, GND1, GND2, IDP1, IDP2 e IDP3 e/ou a deleção de pelo menos um gene escolhido dentre ICL1, DAL7.

REFERÊNCIAS • Anderson, E. H. (1946) Growth requirements of vims-resistant mutants of Escherichia coli strain "B", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 32: 120 128 • Baudin, A.; Ozier-Kalogeropoulos, O.; Denouel, A.; Lacroute, F. e Cullin, C. (1993) A simple and efíícient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae,., Nucl. Acids Res. 21, 3329 -3330 • Bocanegra, J. A. Scrutton, N. S.; Perham, R. N. (1993) Creation of an NADP-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex by protein engineering. Biochemistry 32: 2737 - 2740 • Brachmann CB, Davies A, Cost GJ, Caputo E, Li J, Hieter P, Boeke JD. (1998) Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14: 115 -32. • Datsenko, K. A.; Wanner, B. L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 6640 - 6645 • Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York • Sambrook et al. (1989 Molecular cloning: a laboratory manual. Segunda edição Cold Spring • Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York • Schaefer U.; Boos, W.; Takors, R.; Weuster-Botz, D. (1999) Automated sampling device for monitoring intracellular metabolite dynamics., Anal. Biochem. 270: 88-96 • Wach, A.; Brachat, A.; Pohlmann, R.; e Philippsen, P. (1994) New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae, Yeast 10, 1793 - 1808, 1994.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Cepa de microorganismo de Escherichia coli ou Saccharomyces cerevisiae, caracterizada pelo fato de que o gene qor ou ZTA1 codificando uma quinona oxidoreductase, o gene udhA codificando uma transhidrogenase solúvel, o gene pgi ou PGI1 codificando uma fosfoglucose isomerase, e os genes pfkA e pfkB ou PFK1 e PFK2 codificando uma fosfofructoquinase são deletados.

2. Cepa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender igualmente a modificação do gene Ipd ou LPD1 codificando uma dihidrolipoamida desidrogenase e/ou o gene gapA ou TDH1 codificando uma gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, a fim de que ela(s) utilize(m) preferivelmente o NADP.

3. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de compreender igualmente a super-expressão de pelo menos o gene zwf ou ZWF1 codificando uma glucose 6-fosfato desidrogenase, ou pelo menos o gene SOL1 codificando uma 6-fosfogluconolactonase, ou pelo menos o gene gnd ou GND1 codificando uma 6-fosfogluconato desidrogenase, ou pelo menos o gene icd ou IDP1 codificando uma isocitrato desidrogenase ou pelo menos o gene pntA codificando uma transhidrogenase ligada a membrana.

4. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de compreender igualmente a deleção de pelo menos o gene edd codificando uma 6-fosfogluconato desidratase ou pelo menos o gene aceB ou DAL7 codificando uma malato sintase, ou pelo menos o gene aceA ou ICL1 codificando uma isocitrato liase ou pelo menos o gene acek codificando uma isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase.

5. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um gene, endógeno ou exógeno, codificando pelo menos uma enzima implicada na biotransformação de uma molécula de interesse.

6. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um gene de marcação de seleção.

7. Processo de preparação de cepas otimizadas, conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de envolver a deleção do gene qor ou ZTA1 codificando uma quinona oxidoreductgase, o gene udhA codificando uma transhidrogenase solúvel, o gene pgi ou PGI1 codificando para uma fosfoglucose isomerase, e os genes pfkA e pfkB ou PFK1 e PFK2 codificando uma fosfofructoquinase, em que deleções são realizadas por recombinações homólogas.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a modificação do gene Ipd ou LPD1 codificando uma dihidrolipoamida desidrogenase e/ou o gene gapA ou TDH1 codificando uma gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase a fim de que ela(s) utilize(m) preferivelmente o NADP, em que modificações são realizadas por recombinação homóloga.

9. Processo, de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de a super-expressão do pelo menos gene zwf ou ZWF1 codificando uma glucose 6-fosfato desidrogenase, ou pelo menos o gene SOL1 codificando uma 6-fosfogluconolactonase, ou pelo menos o gene gnd ou GND1 codificando uma 6-fosfogluconato desidrogenase, ou pelo menos o gene aceK codificando uma isocitrato desidrogenase ou pelo menos o gene pntA codificando uma transhidrogenase ligada a membrana, seja transformando a cepa com um vetor apropriado compreendendo pelo menos um gene codificando pelo menos uma enzima implicada na biotransformação de uma molécula de interesse e/ou pelo menos um gene de marcação de seleção, seja aumentando a força do ou dos promotor(es) endógeno(s) controlando o(s) gene(s) a super-expressar.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de compreender ainda a deleção de pelo menos o gene edd codificando uma 6-fosfogluconato desidratase, ou pelo menos o gene aceB ou DAL7 codificando uma malato sintase, ou pelo menos o gene aceA ou ICL1 codificando uma isocitrato liase, ou pelo menos o gene aceK codificando uma isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase, em que deleções são realizadas por recombinação homóloga.

11. Processo de produção de uma molécula de interesse formada por uma via de biossíntese da qual pelo menos uma etapa é NADPH dependente, caracterizado pelo fato de compreender as etapas seguintes: a) crescimento em cultura dos microorganismos otimizados conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em um meio de cultura apropriado favorecendo seu crescimento e compreendendo as substâncias necessárias para a realização da biotransformação por fermentação ou bioconversão, com a exceção de NADPH, e b) extração da molécula de interesse do meio e conforme o caso sua purificação.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a molécula de interesse é um aminoácido, ou uma vitamina, ou um esterol, ou um flavonóide, ou um ácido graxo, ou um ácido orgânico, ou um poliol ou um hidroxiéster.