JP6603658B2 - 脂肪酸及び脂肪酸誘導体の製造のための微生物及び方法 - Google Patents

脂肪酸及び脂肪酸誘導体の製造のための微生物及び方法 Download PDF

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年７月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／８５６，６５２号（代理人整理番号３４２４６−７８０．１０１）の恩恵を主張し、またその全内容を参照により本明細書に援用する。
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
本発明は、米国エネルギー省によってＤＥ−ＡＲ０００００８８として付与された、政府の支援によりなされた。政府は、本発明に関する所定の権利を有する。
脂肪酸及び脂肪酸誘導体（例えば脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）、脂肪族アルコール、脂肪族アミン、その他）は、多くの消費者用生産物、産業用化学物質及び燃料の製造における重要な前駆物質である。例えば、脂肪酸及び脂肪酸誘導体は、洗剤、クリーナー、プラスチック、紙、塗料、潤滑油、ワックス、コーティング及び界面活性剤の製造に用いられる。それらはまた、フレーバー及び芳香剤としても使用できる。現在では、脂肪酸及び脂肪酸誘導体は、油脂化学的（植物性及び動物性脂肪）又は石油化学的給源から製造される。一般的に、油脂化学的給源に由来する脂肪酸は、偶数の炭素数の脂肪族鎖を有するが、石油化学的給源に由来する脂肪酸は、奇数の炭素数の脂肪族鎖を有する。
油脂化学的及び石油化学的脂肪酸は、顕著な短所を有する。特に最も顕著なものは、そのような脂肪酸を産生するのに用いられる原料が一般に、様々な炭素鎖長の脂肪酸の混合物を含み、広範囲にわたる鎖長の、並びに、飽和及び不飽和の脂肪酸を含み得る。図１は、一般に存在する様々な油脂化学的原料中の脂肪酸の炭素組成を示すチャートである。しかしながら、脂肪酸及び脂肪酸誘導体の商業的用途の多くは、その脂肪族鎖長に関してより高い特異性を有する脂肪酸前駆体を必要とする。例えば、Ｃ６〜Ｃ１０脂肪酸はジェット潤滑油の生産に用いられ、Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸は界面活性剤及び洗剤の生産に用いられ、Ｃ１６〜Ｃ１８脂肪酸は金属石鹸の生産に用いられる。その結果、現在の脂肪酸の製造方法は、所定の応用に必要とされる脂肪酸成分を単離するため、高コストの原料処理工程（例えば分画及び蒸留）が必要となる。そのような処理工程の有効性に関する技術的限界と、特定の鎖長の脂肪酸を比較的高い濃度で単離するそれらの能力に関する限界と、が存在する。
油脂化学的及び石油化学的な脂肪酸のもう１つの欠点は、原料コストの大幅な変動である。油脂化学的原料の価格は非常に不安定で、年ごとに顕著に変動し、また様々な地理的地域間でも変動し得る。全生産コストは原料価格に非常に影響されるため、そのような不安定性は、マージンに対して顕著に影響を与え得る。石油化学的な脂肪酸に関しては、石油系炭化水素の供給が減少し、その結果、それらのコストが増加し続けると予想されることが、次第に受け入れられている。
最後に、化学産業の持続可能性に関する懸念が増加しており、再生可能供給源から得られる化学物質に対する需要が増加しつつある。実際に、多くの化学企業及びそれらの顧客は、石油ベースの化学物質などの現行の化学物質を再生可能供給源から製造される化学物質に置き換えることを目的として、持続可能性の主導権を実行している。そのような企業は、生産物の性能又は特性に対する影響が最小で、また下流の生産物及び顧客に対する影響が最小である、代替的な化学物質を探索している。油脂化学的産業では、持続可能性に対する懸念すら存在する。油脂化学的な脂肪酸の多くが、再生可能供給源から生じるにもかかわらず、現在の産業の実践では、持続可能な方向でこれらの資源の採取を管理していない。例えば、パーム油（油脂化学的な脂肪酸の主な給源）の製造では、森林伐採に関する懸念が大きい。
石油ベース及び油脂ベースの脂肪酸及び脂肪酸誘導体に係るこれらの問題点を見るに、持続可能な植物ベースの原料を使用した、化学物質及び燃料の製造のための産業的な微生物システムの開発及び改良に対する関心が増加している。そのような産業的微生物システムは、特定の化学物質及び生産物の製造のための石油系又は油脂化学系の炭化水素の使用を完全に、又は、部分的に置換し得るであろう。
抗生物質及び抗マラリア薬から、ファインケミカル、エタノールなどの燃料にわたる多くの化学物質が、かかる微生物システムによって製造されている。しかしながら、脂肪酸及び脂肪酸誘導体、特に、特定の脂肪酸鎖長を高濃度で有する脂肪酸及び脂肪酸誘導体を生産するように適合させた組み換え微生物に対する商業的なニーズが未だ存在する。
１つの態様では、本発明は、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子組み換え生物を提供するものであり、微生物は、Ｃ４又はそれ以上の炭素鎖長を有する脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７を含む。いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号１から１２０のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、３−ケトブチリル−ＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ケトバレリル−ＣｏＡレダクターゼ、及び３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、配列番号１８３及び配列番号２７１のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ及びエノイル−ＣｏＡヒドラターゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、配列番号１８３及び配列番号２７２のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、トランス−２−エノイル−レダクターゼである。いくつかの実施形態では、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、配列番号２７５と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、アミノ酸８６〜８９において、ＰＤＲＰのＨＦＬＱへの置換、Ｆ２１７Ａ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｇ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｍ、Ｆ２１７Ｐ、Ｆ２１７Ｓ、Ｆ２１７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、Ｆ２１７Ｗ、Ｇ２８８Ｓ、Ｇ３０９Ｓ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｃ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ｌ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｔ、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｙ、Ｖ１５７Ｆ、Ｖ１９６Ｇ、及びＹ１４４Ｌからなる群から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＹ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＨＦＬＱ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１５７Ｆ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｗ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｋ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｅ、並びにＩ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｋからなる群から選択される２つのアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ；Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ及びＨＦＬＱ；Ｉ１４７Ｔ、Ｖ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｖ；並びに、Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ、及びＶ１５７Ｆ；からなる群から選択される３つのアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、Ｓｅｒ８４、Ｖａｌ１１４、Ｇｌｙ２８８、Ｉｌｅ１９４、Ｇｌｙ３１８、Ｔｈｒ８５、Ｇｌｎ９０、Ｖａｌ１９６、Ｔｙｒ１４４、Ｐｈｅ１５９、Ｉｌｅ１４７、及びＰｈｅ２１７からなる群から選択される位置で１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及び３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、配列番号１８３及び配列番号２７１のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ及びエノイル−ＣｏＡヒドラターゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、配列番号１８３及び配列番号２７２のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、トランス−２−エノイル−レダクターゼである。いくつかの実施形態では、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、配列番号２７５と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、チオエステラーゼ又はワックスエステルシンターゼをコードする異種核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、脂肪族アルコール、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルケン、脂肪族アミド、脂肪族アルカン及び脂肪族二塩基酸を含む群から選択される脂肪酸誘導体の産生を触媒する終結酵素をコードする異種核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、アシル−ＣｏＡエステラーゼであり、生物は、脂肪酸を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ｔｅｓＡ、‘ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｃｉＡ、ｙｂｇＣ、ｙｂｆＦ、ｆａｄＭ、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ＣｐｅｒｆＴＥ、ＬｐＴＥ、及びＰＡ２８０１ＴＥを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、及び配列番号２８８のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ワックスエステルシンターゼは、Ｍａｑ１、Ｐｃｒｙ１、Ｒｊｏｓ１とＡｂｏｒｋ１を含む群から選択され、生物は脂肪エステルを産生できる。いくつかの実施形態では、ワックスエステルシンターゼは、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、及び配列番号２９２のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、生物は、脂肪エステルを産生できる。いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７であり；ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｈｂｄ及びｆａｄＢからなる群から選択され；３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｃｒｔ及びｆａｄＢからなる群から選択され；エノイル−ＣｏＡレダクターゼはｔｅｒであり；並びにチオエステラーゼは、ＣｐＴＥ、ｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＢ、ｙｂｇＣ、ｙｂｆＦ、及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数４又は５の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、及びＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ，Ｆ２１７Ｖからなる群から選択され；ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢであり；３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢであり；エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり；並びにチオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ＣｐｅｒｆＴＥ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ、及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数６又は７の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＢ、及びｙｃｉＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、並びにシンターゼＩＩＩからなる群から選択され；ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択され；３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択され；エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり；並びにチオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ＣｐｅｒｆＴＥ、ｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ、及びｙｃｉＡからなる群から選択され；並びにポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数８又は９の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＢ、及びｙｃｉＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、並びにシンターゼＶからなる群から選択され；ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択され；３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択され；エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり；並びにチオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ、及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１０又は１１の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ並びにシンターゼＶＩからなる群から選択され；ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ、ｆａｂＧ及びｆａｄＪからなる群から選択され、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｆａｄＪからなる群から選択され；エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり；並びにチオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ＣｐｅｒｆＴＥ、ｆａｄＭ、ＬｐＴＥ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１２又は１３の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼはｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択
される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ、並びにシンターゼＶＩからなる群から選択され；ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ、及びｆａｄＪからなる群から選択され；３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ、及びｆａｄＪからなる群から選択され；エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒ、ｙｄｉＯ及びｆａｄＥ群からなる群から選択され；並びにチオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ＣｐｅｒｆＴＥ、ｆａｄＭ、ＬｐＴＥ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ、及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、少なくとも炭素数１４の炭素鎖長の脂肪酸を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ｆａｄＭ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１４又は１５の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼはＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ＣｐｅｒｆＴＥ、ｆａｄＭ、Ｐａ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ、及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１６又は１７の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ｆａｄＭ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ、及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１６又は１７の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、生物は、アセチル−ＣｏＡをプライマーとして、及びマロニル−ＣｏＡを伸長分子として使用し、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選択される炭素鎖長の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、生物は、プロピオニル−ＣｏＡをプライマーとして、及びマロニル−ＣｏＡを伸長分子として使用し、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１から選択される炭素鎖長の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。
１つの態様では、本開示は、配列番号１と少なくとも７０％の相同性と、１つ又は２つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入と、を有するアミノ酸配列を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドであって、Ｃ４以上の炭素鎖長のアシル−ＣｏＡ基質を受容できる、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、マロニル−ＣｏＡとアシル−ＣｏＡ基質を縮合する縮合反応を触媒して、Ｃ６以上の炭素鎖長の３−ケト−アシル−ＣｏＡを産生することができる。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、Ｙ１４４Ｌ、Ｖ１５７Ｆ、Ｇ３０９Ｓ、Ｇ２８８Ｓ、アミノ酸８６〜８９におけるＰＤＲＰからＨＦＬＱへの置換、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｃ、Ｉ１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｌ、Ｖ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｙ、Ｆ２１７Ｇ、Ｆ２１７Ａ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｍ、Ｆ２１７Ｔ、Ｆ２１７Ｐ、Ｆ２１７Ｓ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｗ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｃ、Ｉ１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｌ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｙ、及びＦ２１７Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＹ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＨＦＬＱ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１５７Ｆ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｗ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｋ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｅ、並びにＩ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｋからなる群から選択される２つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、（Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ、及びＦ２１７Ｖ）、（Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、及びＨＦＬＱ）、（Ｉ１４７Ｔ、Ｖ１４７Ｆ、及びＦ２１７Ｖ）、並びに（Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ、及びＶ１５７Ｆ）からなる群から選択される３つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｓｅｒ８４、Ｖａｌ１１４、Ｇｌｙ２８８、Ｉｌｅ１９４、Ｇｌｙ３１８、Ｔｈｒ８５、Ｇｌｎ９０、Ｖａｌ１９６、Ｔｙｒ１４４、Ｐｈｅ１５９、Ｉｌｅ１４７、Ｐｈｅ２１７、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される位置で、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｉ１４７Ｔアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｆ２１７Ｖアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｉ１４７Ｔアミノ酸置換及びＦ２１７Ｖアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチドは単離及び精製されている。
１つの態様では、本開示は、本開示の修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする単離及び精製されたポリヌクレオチドを提供する。
１つの態様では、本開示は、配列番号２と少なくとも７０％かつ１００％未満、又は約１００％の相同性又は相補性を有する核酸配列を含む単離及び精製されたポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドが、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を有する配列番号１の修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードし、当該修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドが、Ｃ４の炭素鎖長のアシル−ＣｏＡ基質を受容できる、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、アシル−ＣｏＡ基質をマロニル−ＣｏＡと縮合させる縮合反応を触媒して、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する３−ケトアシル−ＣｏＡを産生できる、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、Ｙ１４４Ｌ、Ｖ１５７Ｆ、Ｇ３０９Ｓ、Ｇ２８８Ｓ、アミノ酸８６〜８９におけるＰＤＲＰからＨＦＬＱへの置換、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｃ、Ｉ１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｌ、Ｖ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｙ、Ｆ２１７Ｇ、Ｆ２１７Ａ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｍ、Ｆ２１７Ｔ、Ｆ２１７Ｐ、Ｆ２１７Ｓ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｗ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｃ、Ｉ１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｌ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｙ、及びＦ２１７Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＹ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＨＦＬＱ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１５７Ｆ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｗ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｋ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｅ、並びにＩ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｋからなる群から選択される２つのアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、（Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ、及びＦ２１７Ｖ）、（Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、及びＨＦＬＱ）、（Ｉ１４７Ｔ、Ｖ１４７Ｆ、及びＦ２１７Ｖ）、並びに（Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ、及びＶ１５７Ｆ）からなる群から選択される３つのアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｓｅｒ８４、Ｖａｌ１１４、Ｇｌｙ２８８、Ｉｌｅ１９４、Ｇｌｙ３１８、Ｔｈｒ８５、Ｇｌｎ９０、Ｖａｌ１９６、Ｔｙｒ１４４、Ｐｈｅ１５９、Ｉｌｅ１４７、Ｐｈｅ２１７、及びその組合せからなる群から選択される位置における１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｉ１４７Ｔアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｆ２１７Ｖアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、２つ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｉ１４７Ｔアミノ酸置換及びＦ２１７Ｖアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ベクターは、本開示に係るポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、本開示に係るポリヌクレオチドを含む。
１つの態様では、本開示は、マロニル−ＣｏＡとＣ２超の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡとを縮合するための候補体として、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを選択する方法を提供し、当該方法は、配列番号１と少なくとも７０％で１００％未満、又は約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼポリペプチドを同定する工程と、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが、（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲ配列モチーフ、ＳＴＰＤＸＰＱ配列のモチーフの欠如及び基質結合部位における疎水性残基のみの存在、からなる群から選択される１つ又は２つ以上の特徴を含む場合に、Ｃ２超の炭素鎖長のアシル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡとを縮合するための候補体として３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを選択する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２つの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを選択することを含み、各シンターゼＩＩＩは、系統樹の異なる分岐を占有する。
１つの態様では、本開示は、本開示に係る方法によって選択されるＮｐｈＴ７のホモログのライブラリを提供する。
１つの態様では、本開示は、単離されたＮｐｈＴ７ホモログを提供し、当該ホモログは、配列番号１〜１２０のいずれか１つと、少なくとも７０％かつ１００％未満の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
１つの態様では、本開示は、本開示に係る選択された３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
１つの態様では、本開示は、本開示に係る選択された３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを発現する遺伝子組み換え生物を提供する。
１つの態様では、本開示は、本開示に係る選択された３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを発現する遺伝子組み換え生物の作製方法を提供し、本開示に係るポリヌクレオチドで微生物を形質転換することを含む。
１つの態様では、本開示は、遺伝子組み換えを有さない対照生物よりも高い率又は力価で、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる、遺伝子組み換え生物を提供し、当該遺伝子組み換え生物は、配列番号１２１、配列番号１２２及び配列番号１２３のいずれか１つを含まない。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、本開示に係るベクター又はプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、ベクター又はプラスミドで形質転換されている。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、本開示に係るポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、本開示に係る修飾ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、本開示に係るＮｐｈＴ７ホモログ又は修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、Ｃ２超の炭素鎖長のアシル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡとを縮合して、Ｃ４超の炭素鎖長の３−ケトアシル−ＣｏＡを産生できる異種ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、アシル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡであり、３−ケトアシル−ＣｏＡは、３−ケトブチリル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、アシル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡであり、３−ケトアシル−ＣｏＡは、３−ケトブチリル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、アシル−ＣｏＡは、プロピオニル−ＣｏＡであり、３−ケトアシル−ＣｏＡは、３−ケトバレリル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、炭素鎖長Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０の遊離の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％超の純度で産生できる。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、約０．１ｇ／ｇＤＣＷ＊時、０．２ｇ／ｇＤＣＷ＊時又はそれ以上の速度で、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、アシル−ＣｏＡの産生速度を上昇させる追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、マロニル−ＣｏＡの産生速度を上昇させる追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、マロニル−ＡＣＰ脂肪酸合成経路を阻害する追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、マロニル−ＣｏＡのマロニルＡＣＰへの転換を減少させる追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、マロニル−ＡＣＰとアセチルＡＣＰとの縮合速度を低下させる追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、グルコースからメチルグリオキサールへの変換、ピルビン酸塩から乳酸塩への変換、アセチル−ＣｏＡから酢酸塩への変換、アセチル−ＣｏＡからエタノールへの変換、脂肪アシルからアセチル−ＣｏＡへの変換、及びそれらの任意の組合せからからなる群から選択される１つ又は２つ以上の反応を完全又は部分的に阻害する、１つ又は２つ以上の追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、配列番号１〜１２０のいずれか１つと少なくとも７０％で１００％未満、又は約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、ケト−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（３ＨＤｈ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥｎＣＲ）、チオエステラーゼ酵素、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、ｆａｄＢ、ｆａｂＧ、ｆａｄＪ、ｅｃｈ２、ＰｈａＢ、ＰａＦａｂＧ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＫＣＲを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、ｆａｄＢ、ｆａｄＪ、ｅｃｈ、ｅｃｈ２、ｃｒｔ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３ＨＤｈを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、ｔｅｒ、ｃｃｒ、ｆａｄＥ、ｙｄｉＯ及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＥｎＣＲを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、ｙｃｉＡ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ＡＴＴＥ、ＹｂｇＣ、ｔｅｓＡ、ＹｂｆＦ、ｆａｄＭ、ＬｐＴＥ、ＣｐＴＥ（又はＣｐｅｒｆＴＥ）、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種チオエステラーゼを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、野生型ＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔの変異を有するＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖの変異を有するＮｐｈＴ７、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと、異種ｆａｄＢ、異種ｔｅｒ、及び／又は、ｔｅｓＡ、ｙｃｉＡ、ＰＡ２８０１ＴＥ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のチオエステラーゼのうちの少なくとも１つと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、野生型ＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔの変異を有するＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖの変異を有するＮｐｈＴ７、シンターゼＩＩＩ、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと、ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＫＣＲ；ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群のうちの１つ又は２つ以上の異種３ＨＤｈ；異種ｔｅｒ；並びに／又はｔｅｓＡ、ｙｃｉＡ、ＰＡ２８０１ＴＥ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のチオエステラーゼ、のうち少なくとも１つと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、野生型ＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔの変異を有するＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖの変異を有するＮｐｈＴ７、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと；ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＫＣＲ；ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３ＨＤｈ；異種ｔｅｒ；並びに／又はｔｅｓＡ、ＡＴＴＥ、ＹｂｇＣ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のチオエステラーゼ、のうちの少なくとも１つと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、野生型ＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔの変異を有するＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖの変異を有するＮｐｈＴ７、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ、シンターゼＶＩ、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと；ｆａｄＢ、ｆａｂＧ、ｆａｄＪ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＫＣＲ；ｆａｄＢ、ｆａｄＪ、ｅｃｈ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３ＨＤｈ；異種ｔｅｒ；並びに／又はｔｅｓＡ、ｙｂｇＣ、ｙｂＦＦ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のチオエステラーゼ、のうちの少なくとも１つと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、野生型ＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔの変異を有するＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖの変異を有するＮｐｈＴ７、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ、シンターゼＶＩ、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと；ｆａｄＢ及びｆａｄＪからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＫＣＲ；ｆａｄＢ及びｆａｄＪからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３ＨＤｈ；ｔｅｒ、ｙｄｉＯ及びｆａｄＥからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＥｎＣＲ；並びに／又はｔｅｓＡ、ｆａｄＭ及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のチオエステラーゼ、のうちの少なくとも１つと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、ＫＣＲ、ｈｂｄ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、チオエステラーゼ及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の内因性ポリペプチドの活性を減少させる追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、１つ又は２つ以上の内因性のポリペプチドの温度感受性型の活性を減少させる追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、本開示に係る第２の遺伝子組み換え体をコードする１つ又は２つ以上のベクターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸を、細胞膜を超えて輸送できる異種トランスポーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、ＡＢＣトランスポーターである異種トランスポーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、脂肪族アルコール、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルケン、脂肪族アミド、脂肪族エステル、脂肪族アルカン又は脂肪族二塩基酸である脂肪酸誘導体を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のチオエステラーゼは、完全又は部分的にノックアウトされ、当該チオエステラーゼは、ｔｅｓＢ、ＹｃｉＡ、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、単離及び精製されている。
１つの態様では、本開示は、Ｆ−、Δ（ａｒａＤ−ａｒａＢ）５６７、ΔｌａｃＺ４７８７（：：ｒｒｎＢ−３）、ＬＡＭ−、ｒｐｈ−１、Δ（ｒｈａＤ−ｒｈａＢ）５６８、ｈｓｄＲ５１４、ΔｌｄｈＡ：：ｆｒｔ、ΔｐｆｌＢ：：ｆｒｔ、ΔｍｇｓＡ：：ｆｒｔ、ΔｐｏｘＢ：：ｆｒｔ、Δｐｔａ−ａｃｋ：：ｆｒｔ、ｆａｂＩ（ｔｓ）−（Ｓ２４１Ｆ）−ｚｅｏＲ、Δｔｉｇ：：ｆｒｔ、ΔａｔｏＤＡＥＢ：：ｆｒｔ、及びΔｆａｄＤ：：ｆｒｔから選択される遺伝子組み換えと、ＣｏＡ基質からの脂肪酸の合成を増加させる追加的な遺伝子組み換えと、を有する遺伝子組み換え生物を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、宿主遺伝子の欠失を含み、当該欠失によりマロニル−ＣｏＡ産生の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸ギ酸塩リアーゼ、メチルグリオキサールシンターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リン酸トランスアセチラーゼアセテートキナーゼ、二官能性アセチル−ＣｏＡレダクターゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態では、本開示に係る遺伝子組み換え生物は、ＡＣＰ、ｆａｂＩ、ｆａｂＢ、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＦ、ｆａｂＧ、ｆａｂＡ、ｆａｂＺ、ｆａｂＲ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の酵素に関連する追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、本開示に係る遺伝的組み換え生物は、ｕｄｈＡ、ｐｎｔＡＢ、ＰＤＨ、ＣｏＡＡ、ｐａｎＤ、ａｃｅＡ、ａｃｅＢ、ａｃｅＫ、ＧＡＰＤＨ、ｐｙｋ、ｐｙｋ、ｇｌｔＡ、ＣＳ、ｂｉｃＡ、ＧＯＧＡＴ、ｇｄｈ、ｃａｎ、ｃｙｎＴ、ｃｙｎＳ、ｐｕｕＣ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢ、ｙｉｅＰ、ｙｉｂＤ、ｐｓｔＳ、ＢＡＡＴ、ｒｈｔＡ、ｍｄｔＭ、ｙｄｄＧ、ｙｅｂＳ、ｙｅｅＯ、ｄｅｄＡ、ｙｃａＰ、ｙｔｆＬ、ｙｂｂＰ、ｙｅｇＨ、ｙｋｇＨ、ｙｔｆＦ、ｅａｍＢ、ｙｄｈＰ、ｙｐｊＤ、ｍｄｌＢ、ａｃｒＤ、ｙｄｃＯ、ｅｍｒＤ、ｃｉｔＴ、ｃｉｔＳ、ｃｉｔＭ、ｃｉｔＨ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の酵素に関連する追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、本開示に係る遺伝子組み換え生物は、ＡＣＣアーゼ酵素に関連する追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、本開示に係る遺伝子組み換え生物は、ｃｓｃＡ、ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｇａｌＰ、ｇａｌＫｆ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の酵素に関連する追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、ｆａｄＥ、ｆａｄＤ、ｆａｄＡ、ｆａｄＢ、ｆａｄＩ、ｆａｄＪ、ｙｄｉＯ、ｐａａＪ、ｙｑｅＦ、ｔｉｇ、ａｔｏＤ、ａｔｏＡ、ａｔｏＥ、ａｔｏＢ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の酵素に関連する追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、ＮｐｈＴ７、ＳａＦａｂＨ、ＢｓＦａｂＨ、ＰａＦａｂＨ、ＭｔＦａｂＨ、ＦａｂＨ、ＰａＦａｂＧ、ｆａｂＧ、ｈｂｄ、ｃｒｔ、ｅｃｈ、ｅｃｈ２、ｔｅｒ、ｃｃｒ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の酵素に関連する追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、異種チオエステラーゼの発現をもたらす追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、任意の特許請求の範囲に係る遺伝子組み換え生物は、ｔｅｓＡ、‘ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｃｉＡ、ｙｂｇＣ、ｙｂｆＦ、ｆａｄＭ、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ（又はＣｐｅｒｆＴＥ）、ＬｐＴＥ、Ｐａ２８０１ＴＥ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種チオエステラーゼを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、異種ワックスエステルシンターゼの発現をもたらす追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、Ｍａｑ１、Ｐｃｒｙ１、Ｒｊｏｓ１、Ａｂｏｒｋ１、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ワックスエステルシンターゼを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、ｐｒｐＥ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、ｐｈａＣ、ＴＨＮＳ、ＴＨＮＳ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種タンパク質の発現をもたらす追加的な遺伝子組み換えを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は微生物である。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は大腸菌（E. Coli）である。
１つの態様では、本開示は、マロニル−ＣｏＡからＣ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸を製造する方法を提供し、当該方法は、形質転換された微生物を炭素給源で培養して遊離脂肪酸を産生させることを含む。
１つの態様では、本開示は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸をマロニル−ＣｏＡから製造する方法を提供し、当該方法は、微生物内でポリペプチドの発現を誘導する工程と、形質転換された微生物を炭素給源で培養して、遊離脂肪酸を産生させる工程と、を含む。
１つの態様では、本開示は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸をマロニル−ＣｏＡから製造する方法を提供し、当該方法は、遺伝子組み換え微生物を準備する工程と、形質転換された微生物を炭素給源で培養して、遊離脂肪酸を産生させる工程と、を含む。
１つの態様では、本開示は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸を製造する方法を提供し、当該方法は、アシル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの産生を増加させるのに十分な条件下で微生物を培養する工程を含む。
１つの態様では、本開示は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸を製造する方法を提供し、当該方法は、マロニル−ＣｏＡとＣ２以上の炭素鎖長のアシル−ＣｏＡの縮合を可能にするのに十分な条件下で微生物を培養する工程を含み、それにより、当該縮合が、Ｃ６以上の鎖長を有するケト−アシル−ＣｏＡ生産物の産生をもたらす。
１つの態様では、本開示は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸を製造する方法を提供し、当該方法は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有するケト−アシル−ＣｏＡ生産物中のケト基を還元するのに十分な条件下で微生物を培養する工程を含み、それにより、Ｃ６以上の炭素鎖長を有するヒドロキシル・アシル−ＣｏＡ生産物が産生される。
１つの態様では、本開示は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸を製造する方法を提供し、当該方法は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有するヒドロキシアシル−ＣｏＡをデヒドラターゼ反応を行ってＣ６以上の炭素鎖長を有するエノイルアシル−ＣｏＡ生産物を産生させるのに十分な条件下で微生物を培養する工程を含む。
１つの態様では、本開示は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸を製造する方法に関し、当該方法は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有するエノイル−アシル−ＣｏＡ生産物のエノイル基を還元してＣ６以上の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡ生産物を産生させるのに十分な条件下で微生物を培養する工程を含む。
１つの態様では、本開示は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸を生産する方法を提供し、当該方法は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡ生産物からＣｏＡ基を削除してＣ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生させるのに十分な条件下で微生物を培養する工程を含む。
１つの態様では、本開示は、マロニル−ＣｏＡからＣ６以上の鎖長の遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を製造する方法を提供し、当該方法は、アシル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの産生を増加させるのに十分な条件下で遺伝子組み換え生物を培養して、遺伝子組み換え生物内でアシル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡとを縮合させて、Ｃ６以上の炭素鎖長を有するケト−アシル−ＣｏＡ生産物を産生させる工程と、ケト−アシル−ＣｏＡ生産物中のケト基を還元して、Ｃ６以上の炭素鎖長を有するヒドロキシル−アシル−ＣｏＡ生産物を産生させる工程と、ヒドロキシル−アシル−ＣｏＡ生産物に対してデヒドラターゼ反応を実施し、Ｃ６以上の炭素鎖長を有するエノイル−アシル−ＣｏＡ生産物を産生させる工程と、エノイル−アシル−ＣｏＡ生産物のエノイル基を還元してＣ６以上の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡ生産物を産生させる工程と、アシル−ＣｏＡ生産物からＣｏＡ基を除去して、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生させる工程と、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物によって産生される遊離脂肪酸の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、Ｃ６以上の炭素鎖長を含む。いくつかの実施形態では、方法は、野生型ＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔの変異を有するＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖの変異を有するＮｐｈＴ７、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと；異種ｆａｄＢ；異種ｔｅｒ；並びに／又は、ｙｃｉＡ及びＰＡ２８０１ＴＥからなる群から選択される１つ又は２つ以上のチオエステラーゼ、のうちの少なくとも１つと、を含む遺伝子組み換え生物を培養することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物によって産生される遊離脂肪酸の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、Ｃ８以上の炭素鎖長を含む。いくつかの実施形態では、方法は、野生型ＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔの変異を有するＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖの変異を有するＮｐｈＴ７、シンターゼＩＩＩ、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと；ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＫＣＲ；ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３ＨＤｈ；異種ｔｅｒ；並びに／又は、ｔｅｓＡ、ｙｃｉＡ、ＰＡ２８０１ＴＥ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のチオエステラーゼ、のうちの少なくとも１つと、を含む遺伝子組み換え生物を培養することを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物によって産生される遊離脂肪酸の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、Ｃ１０以上の炭素鎖長を含む。いくつかの実施形態では、方法は、野生型ＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔの変異を有するＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖの変異を有するＮｐｈＴ７、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと；ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＫＣＲ；ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３ＨＤｈ；異種ｔｅｒ；並びに／又は、ｔｅｓＡ、ＡＴＴＥ、ＹｂｇＣ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のチオエステラーゼ、のうちの少なくとも１つと、を含む遺伝子組み換え生物を培養することを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物によって産生される遊離脂肪酸の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、Ｃ１２の炭素鎖長を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、野生型ＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔの変異を有するＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖの変異を有するＮｐｈＴ７、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ、シンターゼＶＩ、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと；ｆａｄＢ、ｆａｂＧ、ｆａｄＪ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＫＣＲ；ｆａｄＢ、ｆａｄＪ、ｅｃｈ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３ＨＤｈ；異種ｔｅｒ；並びに／又はｔｅｓＡ、ｙｂｇＣ、ｙｂＦＦ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のチオエステラーゼ、のうちの少なくとも１つと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物によって産生される遊離脂肪酸の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％は、Ｃ１４又はＣ１６の炭素鎖長を含む。いくつかの実施形態では、方法は、野生型ＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔの変異を有するＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖの変異を有するＮｐｈＴ７、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ、シンターゼＶＩ、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと；ｆａｄＢ及びｆａｄＪからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＫＣＲ；ｆａｄＢ及びｆａｄＪからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３ＨＤｈ；ｔｅｒ、ｙｄｉＯ及びｆａｄＥからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種ＥｎＣＲ；並びに／又は、ｔｅｓＡ、ｆａｄＭ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のチオエステラーゼ、のうちの少なくとも１つと、を含む遺伝子組み換え生物を培養することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＮｐｈＴ７、ＫＣＲ、３ＨＤｈ及びＥｎＣＲを用いる反応を含むサイクルを更に含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８又は９サイクル行われ、ＮｐｈＴ７、ＫＣＲ、３ＨＤｈ及び／又はＥｎＣＲのうちの少なくとも１つは修飾されている。
１つの態様では、本開示は、遺伝子組み換え生物から産生される遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。
１つの態様では、本開示は、本開示に係る方法によって産生される遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。いくつかの実施形態では、脂肪酸誘導体は、脂肪族アルコール、脂肪族アミド、脂肪族エステル、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルケン、脂肪族アルカン又は脂肪二塩基酸であり、各々置換されているか又は非置換である。
１つの態様では、本開示は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する脂肪酸を製造するための、遺伝子組み換え生物の使用を提供する。
１つの態様では、本開示は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体の産生システムを提供し、当該システムは、１つ又は２つ以上の遺伝子組み換え生物及び／又は修飾ポリペプチドと、１つ又は２つ以上の遺伝子組み換え生物を培養するために構成されたインキュベーターと、を含む。いくつかの実施形態では、システムは、炭素給源を含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、システムは、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を精製するための精製システムを含む。いくつかの実施形態では、システムは、遺伝子組み換え生物の少なくとも２つの株を含む。いくつかの実施形態では、システムは、遺伝子組み換え生物の少なくとも３つの株を含む。いくつかの実施形態では、システムは、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ又はそれ以上の力価で、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、システムは、Ｃ６以上の炭素鎖を含む遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を約０．５ｇ／Ｌ以上の濃度で産生できる。いくつかの実施形態では、システムは、Ｃ１２炭素鎖を含む遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を約０．７ｇ／Ｌ以上の濃度で産生できる。いくつかの実施形態では、システムは、Ｃ１４炭素鎖を含む遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を約０．７ｇ／Ｌ以上の濃度で製造できる。いくつかの実施形態では、システムは、Ｃ１６炭素鎖を約０．８ｇ／Ｌ以上の濃度で含む遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を製造できる。いくつかの実施形態では、システムは、約０．１２５ｇ／ｇ、約０．１６ｇ／ｇ又はそれ以上で遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を製造できる。いくつかの実施形態では、システムは混合装置を更に備える。いくつかの実施形態では、システムは、加熱装置を更に備え、インキュベーターは、加熱装置を備える。いくつかの実施形態では、システムはリザーバーを更に備える。いくつかの実施形態では、システムはポンプを更に備える。いくつかの実施形態では、システムでは、リザーバーがインキュベーターに機能的に連結され、ポンプは、リザーバーからインキュベーターへ材料をポンプで送るように機能的に設置される。いくつかの実施形態では、システムは溶解装置を更に備える。いくつかの実施形態では、システムは抽出装置を更に備える。いくつかの実施形態では、システムは蒸留装置を更に備える。
１つの態様では、本発明は、クロストリジウム（Clostridium）、ザイモモナス（Zymomonas）、大腸菌（Escherichia）、サルモネラ（Salmonella）、ロドコッカス（Rhodococcus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、バチルス（Bacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、エンテロコッカス（Enterococcus）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、クレブシエラ（Klebsiella）、パエニバチルス（Paenibacillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、ピチア（Pichia）、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hansenula）、スラウストキトリッド（Thraustochytrids）、バクテリオファージ（Bacteriophage）又はサッカロミセス（Saccharomyces）である、遺伝子組み換え生物を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は原核細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は真核細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は酵母細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は真菌細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は微細藻類細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は藻類細胞である。
１つの態様では、本開示は、Ｃ６炭素源を含む炭素源を提供する。いくつかの実施形態では、炭素源はＣ３炭素源を含む。いくつかの実施形態では、炭素源は１つ又は２つ以上のセルロース糖を含む。いくつかの実施形態では、炭素源は、グルコース、スクロース、フルクトース、デキストロース、ラクトース、キシロース又はそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、炭素源は、グリセロールの約５０質量％未満、約４０質量％未満、約３０質量％未満、約２０質量％未満、約１０質量％未満又は約５質量％未満を含む。
１つの態様では、本開示は、遺伝子組み換え生物を含むバイオマスを提供する。いくつかの実施形態では、バイオマスは溶解した遺伝子組み換え生物を含む。いくつかの実施形態では、バイオマスは修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、バイオマスは修飾ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、バイオマスはポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バイオマスは遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を含む。いくつかの実施形態では、バイオマスは脱水されている。
１つの態様では、本開示は、遺伝子組み換え生物を含むブロスを提供する。１つの態様では、本開示は、溶解した遺伝子組み換え生物を含むブロスを提供する。１つの態様では、本開示は、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを含むブロスを提供する。１つの態様では、本開示は、修飾ポリペプチドを含むブロスを提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るポリヌクレオチドを含むブロスを提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係る遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を含むブロスを提供する。
１つの態様では、本開示は、Ｃ４の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡを約１５質量％〜５０質量％含む、アシル−ＣｏＡ生産物を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ６の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡを約４０質量％〜５０質量％含む、アシル−ＣｏＡ生産物を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ８の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡを約５質量％〜３０質量％含む、アシル−ＣｏＡ生産物を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ１２の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡを約１質量％〜２０質量％含む、アシル−ＣｏＡ生産物を提供する。１つの態様では、本開示は、アシル−ＣｏＡ生産物を提供し、Ｃ４の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、Ｃ６の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、Ｃ８の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、Ｃ１２の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、の質量比は約２：４：２：１である。１つの態様では、本開示は、アシル−ＣｏＡ生産物を提供し、Ｃ４の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、Ｃ６の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、Ｃ８の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、の質量比は約７：８：１である。１つの態様では、本開示は、アシル−ＣｏＡ生産物を提供し、Ｃ１の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、Ｃ６の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、Ｃ８の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、Ｃ１２の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、の質量比は約２：４：１：１である。２つの態様では、本開示は、アシル−ＣｏＡ生産物を提供し、Ｃ３の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、Ｃ６の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、Ｃ８の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、Ｃ１２の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、の質量比は約８：４：１：１である。いくつかの実施形態では、アシル−ＣｏＡ生産物は、３−ケトアシル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ及びエノイル−ＣｏＡからなる群から選択される。
１つの態様では、本開示は、Ｃ４の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を約１５質量％〜５０質量％含む、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ６の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を約４０質量％〜５０質量％含む、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ８の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を約５質量％〜３０質量％含む、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ１２の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を約１質量％〜２０質量％含む、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ４の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ６の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ８の炭素鎖長を有するを遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ１２の炭素鎖長を有するアシル−ＣｏＡと、の質量比が約２：４：２：１である、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ４の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ６の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ８の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、の質量比約７：８：１である、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ４の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ６の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ８の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ１２の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、の質量比が約２：１：１：１である、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。２つの態様では、本開示は、Ｃ４の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ６の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ８の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ１２の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、の質量比が約８：３：１：１である、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ１４の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を約１６質量％以上含む、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ１６の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を約２０質量％以上含む、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ１４又はＣ１６の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を約３６質量％以上含む、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ１４又はＣ１６の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を約６０％質量以上含む、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、Ｃ４の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ６の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は遊離脂肪酸誘導体と、Ｃ８の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ１０の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ１２の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ１４の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸と、Ｃ１６の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、Ｃ１８の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体と、の質量比が、約１０：２０：１２：７：８：１６：２０：７又は約１：２：１：１：１：２：２：１である、遊離脂肪酸又は脂肪酸誘導体を提供する。１つの態様では、本開示は、単離及び精製された、アシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を提供する。
１つの態様では、本開示は、脂肪族エステル、脂肪族アミド、脂肪族アルコール、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルケン、脂肪族アルカン、脂肪二塩基酸、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の脂肪酸誘導体の製造方法を提供し、当該方法は、微生物と炭素源とを接触させてＣ６以上の炭素鎖長を有する遊離脂肪酸を形成する工程と、遊離脂肪酸を脂肪酸誘導体に変換する工程と、を含み、脂肪酸誘導体は、Ｃ６以上の炭素鎖長を有する。１つの態様では、本開示は、遺伝子組み換え生物によって産生される脂肪酸をエステル化する工程を含む、脂肪酸エステルの製造方法を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係る遺伝子組み換え生物によって産生される脂肪酸のアミドを形成することを含む、脂肪酸アミドの製造方法を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係る遺伝子組み換え生物によって産生される脂肪酸から脂肪族アルコールを形成する工程を含む、脂肪族アルコールの製造方法を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係る遺伝子組み換え生物によって産生される脂肪酸のアルデヒドを形成する工程を含む、脂肪酸アルデヒドの製造方法を提供する。
１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含む燃料を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含むローション剤を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含む石鹸を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含む食物を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含むクリームを提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含むシャンプーを提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含むコンディショナーを提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含む洗剤を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含む界面活性剤を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含む潤滑剤を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含む塗料を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含む染色剤を提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含むインクを提供する。１つの態様では、本開示は、本開示に係るアシル−ＣｏＡ生産物、遊離脂肪酸生産物又は脂肪酸誘導体を含む医薬製剤を提供する。いくつかの実施形態では、生産物は１つ又は２つ以上の活性物質を更に含む。いくつかの実施形態では、生産物は賦形剤を更に含む。
１つの態様では、本開示は、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケト−ＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡレダクターゼ及びチオエステラーゼを含むタンパク質をコードする外来の核酸分子を含む、１つ又は２つ以上の単離及び精製されたポリヌクレオチドを提供し、３−ケトアシルＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ並びにシンターゼＶＩからなる群から選択され、ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｈｂｄ、ｆａｄＢ、ｆａｂＧ及びｆａｄＪからなる群から選択され、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｃｒｔ、ｅｃｈ、ｆａｄＢ及びｆａｄＪからなる群から選択され、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒ、ｙｄｉＯ及びｆａｄＥからなる群から選択され、並びにチオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ（又はＣｐｅｒｆＴＥ）、ｆａｄＭ、ＬｐＴＥ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７であり、ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｈｂｄ及びｆａｄＢからなる群から選択され、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｃｒｔ及びｆａｄＢからなる群から選択され、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり、並びにチオエステラーゼは、ｙｃｉＡであり、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数４の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７であり、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数４の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｈｂｄ及びｆａｄＢからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数４の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｃｒｔ及びｆａｄＢからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数４の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、エノイル−ＣｏＡレダクターゼはｔｅｒであり、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数４の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＣｐＴＥ、ｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＢ、ｙｂｇＣ、ｙｂｆＦ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数４の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数４の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、（ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ）、（ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ）並びに（ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ）からなる群から選択され、ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢであり、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢであり、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり、チオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ（又はＣｐｅｒｆＴＥ）、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数６の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＢ、及びｙｃｉＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、（ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ）、（ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ）並びに（ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ）からなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数６の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、ケト−ＣｏＡレダクターゼはｆａｄＢであり、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数６の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢであり、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数６の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数６の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ（又はＣｐｅｒｆＴＥ）、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数６の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数６の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ並びにシンターゼＩＩＩからなる群から選択され、ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択され、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択され、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり、チオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ（又はＣｐｅｒｆＴＥ）、ｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数８の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＢ、及びｙｃｉＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ並びにシンターゼＩＩＩからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数８の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数８の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数８の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、エノイル−ＣｏＡレダクターゼはｔｅｒであり、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数８の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ（又はＣｐｅｒｆＴＥ）、ｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数８の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数８の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ並びにシンターゼＶからなる群から選択され、ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択され、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択され、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり、並びにチオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１０の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ並びにシンターゼＶからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１０の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１０の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１０の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１０の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１０の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１０の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ並びにシンターゼＶＩからなる群から選択され；ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ、ｆａｂＧ及びｆａｄＪからなる群から選択され、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｆａｄＪからなる群から選択され；エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり；チオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ＣｐｅｒｆＴＥ、ｆａｄＭ、ＬｐＴＥ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１２の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼはｆａｄＭ、ＰＡ２８
０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ並びにシンターゼＶＩからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１２の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ、ｆａｂＧ及びｆａｄＪからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１２の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｆａｄＪからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１２の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒであり、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１２の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ（又はＣｐｅｒｆＴＥ）、ｆａｄＭ、ＬｐＴＥ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１２の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１２の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ及びシンターゼＶＩからなる群から選択され、ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ及びｆａｄＪからなる群から選択され、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ及びｆａｄＪからなる群から選択され、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒ、ｙｄｉＯ及びｆａｄＥからなる群から選択され、並びにチオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ（又はＣｐｅｒｆＴＥ）、ｆａｄＭ、ＬｐＴＥ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、少なくとも炭素数１４の炭素鎖長の脂肪酸を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ｆａｄＭ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１４の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ（又はＣｐｅｒｆＴＥ）、ｆａｄＭ、Ｐａ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１６の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ｆａｄＭ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１６の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７ Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７ Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７ Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ並びにシンターゼＶＩからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１４以上の炭素鎖長の脂肪酸を産生できる。いくつかの実施形態では、ケト−ＣｏＡレダクターゼは、ｆａｄＢ及びｆａｄＪからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１４以上の炭素鎖長の脂肪酸を産生できる。いくつかの実施形態では、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、ｆａｄＢ及びｆａｄＪからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１４以上の炭素鎖長の脂肪酸を産生できる。いくつかの実施形態では、エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、ｔｅｒ、ｙｄｉＯ及びｆａｄＥからなる群から選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１４以上の炭素鎖長の脂肪酸を産生できる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ（又はＣｐｅｒｆＴＥ）、ｆａｄＭ、ＬｐＴＥ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ及びｙｃｉＡからなる群選択され、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１４以上の炭素鎖長の脂肪酸を産生できる。
１つの態様では、本発明は、アリシェワネラ・エスツアリイ（Alishewanella aestuarii）Ｂ１１、アーコバクター・ブツレリ（Arcobacter butzleri）ＥＤ−１、クロストリジアレス・バクテリウム（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７＿ＦＡＡ、グルコナセトバクター・オボエジエンス（Gluconacetobacter oboediens）１７４Ｂｐ２、ゴルドニア・アイキエンシス（Gordonia aichiensis）ＮＢＲＣ １０８２２３、メソリゾビウム種（Mesorhizobium）ｓｐ．ＳＴＭ ４６６１、ペロシヌス・ファーメンタンス（Pelosinus fermentans）ＤＳＭ １７１０８、フェオバクター・ガラエシエンシス（Phaeobacter gallaeciensis）２．１０、ラルストニア・ソラナセアルム（Ralstonia solanacearum）Ｐｏ８２、サッカロモノスポラ・アズレア（Saccharomonospora azurea）ＮＡ−１２８、サッカロモノスポラ・グラウカ（Saccharomonospora glauca）Ｋ６２、及びベルコシスポラ・マリス（Verrucosispora maris）ＡＢ−１８−０３２からなる群から選択される種由来の３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩを含むタンパク質をコードする外来の核酸分子を含む１つ又は２つ以上の単離及び精製されたポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、脂肪酸を産生できる。いくつかの実施形態では、３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩは、ペロシヌス・ファーメンタンスＤＳＭ １７１０８、サッカロモノスポラ・グラウカＫ６２、ベルコシスポラ・マリスＡＢ−１８−０３２及びクロストリジアレス・バクテリウム１＿７＿４７＿ＦＡＡからなる群から選択される種に由来し、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、アセチル−ＣｏＡを産生できる。いくつかの実施形態では、３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩは、サッカロモノスポラ・グラウカＫ６２、サッカロモノスポラ・アズレアＮＡ−１２８、メソリゾビウムＳＴＭ ４６６１及びクロストリジアレス・バクテリウム１＿７＿４７＿ＦＡＡからなる群から選択される種に由来し、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数４の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩは、ゴルドニア・アイキエンシスＮＢＲＣ １０８２２３、アーコバクター・ブツレリＥＤ−１、クロストリジアレス・バクテリウム１＿７＿４７＿ＦＡＡ、サッカロモノスポラ・グラウカＫ６２及びラルストニア・ソラナセアルムＰｏ８２からなる群から選択される種に由来し、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数６の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩは、ゴルドニア・アイキエンシスＮＢＲＣ １０８２２３、グルコナセトバクター・オボエジエンス１７４Ｂｐ２、アーコバクター・ブツレリＥＤ−１、ラルストニア・ソラナセアルムＰｏ８２及びフェオバクター・ガラエシエンシス２．１０からなる群から選択される種に由来し、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数８の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩは、アリシェワネラ・エスツアリイＢ１１に由来し、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１０の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、ストレプトマイセス種（ＣＬ１９０株）に由来する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを更に含む。
参照による援用：
本明細書に記載する全ての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも個々の発行、特許又は特許出願が参照によって援用されると具体的かつ個別的に示されたのと同程度に、参照によって援用される。本明細書の用語と援用された引用文献の用語が不一致の場合は、本明細書の用語を優先する。
脂肪酸及び脂肪酸誘導体を製造するのに用いられる油脂化学的な原料における炭素鎖長分布を示すチャートである。
本発明の様々な完全な生合成経路を例示するダイアグラムであり、様々な炭素源のＣ１０脂肪酸又はＣ１０脂肪族エステルへの変換の代表的な例を示す。
プライマーとしてのアセチル−ＣｏＡと、伸長分子としてのマロニル−ＣｏＡ（ＭＣＡ）と、を使用した、偶数炭素鎖脂肪酸の産生を表すダイアグラムである。
プライマーとしてのアセチル−ＣｏＡと、伸長分子としてのマロニル−ＣｏＡ（ＭＣＡ）と、を使用した、偶数炭素鎖鎖脂肪酸エステルの産生を表すダイアグラムである。
プライマーとしてのプロピオニル−ＣｏＡと、伸長分子としてのマロニル−ＣｏＡ（ＭＣＡ）と、を使用した、奇数炭素鎖脂肪酸の産生を表すダイアグラムである。
プライマーとしてのプロピオニル−ＣｏＡと、伸長分子としてのマロニル−ＣｏＡ（ＭＣＡ）と、を使用した、奇数炭素鎖脂肪酸エステルの産生を表すダイアグラムである。
本発明に係る様々な一連の反応経路である。
本発明に係る様々な一連の反応経路である。
本発明に係る様々な一連の反応経路である。
本発明に係る様々な一連の反応経路である。
本発明に係る様々な一連の反応経路である。
本発明に係る様々な一連の反応経路である。
本発明に係る様々な一連の反応経路である。
本発明に係る様々な一連の反応経路である。
ＮｐｈＴ７誘導体及びＮｐｈＴ７変異体がマロニル−ＣｏＡと、Ｃ４−、Ｃ６−又はＣ１０−ＣｏＡに作用し（１００μｇ、３０分のアッセイ）、ＰａＦａｂＧヒドロキシアシル−ＣｏＡレダクターゼの存在下で、対応するＣ６−、Ｃ８−又はＣ１２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを生成することによって産生されたアシル−ＣｏＡ生産物の形成を表す棒グラフである。
異なる炭素鎖長のアシル−ＣｏＡ基質に対するチオエステラーゼの活性を表す棒グラフである。
異なる細菌株で産生されたＣ８〜Ｃ１８遊離脂肪酸の産生率を表す棒グラフである。
異なる細菌株で産生されたＣ６〜Ｃ１８遊離脂肪酸の力価を表す棒グラフである。
株サンプル３で産生された遊離脂肪酸の鎖長特異性分布を表す円グラフである。
異なる３ＨＤｈの鎖長特異性選好性を表す棒グラフである。
本発明に係る様々な微生物によって産生される脂肪酸の炭素鎖長の分布を表すグラフである。
本発明に係る様々な微生物によって産生される脂肪酸の炭素鎖長の分布を表す一連の円グラフを含む。
本発明に係る様々な遺伝子組み換え微生物によって産生されるＣ４、Ｃ６及びＣ８遊離脂肪酸の量を表す棒グラフである。
本発明に係る様々な遺伝子組み換え微生物によって産生される総脂肪酸（Ｃ４〜Ｃ１８）の量を表す棒グラフである。
本発明に係る様々な遺伝子組み換え微生物によって産生される遊離脂肪酸の分布を表す一連の円グラフを含む。
細菌が利用するＩＩ型脂肪酸合成（ＦＡＳ）システムと類似する経路を利用する、４ステップを含む脂肪酸経路を表す。両方の脂肪酸合成を、図２６に示す。Ａ：ステップ１では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが、マロニル−ＣｏＡとアシル−ＣｏＡ（又は鎖伸長の最初のステップではアセチル−ＣｏＡ）の縮合を触媒して、β−ケトアシル−ＣｏＡを産生する。その後のステップでは、β−ケトアシル−ＣｏＡはβ−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼによって還元され（ステップ２）、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼにより脱水され（ステップ３）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼによる最終的な還元を受ける（ステップ４）。反応を繰り返し、各サイクルでは２つの炭素がアシル−ＣｏＡ鎖に付加される。（Ｂ）ＩＩ型ＦＡＳシステム：脂肪酸合成は、アセチル−ＣｏＡとマロニル−ＡＣＰの縮合を触媒して、β−ケトアシル−ＡＣＰを産生するβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳＩＩＩ）（ステップ１ａ）によって開始する。その後のステップでは、β−ケトアシル−ＡＣＰは、ＣｏＡ特定的経路と類似の還元（ステップ２）、脱水（ステップ３）及び還元（ステップ４）を受ける。更なる伸長ステップは、アシルＡＣＰとマロニル−ＡＣＰとの縮合を触媒するＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＩによって開始される（ステップ１ｂ）。図２７では、新規ＣｏＡ依存的脂肪酸経路、及びそれに関連する鍵となる酵素を表す。
新規ＣｏＡ依存的脂肪酸経路、及びそれに関連する鍵となる酵素を表す。
１つ又は２つ以上の本発明の実施形態の詳細を、本願に添付の図面、特許請求の範囲及び明細書において記述する。明確に除外されない限り、本明細書に開示され、考察される本発明の実施形態以外の特徴、課題及び効果は、他のいかなる実施形態と組み合わせてもよい。
本発明は、概略的には、様々な化学生産物を発酵生産させるために有用性を有する様々な製造方法及び／又は遺伝子組み換え微生物、これらの微生物集団を容器中で利用した、かかる化学生産物の製造方法、並びに、これらの微生物及び方法を使用した化学的製造システムに関する。本発明の利点は、かかる微生物が発酵事象又は発酵サイクルの間に化学生産物を生産するとき、特異的生産性が向上することである。
本発明は、関心対象の化学生産物（例えば脂肪酸又は脂肪酸誘導体）の製造のための、製造技術及び／又は遺伝子組み換え微生物を提供する。本発明は、産生経路が基質としてマロニル−ＣｏＡを使用する酵素変換ステップを含むマロニル−ＣｏＡ依存的経路を含む、マロニル−ＣｏＡから脂肪族アシル分子への変換を調節する、１つ又は２つ以上の手段を提供する。特定の実施形態では、マロニル−ＣｏＡ依存的経路はまた、マロニル−ＡＣＰ非依存的経路でもあり、微生物固有のマロニル−ＡＣＰ依存的脂肪酸シンターゼ経路の阻害と組み合わせて用いられる。本発明の特定の他の実施形態では、脂肪酸又は脂肪酸誘導体は、マロニル−ＣｏＡ依存的経路とマロニル−ＡＣＰ依存的経路の両方に依存する方法で産生される。
本発明の遺伝子組み換え微生物は、少なくとも部分的にマロニル−ＣｏＡ依存的である代謝経路を通して、脂肪酸又は脂肪酸誘導体の産生のためのマロニル−ＣｏＡの利用を増加させるように代謝的に操作されている。脂肪酸誘導体は、様々な程度の脱飽和及び鎖分枝を有するエステル、アルデヒド、アルコール、アルカン、アルケン及び二塩基酸を含んでもよく、更にかかる化学生産物から形成される下流の生産物を含んでもよい。また、遺伝子組み換えは、１つ又は２つ以上の化学生産物を提供するように行われ得る。
本発明はまた、マロニル−ＣｏＡ依存的経路で特定の鎖長の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生するように機能するユニークな酵素及び酵素の組合せをコードする遺伝子組み換え微生物にも関する。微生物及び方法は、特定の鎖長を有するか、又は、比較的狭い炭素鎖長分布を示す（すなわち、例えばＣ８／Ｃ１０又はＣ８／Ｃ１０／Ｃ１２などの、異なる炭素鎖長のものが２、３、４又は５つ未満で脂肪酸生産物中に存在する）、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を、比較的高濃度でを製造するための、価格競争力のある手段を提供するものである。
Ｉ．定義／命名法
特に明記しない限り、本明細書で用いられる「含有する」「含有している」、「含む」、「含んでいる」等の用語は、含む（comprising）の意味を有する。
本発明のいくつかの実施形態では、数値範囲を考察する。数値範囲が提供されるとき、当該範囲は、範囲の両端の値を含む。当該数値範囲は、あたかも明確に記載されたかのように、全ての値及びその中間範囲を含む。
本明細書では、明確に定義されない限り、「ａ」（不定冠詞）は１つ又は２つ以上のことを意味する。
１文字省略形Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹとＶは、本明細書で特に明記しない限り、天然に合成されるペプチド中に通常存在する２０個のアミノ酸を表す。
特に明記しない限り、本明細書のポリペプチドに対して文字１−数字−文字２が適用されるとき、１文字表記の文字１のアミノ酸が、ポリペプチドの数字の位置で、１文字表記の文字２のアミノ酸で置換されることを意味する。例えば、Ｉ１４７Ｔは、アミノ酸Ｉ（ペプチド位置１４７に存在）がアミノ酸Ｔで置換されることを意味する。
特に明記しない限り、本明細書で使用される記号Ｃ数字は、表記の炭素原子数を有する炭素骨格鎖長を意味する。例えば、Ｃ２０は２０の炭素鎖長を有する化学骨格を意味する。炭素骨格に含まれる炭素数は、骨格に結合する官能基単位（例えば、脂肪酸誘導体の官能基単位）に含まれる炭素を含まないことに注意すべきである。
本明細書で用いられる「低下した酵素活性」、「酵素活性を低下させる」、「減少した酵素活性」、「酵素力を減少させる」等は、微生物細胞の又は単離された酵素が、同じ種の相当する細胞又はその天然の酵素で測定される活性よりも低い活性レベルを示すことを表すことを意味する。すなわち、その酵素の既知の標準状態において表記の基質から表記の生産物への酵素的変換が、明記された標準的な条件下において、天然の（非修飾の）酵素による同じ生化学的変換の酵素活性より、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％小さいことを表す。これらの用語はまた、その酵素活性の消失を含み得る。酵素活性の減少は、例えば遺伝子破壊又は遺伝子欠失など、様々な、当業者に公知の方法により実施できる。酵素活性の減少は、一時的であってもよく、様々な遺伝的要素の発現を通して制御されてもよく、又は細胞の培養条件に反応して減少させてもよい。酵素活性が低下した細胞は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して同定できる。例えば、酵素活性アッセイを用いて、酵素活性が低下した細胞を同定できる。例えば、Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２００７参照。
本明細書において用いられる「酵素活性を増加させる」、「酵素活性を増加させること」などの用語は、微生物細胞の又は単離された酵素が、同じ種の相当する細胞又はその天然の酵素で測定される活性よりも高い活性レベルを示すことを表すことを意味する。すなわち、その酵素の既知の標準状態において表記の基質から表記の生産物への酵素的変換が、明記された標準的な条件下において、天然の（非修飾の）酵素による同じ生化学的変換の酵素活性より、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％大きいことを表す。これらの用語はまた、外来の酵素活性の添加を含んでもよい。酵素活性の増加は、一時的であってもよく、様々な遺伝的要素の発現を通して制御されてもよく、又は細胞の培養条件に反応して減少させてもよい。酵素活性が増加した細胞は、酵素活性が低下した細胞を同定するのに用いられた、上記の酵素活性アッセイを含む当技術分野で公知のいかなる方法を使用しても特定できる。
本明細書で用いられる「遺伝子破壊」という用語又はその文法的同等語（「酵素機能を破壊する」、「酵素機能の破壊」などを含む）は、そのような修飾を有さない微生物細胞中の又は微生物細胞からのポリペプチドの活性と比較して、コードされた遺伝子産物のポリペプチド活性を低下させる、微生物に対する遺伝子組み換えを意味すると意図される。遺伝子組み換えは、例えば、遺伝子全体の欠失、転写又は翻訳に必要な制御配列の欠失若しくは他の修飾、切断された遺伝子産物（例えば酵素）を生じさせる遺伝子の一部の欠失、又は、コードされた遺伝子産物の活性（検出不可能な活性レベルを含む）を減少させる様々な任意の突然変異ストラテジーのいずれかであり得る。遺伝子破壊は広義には、酵素をコードする核酸配列の全部又は一部の欠失を含んでもよく、また他のタイプの遺伝子組み換え（例えば、終止コドンの導入、フレームシフト変異、遺伝子の部分の導入又は除去）並びに分解シグナルの導入、ｍＲＮＡ転写レベル及び／又は安定性に影響を及ぼす遺伝子組み換え、酵素をコードする遺伝子の上流のプロモーター又はリプレッサーの変更を含むが、これに限定されるものではない。
様々な状況を踏まえると、遺伝子破壊とは、ポリペプチド活性の低下をもたらす、ＤＮＡ、ＤＮＡからコードされるｍＲＮＡ、及び対応するアミノ酸配列に対するあらゆる遺伝子組み換えを意味すると解される。様々な方法を用いて、ポリペプチド活性が低下した細胞を作製することができる。例えば、一般的な突然変異導入又はノックアウト技術を使用して、制御配列又はポリペプチドコード配列が破壊された細胞を工学操作できる。例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７），Ａｄａｍｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照。遺伝子破壊の１つの特に有用な方法は、本発明の遺伝子組み換え微生物での遺伝子の復帰変異の発生を低下又は除去する理由から、完全な遺伝子欠失である。したがって、生産物が酵素である遺伝子の破壊は、それによって酵素機能を破壊する。あるいは、アンチセンス技術を用いて、特定のポリペプチドの活性を低下させることができる。例えば、ポリペプチドが翻訳されるのを防止するアンチセンス分子をコードするｃＤＮＡを含むよう、細胞を工学操作することができる。更に、遺伝子サイレンシングを用いて、特定のポリペプチドの活性を低下させることができる。
「異種である」という用語は、一般的に当技術分野で用いられる「外来である」という用語を含むと意図される。異種である、とは、宿主細胞によって通常産生されないポリペプチド及び／又は核酸を意味し得る。すなわちかかる異種ポリペプチド及び／若しくは核酸には、宿主細胞によって産生されるタンパク質と実質的な相同性を有するアミノ酸配列相動性を有しないか、又は、宿主細胞若しくは宿主細胞が由来する細胞株によって産生されるタンパク質と自室的な、しかし不完全な相同性を有するポリペプチドを含む、ポリペプチドが含まれ得る。
本明細書で用いられる用語「異種ＤＮＡ」、「異種核酸配列」等は、以下のうちの少なくとも１つが当てはまる核酸配列のことを指す：（ａ）核酸の配列が、所定の宿主微生物に対して外来である（すなわち、天然に存在しない）；（ｂ）配列が、所定の宿主微生物に天然に存在し得るが、非天然的な量（例えば、予想されるより多い）又は位置で存在する；又は、（ｃ）核酸の配列が、天然での互いの関係と同じ関係で見いだされない２つ以上のサブ配列を含む。例えば、ケース（ｃ）の例としては、組み換えによって産生される異種核酸配列は、新しい機能的核酸を作製するように配置された無関係な遺伝子に由来する２つ以上の配列を有する。
本明細書で用いられる「アンチセンス分子」という用語は、内因性のポリペプチドのコード鎖に対応する配列を含むあらゆる核酸分子又は核酸類似体（例えばペプチド核酸）を含む。アンチセンス分子はまた、隣接配列（例えば制御配列）を有し得る。このように、アンチセンス分子は、リボザイム又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
本明細書において用いられるリボザイムは、分子がＲＮＡを切断する限り、ヘアピン、ハンマーヘッド又はアックスヘッド（斧頭）構造など、特に限定されない、任意の一般構造を有し得る。
本明細書において用いられるバイオプロダクションは、好気的であってもよく、微好気的であってもよく、嫌気的であってもよい。
本明細書において用いられる「十分に相同な」という用語は、本願に提供されるアミノ酸配列（配列番号／配列表を含む）と比較したときに、最小限の数の同一又は同等のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質又はその部分であって、それぞれの酵素反応及び／又は他の機能を発揮できるタンパク質又はその部分のことを指す。特定のタンパク質又はその部分が十分に相同か否かについての決定は、当技術分野で一般的に公知のアッセイなどの酵素活性アッセイによって測定され得る。
配列同一性及び相同性に関する説明及び方法は、例示的なものであると意図され、これらの概念は当技術分野で十分理解されていると認識される。更に、核酸配列は変化してもよく、それでもなお所望の機能性を示す酵素又は他のポリペプチドをコードし得ると認識され、かかる変動も本発明の範囲内である。
更に、核酸配列に関して「ハイブリダイゼーション」とは、２つの一本鎖のポリヌクレオチドが非共有結合的に結合して、安定な二本鎖のポリヌクレオチドを形成するプロセスを指す。「ハイブリダイゼーション」という用語は、３重鎖のハイブリダイゼーションを指すこともある。得られる（通常の）二本鎖のポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」又は「二重鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的に約１Ｍ未満、より一般には約５００ｍＭ未満、あるいは約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃もの低い温度であってもよいが、典型的には２２℃超より典型的には約３０℃超、多くの場合約３７℃超である。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件（すなわちプローブがその標的サブ配列にハイブリダイズする条件）下で行われる。ストリンジェントな条件は、配列依存的で、状況が異なれば異なる。長い断片は、特異的なハイブリダイゼーションのために、より高いハイブリダイゼーション温度が必要となり得る。他の要因（塩基組成及び相補鎖の長さ、有機溶媒の存在及び塩基ミスマッチングの程度を含む）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るため、パラメータの組合せは、そのいずれか１つの単独の絶対測定よりも重要である。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びｐＨにおいて、特定の配列のＴｍ値（ＤＮＡの半分が一本鎖の（変性した）形状で存在する温度）よりも約５℃低い温度となるように選択される。例示的なストリンジェント条件は、ｐＨ ７．０〜８．３、及び少なくとも２５℃の温度で、少なくとも０．０１Ｍの塩濃度〜１Ｍ以下のＮａイオン（又は他の塩）濃度を含む。例えば、５ Ｘ ＳＳＰＥ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸Ｎａ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）の条件及び２５〜３０℃の温度は、アレル特異的なプローブハイブリダイゼーションに適する。ストリンジェントな条件については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１ｓｔ Ｅｄ．，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９９）を参照すべきであり、そのハイブリダイゼーションプロトコルを、参照により本発明に援用する。「．．．に特異的にハイブリダイズ」又は「特異的に．．．にハイブリダイズ」などの表現は、それがＤＮＡ又はＲＮＡの複雑な混合物中（例えば全細胞）に存在するときに、ストリンジェントな条件下で、特定のヌクレオチド配列に対して実質的に又はそれのみに対して分子が結合、二量体形成又はハイブリダイズすることを指す。
フレーズ「関心対象のセグメント」の使用は、関心対象の遺伝子及び関心対象の他の任意の核酸配列部分の両方を含むことを意味する。関心対象のセグメントを得るのに用いられる方法の一例は、微生物の培養物を得ることであり、当該微生物のゲノムには、関心対象の遺伝子又は核酸配列セグメントが含まれる。
遺伝子産物、すなわち酵素の遺伝子組み換えについて、特許請求の範囲を含む本明細書で言及するとき、遺伝子組み換えとは、記載の遺伝子産物、すなわち酵素を通常コードする遺伝子などの、又は遺伝子を含む核酸配列の遺伝子組み換えであると理解される。
いくつかの実施形態では、切断された各々のポリペプチドは、各々の天然の酵素をコードする核酸配列によってコードされるポリペプチドの全長の少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％を有し、より具体的には、各々の天然の酵素をコードする核酸配列によってコードされるポリペプチドの前兆の少なくとも９５％を有する。例えば、ポリペプチドの参照アミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、特許請求されたポリペプチドのアミノ酸配列が、参照配列と同一であって、但し、当該特許請求されたポリペプチド配列が、参照ポリペプチドの１００アミノ酸あたり、最高５個のアミノ酸変異を含み得ることを意図するものである。言い換えると、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基のうち最大５％を、欠失させるか、他のアミノ酸で置換することができ、又は、参照配列の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸を参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシ末端、又は、それらの末端の間の任意の部位で行ってもよく、参照配列中の残基に個々に、又は参照配列内の１つ若しくは２つ以上の隣接する基に介在してもよい。他の実施形態では、本明細書の他の部分で記載するように、切断は、より重要であり得る。
種及び他の系統発生学的同定は、細菌学の当業者に公知の分類方法によって行う。
本明細書に記載の方法及びステップが特定の順序で行われる特定の自称を示すとき、当業者は、特定のステップの順序を変更してもよいこと、及びかかる変更は、本発明の変形態様に従うことを理解し得る。更に、特定のステップは、可能であれば、並行プロセスで同時に実施されてもよく、並びに連続的に実施されてもよい。
略語の意味は、以下の通りである。「℃」は、その使用から明確なように、摂氏温度を意味し、ＤＣＷは乾燥細胞重量を意味し、「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」、「ｈｒ」又は「ｈｒｓ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチあたりのポンドを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」又は「ｕＬ」又は「ｕｌ」は、マイクロリットルを意味し、「ｍＬ」ミリリットルを意味し、「Ｌ」リットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」又は「ｕＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」又は「ｕＭｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」又は「ｕｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ナノメートルの光子波長で測定した光学密度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」キロ塩基対を意味し、「％ ｗ／ｖ」は重量／体積の百分率を意味し、「％ ｖ／ｖ」は重量／体積の百分率を意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「ＲＢＳ」はリボソーム結合部位を意味し、「ｒｐｍ」は回転／分を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し、「ＵＰＬＣ」は超高速液体クロマトグラフィを意味し、及び「ＧＣ」はガスクロマトグラフィを意味する。
「調節するための手段」とは、以下のいずれか１つを意味する：１）微生物細胞に、特定の酵素活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを提供する工程であって、コードされるポリペプチドのかかる酵素活性が、（ａ）外来的であるか、（ｂ）固有であるが、その天然型の酵素活性と比較して酵素活性が低いか若しくは高い（例えば、突然変異及び／若しくはプロモーター置換などによって）、又は（ｃ）発酵プロセスのいずれかの時点で、酵素活性を低下若しくは増加させるように調節する工程（例えば、温度感受性、誘導型プロモーターなどによる）か、又は、２）酵素活性を阻害する阻害剤若しくは酵素活性を増加させるサプリメントを微生物細胞又は細胞集団を含む容器に提供する工程。これらの手段は、互いに組み合わせて行われてもよい。
本明細書において用いられる、「シンターゼＩＩＩ」、「シンターゼＩＶ」、「シンターゼＶ」及び「シンターゼＶＩ」と記載するときは（１つの表中のＦＡＳＴＡヘッダーに含まれる具体的な酵素配列名での使用の場合を除き）、シンターゼ群中に含まれる３、４、５及び６番目のシンターゼのことを指す。シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ及びシンターゼＶＩは、本明細書で開示される任意の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼであり得る。例えば、本明細書においてシンターゼＩＩＩ及びシンターゼＩＶからなる群から選択される３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子組み換え生物と記載するときは、（１）少なくとも３つの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする異種核酸配列を含み、かかる３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのうちの少なくとも１つが、本明細書で開示される３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼである、遺伝子組み換え生物か、又は、（２）少なくとも４つの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする異種核酸配列を含み、かかる３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのうちの少なくとも１つが、本明細書で開示される３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼである遺伝子組み換え生物、のことを指す。
ＩＩ．本発明のバイオプロダクション経路
Ａ．ＣｏＡ依存的経路
本発明は、細菌が利用するＩＩ型脂肪酸合成（ＦＡＳ）システムと類似する経路を利用する４ステップ含む脂肪酸経路に関するものである。両方の脂肪酸合成を、以下のスキーム１に示す。図２６のスキーム１に示されるように、いずれも経路も、１）アシル鎖の縮合、２）縮合生産物の還元、３）脱水、及び４）還元による、炭素原子２個分長いアシル鎖の生成、を必要とする周期的プロセスであり、本プロセスを繰り返すと、各サイクルで更に２つの炭素原子が付加される。２つのプロセスの類似性のため、ＩＩ型ＦＡＳシステムに利用される大部分の酵素は、本発明に係る脂肪酸経路においても機能し得る。しかしながら、アシル部分の鎖伸長に必要となる鍵となるステップは全く異なる。本発明においては、本発明に係る脂肪酸経路の縮合ステップは、とりわけ、マロニル−ＣｏＡとアシル−ＣｏＡとの縮合を触媒するケトアシル−ＣｏＡシンターゼを使用し、一方、ＩＩ型ＦＡＳシステムは、マロニル−ＡＣＰとアシルＡＣＰとの縮合を触媒するケトアシル−ＡＣＰシンターゼを使用する。このタイプのＣｏＡ依存的経路は、長い脂肪酸鎖長への伸長（例えば、Ｃ１４〜Ｃ１６又はそれ以上の伸長）のための経路として、従来知られていた。しかしながら、本発明において、出願人は、スキーム１Ａで示される伸長経路を通じて脂肪酸を産生できる新規遺伝子組み換え微生物を発見し、当該微生物は、この経路を通して、短い炭素鎖長を伸長できる（例えば、Ｃ４からＣ６、Ｃ６からＣ８、Ｃ８からＣ１０、Ｃ１０からＣ１２、及びＣ１２からＣ１４への伸長である）。（なお、β−ケトアシルと３−ケトアシルが同義であることに注意すべきである。）
新規ＣｏＡ依存的脂肪酸経路及びそれに関連する鍵となる酵素は、Ｃ６脂肪酸の産生に関する図２７に示される。当業者は、所望の炭素鎖長に達するまで、マロニル−ＣｏＡが各サイクルにおいて添加されるこの経路の周期的性質を認識するであろう。この新しい経路の周期的性質を、図３〜図６において更に示す。図３は、プライマーとしてのアセチル−ＣｏＡと伸長分子としてのマロニル−ＣｏＡ（ＭＣＡ）とを使用した、偶数炭素鎖脂肪酸の産生を示す。図４は、プライマーとしてのアセチル−ＣｏＡと、伸長分子としてのマロニル−ＣｏＡ（ＭＣＡ）とを使用した、偶数炭素鎖脂肪酸エステルの産生を例示する。図５は、プライマーとしてのプロピオニル−ＣｏＡと、伸長分子としてのマロニル−ＣｏＡ（ＭＣＡ）を使用した、奇数炭素鎖脂肪酸の産生を例示する。図６は、プライマーとしてのプロピオニル−ＣｏＡと、伸長分子としてのマロニル−ＣｏＡ（ＭＣＡ）を使用した、奇数炭素鎖脂肪酸エステルの産生を例示する。
本発明では、脂肪酸又は脂肪酸誘導体は、少なくとも部分的にはマロニル−ＣｏＡ依存的経路に依存する方法で産生される。特定の実施形態では、マロニル−ＣｏＡ依存的経路はまた、マロニル−ＡＣＰ非依存的脂肪酸産生経路でもあり、微生物のマロニル−ＡＣＰ依存的脂肪酸シンターゼ経路の阻害と組み合わせて用いられ得る。本発明の特定の他の実施形態では、脂肪酸又は脂肪酸誘導体は、部分的にマロニル−ＣｏＡ依存的及び部分的にマロニル−ＡＣＰ依存的、微生物的経路を通じて産生される。本発明の他の具体的実施形態では、脂肪酸又は脂肪酸誘導体は、ＣｏＡ依存的経路を経てマロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡとの反応を通じて開始される微生物経路を通じて産生される。
図７〜図１４を参照すると、様々なマロニル−ＣｏＡ依存的経路の例が示される。例示される経路は、４、６、８又は１０の炭素鎖長を有する脂肪酸又はエステルの産生例である。当業者は、経路の周期的性質を考慮し、より長い炭素鎖長を得るためには当該経路を長く行えばよいことを認識するであろう。本発明において、（１）生物によって生成される炭素鎖長、及び（２）経路がＣｏＡ依存的である程度、又はＣｏＡ及びＡＣＰの両方に依存的である程度、を決定する酵素の様々な組合せを含む遺伝子組み換え微生物が提供される。更に、図７〜図１４に示される経路を開始するアセチル−ＣｏＡ前駆体がプロピオニル−ＣｏＡに変換される場合、奇数の炭素鎖長（すなわち、５、７、９又は１１）を有する脂肪酸及びエステルが、当該経路を通じて形成される。
ＩＩＩ．微生物の遺伝子組み換え
本発明では、少なくとも部分的にマロニル−ＣｏＡ依存的経路を通して脂肪酸及び／又は脂肪酸誘導体を産生する微生物の能力を可能にする及び／又は改善するように改変された、遺伝子組み換え微生物が提供される。マロニル−ＣｏＡ依存的経路は、マロニル−ＡＣＰ経路から独立している場合や、マロニル−ＡＣＰ経路と組み合わされている場合がある。
一般的に、本発明の遺伝子組み換え生物は、クロストリジム、ザイモモナス、大腸菌、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、ストレプトマイセス、バチルス、ラクトバチルス、エンテロコッカス、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ピチア、カンジダ、ハンセヌラ、スラウストキトリッド、バクテリオファージ、サッカロミセスであってもよく、原核細胞であってもよく、真核生物細胞であってもよく、及び／又は細菌、酵母、真菌、微細藻類又は藻類細胞であってもよい。好ましくは、当該遺伝子組み換え生物は大腸菌である。
本発明で考察される遺伝子組み換えは、本発明で考察される生物のＣｏＡ依存的脂肪酸経路中の以下の３つの段階における機能を強化することを含む：（１）脂肪酸経路の開始；（２）鎖長の伸長（又は延長）；及び（３）所望の鎖長が得られるとプロセスの終了。これらの３つの段階を、図７〜図１４中に例示する。
Ａ．第１段階を促進する遺伝子組み換え：反応の開始
マロニル−ＣｏＡ依存的経路の第１段階は、反応の開始である。偶数炭素鎖脂肪酸生産物を産生する反応は、アセチル−ＣｏＡ＋マロニル−ＣｏＡの３−ケトブチリル−ＣｏＡへの変換を通して開始される。この変換は、シンターゼ、すなわちケトブチリル−ＣｏＡシンターゼを必要とする。図７に図示されるように、反応開始段階は、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（「ＫＣＲ」）、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ（「３ＨＤｈ」）及びエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（「ＥｎＣｒ」）の３つの酵素による、ケトブチリル−ＣｏＡのブチリルＣｏＡへの変換によって完了する。奇数炭素鎖脂肪酸生産物を産生する反応は、プロピオニル−ＣｏＡ＋マロニル−ＣｏＡの３−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を通して開始され、その後、ＫＣＲ、３ＨＤｈ及びＥｎＣｒによる還元及び脱水反応が起こる。したがって、本発明の遺伝子組み換え微生物は、これらの機能を提供する、その中にコードされた、天然の、又は、外来の酵素を含む。
（１）段階１（反応の開始）シンターゼ
本発明の１つの態様では、ＮｐｈＴ７、すなわちストレプトマイセス種ＣＬ１９０株由来の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、アセチル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡの３−ケトブチリル−ＣｏＡへの縮合を触媒し、更に還元→脱水→還元を行い、ブチリルＣｏＡ（Ｃ４−ＣｏＡ）とすることにより脂肪酸合成を開始する、ケトブチリル−ＣｏＡシンターゼとして作用する。本発明の１つの態様では、ＮｐｈＴ７は、プロピオニル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡの３−ケトバレリル−ＣｏＡへの縮合を触媒し、更に還元→脱水→還元を行い、バレリル−ＣｏＡ（Ｃ５−ＣｏＡ）とすることにより脂肪酸合成を開始する、３−ケトバレリル−ＣｏＡシンターゼとして作用する。ＮｐｈＴ７のタンパク質配列（ＢＡＪ１００４８．１ ＧＩ：２９９７５８０８２）及びその核酸配列（ＡＢ５４０１３１．１ ＧＩ：２９９７５８０８１）を、以下（配列番号１；配列番号２）に示す。
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いくつかの実施形態では、本発明の３−ケトブチリル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号１〜１２０（下記の表１で示す）のいずれか１つのタンパク質配列を含むシンターゼに対するホモログである。いくつかの実施形態では、本発明の３−ケトブチリル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号１〜１２０のいずれか１つと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％又は約９９％であるが１００％未満、又は約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼである。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、各シンターゼが系統樹の異なる分岐に存在する、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのうちの、少なくとも２つを選択することを含む。１つの態様では、本発明は、本発明の方法によって選択されたＮｐｈＴ７ホモログのライブラリを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の３−ケトバレリル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号１〜１２０（下記の表１で示す）のいずれか１つのタンパク質配列を含むシンターゼに対するホモログである。いくつかの実施形態では、本発明の３−ケトバレリル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号１〜１２０のいずれか１つと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％又は約９９％であるが１００％未満、又は約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼである。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、各シンターゼが系統樹の異なる分岐に存在する、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのうちの、少なくとも２つを選択することを含む。１つの態様では、本発明は、本発明の方法によって選択されたＮｐｈＴ７ホモログのライブラリを提供する。
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（２）第１段階（反応開始）−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ及びエノイル−ＣｏＡレダクターゼ
上記のように、偶数炭素鎖脂肪酸生産のための反応開始段階は、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ及びエノイル−ＣｏＡレダクターゼの３つの酵素による３−ケトブチリル−ＣｏＡのブチリルＣｏＡへの変換によって完了する。この段階におけるケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、３−ケトブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（例えばｆａｄＢ、二官能性酵素、配列番号１８３）及び３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（例えばｈｂｄ、配列番号２７１）からなる群から選択され得る。ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（例えばｆａｄＢ、二官能性酵素、配列番号１８３）及びエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（例えばｃｒｔ、配列番号２７２）からなる群から選択され得る。またエノイル−ＣｏＡレダクターゼは、トランス−２−エノイル−レダクターゼ（例えばｔｅｒ、配列番号２７５）であり得る。好ましくは、二官能性ｆａｄＢは、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及びヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼの両方であるか、又は、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼがｈｂｄであり、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼがｃｒｔである。
上記したように、奇数炭素鎖脂肪酸生産のための反応開始段階は、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ及びエノイル−ＣｏＡレダクターゼの３つの酵素による、３−ケトバレリル−ＣｏＡのバレリル−ＣｏＡへの変換により行われる。この段階の間、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、３−ケトバレリル−ＣｏＡレダクターゼ（例えばｆａｄＢ、二官能性酵素、配列番号１８３）及び３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（例えばｈｂｄ、配列番号２７１）からなる群から選択され得る。ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼは、３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（例えばｆａｄＢ、二官能性酵素、配列番号１８３）及びエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（例えばｃｒｔ、配列番号２７２）からなる群から選択され得る。またエノイル−ＣｏＡレダクターゼは、トランス−２−エノイル−レダクターゼ（例えばｔｅｒ−配列番号２７５）であり得る。好ましくは、二官能性ｆａｄＢは、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及びヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼの両方であるか、又は、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼがｈｂｄであり、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼがｃｒｔである。
（３）第１段階（反応開始）マロニル−ＡＣＰ経路
代替的実施形態では、図１２及び図１３に示すように、開始段階はその後の１つ又は２つ以上の段階（すなわち伸長段階及び／又は終結段階）の少なくとも一部がマロニル−ＡＣＰ依存的経路に依存する、マロニル−ＣｏＡ依存的経路を通して行われてもよい。この実施形態では、偶数炭素鎖脂肪酸生産物の生成反応は、アセチル−ＣｏＡ＋マロニル−ＡＣＰの３−ケトブチリル−ＡＣＰへの変換を通じて開始される。この実施形態では、偶数炭素鎖脂肪酸生産物を生成する反応は、プロピオニル−ＣｏＡ＋マロニル−ＡＣＰの３−ケトバレリル−ＡＣＰへの変換を通じて開始される。この実施形態では、マロニル−ＣｏＡ依存的経路に沿って反応を触媒する本明細書において記述される１つ又は２つ以上の酵素をコード遺伝子組み換え微生物が提供され、その際、天然の酵素が天然のマロニル−ＡＣＰ経路を通じて開始段階を促進する。
（４）第１段階：ＣｏＡ／ＡＣＰ又はＡＣＰ／ＣｏＡの伸長への移行
ＡＣＰ依存的開始段階の直後にＣｏＡ依存的伸長段階が続く場合（例えば図１３を参照）、微生物はトランスアシラーゼ（例えばブチリルＡＣＰをブチリルＣｏＡに変換するブチリルＡＣＰ：ＣｏＡトランスアシラーゼ、又はバレリル基−ＡＣＰをバレリル−ＣｏＡに変換するバレリル−ＡＣＰ：ＣｏＡトランスアシラーゼ）もコードしなければならない。ＣｏＡ依存的開始段階の直後にＡＣＰ依存的伸長段階が続く場合（例えば図１１を参照）に続く場合、同様に、微生物はトランスアシラーゼ（例えばブチリルＣｏＡをブチリルＡＣＰに変換するブチリルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ、又はバレリル−ＣｏＡをバレリル基−ＡＣＰに変換するバレリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ）もコードしなければならない。好適なブチリルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼとしては、好ましくは大腸菌由来のｆａｂＨ、好ましくはホモ・サピエンス由来のＦＡＳＮ、好ましくは出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のＦＡＳ１が挙げられる。更なるトランスアシラーゼとしては、クラス２．３．１．３８の酵素（例えばブラシカ・ジュンセア（Brassica juncea）、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）由来）、及びＡＣＴ（ストレプトマイセス・コリヌス（Streptomyces collinus）由来）が挙げられる。
あるいは、遺伝子組み換え微生物は、いずれかのＡＣＰ中間体をその対応するＣｏＡ中間体に変換すること、又はその逆によって、ＡＣＰ依存的経路からＣｏＡ依存的経路に、又は、逆に、ＣｏＡ依存的経路からＡＣＰ依存的経路に脂肪酸産生経路を移行させる遺伝子をコードしてもよい。例えば、遺伝子組み換え微生物は、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰを３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する、好ましくはシュードモナス・プチダＫＴ２４４０由来のｐｈａＧをコードしてもよい。
Ｂ．第２段階：鎖の伸長（伸長段階）を促進する遺伝子組み換え
マロニル−ＣｏＡ依存的経路の第２段階は、炭素鎖長が各サイクルで炭素原子２個分伸長される循環的なプロセスを含む。図７に図示されるように、この段階はケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ及びエノイル−ＣｏＡレダクターゼを必要とする。したがって、本発明の遺伝子組み換え微生物は、これらの機能を提供する、その中にコードされた、天然の、又は、外来の酵素を含む。
（１）第２段階（伸長）−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ
ＮｐｈＴ７は、開始段階のプライマーとしてのアセチル−ＣｏＡ及びプロピオニル−ＣｏＡに対する有意な特異性を示すが、伸長段階においては、より大きなアシルＣｏＡ鎖に対して最小の活性を示す。長いアシルＣｏＡ鎖の縮合を触媒できる大部分の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、植物、哺乳類、酵母及び他の下等真核細胞に存在する。長いアシルＣｏＡに対する特異性を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが存在しなければ、Ｃ４−ＣｏＡ又はＣ５−ＣｏＡより大きなアシルＣｏＡ鎖の伸長は行われず、したがって、より長いアシルＣｏＡに対する特異性を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが必要とされ得る。
１つの態様では、本発明は、マロニル−ＣｏＡ依存的経路中の伸長段階の間にケトアシル−ＣｏＡシンターゼとして機能する、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを提供する。修飾ＮｐｈＴ７は、配列番号１と少なくとも７０％であるが１００％未満、又は約１００％の相同性を有するアミノ酸配列と、１つ又は２つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入とを有し、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｃ４又はそれ以上（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１又はＣ２２）の炭素鎖長を有するアシルＣｏＡ基質を受容できる。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、マロニル−ＣｏＡとアシルＣｏＡ基質との縮合反応を触媒して、Ｃ６又はそれ以上（例えばＣ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１又はＣ２２）の炭素鎖長を有する３−ケトアシル−ＣｏＡを産生することができる。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、Ｙ１４４Ｌ、Ｖ１５７Ｆ、Ｇ３０９Ｓ、Ｇ２８８Ｓ、アミノ酸８６〜８９におけるＰＤＲＰからＨＦＬＱへの置換、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｃ、Ｉ１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｌ、Ｖ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｙ、Ｆ２１７Ｇ、Ｆ２１７Ａ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｍ、Ｆ２１７Ｔ、Ｆ２１７Ｐ、Ｆ２１７Ｓ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｗ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｃ、Ｉ１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｌ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｙ及びＦ２１７Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＹ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＨＦＬＱ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１５７Ｆ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｗ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｋ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｅ、並びにＩ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｋからなる群から選択される２つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、任意の実施形態に係る修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、（Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ）、（Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ及びＨＦＬＱ）、（Ｉ１４７Ｔ、Ｖ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｖ）、並びに（Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１５７Ｆ）からなる群から選択される、３つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｓｅｒ８４、Ｖａｌ１１４、Ｇｌｙ２８８、Ｉｌｅ１９４、Ｇｌｙ３１８、Ｔｈｒ８５、Ｇｌｎ９０、Ｖａｌ１９６、Ｔｙｒ１４４、Ｐｈｅ１５９、Ｉｌｅ１４７、Ｐｈｅ２１７、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される位置で、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｉ１４７Ｔアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｆ２１７Ｖアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入（例えばＩ１４７Ｔアミノ酸置換とＦ２１７Ｖアミノ酸置換）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチドは単離及び精製される。
１つの態様では、本発明は、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする単離及び精製されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも７０％であるが１００％未満、又は約１００％の相同性又は相補性を有する核酸配列を含み、ポリヌクレオチドは、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を有する配列番号１の修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードし、ＮｐｈＴ７ポリペプチドは、Ｃ４又はそれ以上（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１又はＣ２２）の炭素鎖長を有するアシルＣｏＡ基質を受容できる。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、マロニル−ＣｏＡとアシルＣｏＡ基質とを縮合させる縮合反応を触媒して、Ｃ６又はそれ以上（例えばＣ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１又はＣ２２）の炭素鎖長を有する３−ケトアシル−ＣｏＡを産生できる修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。本発明の実施形態に係る単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、Ｙ１４４Ｌ、Ｖ１５７Ｆ、Ｇ３０９Ｓ、Ｇ２８８Ｓ、アミノ酸８６〜８９におけるＰＤＲＰからＨＦＬＱへの置換、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｃ、Ｉ１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｌ、Ｖ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｙ、Ｆ２１７Ｇ、Ｆ２１７Ａ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｍ、Ｆ２１７Ｔ、Ｆ２１７Ｐ、Ｆ２１７Ｓ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｗ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｃ、Ｉ１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｌ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｙ及びＦ２１７Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＹ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＨＦＬＱ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１５７Ｆ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｗ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｋ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｅ、並びにＩ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｋからなる群から選択される２つのアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本発明の単離及び精製されたポリヌクレオチドは、（Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ）（Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ及びＨＦＬＱ）、（Ｉ１４７Ｔ、Ｖ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｖ）、と（Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１５７Ｆ）からなる群から選択される、３つのアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本発明の単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｓｅｒ８４、Ｖａｌ１１４、Ｇｌｙ２８８、Ｉｌｅ１９４、Ｇｌｙ３１８、Ｔｈｒ８５、Ｇｌｎ９０、Ｖａｌ１９６、Ｔｙｒ１４４、Ｐｈｅ１５９、Ｉｌｅ１４７、Ｐｈｅ２１７、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される位置で、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本発明の単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｉ１４７Ｔアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本発明の単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｆ２１７Ｖアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、本発明の単離及び精製されたポリヌクレオチドは、２つ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、本発明の単離及び精製されたポリヌクレオチドは、Ｉ１４７Ｔアミノ酸置換とＦ２１７Ｖアミノ酸置換とを含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本発明の単離及び精製されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、本発明の単離及び精製されたポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本発明の単離及び精製されたポリヌクレオチドは、合成ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡである。
１つの態様では、本発明は、マロニル−ＣｏＡ依存的経路の伸長段階の間に活性を示すケトアシル−ＣｏＡシンターゼを提供し、当該ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ｎｐｈｔ７ Ｆ２１７Ｖ、ｎｐｈｔ７ Ｉ１４７Ｔ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ及びシンターゼＶＩからなる群から選択され、ｎｐｈｔ７ Ｆ２１７Ｖ及び／又はｎｐｈｔ７ Ｉ１４７Ｔが、伸長において第５及び／又は第６の炭素原子を付加する反応を触媒するか、ｎｐｈｔ７ Ｆ２１７Ｖ、ｎｐｈｔ７ Ｉ１４７Ｔ及び／又は、シンターゼＩＩＩが、伸長において第７及び／又は第８の炭素原子を付加する反応を触媒するか、ｎｐｈｔ７ Ｆ２１７Ｖ、ｎｐｈｔ７ Ｉ１４７Ｔ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ及び／又はシンターゼＶが、伸長において第９及び／又は第１０の炭素原子を付加する反応を触媒するか、又はｎｐｈｔ７ Ｆ２１７Ｖ、ｎｐｈｔ７ Ｉ１４７Ｔ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、シンターゼＶ及び／又はシンターゼＶＩは、伸長において第９及び／又はそれ以上の番目の炭素原子を付加する反応を触媒する。
（２）第２段階（伸長）：ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ及びエノイル−ＣｏＡレダクターゼ
再び図７を参照すると、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに加えて、マロニル−ＣｏＡ依存的伸長段階の各サイクルでは、３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（「ＫＣＲ」）、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ（「３ＨＤｈ」）及びエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（「ＥｎＣｒ」）が必要となる。
伸長段階の間、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（例えば、ｆａｄＢ、二官能性酵素、配列番号１８３）と３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（例えば、ｈｂｄ、配列番号２７１）とからなる群から選択され得る。ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼは、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（例えば、ｆａｄＢ、二官能性酵素、配列番号１８３）とエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（例えば、ｃｒｔ、配列番号２７２）とからなる群から選択され得る。またエノイル−ＣｏＡレダクターゼは、トランス−２−エノイル−レダクターゼ（例えば、ｔｅｒ、配列番号２７５）であり得る。好ましくは、二官能性ｆａｄＢは、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及びヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼの両方であるか、又は、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼがｈｂｄであり、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼがｃｒｔである。
Ｃ．第３段階（鎖長の終結反応）を促進する遺伝子組み換え
所望の鎖長が得られると、伸長段階は終結ステップで終結する。本発明の１つの態様では、遺伝子組み換え微生物は、実質的にに所望の鎖長で、又は、実質的に比較的狭い鎖長分布範囲（すなわち炭素原子２〜４個：例えば、Ｃ８〜Ｃ１０、Ｃ８〜Ｃ１２、Ｃ１０〜Ｃ１２、Ｃ１０〜Ｃ１４等の範囲）内でアシル伸長サイクルを終結できる酵素をコードする。本発明の別の態様では、終結酵素はアシルＣｏＡエステラーゼなどのチオエステラーゼであり、微生物は脂肪酸を産生する。好適なチオエステラーゼは、ｔｅｓＡ−配列番号２７７、‘ｔｅｓＡ−配列番号２７８、ｔｅｓＢ−配列番号２７９、ｙｃｉＡ−配列番号２８０、ｙｂｇＣ−配列番号２８１、ｙｂｆＦ−配列番号２８２、ｆａｄＭ−配列番号２８３、ＡｔＴＥ−配列番号２８４、ＣｐＴＥ−配列番号２８５、ＣｐｅｒｆＴＥ−配列番号２８６、ＬｐＴＥ−配列番号２８７、及びＰＡ２８０１ＴＥ−配列番号２８８並びにその組合せを含む。あるいは、終結酵素はワックスエステルシンターゼであり、微生物は脂肪族エステルを産生する。好適なワックスエステルシンターゼは、Ｍａｑ１−配列番号２８９、Ｐｃｒｙ１−配列番号２９０、Ｒｊｏｓ１−配列番号２９１及びＡｂｏｒｋ１−配列番号２９２を含む。あるいは、遺伝子組み換え微生物における、代替的な脂肪酸誘導体（例えば脂肪族アルコール、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルケン、脂肪族アミド、脂肪族アルカン又は脂肪二塩基酸）を産生することを可能にする、他の既知の終結酵素を添加することは、当業者の技量の範囲内でである。例えば、終結酵素は、脂肪族アルコール又は脂肪族アルデヒドの産生を触媒する脂肪酸又はアシルＣｏＡレダクターゼか、又は脂肪族アルデヒドの産生を触媒するアルデヒドデカルボニラーゼであるか、又はアルカンの産生を触媒する、アルデヒドデカルボニラーゼと、アシルＡＣＰレダクターゼ又はアシルＣｏＡレダクターゼとの組合せ、であり得る。
Ｄ．特定の鎖長に関連する遺伝子組み換え
本発明の１つの態様では、遺伝子組み換え微生物は、実質的に特定の鎖長を有するか、又は実質的に狭い鎖長分布（すなわち炭素原子２〜４個分）を有する脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生するように光学操作される。好ましくは、本発明の遺伝子組み換え微生物によって産生される脂肪酸又は脂肪酸誘導体の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％は、所望の鎖長であるか、又は、所望の狭い鎖長分布の脂肪酸又は脂肪酸誘導体である。出願人は、かかる特異性が、様々な遺伝子の組合せをコードするように微生物を工学操作することを通じて得られ、それにより、特定の鎖長を有する脂肪酸と脂肪酸誘導体の産生に至ることを見出した。下記の表２は、表中に示す炭素鎖長を有する生産物の産生に至る遺伝子の特定のユニークな組合せを示す。
Figure 0006603658
本発明の１つの態様では、表２に含まれる所定の経路に関する遺伝子をコードする遺伝子組み換え微生物が提供され、かかる微生物は、かかる経路において、表２に示す炭素鎖長を有する脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。また、経路の組合せに関する、上記の表２に含まれる遺伝子をコードする遺伝子組み換え微生物が提供され、かかる微生物は、当該経路の組合せに関する、表２で示す炭素鎖長に対応する実質的に狭い鎖長範囲を有する脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる。例えば、ＮｐｈＴ７、ｆａｄＢ、ｔｅｒ、ＡｔＴＥ、及びｔｅｓＡ（Ｃ１０経路Ａ及びＣ１２経路Ａ）を含む遺伝子組み換え微生物が提供され、微生物は、Ｃ１０及びＣ１２脂肪酸を含む脂肪酸組成を産生できる。
別の態様では、出願人は、特定の特異的生物種に由来する特定の酵素を利用することによって、鎖長特異性が制御され得ることを見出した。したがって、本発明は、アリシェワネラ・エスツアリイＢ１１、アーコバクター・ブツレリＥＤ−１、クロストリジアレス・バクテリウム１＿７＿４７＿ＦＡＡ、グルコナセトバクター・オボエジエンス１７４Ｂｐ２、ゴルドニア・アイキエンシスＮＢＲＣ １０８２２３、メソリゾビウムＳＴＭ ４６６１、ペロシヌス・ファーメンタンスＤＳＭ １７１０８、フェオバクター・ガラエシエンシス２．１０、ラルストニア・ソラナセアルムＰｏ８２、サッカロモノスポラ・アズレアＮＡ−１２８、サッカロモノスポラ・グラウカＫ６２、及びベルコシスポラ・マリスＡＢ−１８−０３２からなる群から選択される種に由来する３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩを含むタンパク質をコードする外来の核酸分子を含む１つ又は２つ以上の単離及び精製されたポリヌクレオチドを提供し、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、脂肪酸を産生できる。
いくつかの実施形態では、３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩは、ペロシヌス・ファーメンタンスＤＳＭ １７１０８、サッカロモノスポラ・グラウカＫ６２、ベルコシスポラ・マリスＡＢ−１８−０３２及びクロストリジアレス・バクテリウム１＿７＿４７＿ＦＡＡからなる群から選択される種に由来し、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、アセチル−ＣｏＡを産生できる。いくつかの実施形態では、３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩは、サッカロモノスポラ・グラウカＫ６２、サッカロモノスポラ・アズレアＮＡ−１２８、メソリゾビウムＳＴＭ ４６６１（そして、クロストリジアレス・バクテリウム１＿７＿４７＿ＦＡＡ）種からなる群から選択される種に由来し、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数４の脂肪酸を産生できる。いくつかの実施形態では、３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩは、ゴルドニア・アイキエンシスＮＢＲＣ １０８２２３、アーコバクター・ブツレリＥＤ−１、クロストリジアレス・バクテリウム１＿７＿４７＿ＦＡＡ、サッカロモノスポラ・グラウカＫ６２、及びラルストニア・ソラナセアルムＰｏ８２からなる群から選択される種に由来し、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数６の脂肪酸を産生できる。いくつかの実施形態では、３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩは、ゴルドニア・アイキエンシスＮＢＲＣ １０８２２３、グルコナセトバクター・オボエジエンス１７４Ｂｐ２、アーコバクター・ブツレリＥＤ−１、ラルストニア・ソラナセアルムＰｏ８２、及びフェオバクター・ガラエシエンシス２．１０からなる群から選択される種に由来し、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数８の脂肪酸を産生できる。いくつかの実施形態では、３−オキソアシル−（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩは、アリシェワネラ・エスツアリイＢ１１に由来し、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、炭素数１０の脂肪酸を産生できる。
Ｅ．天然のマロニル−ＡＣＰ依存的脂肪酸合成からマロニル−ＣｏＡ依存的脂肪酸合成への、マロニル−ＣｏＡをリダイレクトする遺伝子組み換え
上記のように、本発明の特定の態様は、マロニル−ＡＣＰ非依存的から独立した経路でもあるマロニル−ＣｏＡ依存的経路を通じて、脂肪酸及び脂肪酸誘導体を産生するように遺伝子が組み換えられた微生物に関する。本発明のこの態様は、微生物のマロニル−ＡＣＰ依存的脂肪酸シンターゼ系遺伝子の１つ又は２つ以上によりコードされる酵素の活性を低下させるために、１つ又は２つ以上の遺伝子組み換えを通じて微生物のマロニル−ＡＣＰ依存的脂肪酸シンターゼ経路の阻害と組み合わせて用いられ得る。組成物は、本発明の方法及びシステムで用いられ得るてもよい。
多くの微生物細胞において、脂肪酸シンターゼ系は、以下の酵素活性を有するポリペプチドを含む：マロニル−ＣｏＡ−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）トランスアシラーゼ；３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ；３−ケトアシル−ＡＣＰリダクターゼ；３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ；３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ；及びエノイル−ＡＣＰレダクターゼ。様々な実施形態では、これらのポリペプチドの温度感受性型をコードする核酸配列を、天然の酵素の代わりに導入してもよく、そして、当該遺伝子組み換え微生物を上昇した温度（これらの熱不安定ポリペプチドが、タンパク質構造の変化又は完全な変性により、部分的又は完全に不活化される温度）で培養するとき、マロニル−ＣｏＡ依存的経路を通じた流れの増加、及びマロニル−ＡＣＰ依存的経路を通じた流れの減少が観察される。
大腸菌におけるこれらの温度感受性変異体遺伝子には、ｆａｂＩｔｓ（Ｓ２４１Ｆ）、ｆａｂＢｔｓ（Ａ３２９Ｖ）又はｆａｂＤｔｓ（Ｗ２５７Ｑ）が含まれ得る。他の実施形態では、これらのポリペプチドの１つ又は２つ以上の酵素活性を、低下させるなどの、それ以外に調節するために他のタイプの遺伝子組み換えを行ってもよい。様々な実施形態では、かかる遺伝子組み換えの結果、マロニル−ＣｏＡの利用をシフトさせ、本来の経路、バイオマス全体を通じたマロニル−ＣｏＡの脂肪酸への変換を低下させ、それに比例してマロニル−ＣｏＡ依存的経路、時にはマロニル−ＡＣＰ非依存的経路を通じた、炭素源から、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を含む化学生産物への変換が大きくなる。様々な実施形態では、微生物が生産する化学生産物の特定生産性は、予想外に高い。また、特定の実施形態では、例えばマロニル−ＣｏＡ産生を増加させるための追加的な遺伝子組み換えを行ってもよい。
一酵素である、エノイル−アシルキャリアータンパク質レダクターゼ（ＥＣ番号１．３．１．９、エノイル−ＡＣＰレダクターゼとも呼ばれる）は、マロニル−ＣｏＡからの脂肪酸の生合成において鍵となる酵素である。大腸菌において、この酵素（ＦａｂＩ）は、遺伝子ｆａｂＩによってコードされる（「Ｅｎｏｙｌ−Ａｃｙｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｆａｂＩ）Ｐｌａｙｓ ａ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｔｉｎｇ Ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，」Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ．Ｈｅａｔｈ ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｏ．Ｒｏｃｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：４４，ｐｐ．２６５３８〜２６５４３（１９９５））を参照。また、ｆａｂＩ及び脂肪酸シンターゼ系に関する議論について、参照により本発明に援用する）。
本発明では、発酵事象の間に調節され得る、エノイル−ＡＣＰレダクターゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列（ポリヌクレオチド）を有する微生物を利用してもよい。例えば、温度感受性エノイル−ＡＣＰレダクターゼをコードする核酸配列を、天然のエノイル−ＡＣＰレダクターゼの代わりに提供してもよく、その結果、上昇した培養温度により酵素活性が低下し、それにより、マロニル−ＣｏＡの利用が、所望の化学生産物の生産へとシフトする。かかる配列は、大腸菌の温度度感受性変異体ｆａｂＩ（ｆａｂＩＴＳ）であるか、又はｆａｂＩｔｓ（Ｓ２４１Ｆ）（配列番号１４１）である。この酵素は、３０℃以上の温度では低下した酵素活性を示すが、３０℃では正常な酵素活性を示すことができ、そのため、培養温度を例えば３４℃、あるいは３５℃、３６℃、３７℃又は４２℃まで上昇させることにより、エノイル−ＡＣＰレダクターゼの酵素活性が低下する。このような場合、天然の脂肪酸経路を通じたマロニル−ＣｏＡの脂肪酸への返還がエノイル−ＡＣＰレダクターゼの活性が低いために妨害されない３０℃と比較して、より多くのマロニル−ＣｏＡが、本発明に係る非天然の経路を通じて脂肪酸若しくは肪酸誘導体又は他の化学生産物に変換される。
大腸菌以外の種のエノイル−ＡＣＰレダクターゼの核酸及びアミノ酸配列は、既知のゲノミクスデータベース（例えばＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰ）での相同性検索実行することによって容易に得られると認識される。他の種のホモログ及び機能的に同等な配列を取得するためのアプローチについて、本明細書で述べる。したがって、本発明は、商業的に有用な多くの微生物種に関する分野の当業者によって実施されうると認識される。
当業者に公知のように、温度感受性エノイル−ＡＣＰレダクターゼ以外のアプローチを使用してもよく、例えば、限定されないが、天然のエノイル−ＡＣＰ又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼを、当該酵素のための誘導可能なプロモーターを含む核酸配列に置換して、初回誘導の後に誘導を行わず、それにより、選択された細胞密度が得られた後で、エノイル−ＡＣＰ又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼ酵素活性を低下させてもよい。例えば、エノイル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子（例えば、大腸菌のｆａｂＩ）の酵素活性を低下させるように、遺伝子組み換えを行ってもよい。かかる例においては、本発明の方法の第１段階の間、プロモーターを（例えばイソプロピル−μ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））で誘導し、ＩＰＴＧが枯渇、除去又は希釈された後で、第２のステップ（エノイル−ＡＣＰレダクターゼ酵素活性を低下させる）を開始してもよい。他のアプローチを採用して、例えば本明細書で述べられ及び／又は当業者に公知の、酵素発現及び活性の制御を行ってもよい。例えば、リン酸の枯渇に反応す量に調整されたプロモーターを用いて、所望の遺伝子を制御可能に発現させてもよい。かかるプロモーターとしては、大腸菌のｙｉｂＤ又はｐｓｔＳ遺伝子のプロモーターが挙げられる。
特定の理論に拘束されないが、微生物におけるエノイル−ＡＣＰレダクターゼ（及び／又は脂肪酸合成酵素系中の他の酵素）の酵素活性の低下により、マロニル−ＣｏＡ（酵素の上流の代謝中間体）の蓄積及び／又はシャンティングに至ると考えられ、かかるマロニル−ＣｏＡは次に、微生物細胞がマロニル−ＣｏＡを利用する代謝経路を含むことにより、化学生産物へと変換され得る。本発明の特定の組成物、方法及びシステムでは、遺伝子組み換え微生物の充分な細胞密度が得られた後、エノイル−ＡＣＰレダクターゼの（又は、より一般的には、脂肪酸シンターゼ系の）酵素活性を低下させる。この２段階培養アプローチは、細胞バイオマス中で、特定の生産速度をサポートする生体触媒の所望の量と収率とのバランスをとるが、このことは、エノイル−ＡＣＰレダクターゼの活性（及び／又は脂肪酸シンターゼ系の他の酵素の活性）が低下した後の、細胞マスに向けられる炭素の減少に一部起因し得る。これはマロニル−ＣｏＡの正味の利用をシフトさせ、所望の化学生産物への炭素の流れを増加させるものである。
上記の調節が上記の酵素活性を減少させるために効力を有すると、そのように調節された各酵素の活性は、天然の、調節されない酵素活性（例えば細胞中の、又は、単離された状態の）と比較し、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０又は少なくとも９０％減少し得る。同様に、マロニル−ＣｏＡから脂肪族アシルＡＣＰ又は諸分子への変換も、そのように調節されない細胞又は他の系でのそのような変換と比較すると、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０又は少なくとも９０％低下し得る。同様に、天然の経路を通じた、マロニル−ＣｏＡの脂肪酸分子への変換は、調節されない細胞又は他の系でのそのような変換と比較すると、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０又は少なくとも９０％低下し得る。
Ｆ．更なる遺伝子組み換え
上記の遺伝子組み換えは、所望の化学生産物の生産を更に強化するために、様々な追加的な遺伝子組み換えと組み合わされてもよい。かかる追加的な遺伝子組み換えにより、種々の有益な特性が付与され得るが、これには例えばグルコース取り込みの増加、望ましくない副産物を生じさせる代替的反応経路における、鍵となる中間体の消費の減少、マロニル−ＣｏＡへの炭素の流れの促進、が挙げられる。これらの追加的な遺伝子組み換えのいくつかの例を、表３に記述する。
Figure 0006603658
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上記の遺伝子組み換えに加えて、様々な実施形態では、補因子ＮＡＤＰＨのプール及び理容室を増加させ、及び／又はその結果ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を増加させる遺伝子組み換えが提供される。例えば、大腸菌を用いる様々な実施形態では、このことは、以下の１つ又は２つ以上の遺伝子の、例えば遺伝子組み換え：ｐｇｉ（変異形態）、ｐｎｔＡＢ、過剰発現したｇａｐＡ：ｇａｐＮの置換／代替、及びｓｔｈＡなどの可溶性トランスヒドロゲナーゼの破壊若しくは修飾、並びに／又はｚｗｆ、ｇｎｄ、及びｅｄｄのうちの１つ若しくは２つ以上の遺伝子組み換え、によって活性を増加させることによって行われ得る。
本明細書に記載の遺伝子組み換えのいずれかを、かかる機能を有さないか、又は、かかる機能が所望のレベルにない種に提供してもよい。
より一般的には、また遺伝子組み換えのために選択された微生物の特定の代謝経路に応じて、任意のサブグループの遺伝子組み換えを行うことにより、以下からなる群から選択される発酵生産物の細胞内産生を減少させ得る：酢酸塩、アセトイン、アセトン、アクリル、リンゴ酸塩、脂肪酸エチルエステル、グリセロ脂質、脂質、イソプレノイド、グリセロール、エチレングリコール、エチレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレン、酢酸エチル、酢酸ビニル、他の酢酸エステル、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、酪酸エステル、イソ酪酸エステル、２−ＯＨ−イソ酪酸エステル、３−ＯＨ−酪酸エステル、エタノール、イソプロパノール、Ｄ−乳酸エステル、Ｌ−乳酸エステル、ピルビン酸エステル、イタコン酸エステル、レブリン酸エステル、グルカル酸エステル、グルタル酸エステル、カプロラクタム、アジピン酸、プロパノール、イソプロパノール、フゼールアルコール、及び１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、ギ酸エステル、フマル酸、プロピオン酸、コハク酸、吉草酸、及びマレイン酸。遺伝子欠失は、本明細書で概略的に開示されるように行ってもよく、また他のアプローチを用いて、選択された発酵生産物の所望の減少した細胞内産生を達成してもよい。
いくつかの実施形態では、追加的な遺伝子組み換えは、以下の表４〜表１３に列挙される群から選択される遺伝子型又は酵素に関連する。これらの酵素のアミノ酸配列を、表１４に示す。
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ＩＶ．遺伝子、ヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列に関連する方法及び組み換え技術
Ａ．アミノ酸配列変種
アミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸は、タンパク質の構造又は機能に有意な影響を与えることなく、変異させることができる。示される酵素活性が有意に逆の影響を受けない限り、含まれる変種は、欠失、挿入、逆転、繰り返し、及びタイプ置換を構成し得る。どのアミノ酸変化が表現型上サイレントである可能性があるかに関する指針は、特にＢｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．，ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）を参照のこと。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチド分子の発現によって得られるポリペプチドは、脂肪酸又は脂肪酸誘導体の耐性関連及び生合成経路に関して本明細書に記載の遺伝子及び／又は核酸配列によってコードされる１つ又は２つ以上のアミノ酸配列に対して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し得る。
当業者であれば、本明細書に記載のものと相同なアミノ酸も、本発明の範囲内であることを認識するであろう。アミノ酸の「相同性」は、保存的置換（すなわち、類似する特徴を有する他のアミノ酸で、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を置換すること）を含むと認識される。以下の置換は、典型的に保存的置換と考えられる：脂肪族アミノ酸（例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ）の、他の脂肪族アミノ酸による置換；ＴｈｒによるＳｅｒの置換、又はその逆；酸性残基（例えばＡｓｐ又はＧｌｕ）の、他の酸性残基による置換；アミド基を有する残基（例えばＡｓｎ又はＧｌｎ）の、他のアミド基を有する残基による置換；塩基性残基（例えばＬｙｓ又はＡｒｇ）の、他の塩基性残基による交換；及び芳香族残基（例えばＰｈｅ又はＴｙｒ）の、他の芳香族残基による置換。
本発明で提供される全ての核酸及びアミノ酸配列に関して、これらの配列の保存的修飾変種が含まれ、その様々な実施形態において、本発明の範囲内に含まれると認識される。機能的に同等の核酸及びアミノ酸配列（機能的変異）は、保存的に修飾された変異体及びより広範囲に変化した配列を含んでもよく、それらは当業者の技量の範囲内であり、また、それらを含む微生物もまた、本発明の様々な実施形態の範囲内であり、また、かかる配列及び／又は微生物を含む方法及びシステムも然りである。様々な実施形態では、十分に相同なタンパク質又はその部分をコードする核酸配列は、本発明の範囲内である。より一般的には、本発明で使用される特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、遺伝子コードの縮重により変化し得るが、それにもかかわらず本発明の範囲内に含まれうる。表１５は、保存的及び準保存的な置換の基礎となりうるアミノ酸の類似性、更にはこの縮重を反映する様々なコドン重複性をまとめたものである。
Figure 0006603658
 説明：側鎖及び他の関連する特性：Ａ＝酸性；Ｂ＝塩基性；Ａｌｉ＝脂肪族；Ａｍｉ＝アミン；Ａｒｏ＝芳香族；Ｎ＝非極性；ＰＵ＝極性・非荷電；ＮＥＧ＝陰性荷電；ＰＯＳ＝陽性荷電。
また、本明細書に記載の特定の核酸配列の変異体及びその部分、並びに各々のコードされたアミノ酸配列は、そのような核酸配列変種及び／又は部分が、ヌクレオチド番号１から始まりヌクレオチド番号１５で終わる配列、ヌクレオチド番号２から始まりヌクレオチド番号１６で終わる配列、ヌクレオチド番号３から始まりヌクレオチド番号１７で終わる配列、その他、が含まれるが、これらに限定されない、本明細書で記載される核酸配列において記述される任意の１５ヌクレオチドの配列と同一の１５ヌクレオチド配列を含むとき、所望の機能（例えば選択したレベルの酵素活性）を示すことができる。本発明はまた、１５超の長さのヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれ以上のヌクレオチド）であり、本明細書に記載の核酸配列において記述される配列のいずれかの部分と同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸も提供すると認識される。例えば、本発明は、ヌクレオチド番号１から始まりヌクレオチド番号２５で終わる配列、ヌクレオチド番号２から始まりヌクレオチド番号２６で終わる配列、ヌクレオチド番号３から始まりヌクレオチド番号２７で終わる配列、が含まれるが、これらに限定されない、本明細書に記載の任意の１つ又は２つ以上（その任意の群を含む）の核酸配列において記述される任意の２５ヌクレオチド配列と同一の２５ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。追加的な例には、５０以上の長さのヌクレオチド（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００又はそれ以上のヌクレオチド）で、本明細書で開示される配列のいずれかの部分と同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸が含まれるが、これらに限定されない。かかる単離された核酸には、考察及び／又は実施例のいずれか１つのセクションに記載された核酸配列（例えば、脂肪酸若しくは脂肪酸誘導体産生経路、脂肪酸シンターゼ系の酵素をコードする核酸配列、又は脂肪酸若しくは脂肪酸誘導体耐性に関する核酸配列）を含む、単離された核酸が含ま得るが、これらに限定されない。例えば、本発明は、本明細書で列挙される核酸配列を含む単離された核酸であって、１個の挿入、１個の欠失、１個の置換、複数個の挿入、複数個の欠失、複数個の置換又はそれらの任意の組合せ（例えば、複数個の挿入と１個の欠失）を含む核酸を提供する。かかる単離された核酸分子は、本明細書（すなわち配列表）で列挙される核酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有し得る。
追加的な例には、５０以上の長さのアミノ酸残基（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００又はそれ以上のアミノ酸残基）で、本明細書に列挙又は開示されるアミノ酸配列のいずれかの部分と同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、単離された核酸が含まれるが、これらに限定されない。
更に本発明は、本明細書に列挙又は開示されるアミノ酸配列の変異を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、単離された核酸を提供する。例えば、本発明は、本明細書で列挙又は開示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、単離された核酸であって、１個の挿入、１個の欠失、１個の置換、複数個の挿入、複数個の欠失、複数個の置換又はそれらの任意の組合せ（例えば、複数個の挿入と１個の欠失）を含む、単離された核酸を提供する。かかる単離された核酸分子は、本明細書で列挙又は開示されるアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み得る。
保存的アミノ酸置換及び他のアミノ酸置換のための基礎を提供する特性の例を、表１５に例示する。したがって、当業者であれば、所望の機能を示すアミノ酸配列変種を得るために、多数の置換を行ってもよい。ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＰ、及びその他のアラインメントツール及び比較ツールを用いて、置換の頻度が少ないと考えられる（複数の置換が必要となり得る選択されたレベルに活性を変化させるように向ける場合を除き）、高度に保存された領域を評価してもよい。活性部位又は他の結合若しくは構造的モチーフに関係しないと認識されるか又は考えられる領域では、多くの置換がなされ得る。表１５に従えば、例えば、任意に、サイズ／分子量を考慮しつつ、１つの極性・非荷電アミノ酸を、列挙された配列の極性・非荷電（ＰＵ）アミノ酸で置換してもよい（すなわち、セリンをスレオニンで置換してもよい）。どのアミノ酸変化が、表現型上サイレントである可能性があるかに関する指針は、特にＢｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）を参照のこと。この文献の教示内容を、参照により援用するが、当業者にも公知であると考えられる。公知の保存的アミノ酸置換としては、以下が挙げられる（各組のコロンの後に置換可能なアミノ酸を示す）：ａｌａ：ｓｅｒ、ａｒｇ：ｌｙｓ、ａｓｎ：ｇｌｎ又はｈｉｓ、ａｓｐ：ｇｌｕ、ｃｙｓ：ｓｅｒ、ｇｌｎ：ａｓｎ、ｇｌｕ：ａｓｐ、ｇｌｙ：Ｐｒｏ、ｈｉｓ：ａｓｎ又はｇｌｎ、ｉｌｅ：ｌｅｕ又はｖａｌ、ｌｅｕ：ｉｌｅ又はｖａｌ、ｌｙｓ：ａｒｇ又はｇｌｎ又はｇｌｕ、ｍｅｔ：ｌｅｕ又はｉｌｅ、ｐｈｅ：ｍｅｔ又はｌｅｕ又はｔｙｒ；ｓｅｒ：ｔｈｒ、ｔｈｒ：ｓｅｒ、ｔｒｐ：ｔｙｒ、ｔｙｒ：ｔｒｐ又はｐｈｅ、ｖａｌ：ｉｌｅ又はｌｅｕ。
特定の種におけるコドン選択及びコドン使用頻度表を用いて、その特定の種のコドン使用選択を利用する単離された核酸分子を工学操作できると認められる。例えば、本明細書で提供される単離された核酸を、関心対象の特定の微生物が選択的に使用するコドンを有するように設計することができる。多くのソフトウェア及び塩基配列決定サービスを利用して、配列中のコドンを最適化できる。
本発明は、本明細書で列挙又は開示されるアミノ酸配列のアミノ酸配列全体を含むポリペプチドを提供する。更に、本発明は、本明細書で列挙又は開示されるアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドを提供する。例えば、本発明は、本明細書で列挙又は開示されるアミノ酸配列のいかなる１５アミノ酸の配列とも同一の１５アミノ酸の配列を含むポリペプチドを提供し、これには限定されないが、アミノ酸残基番号１から始まりアミノ酸残基番号１５で終わる配列、アミノ酸残基番号２から始まりアミノ酸残基番号１６で終わる配列、アミノ酸残基番号３から始まりアミノ酸残基番号１７で終わる配列、等が含まれる。本発明はまた、１５超の長さのアミノ酸残基（例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれ以上アミノ酸残基）で、本明細書で列挙又は開示されるアミノ酸配列のいずれかの部分と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドもを提供すると認識されるであろう。例えば、本発明は、本明細書で列挙又は開示されるアミノ酸配列のいかなる２５アミノ酸の配列とも同一の２５アミノ酸の配列を含むポリペプチドを提供し、これには限定されないが、アミノ酸残基番号１から始まりアミノ酸残基番号２５で終わる配列、アミノ酸残基番号２から始まりアミノ酸残基番号２６で終わる配列、アミノ酸残基番号３から始まりアミノ酸残基番号２７で終わる配列、等が含まれる。更なる例には、５０以上の長さのアミノ酸残基（例えば１００、１５０、２００、２５０、３００又はそれ以上のアミノ酸残基）で、本明細書で列挙又は開示されるアミノ酸配列のいずれかの部分と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。更に、上記から、ヌクレオチド１５個の配列がアミノ酸５個の配列を提供することから、後者の、より長いアミノ酸配列が、本明細書に記載の配列と同一性を有する上記のヌクレオチド配列の長さによって定義され得ると認識される。
更に、本発明は、本明細書で列挙又は開示されるアミノ酸配列において記述されるアミノ酸配列の変異を有するアミノ酸配列のポリペプチドを提供する。例えば、本発明は、本明細書で列挙又は開示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、１個の挿入、１個の欠失、１個の置換、複数個の挿入、複数個の欠失、複数個の置換又はそれらの任意の組合せ（例えば、複数個の挿入と１個の欠失）を含む、ポリペプチドを提供する。かかるポリペプチドは、本明細書で列挙又は開示されるアミノ酸配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の変種アミノ酸配列は、任意の数の変異、並びに変異のタイプの任意の組合せを有し得る。
本明細書に示すように、変種アミノ酸配列を有するポリペプチドは酵素活性を保持することができる。かかるポリペプチドは、標準的な手順（例えば部位特異的変異導入又は様々なＰＣＲ技術）を使用して、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって産生することができる。本明細書に示すように、修飾の１つのタイプとして、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の、類似の化学的及び／又は生化学性質を有するアミノ酸残基による置換が挙げられる。例えば、ポリペプチドは、更に１つ又は２つ以上の保存的置換を含む、本明細書に記載又は開示のアミノ酸配列において記述されるアミノ酸配列を有し得る。
より実質的な変化は、保存的でない置換、及び／又は、より重要であり得る配列領域の置換を選択することにより得ることができ、例えば、以下の維持に及ぼすその効果が有意に異なる残基を選択することにより得られる：（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シート又はへリックス構造）；（ｂ）標的部位でのポリペプチドの電化又は疎水性；又は（ｃ）側鎖の大きさ。一般的にポリペプチド機能に最も大きな変化をもたらすと予想される置換は、以下のものである：（ａ）親水性残基（例えば、セリン又はスレオニン）の、疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン又はアラニン）による置換；（ｂ）システイン又はプロリンの、他の何らかの残基による置換；（ｃ）陽性荷電側鎖を有する残基（例えば、リジン、アルギニン又はヒスチジン）の、陰性荷電残基（例えば、グルタミン酸又はアスパラギン酸）による置換；又は（ｄ）大きな側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）の、側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）による置換。これらのアミノ酸置換（又は他の欠失若しくは付加）の効果は、酵素活性を有するポリペプチドの場合には、関連する天然ポリペプチドと同じ基質の、関連する天然ポリペプチドと同じ生産物への変換を触媒する、当該ポリペプチドの能力を分析することによって評価できる。したがって、５、１０、２０、３０、４０、５０個又はそれ未満の保存的置換を有するポリペプチドが、本発明において提供される。
Ｂ．アミノ酸配列同一性の決定
実際問題として、何らかの特定のポリペプチドが、本明細書に記載の任意のポリペプチド（本明細書に記載の特定の核酸配列に対応し得る）のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するか否かによらず、かかる特定のポリペプチド配列は従来、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムなどの公知のコンピュータプログラムを使用して決定できる（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）。Ｂｅｓｔｆｉｔ又は他の任意の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明に係る参照配列と９５％同一か否かを決定するとき、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長にわたり算出され、なおかつ参照配列におけるアミノ酸残基総数の最大５％のギャップが相同性において許容されるように、パラメータを設定する。
例えば、具体的な実施形態では、参照配列（クエリー配列、すなわち本発明の配列）と対象配列との間の同一性（また、グローバル配列アラインメントとも呼ばれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５の（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定され得る。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで用いられる、同一性が狭く解釈される特定の実施形態に係る好ましいパラメータは、以下の通りである：スコアリングスキーム＝ＰＡＭ（許容される変異の％）０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、連結ペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ウインドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００又は対象アミノ酸配列の長さのいずれか短い方。この実施形態では、対象配列がＮ末端又はＣ末端の欠失（内部の欠失ではない）によりクエリー配列より短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、グローバル％同一性を算出するとき、対象配列のＮ末端及びＣ末端の切断を考慮しないという事実を考慮して、結果を手動で補正する。クエリー配列と比較して、Ｎ−及びＣ末端が切断された対象配列の場合、％同一性は、対象配列のＮ末端及びＣ末端の外側に存在して、対応する対象残基と一致／整列しないクエリー配列の残基数を、クエリー配列の全塩基に対するパーセントとして算出することによって補正される。残基が一致／整列するか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果に基づきなされる。次に、このパーセンテージを％同一性から減算し、特定のパラメータを用いたＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出すると、最終的な％同一性スコアが得られる。この最終的な％同一性のスコアは、この実施形態の目的のためにスコアである。クエリー配列と一致／整列しない対象配列のＮ−及びＣ末端の残基のみが、％同一性スコアを手動で調節する目的のために考慮される。すなわち、対象配列の最も遠位のＮ末端及びＣ末端残基の外側のクエリー残基側の位置だけが、この手動による補正において考慮される。例えば、アミノ酸残基９０個の対象配列を、１００残基のクエリー配列と整列させ、％同一性を決定する。対象配列のＮ末端で欠失が存在するため、ＦＡＳＴＤＢアラインメントでは、Ｎ末端の最初の１０残基については一致／整列を示さない。１０個の不対残基は、配列に対して１０％を表すため（一致しなかったＮ−及びＣ末端の残基数／クエリー配列全体の残基数）、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出される％同一性スコアから１０％を減算する。残りの９０個の残基が完全に一致した場合、最終的な％同一性は９０％となる。別の例では、９０残基の対象配列を、１００残基のクエリー配列と比較する。この場合、欠失は内部欠失であり、そのため対象配列のＮ−又はＣ末端において、クエリーと一致／整列しない部分が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出される％同一性は、手動で補正されない。繰り返すが、ＦＡＳＴＤＢアラインメントで示されるように、クエリー配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端及びＣ末端の外側の残基位置のみが、手動で補正される。
Ｃ．遺伝子組み換え及び核酸構築物の作製技術
本発明においては、様々な方法及び技術を用いて微生物を修飾し得る。本発明の実施形態は、通常宿主微生物中に通常見いだされるか、又は見いだされない酵素をコードする核酸配列を含む。
宿主細胞を遺伝的に改変できることは、任意の遺伝子組み換え（組み換え型）微生物の作製にとって不可欠である。遺伝子導入の方法は、電気穿孔法、接合、形質導入又は天然による形質転換による方法であり得る。様々な宿主接合プラスミド及び薬剤抵抗性マーカーを利用できる。クローニングベクターは、宿主内で機能し得る抗生物質耐性マーカーの性質に基づき、宿主微生物に合わせて調整され得る。また、本明細書で開示されるように、遺伝子組み換え（組み換え型）微生物は、プラスミド導入以外の改変による、例えば微生物のゲノムＤＮＡに対する改変などを含み得る。
より一般的には、１つ又は２つ以上の（いくつかの）制御配列に機能的に連結された、酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を調製することができ、当該制御配列は、それと適合性を有する条件下で、微生物（例えば大腸菌）中で当該コード配列の発現を指示する。単離されたポリヌクレオチドを、ポリペプチドの発現を提供するように操作することができる。ベクターへ挿入する前のポリヌクレオチド配列の操作は、発現ベクターによっては、好ましい場合があり、また必要である場合もある。組み換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチド配列を改変する技術は、当該技術分野で確立されている。
制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるために宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列である、適切なプロモーター配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、変異型、切断型及びハイブリッド型のプロモーターなど、選択された宿主細胞で転写活性を示すいかなるヌクレオチド配列であってもよく、宿主細胞と同種又は異種の、細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。核酸構築物の転写を指示する好適なプロモーターの例としては、特に大腸菌宿主細胞の場合は、ｌａｃプロモーター（Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ，１９７６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１４８：２４３〜２５０）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８０：２１〜２５）、ｔｒｃプロモーター（Ｂｒｏｓｉｕｓら、１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３５３９〜３５４１）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ及びＭｏｆｆａｔｔ，１９８６，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３〜１３０）、ファージプロモーターｐＬ（Ｅｌｖｉｎら、１９９０，Ｇｅｎｅ ８７：１２３〜１２６）、ｔｅｔＡプロモーター（Ｓｋｅｒｒａ，１９９４，Ｇｅｎｅ １５１：１３１〜１３５）、ａｒａＢＡＤプロモーター（Ｇｕｚｍａｎら、１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：４１２１〜４１３０）並びにｒｈａＰＢＡＤプロモーター（Ｈａｌｄｉｍａｎｎら、１９９８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１２７７〜１２８６）が挙げられる。他のプロモーターについては、「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４〜９４；及びＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，」Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１（ｖｏｌｕｍｅｓ １〜３）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている。
制御配列はまた、宿主細胞によって転写を終結させると認められる好適な転写ターミネーター配列であり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に機能的に連結される。大腸菌細胞内で機能するいかなるターミネーターも、本発明で使用できる。宿主細胞の成長と関連して、ポリペプチドの発現調節を可能にする調節配列を加えることが好ましい場合もある。調節システムの例としては、調節化合物の存在を含む化学的又は物理的刺激に反応して、遺伝子の発現をオン又はオフにするシステムが挙げられる。原核細胞系における調節システムとしては、ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｐシステムが挙げられる。
本発明の様々な実施形態では、遺伝子操作及び／又は改変は、例えば、それぞれの経路のいずれかで同定される酵素又は酵素活性の調節を変化させ、それゆえ最終的な活性の変化を変化させるための、様々な遺伝子操作を含むものとして記載される。かかる遺伝子組み換え、及び遺伝子の調節に関する本明細書でのあらゆる言及は、それにより、選択された及び／又は同定された培養条件下での酵素活性及び／又は選択性の変化が起こる、転写、翻訳、及び翻訳語改変に向けられ、並びに／又は、例えば脂肪酸又は脂肪酸誘導体の産生に関連する酵素のコピー数及び／又は変異体を増加させるための更なる核酸配列の提供に向けられ得る。かかる遺伝子組み換え及び／又は調節を実施するための具体的な方法論及びアプローチは、当業者に公知であり、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：内因性の遺伝的要素の発現の増加；リプレッサー遺伝子の機能の減少；異種の遺伝的要素の導入；脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生するための酵素変換ステップを触媒するポリペプチドをコードする核酸配列のコピー数の増加；特異的酵素活性を増加させる変異タンパク質を提供するための遺伝的要素の変異；過剰発現；過少発現；シャペロンの過剰発現；プロテアーゼのノックアウト；フィードバック阻害の変更又は修飾；リプレッサー及び／又は競合的阻害剤にとっての障害のある結合部位を１つ又は２つ以上含む酵素変種の提供；リプレッサー遺伝子のノックアウト；進化、選択及び／又はｍＲＮＡの安定性を改善するための他のアプローチ、並びに有効な改善レベルをもたらす、有効なコピー数及びプロモーターを有するプラスミドの使用。遺伝子組み換えを提供するために、これら又は他で言及されたアプローチのいずれかに分類されうるランダムな突然変異導入を行ってもよい。遺伝子組み換え及び／又は調節は更に、関心対象の核酸における１つ又は２つ以上の核酸の付加（挿入を含む）、欠失（例えば突然変異による）及び置換へと、広く分類される。様々な実施形態では、遺伝子の組み換え及び／又は調節は、酵素の比活性及び／又はターンオーバー数の改善をもたらす。限定されないが、変化は以下の１つ又は２つ以上により測定され得る：ＫＭ；Ｋｃａｔ；及びＫａｖｉｄｉｔｙ。
様々な実施形態では、より効率的に機能するために、微生物は１つ又は２つ以上の遺伝子欠失を含み得る。例えば、大腸菌において、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、及びピルビン酸−ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）をコードする遺伝子を破壊（欠失を含む）してもよい。かかる遺伝子破壊（欠失を含む）は、限定されないが、様々な実施形態で、様々な組合せで実施され得る。遺伝子欠失は、突然変異による遺伝子欠失アプローチによって実施してもよく、及び／又は、これらの酵素の１つ又は２つ以上の発現が低下しているか若しくは発現がないない変異体株から開始してもよく、及び／又は、当業者に公知の他の方法で行ってもよい。遺伝子欠失は、多くの既知の具体的方法論のいずれかを用いて実施でき、例えば、限定されないが、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ社（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、ドレスデン、ドイツ＜＜ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ．ｃｏｍ＞＞）が販売するきっと及び他の試薬を使用するＲＥＤ／ＥＴ法が挙げられる。
後者の方法に関してより詳しく述べると、Ｒｅｄ／ＥＴ組み換え法の使用は、当該技術分野の当業者に公知であり、Ｓｔｅｗａｒｔらの米国特許第６，３５５，４１２号及び第６，５０９，１５６号に記載されており、この方法のその教示について、参照により本発明に援用する）。かかる方法のための材料及びキットは、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ社（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、ドレスデン、ドイツ＜＜ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ．ｃｏｍ＞＞）から入手可能であり、当該方法は、製造業者の指示に従うことにより実施できる。上記方法は、λ−ファージ由来のリコンビナーゼによって行われる相同的組み換えにより、選択可能マーカーによる標的遺伝子の置換を含む。λ−ｒｅｄリコンビナーゼを発現する宿主微生物を、標的遺伝子と相同な末端領域（一般に約５０ｂｐ、あるいは約３００ｂｐまで）に隣接する選択可能マーカーをコードする直鎖ＤＮＡ生産物で形質転換する。マーカーは次に、ＦＬＰ−リコンビナーゼ又は他のリコンビナーゼ（例えばＣｒｅ）を有するプラスミドベクターによって行われる他の組み換えステップによって除去され得る。
微生物染色体ＤＮＡの一部の標的特異的な欠失又は異質遺伝材料の微生物染色体への付加を実施することにより、宿主細胞の代謝を変化させて、望ましくない代謝産物の産生を低下させる又は排除することができる。これは、本明細書においてこの一般的な実施例で述べられる組み換えなどの、他の遺伝子組み換えとの組合せで用いてもよい。この発明の詳細な説明では、複数の実施形態及び添付の図面を参照してきたが、それらは、本発明を実施する上での特定の例示的形態を示すものである。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施できる程に詳細に記載されており、開示された実施形態に対する変更が、当業者により適宜なされ得ることを理解すべきである。
ポリペプチド及びポリペプチドをコードする核酸は、標準的なＤＮＡ変異導入方法（例えば、Ｍ１３プライマーによる変異導入）によって産生できる。これらの方法の詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）に記載されている。核酸分子は、分子を導入しようとする特定の微生物のコドン使用バイアスにフィットするようなコード領域の変更を含み得る。
あるいは、コード領域は、その核酸配列が実質的に変化しているがそれでもなお天然のアミノ酸配列と同一か又は実質的に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするように、コドン縮重を利用してコード配列を変化させることによって変化させることができる。例えば、アラニンは、オープンリーディングフレームにおいて、ヌクレオチドのコドントリプレットＧＣＴとしてコードされる。遺伝子コードの縮重により、他の３つのヌクレオチドのコドントリプレット：ＧＣＡ、ＧＣＣ、及びＧＣＧも、アラニンをコードする。このように、オープンリーディングフレームの核酸配列は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列又はポリペプチドの特徴に影響を及ぼすことなく、これらの３つのコドンのいずれかの位置で変更できる。遺伝子コードの縮重に基づき、核酸変種は、本明細書で述べた標準的なＤＮＡ変異導入技術を使用して、又は核酸配列の合成によって、本明細書で開示される核酸配列から誘導することができる。このように、様々な実施形態では、本発明は、同じポリペプチドをコードするが、遺伝子コードの縮重によって異なる核酸配列を有する核酸分子を含む。
本発明はまた、少なくとも約１２塩基の長さ（例えば、少なくとも約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００又は２００００塩基の長さ）を有し、本明細書において記載又は開示される配列を有する核酸のセンス又はアンチセンス鎖と、ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、単離された核酸を提供する。ハイブリダイゼーション条件は、中等度、又は、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であり得る。
Ｖ．発酵プロセス
本発明では、本明細書に記載の微生物を、発酵プロセスに用いて、本明細書に記載のバイオプロダクション経路を通じて、所望の化学生産物（例えば脂肪酸又は脂肪酸誘導体）を製造する。限定されないが、かかるプロセスは、容器（例えば培養用又はバイオリアクター用容器）に以下の材料を提供することにより実施され得る：（１）バイオプロダクション用の培地、（２）栄養培地（例えば当業者に公知の最小培地）、及び（３）微生物集団（微生物、例えば細菌、具体的には、腸内細菌科のメンバー、例えば大腸菌）を提供するための遺伝子組み換え微生物の接種材料。本発明の１つの態様では、遺伝子組み換え微生物は、マロニル−ＣｏＡを特定の化学生産物に変換する代謝経路を含む。接種材料を容器で培養して、所望の総生産性測定基準を満たす脂肪酸又は脂肪酸誘導体の生産レベルに到達するのに好適な細胞密度まで、細胞密度を増加させる。様々な代替的実施形態では、これらの遺伝子組み換え微生物集団を、第１に、予備的な容器で第１の細胞密度となるまで培養し、次に上記の容器に移し、所定の細胞密度となるまで培養してもよい。多くの複数容器培養ストラテジーが、当業者に公知である。
Ａ．バイオプロダクション用培地（炭素源）
本発明において、脂肪酸又は脂肪酸誘導体のための生合成経路を有する組み換え微生物で用いられるバイオプロダクション用培地は、意図する代謝経路にとって好適な炭素源又は基質を含み得る。好適な基質としては限定されないが、グルコース及びフルクトースなどの単糖、ラクトース又はスクロースなどのオリゴ糖、デンプン又はセルロース又はそれらの混合物などの多糖、並びにと再生可能な原料（例えばチーズホエイ透過物、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、及びオオムギ麦芽）由来の非精製混合物が挙げられる。更に、炭素基質はまた、炭素数１の基質（例えば鍵となる生化学的中間体への代謝的変換が証明されている二酸化炭素、一酸化炭素、又はメタノール）であり得る。炭素数１及び２の基質に加えて、メチル栄養性微生物が、多くの他の炭素含有化合物（例えばメチルアミン、グルコサミン及び代謝活性に必要な種々のアミノ酸）を利用することは公知である。
上記の炭素基質及びそれらの混合物の全てが、本発明における炭素源として好適であると考えられるが、炭素源として用いられる一般的な炭素基質は、様々な単糖及びオリゴ糖、例えばグルコース、フルクトース、及びスクロース、並びにこれらの任意の糖の混合物である。他の好適な基質としては、キシロース、アラビノース、他のセルロース骨格Ｃ−５糖、フルクトース高含有コーンシロップ、並びに市販の様々な他の糖及び糖混合物が挙げられる。スクロースは、サトウキビ、テンサイ、カッサバ、バナナ若しくは他の果物、及びサトウモロコシなどの原料から得られ得る。グルコース及びデキストロースは、穀物（例えば穀物、小麦、ライ麦、オオムギ、及びオート麦）などのデンプンベースの原料の糖化により得られ得る。また、いくつかの実施形態では、炭素源の全部又は一部は、グリセロールであってもよい。あるいは、グリセロールを添加炭素源から除外してもよい。
１つの実施形態では、炭素源は、グルコース、フルクトース、スクロース、デキストロース、ラクトース、グリセロール、及びそれらの混合物から選択される。炭素源中のこれらの成分の量は、各々独立に、炭素源の約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、又はそれ以上かつ１００％未満、又は本質的に１００％であってもよい。
更に、メチル栄養性微生物が、他の多くの炭素含有化合物（例えばメチルアミン、グルコサミン及び代謝活性に必要な種々のアミノ酸）を利用することが知られている。例えば、メチル栄養性の酵母は、トレハロース又はグリセロールの形成においてメチルアミンからの炭素を利用することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．（Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．）、７ｔｈ（１９９３）、４１５〜３２．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｍｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ、Ｄｏｎ Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＵＫ）。同様に、カンジダ属の様々な種は、アラニン又はオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５〜４８９（１９９０））。ゆえに、本発明の実施形態で利用される炭素供給源には、多種多様な炭素含有基質が含まれ得ると考えられる。
更に、発酵可能な糖を、例えば、米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号（参照により本発明に援用する）に記載の前処理及び糖化プロセスにより、セルロース及びリグノセルロース系のバイオマスから得てもよい。バイオマスとは、あらゆるセルロース系又はリグノセルロース系材料のことを指し、セルロースと、任意にヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖及び／又は単糖とを更に含む材料を含む。バイオマスはまた、更なる成分（例えばタンパク質及び／又は脂質）を含んでもよい。バイオマスは、単一の給源に由来してもよく、又は、バイオマスは、複数の給源に由来する混合物を含んでもよい。例えば、バイオマスは、コーンコブとコーンストーブの混合物を含んでもよく、又は、草と葉との混合物を含んでもよい。バイオマスには、バイオエネルギー用作物、作物残渣、農業固形廃棄物、産業固形廃棄物、紙製造からの沈殿物、雑草、木及びと森林の廃棄物が含まれるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、限定されないが、トウモロコシ穀粒、コーンコブ、コーン外皮などの作物残渣、コーンストーブ、草、小麦、小麦わら、オオムギ、オオムギわら、干し草、米わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀物の粉砕から得られる成分、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、潅木及び低木、野菜、果物、花及び動物堆肥が挙げられる。かかるバイオマスをバイオプロダクション方法又はシステムで用いることにより、炭素源が提供され得る。セルロースバイオマスを、より入手可能で利用性の高い炭素分子（糖を含む）の混合物に分解する様々なアプローチとしては、以下が挙げられる：濃縮若しくは希釈された酸（例えば＜１％硫酸）の存在下での加熱；アンモニア処理；イオン性塩による処理；酵素的分解；及びこれらの組合せ。通常、これらの方法の後に、機械的分離及び粉砕が続き、この後に適切な分離プロセスが続く。
様々な実施形態では、例えば反応容器を備える工業的システムでは、限定されないが、スクロース、グルコース、キシロース、セルロース又はヘミセルロースなどの様々な糖質が微生物に提供され、反応容器中で、既知組成培地（例えば、限定されないが、Ｍ９最小培地、硫酸カリウム最小培地、酵母合成最小培地及びその他、又はそれらの改変培地等の、最小塩類培地）、１つ又は２つ以上の脂肪酸又は脂肪酸誘導体整合性経路代替物を提供する微生物接種材料、並びに炭素源を混合してもよい。炭素源は細胞に入りれ、公知及び一般的な代謝経路によって異化され、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）などの一般的な代謝中間体を生じる。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４、ｐｐ．４２〜４５、６６〜７４、糖の基本ていな代謝異化経路の教示について、参照により本発明に援用；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｄ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ ＆ Ｍ．Ｍ．Ｃｏｘ、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００、ｐｐ ５２７〜６５８（主要な代謝経路に関する教示を、参照により本発明に援用）；及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４ｔｈ Ｅｄ．、Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５、ｐｐ．４６３〜６５０（主要な代謝経路に関する教示を、参照により本発明に援用）を参照）。
生物系の炭素は、ＡＳＴＭ Ｄ６８６６又は他の様々な技術を含むがこれらに限定されるわけではない様々な方法により、石油系の炭素と区別することができる。例えば、炭素１４と炭素１２の比率は、生物系の炭素源と石油系の炭素源とで異なり、生物系の炭素源では炭素１４比率が高い。様々な実施形態では、炭素源は、石油系でないか、又は主に石油系ベースで構成されるのではない。様々な実施形態では、炭素源は、約５０％超が非石油ベースであるか、約６０％超が非石油ベースであるか、約７０％超が非石油ベースであるか、約８０％超が非石油ベースであるか、約９０％超が非石油ベースであるか、又はそれ以上である。様々な実施形態では、炭素源は、約１．０×１０−１４以上の炭素１４対炭素１２比率（例えば、２．０×１０−１４以上、３．０×１０−１４以上、４．０×１０−１４以上、５．０×１０−１４以上、６．０×１０−１４以上、７．０×１０−１４以上、８．０×１０−１４以上、９．０×１０−１４以上又は１０．０×１０−１４以上）を有する。
いくつかの実施形態の炭素源は、Ｃ６炭素源又はＣ３炭素源を含む。いくつかの実施形態の炭素源は、１つ又は２つ以上のセルロース系の糖（例えばグルコース、スクロース、フルクトース、デキストロース、ラクトース、キシロース）又はそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態の炭素源は、約５０質量％、４０質量％、３０質量％、２０質量％、１０質量％又は５質量％未満のグリセロールを含む。
Ｂ．接種材料（微生物）
本発明に係る発酵によるバイオプロダクションプロセスは、上記のいずれかの遺伝子組み換え微生物を含む接種材料を利用し得る。本明細書に記載され、特許請求される特性は、本明細書に列挙される微生物、又はその他の好適な微生物から選択される微生物において提供されてもよく、微生物はまた、天然の、誘導型の、又は強化された脂肪酸又は脂肪酸誘導体のバイオプロダクション経路の１つ又は２つ以上を含む。このように、いくつかの実施形態では、微生物は内因性の脂肪酸又は脂肪酸誘導体産生経路（いくつかの実施形態では強化され得る）を含むが、他の実施形態では、微生物は内因性の脂肪酸又は脂肪酸誘導体産生経路を含まない。
これらの遺伝子組み換え微生物の変種は、１人以上の本発明者の他の特許出願、及び／又は本特許出願の特許権者に対する譲渡の対象である他の特許出願に記載される、遺伝子組み換え及び／又は他のシステム変更を含み得る。
実施例は、特定の細菌及び酵母微生物に対する特異的な改変及び評価について説明している。本発明の範囲は、かかる種に限定されるものではなく、通常、広範囲にわたる好適な微生物に適用できることを意味する。通常、本発明に用いられる微生物は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌及び酵母から選択され得る。
いくつかの実施形態では、選択された化学生産物のバイオプロダクションのために、最初に選択される微生物宿主は、グルコースを含む糖の利用率が高くなければならない。大部分の微生物は、炭水化物を利用できる。しかしながら、特定の環境微生物は、高い効率で炭水化物を利用することができず、したがって、添加される主要な炭素源としてグルコース又は他の炭水化物を用いる実施形態では、好適な宿主ではないと考えられる。
様々な種のゲノムが明らかとなるにつれて、本発明が適用できる、好適な微生物の範囲が更に拡大するであろう。更に、遺伝子のシークエンシングのコストが比較的低いことを考慮すると、（既知のゲノム配列を有する微生物に、遺伝子組み換えを適用する容易さに基づき）、関心対象の種の遺伝子配列を、より容易に決定して、本発明の態様をより容易に適用することができるであろう。
より具体的には、本明細書に記載の様々な基準に基づくと、化学物質のバイオプロダクションのための好適な微生物宿主は、限定されないが、グラム陰性微生物、具体的には、腸内細菌科（例えば大腸菌又はオリゴトロファ・カルボキシドボランス（Oligotropha carboxidovorans）、シュードモナス種の細菌；グラム陽性微生物、例えば枯草菌、ラクトバチルス種又はラクトコッカス種；酵母（例えば出芽酵母、ピチア・パストリス又はピチア・スチピチス（Pichia stipitis）；及びその他の群又は微生物種が挙げられる。より具体的には、脂肪酸又は脂肪酸誘導体のバイオプロダクションのための好適な微生物宿主としては、限定されないが、クロストリジウム、ザイモモナス、大腸菌、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、ラクトバチルス、エンテロコッカス、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ピチア、カンジダ、ハンセヌラ及びサッカロミセス属のメンバーが挙げられる。特に興味深い宿主としては、以下のものが挙げられる：オリゴトロファ・カルボキシドボランス（例えば株ＯＭ５）、大腸菌、アルカリゲネス・ユートロフス（カプリアビダス・ネカトール）、バチルス・リシェニホルミス（Bacillus licheniformis）、パエニバチルス・マセランス（Paenibacillus macerans）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、シュードモナス・プチダ、ラクトバチルス・プランタルム、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナリウム（Enterococcus gallinarium）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、枯草菌及び出芽酵母。
より具体的には、脂肪酸又は脂肪酸誘導体のバイオプロダクションのための好適な微生物宿主としては、限定されないが、クロストリジウム、ザイモモナス、大腸菌、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、ラクトバチルス、エンテロコッカス、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ピチア、カンジダ、ハンセヌラ及びサッカロミセス属のメンバーが挙げられる。
特に興味深い宿主としては、以下のものが挙げられる：オリゴトロファ・カルボキシドボランス（例えば株ＯＭ５Ｔ）、大腸菌、アルカリゲネス・ユートロフス（カプリアビダス・ネカトール）、バチルス・リシェニホルミス、パエニバチルス・マセランス、ロドコッカス・エリスロポリス、シュードモナス・プチダ、ラクトバチルス・プランタルム、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・ガリナリウム、エンテロコッカス・フェカーリス、枯草菌及び出芽酵母。また、これらの既知の種のいずれかを、開始時の微生物として利用することができ、また、以下の種のいずれかを利用してもよい：カプリアビダス・バシレンシス（Cupriavidus basilensis）、カプリアビダス・カンピネンシス（Cupriavidus campinensis）、カプリアビダス・ギラルディ（Cupriavidus gilardi）、カプリアビダス・ラハルシス（Cupriavidus laharsis）、カプリアビダス・メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）、カプリアビダス・オキサラチクス（Cupriavidus oxalaticus）、カプリアビダス・パウクルス（Cupriavidus pauculus）、カプリアビダス・ピナツボネンシス（Cupriavidus pinatubonensis）、カプリアビダス・レスピラクリ（Cupriavidus respiraculi）、及びカプリアビダス・タイワネンシス（Cupriavidus taiwanensis）。
いくつかの実施形態では、組み換え微生物はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、組み換え微生物は、ザイモモナス、大腸菌、シュードモナス、アルカリゲネス、及びクレブシエラ属から選択される。いくつかの実施形態では、組み換え微生物は、大腸菌、カプリアビダス・ネカトール、オリゴトロファ・カルボキシドボランス、及びシュードモナス・プチダの種から選択される。いくつかの実施形態では、組み換え微生物は、大腸菌株である。
いくつかの実施形態では、組み換え微生物は、グラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、組み換え微生物は、クロストリジウム、サルモネラ、ロドコッカス、バチルス、ラクトバチルス、エンテロコッカス、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、及びブレビバクテリウム属から選択される。いくつかの実施形態では、組み換え微生物は、バチルス・リシェニホルミス、パエニバチルス・マセランス、ロドコッカス・エリスロポリス、ラクトバチルス・プランタルム、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・ガリナリウム、エンテロコッカス・フェカーリス、及び枯草菌から選択される。特定の実施例において、組み換え微生物は、枯草菌株である。
いくつかの実施形態では、組み換え微生物は、酵母である。いくつかの実施形態では、組み換え微生物は、ピチア、カンジダ、ハンセヌラ、クレブシエラ、イサチェンキア（Issatchenkia）、及びサッカロミセス属から選択される。特定の実施形態では、組み換え微生物は、出芽酵母である。
上記の開示を鑑み、上記の微生物のいかなるものも、脂肪酸又は脂肪酸誘導体以外の化学生産物の生産のために用いられ得ると更に認識される。
宿主を遺伝子組み換えできることは、いかなる組み換え型微生物の作製においても不可欠である。遺伝子導入法は、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、接合、形質導入又は天然による形質転換によるものであってもよい。様々な宿主接合プラスミド及び薬剤抵抗性マーカーを利用できる。クローニングベクターは、宿主内で機能し得る抗生物質耐性マーカーの性質に基づき、宿主微生物に合わせて調整され得る。
Ｃ．発酵用栄養培地及び培養条件
バイオプロダクション用の培地には、適当な炭素源（例えば本明細書に開示されたタイプの１つから選択されるもの）に加えて、当業者に公知で、培養物の増殖にとって好適な、及び本発明における化学生産物のバイオプロダクションのために必要な酵素的経路の促進にとって好適な、ミネラル、塩、補因子、バッファー及び他の成分を含まなければならない。
本発明の他の態様は、本発明の遺伝子組み換え微生物と、任意のサプリメントとを含む、培地及び培養条件に関する。
典型的には、細胞を、約２５℃〜約４０℃の温度範囲で、適切な培地中で増殖させ、好熱性微生物の場合には、最高７０℃で増殖させる。本発明の好適な増殖培地は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）、Ｍ９最小培地、サブローアンドデキストロース（ＳＤ）ブロス、イーストメディウム（ＹＭ）ブロス、酵母合成最少（Ｙｍｉｎ）培地、及び本明細書に記載の最小培地（例えばＭ９最小培地）などの一般的に市販されている調製培地が挙げられる。他の既知組成培地又は合成増殖培地も同様に用いてもよく、特定の微生物の増殖のための適切な培地は、細菌学又はバイオプロダクション技術の当業者に公知である。様々な実施形態では、限定されないが、酵母抽出物、ペプトン、トリプトン、大豆粉末、コーンスティープリカー又はカゼインなどの複雑な窒素源の様々な成分を含まないか、又は１０、５、２又は１ｇ／Ｌ未満の低レベルを添加した最小培地を作製して使用してもよい。これらの最小培地は、ビオチン、ビタミンＢ１２及びビタミンＢ１２誘導体、チアミン、パントテン酸及び他のビタミンなど、ビタミン混合物を限定的に含み得る。最小培地は、２８、１７若しくは２．５ｍＭ未満のリン酸、２５若しくは４ｍＭ未満の硫酸、並びに１３０又は５０ｍＭ未満の窒素を含む、限定的な単純無機栄養分を有し得る。
バイオプロダクションのための好適なｐＨ範囲は、ｐＨ ３．０〜ｐＨ １０．０であり、ｐＨ ６．０〜ｐＨ ８．０は、初期条件のための典型的なｐＨ範囲である。例えば、ｐＨは２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０又は１０．０であり得る。しかしながら、特定の実施形態における実際の培養条件は、これらのｐＨ範囲によって限定されないことを意味する。
バイオプロダクションは、撹拌の有無にかかわらず、好気的、微好気的又は嫌気的条件下で実施され得る。
様々な実施形態では、かかる微生物集団を含むバイオリアクター容器に、本発明の方法及びシステムを更に改善するために、特定のサプリメントを提供してもよい。
Ｄ．バイオプロダクション用リアクター及びシステム
本発明に係る方法及び／又は組成物を利用した培養システムもまた、本発明の範囲内である。
本明細書に記載の、及び／又は本明細書で言及される組み換え微生物のいずれかを、商業的に実行可能な操作で、微生物が炭素源を脂肪酸又は脂肪酸誘導体に変換する産業的バイオプロダクションシステムに導入してもよい。バイオプロダクションシステムは、炭素源基質と、組み換え微生物の増殖に好適なバイオプロダクション培地とを含むバイオリアクター容器に、かかる組み換え型微生物を導入すること、並びに選択された化学生産物への基質分子の一部の所望の変換を得るのに好適な時間、好適な温度範囲（及び反応が好気性若しくは微好気的である場合には、好適な溶存酸素濃度範囲）で、バイオプロダクションシステムを維持することを含む。産業的バイオプロダクションシステム及びそれらの操作方法は、化学工学及びバイオプロセス工学の当業者に公知である。
バイオプロダクションは、撹拌の有無にかかわらず、好気的、微好気的又は嫌気的条件下で実施され得る。好気的、微好気的及び嫌気的条件を得るための培養物及び微生物集団に対する操作は、当技術分野で公知であり、栄養培地及びかかる微生物集団を含む液体培養物中の溶存酸素レベルは、所望の好気的、微好気的又は嫌気的条件を維持又は確認するためにモニターされ得る。合成ガスを原料として用いるとき、好気的、微好気的又は嫌気的条件を利用できる。糖を用いるとき、嫌気的、好気的又は微好気的条件を様々な実施形態で実行することができる。
本明細書に記載及び／又は言及される任意の組み換え型微生物を、商業的に実行可能な操作で、微生物が炭素源を選択された化学生産物に変換する、産業的バイオプロダクションシステムに導入してもよい。バイオプロダクションシステムは、炭素源基質及び組み換え型微生物の増殖に好適なバイオプロダクション培地を含むバイオリアクター容器に、かかる組み換え型微生物を導入すること、並びに選択された化学生産物への基質分子の一部の所望の変換を得るのに好適な時間、好適な温度範囲（及び反応が好気性若しくは微好気的である場合には、好適な溶存酸素濃度範囲）で、バイオプロダクションシステムを維持することを含む。
様々な実施形態では、反応容器を備えた産業的システムなどにおいて、合成ガス組成物又は糖が微生物に提供され、反応容器において、既知組成培地（限定されないが、Ｍ９最小培地、硫酸カリウム最小培地、最小塩類培地、酵母合成最小培地、及びその他の多くの培地、又はそれらの改変培地など）と、本発明で教示する生合成経路の実施形態を提供する微生物接種材料と、炭素源とが混合され得る。炭素源は細胞に入り、公知の及び一般的な代謝経路によって異化され、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）又はアセチル−ＣｏＡなどの一般的な代謝中間体を生じる。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４、ｐｐ．４２〜４５、６６〜７４（糖の基本的な代謝異化経路の教示について、参照により本発明に援用）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｄ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ ＆ Ｍ．Ｍ．Ｃｏｘ、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００、ｐｐ．５２７〜６５８（主要な代謝経路の教示について、参照により本発明に援用）；及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４ｔｈ Ｅｄ．、Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５、ｐｐ．４６３〜６５０（主要な代謝経路の教示について、参照により本発明に援用）を参照）。
産業的バイオプロダクションのタイプに付け加えて、本発明の様々な実施形態は、バッチタイプの産業的バイオプロダクションを利用してもよい。古典的なバッチ式バイオリアクターシステムは「クローズド」システムであると考えられ、すなわち、培地の組成が、各々のバイオプロダクション事象の当初で確立され、バイオプロダクション事象の終了により実質的に終了するまでの期間、培地の人為的な変更及び追加が行われないことを意味する。すなわち、バイオプロダクション事象の開始時に、所望の微生物を培地に接種し、システムにいかなるものも添加することなくバイオプロダクションを進行させる。しかしながら、典型的には、「バッチ」タイプのバイオプロダクション事象は、炭素源の追加に関して「バッチ」であり、ｐＨ及び酸素濃度などの因子の制御はしばしばなされる。バッチシステムでは、システム中の代謝生産物及びバイオマスの組成は、バイオプロダクション事象が終了する時まで常に変化する。バッチ培養では、細胞は、静的な誘導期から、対数増殖期、更に最後に成長速度が減弱又は停止する静止期へと移り変わる。無処理の場合、静止期の細胞は最終的に死滅する。対数増殖期の細胞は、一般には、所望の最終生産物又は中間体の産生量に寄与する。
標準的なバッチシステムの変法として、フェドバッチシステムがある。フェドバッチによるバイオプロダクションプロセスも、本発明において好適であり、バイオプロダクションが進行するにつれて栄養分（基質を含む）の量を増加して添加すること以外は、典型的なバッチシステムを含む。異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があるとき、及び培地中の基質量が限定的であることが望ましい場合には、フェドバッチシステムは有用である。フェドバッチシステムにおける実際の栄養分濃度の測定は、例えば異なる時間におけるサンプル分析によって直接測定してもよく、又は、測定可能な要素（例えばｐＨ、溶存酸素及びＣＯ２などの廃ガス分圧）の変化に基づいて推定され得る。バッチ及びフェドバッチによるアプローチは、当技術分野で一般的で周知の技術であり、例は、例えばＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．，Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７（１９９２）、及びＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，２ｎｄ Ｅｄ．Ｊ．Ｅ．Ｂａｉｌｅｙ及びＤ．Ｆ．Ｏｌｌｉｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６に見出され得る（バイオプロダクションについての一般的な教示について、参照により本発明に援用する）。
本発明の実施形態は、バッチ方式又はフェドバッチ方式で行われてもよいが、本発明はまた、連続的バイオプロダクション方法にも適応可能であろうと考えられる。連続的バイオプロダクションは、「オープン」システムと考えられ、既知組成のバイオプロダクション用の培地が連続的にバイオリアクターに添加され、それと同時に等量の条件培地が処理のために除去される。連続的バイオプロダクションは、一般に、主に対数増殖期の細胞密度の範囲となるように培養を維持する。２種類の連続的バイオリアクター操作は、ケモスタットを含み、すなわち新鮮な培地を容器に供給するのと同時に、同じ速度で容器内容物を除去する。このアプローチの欠点は、細胞が失われ、一般に高い細胞密度を達成できない点である。実際、典型的には、フェドバッチプロセスではより高い細胞密度を得ることができる。他の連続的バイオリアクターでは、灌流培養を利用する。それは、容器から除去される液体が分離技術工程に供され、それにより生きた菌を容器に戻すようにリサイクルされることを除き、ケモスタットアプローチと類似である。この種の連続的バイオリアクター操作は、フェドバッチ方式より有意に高い細胞密度を得ることができ、連続的に操作できることが示されている。連続的バイオプロダクションは、次のバイオプロダクション事象のための装置の排出、洗浄、及び準備に関連するダウンタイムが少ないため、特に工業操作において有利である。更に、下流の操作（例えば蒸留）を連続的に操作することは、バッチ式で行うよりも、典型的に無駄がなくなる。
連続的バイオプロダクションでは、細胞増殖又は最終生産物濃度に影響を及ぼす１つ又はそれ以上の要因の調節が可能となる。例えば、１つの方法では、炭素源又は窒素レベルなどの限定的栄養分を一定速度に維持して、他の全パラメータを控えめにすることが可能である。また他のシステムでは、細胞濃度（培地の濁度で測定）を一定に維持しつつ、細胞増殖に影響を及ぼす多くの因子を連続的に変化させることができる。連続的バイオプロダクションプロセス用に、栄養分及び増殖因子を調節する方法、並びに生産物の生成速度を最大にする技術は、微生物工学の技術分野で周知であり、その種々の方法については、上記のＢｒｏｃｋにより詳述される通りである。
本発明の実施形態では、バッチ、フェドバッチ又は連続プロセスのいずれによっても実施でき、また既存のいかなるバイオプロダクション方法も好適であろうと考えられる。細胞を、細胞触媒として不活性な足場に固定して、化学生産物のバイオプロダクションに好適なバイオプロダクション条件に供してもよく、又は、容器（例えば培養容器）内の液体培地中で培養してもよいと考えられる。すなわち、かかるプロセス、及びこれらのプロセスを使用したバイオプロダクションシステムで用いられる実施形態は、本発明の遺伝子組み換え微生物集団と、かかる微生物集団への栄養分を含む培地中に微生物集団を含む培養システムと、選択される化学生産物の製造方法と、を含む。
本発明の実施形態は、バイオプロダクションシステムにおける選択された化学生産物の製造方法を含み、そのうちのいくつかの方法は、かかるバイオプロダクション事象の後に、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を得ることを含み得る。例えば、脂肪酸又は脂肪酸誘導体の製造方法は、以下を含み得る：好適な栄養分を含む培地を培養容器に提供するステップと；本明細書に記載の遺伝子組み換えを含む遺伝子組み換え微生物の接種材料を培養容器に提供して、選択された化学生産物を合成ガス及び／又は糖分子から当該微生物に産生させるステップと、遺伝子組み換え微生物に好適な条件下に、培養容器を維持して、選択された化学生産物を産生させるステップ。
本発明の範囲内には、１つ又は２つ以上の改変を有さない対照微生物と比較して、化学生産物のバイオプロダクションを少なくとも２０％増加させるために有効な、１つ又は２つ以上の態様を改変するために遺伝子組み換えされた微生物を、選択された化学生産物生産のための工業的バイオプロダクションシステムを含むバイオプロダクション法及びシステム中で産生及び利用することが含まれる。
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載の化学生産物のバイオプロダクション用のシステムに関し、当該システムは以下を含む：微生物細胞の培養に好適な培養タンク；発酵タンクから抽出及び／又は分離容器に、内容物を排出するための配管；及び、細胞培養老廃物からの化学生産物の分離に適する、抽出及び／又は分離容器。様々な実施形態では、システムは、１つ又は２つ以上の前発酵タンク、蒸留カラム、遠心分離容器、逆抽出カラム、混合容器又はその組合せを含む。
以下の公表文献は各々、これらの関連する技術分野における技術レベルを示すために、並びに必要に応じて、糖源からの、本発明で産生される化学生産物の産業的バイオプロダクション方法、並びに本発明のいずれかの組み換え型微生物によりかかる変換を達成するために用いられ得る産業的システムの作製及び使用方法を教示する本開示を支持するために、当該開示内容を参照により本発明に援用する：（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，２ｎｄ Ｅｄ．Ｊ．Ｅ．Ｂａｉｌｅｙ ａｎｄ Ｄ．Ｆ．Ｏｌｌｉｓ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６，表記の目的に関して書物全体、及びＣｈａｐｔｅｒ ９，ｐａｇｅｓ ５３３〜６５７、特にバイオリアクターの設計に関して；Ｕｎｉｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ｌ．ＭｃＣａｂｅら、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９３，表記の目的、及び特にプロセス及び分離技術の分析に関して書物全体；Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｓｔａｇｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｐ．Ｃ．Ｗａｎｋａｔ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ ＵＳＡ，１９８８，分離技術の教示に関して書物全体）。
Ｆ．製造基準
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換えにより、目的の脂肪酸又は脂肪酸誘導体化学物質の微生物における生合成が、当該遺伝子組み換えの行わないコントロール微生物における当該目的化学物質の合成速度及び力価よりも高くなる。いくつかの実施形態では、当該遺伝子組み換えは、遺伝子組み換えを欠如する対照微生物の酵素的変換と比較し、選択された化学生産物への酵素的変換を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％又は少なくとも約５０％増加させるのに有効である。様々な実施形態では、例えば本明細書で開示される方法の１つを用いることなどにより、選択された化学生産物のバイオプロダクションは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、及び少なくとも５０ｇ／Ｌの力価に達し得る。
選択された化学生産物の商業的発酵に関して、本明細書で開示される技術革新を認識することによって実現され得るように、本発明の実施形態を、他の遺伝子組み換え及び／又は他の方法若しくはシステム調節と組み合わせて、それにより、本明細書で開示される特異的生産性及び／又は容積測定生産性でて、最終的な（例えば消費される全）発酵ブロス１Ｌ当たりの化学生産物（例えば脂肪酸又は脂肪酸誘導体）を、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも８０、少なくとも１００又は少なくとも１２０ｇ産生するのに有効な微生物（及び対応する方法）を得てもよい。バイオプロダクション用培地で通常生産される化学生産物の量は、当業者に公知の様々な方法を使用して測定することができ、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）又はＧＣ／質量分析法（ＭＳ）などにより測定できる。
遺伝子組み換え微生物の集団による予想外の特異的生産性の増大は、微生物が、マロニル−ＣｏＡから選択された化学生産物への微生物産生経路を有し、微生物中の脂肪酸シンターゼ系中の選択された酵素（より詳しくは、そのマロニル−ＡＣＰ依存的脂肪酸伸長酵素）の酵素活性を減少させ、更に、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存的脂肪族アシルＣｏＡ産生経路の活性を増加させる、方法及びシステムにおいて実現されうる。
いくつかの実施形態では、微生物による化学物質のバイオプロダクション事象（すなわち、培養微生物集団を使用した発酵事象）は、本明細書に記載の遺伝子組み換え微生物を使用して進行し、その特異的生産性は、単位時間当たりの乾燥重量（ｇ化学生産物／ｇＤＣＷ−時間）に基づく微生物細胞１ｇあたりの選択された化学生産物の生産量が、０．０１〜０．６０ｇである。様々な実施形態では、特異的生産性は、０．０１超、０．０５超、０．１０超、０．１５超、０．２０超、０．２５超、０．３０超、０．３５超、０．４０超、０．４５超又は０．５０ｇ超の化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時である。特異的生産性は、特定の微生物による化学物質の産生事象において、２、４、６、８、１２又は２４時間にわたり評価され得る。より詳細には、化学生産物の特異的生産性は、０．０５〜０．１０、０．１０〜０．１５、０．１５〜０．２０、０．２０〜０．２５、０．２５〜０．３０、０．３０〜０．３５、０．３５〜０．４０、０．４０〜０．４５若しくは０．４５〜０．５０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時、又は、０．５０〜０．５５若しくは０．５５〜０．６０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時である。様々な実施形態では、かかる生産性を示す培養システムが含まれる。
また、本発明の様々な実施形態では、得られる容積測定生産性は、１Ｌ当たり毎時約０．２５ｇ（ｇ（化学生産物）／Ｌ−時間）の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約０．２５ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約０．５０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約１．０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約１．５０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約２．０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約２．５０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約３．０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約３．５０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約４．０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約４．５０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約５．０ｇ／Ｌ−時間庁の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約５．５０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約６．０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約６．５０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約７．０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約７．５０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約８．０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約８．５０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約９．０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、約９．５０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよく、又は、約１０．０ｇ／Ｌ−時間超の脂肪酸（又は他の化学生産物）であってもよい。
いくつかの実施形態では、２４時間にわたる発酵（培養）機関のあいだに測定される特異的生産性は、微生物のＤＣＷ（ｇ）当たり（２４時間後の最終的なＤＣＷに基づく）、約０．０１、０．０５、０．１０、０．２０、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０又は１２．０ｇ超の化学生産物、でありうる。
本発明の様々な態様及び実施形態では、微生物特異的な生産性の実質な増大が得られ、それにより、発酵の技術分野及び微生物による化学物質（例えば、限定されないが脂肪酸）製造の産業的経済的実現可能性の前進が得られる。
言い換えると、様々な実施形態では、特異的生産性は、０．０１ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上、０．０５ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上、０．１０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上、０．１５ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上、０．２０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上、０．２５ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上、０．３０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上、０．３５ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上、０．４０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上、０．４５ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上、０．５０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上、又は０．６０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間以上である。本発明の特定の実施形態では、化学生産物は、脂肪酸又は脂肪酸誘導体である。
より一般的には、本明細書に記載の遺伝子組み換えの様々な組合せに基づいて、また任意に、本明細書に記載の補足と組み合わせて、脂肪酸又は脂肪酸誘導体の、及び本明細書に記載の他の化学生産物の特異的生産性の値は、０．０１ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間超であってもよく、０．０５ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間超であってもよく、０．１０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間超であってもよく、０．１５ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間超であってもよく、０．２０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間超であってもよく、０．２５ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間超であってもよく、０．３０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間超であってもよく、０．３５ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間超であってもよく、０．４０ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間超であってもよく、０．４５ｇ化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間超であってもよく、また０．５０ｇ又は０．６０化学生産物／ｇ ＤＣＷ−時間超であってもよい。かかる特異的生産性は、特定の微生物による化学品の産生事象において、２、４、６、８、１２又は２４時間にわたり評価され得る。
本発明の実施形態によって得られる改善は、本明細書で教示する特定の遺伝子組み換えの組合せを有さない適切な対照微生物と比較した特異的生産性のパーセンテージ増大によって、又は容積測定生産性のパーセンテージ増大によって決定され得る（本明細書での教示に係る、微生物集団を含む容器に添加されるサプリメントの有無に拘わらず）。特定の実施形態及びそのグループにおいて、かかる特異的生産性及び／又は容積測定生産性の改善は、かかる適切な対照微生物の各々の特異的生産性及び／又は容積測定生産性と比較して、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００及び少なくとも５００％である。
本明細書（及び／又は参照によって援用される引用文献）の具体的な方法及び教示内容は、実施例においても援用され得る。また、化学生産物の産生は、様々な実施形態で少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、及び少なくとも５０ｇ／Ｌの力価に達しうる。
上記測定基準は、任意の組成物、例えば遺伝子組み換え微生物、方法、例えば化学生産物の製造方法、及びシステム、例えば本明細書で開示される遺伝子組み換え微生物及び／又は方法を利用する発酵システムにも適用できる。
本発明で提供され、並びに経路及び経路の一部の相互関係の発見に基づくストラテジー及び方法を使用した繰り返しの改善により、バイオプロダクション事象において更に大きい化学生産物のバイオプロダクションにつながり得ると考えられる。
ＶＩ．得られる生産物−化学生産物
本明細書に記載の新規なバイオプロダクション経路、発酵プロセス及び遺伝子組み換え微生物は、関心対象の様々な化学生産物を生産するように工学操作される。１つの化学生産物は、４〜１８超の炭素原子数（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の炭素原子数）のいかなる鎖長の脂肪酸であってもよい。この化学生産物の群には、以下のものが含まれる：酪酸エステル又は酪酸、吉草酸エステル又は吉草酸、カプロン酸エステル又はカプロン酸、エナント酸エステル又はエナント酸、カプリル酸エステル又はカプリル酸、ペラルゴン酸エステル又はペラルゴン酸、カプリン酸エステル又はカプリン酸、ウンデシル酸エステル又はウンデシル酸、ラウリン酸エステル又はラウリン酸、トリデシル酸エステル又はトリデシル酸、ミリスチン酸エステル又はミリスチン酸、ペンタデカン酸エステル又はペンタデカン酸、パルミチン酸エステル又はパルミチン酸、マルガリン酸エステル又はマルガリン酸、ステアリン酸エステル又はステアリン酸、ノナデシル酸エステル又はノナデシル酸、アラキジン酸エステル又はアラキジン酸。これらの脂肪酸生産物は、脂肪族アシルＣｏＡチオエステラーゼ又はワックスエステルシンターゼの活性により、中間体の脂肪アシルＣｏＡから産生され得る。あるいは、これらの脂肪酸はまた、最初に脂肪族アシルリン酸を産生する脂肪族アシルＣｏＡホスホトランスフェラーゼと、次いで脂肪族アシルリン酸から脂肪酸を産生する脂肪酸キナーゼの作用との協調活性により脂肪族アシルＣｏＡ中間体から産生してもよい。
他の化学生産物は、４〜１８超の炭素原子数（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の炭素原子数）のいかなる鎖長の脂肪族アルデヒドであってもよい。この化学生産物の群には、以下のものが含まれる：ブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、カプロアルデヒド、エナントアルデヒド、カプリルアルデヒド、ペラルゴンアルデヒド、カプラルデヒド、ウンデシルアルデヒド、ラウルアルデヒド、トリデシルアルデヒド、ミリスタルデヒド、ペンタデシルアルデヒド、パルミトアルデヒド、マルガルアルデヒド、ステアルアルデヒド、ノナデシルアルデヒド、及びアラキドアルデヒド。これらのアルデヒド生産物は、脂肪族アシルＣｏＡレダクターゼ又はアシルＣｏＡレダクターゼの活性により、脂肪族アシルＣｏＡ中間体から産生されうる。脂肪酸の産生株は、脂肪族アルデヒドの産生にも用いられ得る。
他の化学生産物は、４〜１８超の炭素原子数（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の炭素原子数）のいかなる鎖長の脂肪族アルコールであってもよい。この化学生産物の群には、以下のものが含まれる：ブタノール、アミルアルコール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ヘンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、へプタデカノール、オクタデカノール、ノナデカノール、及びエイコサノール。これらの脂肪酸生産物は、アルデヒドレダクターゼの活性により、脂肪族アルデヒドから産生され得る。脂肪酸の産生株は、脂肪族アシルＣｏＡ又は遊離脂肪酸を脂肪族アルコールに変換する酵素をコードする遺伝子を発現することにより、脂肪族アルコールの産生にも用いられ得る。これらの酵素の例としては、アルコール形成アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．−）、又は長鎖脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．５０）とアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）との組合せ、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．−）とアルコールデヒドロゲナーゼとの組合せが挙げられる。脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドは、アシネトバクターＳＰ ＡＤＰ１のｆａｂＧ遺伝子（登録番号ＹＰ＿０４７８６９）により提供される。脂肪アシルレダクターゼ活性を有するポリペプチドは、カイコ（Bombyx mori）のＦＡＲ−Ｎ＿ＳＤＲ＿ｅ遺伝子（登録番号ＢＡＣ７９４２５）によって提供される。アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）ＮＧ８０−２のＡＬＤＨ遺伝子（登録番号ＹＰ＿００１１２５９７０）によって提供される。アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、大腸菌のｙｑｈＤ遺伝子（登録番号ＡＰ＿００３５６２．１）によって提供される。これらの活性物質の更なる給源は、当業者に公知であり、これらを組み合わせて脂肪族アルコールを産生する産生株を作製することができる。
他の化学生産物は、４〜１８超の炭素原子数（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の炭素原子数）のいかなる鎖長のαオレフィンであってもよい。
他の化学生産物は、４〜１８超の炭素原子数（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の炭素原子数）のいかなる鎖長のアルカンであってもよい。
他の化学生産物は、４〜１８超の炭素原子数（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の炭素原子数）のいかなる鎖長の二塩基酸であってもよい。これらの脂肪酸誘導体は、当業者に公知の酵素によって、オメガ酸化又は末端酸化を経て、脂肪酸から産生され得る。
これらのいずれかも、選択された化学生産物、又は関心対象の化学生産物、又は、脂肪酸生産物、脂肪酸誘導体若しくは脂肪酸生産物誘導体として本明細書において記述され得る。また、上記のリストについていかなる分類（いかなるサブグループも含む）を行っても、「選択された化学生産物」、「関心対象の化学生産物」等として言及されるものと考えられ得る。これらの化学生産物のいずれについても、微生物は、かかる化学生産物の所望の産生を実現するために、かかる化学生産物の生合成経路を本質的に含み得るか、及び／又はかかる生合成経路を提供若しくは完成させるために１つ又は２つ以上の異種核酸配列の付加を必要とし得る。
ＶＩＩ．開示された実施形態は、非限定的である
本発明の様々な実施形態を示し、記載したが、かかる実施形態が例証としてのみ提供されるものであることを注記する。様々なバリエーション、変化及び入れ替えを、本発明に係る実施形態から逸脱しない範囲で適宜行うことができる。具体的には、いかなる理由であれ、化合物、核酸配列、機能的酵素を含む特定のタンパク質を含むポリペプチド、代謝経路の酵素若しくは中間体、要素、又は他の組成物、又は本明細書で記載されるか、リスト、表に記載又は示される濃度に関する分類、又は他の分類（例えばスキーム中で示される代謝経路の酵素）については、特に明記しない限り、各分類が、様々なサブセットの実施形態のための基礎を提供してそれらを同定するために役立つものであり、サブセットの最も幅広い範囲の実施形態は、各記載の分類中の１つ又は２つ以上の構成要素（又はサブセット）を除外することにより、かかる分類中のあらゆるサブセットを含むと考えられる。更に、本発明のいかなる範囲も、特に明記しない限り、その中の全ての値及びその中の全ての部分範囲を含む。
また、より一般的には、本発明の開示、考察、実施形態及び実施例に従うと、当業者の技術の範囲内の、従来公知のあらゆる分子生物学、細胞生物学、細菌学、及び組み換えＤＮＡ技術を使用できる。かかる技術は、文献を通じて十分に説明される。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，」Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１（ｖｏｌｕｍｅｓ １〜３）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；及びＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、ｅｄ．、１９８６．を参照）。これらの公表された資料は、そこに記載の標準的な実験手法に関する教示について、本発明に参照により援用する。かかる援用は、少なくとも、当該参考文献を本発明で引用するとき、示され得る具体的な教示及び／又は他の目的に適ったものである。具体的な教示及び／又は他の目的が示されない場合、公表された資料は、具体的には、参考文献の表題、要約及び／又は抄録の１つ又は２つ以上において示される教示について援用される。かかる具体的に示された教示及び／又は他の目的が適当でない場合、公表された資料は、本発明が関連する技術分野の状況をより完全に記載し、及び／又は、必要に応じて、当業者に一般的に公知の教示内容を利用できるように提供するために援用される。しかしながら、本明細書における公表資料の引用は、それらが本発明に対する先行技術文献であることを認めるものではないことを具体的に注記する。また、援用された公表資料の１つ又は２つ以上が、本出願（限定されないが、定義済みの用語、用語の使用態様、記載された技術等）と異なる場合には、本出願を優先させるものとする。実施例中の開示内容は、既に開示されていない範囲については、本セクションに援用するものとする。
実施例１：ＮｐｈＴ７変異体
酵素ＮｐｈＴ７は、プライマーとしてのアセチル−ＣｏＡと、伸長ドナーとしてのマロニル−ＣｏＡと、により３−ケト−Ｃ４−ＣｏＡ生産物を産生する活性を示す、３−ケト−アシルＣｏＡシンターゼである。天然の酵素は、長鎖プライマー鎖に対して検出可能な活性を示さない。ＮｐｈＴ７の残基の修飾を行って、炭素数４以上の鎖長の基質を受容するようアシルＣｏＡ結合ポケットを改変した。これらの修飾は、１アミノ酸の変化、１アミノ酸変化の組合せ、及び構造ループの標的特異的な修飾であり、それにより、マロニル−ＣｏＡと、炭素数４以上の鎖長のアシルＣｏＡ（例えばＣ４−ＣｏＡ及びＣ６−ＣｏＡ）との縮合反応が可能になる。かかる修飾は、以下の基準に基づき行った。
（ａ）関連する酵素（ヒト型結核菌由来のｆａｂＨ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａＢａｓｅにおける構造１Ｕ６Ｓ））の結晶構造学的試験の結果、表１６に示す残基で、アシル鎖と接触することが確認された。ＮｐｈＴ７中の対応する残基を、相同性に基づき同定した。
Figure 0006603658
（ｂ）リッドスワップ変異体。ｍｔＦａｂＨとＮｐｈＴ７との間の、配列及び構造の相同性比較の結果、ＮｐｈＴ７中で残基１６７〜２０１を含む予想されるＬ９ループが明らかとなった。アミノ酸配列：ＧＧＬＴＤＬＩＲＶＰＡＧＧＳＲＱＰＬＤＴＤＧＬＤＡＧＬＱＹＦＡＭＤは、アシルＣｏＡのリッドに対応するＬ９ループ構造を形成する。リッドの飽和突然変異（リッドの各アミノ酸の他のあらゆるアミノ酸への変異、及びリッド内の突然変異の組合せ）により、更に大きなアシルＣｏＡ鎖を受容するリッド構造の改変がもたらされ得る。
変異体ｎｐｈＴ７遺伝子は、オリゴヌクレオチドに部位特異的変異導入によって構築され、全ての変異体が、ＤＮＡのシークエンシングによって正しいことを確認した。親の及び変異体のｎｐｈＴ７遺伝子を、６×Ｈｉｓ残基と共にインフレームでｐＥＴ２８ｂベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、３５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ中、３７℃で、ＯＤ６００が０．４となるまでインキュベートした。０．１ｍＭのＩＰＴＧの添加により発現を誘導した。細胞を１８℃でインキュベートし、１８時間後、４℃、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心単離して回収した。ペレットを、−８０℃で保存した後溶解した。細胞を、５０ｍＬの溶解バッファー（２５ｍＭのトリス（ｐＨ ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、及びベンゾナーゼヌクレアーゼを含む）中に懸濁し、マイクロフルダイザー（Microfluidizer）（２パス）で溶解させ、溶解液を調製した。４℃、１２，０００ＲＰＭで３０分間遠心単離し、可溶性分画を単離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシー染色）及び抗Ｈｉｓウェスタンブロッティング（４μｇの可溶性成分／レーン、可溶性／不溶性分画共に同量を維持）によって発現を解析した。ＮｐｈＴ７酵素を、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィにより精製した。ループ変異体ｍｔｌｏｏｐ１及びｍｔｌｏｏｐ２を更に、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーを使用して精製した。
５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）試薬、ドナー基質としてのマロニル−ＣｏＡ及び様々なプライマー基質（アセチル−ＣｏＡ、Ｃ４−ＣｏＡ、Ｃ６−ＣｏＡ又はＣ１０−ＣｏＡ）を使用し、遊離のＣｏＡ−ＳＨの放出を測定することによって、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ活性をモニターした。
Figure 0006603658
 を、酵素活性の決定に用いた。また、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ活性は、３−ケトアシル−ＣｏＡの産生と、その後の精製ＰａＦａｂＧとＮＡＤＰＨとによる３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ生産物の形成とをカップリングさせることによってもモニターした。室温で３０分間反応させ、アセトニトリルを２０％となるように添加することにより反応を停止させ、１５分間氷中でインキュベートし、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
様々な工学操作されたＮｐｈＴ７変異体の比活性を、表１７に示す。更に、ＵＰＬＣ−質量分析を使用して反応生産物を測定することによって、Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ変異を有する変種ＮｐｈＴ７は、伸長ドナーとしてマロニル−ＣｏＡを使用して、Ｃ４−ＣｏＡから３−ケト−Ｃ６−ＣｏＡを、Ｃ６−ＣｏＡから３−ケト−Ｃ８−ＣｏＡを、及びＣ１０−ＣｏＡからの３−ケト−Ｃ１２−ＣｏＡを産生することが示された（図１５を参照。ＮｐｈＴ７反応生産物は、ＰａＦａｂＧによって３−ＯＨ−アシルＣｏＡに変換され、ＵＰＬＣ−ＭＳによる定量化が可能となった。）。これらの結果から、ＮｐｈＴ７の選択された残基の修飾により、野生型の酵素におけるアセチル−ＣｏＡに対するほぼ排他的な選好性から、Ｃ４−ＣｏＡに対する顕著な活性を示す変異体にまで、基質選好性が変化することが明らかとなった（例えば変種Ｖ１５７Ｆ、Ｆ２１７Ｖ及びＩ１４７Ｓ、Ｆ２１７Ｖ）。
Figure 0006603658
 「ＮＤ」：非検出



実施例２：３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ候補体を同定するためのストラテジー：
ＮｐｈＴ７は、他の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ候補体を同定するためのストラテジーを作成するための理想的な出発点である。何故なら、伸長材としてマロニル−ＡＣＰを使用するＩＩ型ＦＡＳである３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）とは異なり、マロニル−ＣｏＡを使用する特異的な反応を行うことができ、そのため、ＮｐｈＴ７のホモログは、マロニル−ＣｏＡに対する特異性をおそらく維持していると考えられるからである。更に、様々な生物由来のＫＡＳ ＩＩＩは、結晶構造及び生化学アッセイによって特徴が調べられており、それにより基質結合部位及び基質特異性が定義されている。ＮｐｈＴ７とは異なり、様々な生物由来のＫＡＳ ＩＩＩは、長鎖又は分岐鎖のアシルＣｏＡに対して異なる特異性を有することが示されている。ＫＡＳ Ｉ及びＫＡＳ ＩＩに関して同様の情報があるが、縮合反応の基質としてアシルＣｏＡを利用するＫＡＳ ＩＩＩとは異なり、それらは基質としてアシルＡＣＰを必要とする。したがって、既知のＫＡＳ ＩＩＩの結晶構造及び生化学データは、アシルＣｏＡを認識する保存された残基を同定するための指針、及び長鎖アシルＣｏＡを利用するＮｐｈＴ７ホモログの同定を促進するための補助を提供する。
Figure 0006603658
 ａ 基質特異性は、酵素活性により測定。
＊ 基質は、分岐鎖アシルＣｏＡを含む。
Ｏｋａｍｕｒａら（ＰＮＡＳ、２０１０）は、ＮｐｈＴ７の生化学機能を定義し、他のＮｐｈＴ７ホモログ及び大腸菌ＫＡＳ ＩＩＩ、ＦａｂＨ（ｅｃＦａｂＨ）とのアミノ酸配列比較を行う。主に、詳細に特徴づけられたｅｃＦａｂＨを用いて、全てのＮｐｈＴ７（ＮｐｈＴ７及び６つのＮｐｈＴ７ホモログ）の類似性、並びにＫＡＳ ＩＩＩとの主な差異について述べている。Ｏｋａｒａｍｕｒａらの情報、並びに他のＫＡＳ ＩＩＩについて記述する他の報告を用いて、３−ケトアシル−ＣｏＡ候補体を同定するためのルールを定義する。
３−ケトアシル−ＣｏＡ候補体を同定するため、以下の５つのストラテジーを用いた：
１．ＮｐｈＴ７ホモログを同定するＢＬＡＳＴｐ：
理論：
ａ．縮合反応の伸長剤として、マロニル−ＣｏＡを利用する可能性が最も高い。
２．（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲ配列モチーフを含むホモログを同定すること。
理論：
ａ．ＮｐｈＴ７ホモログ中の予測されるＬ９ループに、更なる配列を挿入して、（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲ配列モチーフを共有する。
ｂ．Ｏｋａｍｕｒａらは、（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲのモチーフが、伸長剤の基質であるマロニル−ＣｏＡのＣｏＡ部分認識部位の１つとして用いられ得ることを示唆する。
ｃ．（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲのモチーフ及び更なる配列が、ＫＡＳ ＩＩＩホモログで見いだされない場合、配列モチーフがＮｐｈＴ７ホモログに特異的であることを示す。
ｄ．参照
ｉ．Ｏｋａｍｕｒａら、ＰＮＡＳ ２０１０
３．ＳＴＰＤＸＰＱ配列のモチーフを含まないＮｐｈＴ７ホモログを選択：
理論：
ａ．ｅｃＦａｂＨ（ＫＡＳ ＩＩＩ）においてプライマー基質特異性を示すＰｈｅ８７残基を、ＮｐｈＴ７ホモログにおいてＧｌｎで置換する。
ｂ．全てのＮｐｈＴ７ホモログは、Ｇｌｎが配列モチーフの一部であるＳＴＰＤＸＰＱ配列モチーフを共有する。
ｃ．ＫＡＳ ＩＩＩホモログは、ＳＴＰＤＸＰＱのモチーフを保存していない。
ｄ．参照
ｉ．Ｏｋａｍｕｒａら、ＰＮＡＳ ２０１０
４．基質結合部位中に疎水性残基のみを含むホモログを同定すること：
理論：
ａ．アセチルＣｏＡのアセチルメチル基の認識のための疎水性ポケットを形成する、ｅｃＦａｂＨのＰｈｅ８７、Ｌｅｕ１４２、Ｐｈｅ１５７、Ｌｅｕ１８８及びＬｅｕ２０５は、ＮｐｈＴ７ホモログにおいて保存されていない。
ｉ．ＮｐｈＴ７は、疎水性残基である５アミノ酸のうちの３アミノ酸を有する。
ｂ．大部分の疎水性残基は、ＫＡＳ ＩＩＩホモログ間で保存されている。
ｃ．参照
ｉ．Ｏｋａｍｕｒａら、ＰＮＡＳ ２０１０
ｉｉ．Ｑｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５
ｉｉｉ．Ｓｃａｒｓｄａｌｅら、ＪＢＣ ２００１
ｉｖ．Ｑｕｉら、ＪＢＣ １９９９
５．ＮｐｈＴ７ホモログの異なるファミリーを特定すること：
理論：
ａ．上記の要件を満たしたＮｐｈＴ７ホモログの複数の配列アラインメント（ＭＳＡ）から作成される系統樹は、異なる祖先から進化したＮｐｈＴ７ホモログで最も多様な群を代表する候補体を選択するのに用いられる。
ｉ．多様性は、様々な祖先からの進化のため、様々な特異性を有するＮｐｈＴ７ホモログを発見する確率が最も高いと考えられる。
結果／結果物
以下は、上記で概説される３−ケトアシル−ＣｏＡ候補体を同定するための５つのストラテジーからの結果を要約する：
１．ＮｐｈＴ７の相同性サーチ
ａ．ＢＬＡＳＴ検索は、ｅ値のカットオフのない最大配列標的１０，０００で、ＮｐｈＴ７を参照配列として実施した。
ｉ．ＢＬＡＳＴ検索により、７１４１個のＮｐ７ｈＴホモログが得られた。
２．（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲのモチーフを有するＮｐｈＴ７ホモログを選択する。
ａ．３０９個のＮｐｈＴ７ホモログが、（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲのモチーフを有した。
３．ＳＴＰＤＸＰＱ配列のモチーフを有するホモログを除去する。
ａ．２８８個のＮｐｈＴ７ホモログは、ＳＴＰＤＸＰＱのモチーフを有さなかった。
４．基質結合ポケット中の疎水性残基の保存に基づき選択する。
ａ．２８８個のホモログのうち、１４４個のＮｐｈＴ７ホモログは、ＫＡＳ ＩＩＩ間で保存された５個の残基において、疎水性残基を有した。
５．ＮｐｈＴ７及び既知のＫＡＳ ＩＩＩからの進化距離に基づく選択。
ａ．ＮｐｈＴ７ホモログ、ＮｐｈＴ７、ｅｃＦａｂＨ、ｍｔＦａｂＨ、ｂｓＦａｂＨ１、ｂｓＦａｂＨ２、ｓａＦａｂＨ、（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲ配列のモチーフを有するｓｐＦａｂＨ、のＭＳＡから構成した系統樹は、ＮｐｈＴ７ホモログの６つの異なるファミリーが存在することを示す（表１７）。
ｂ．全６種類のファミリーをカバーする、２２個の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ候補体を選択した。
ｉ．１０個の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ候補体。
１．（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲ配列のモチーフを有する。
２．ＳＴＰＤＸＰＱ配列のモチーフを有さない。
３．保存された疎水性残基を有する。
ｉｉ．１１個の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ候補体。
１．（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲ配列のモチーフを有する。
２．ＳＴＰＤＸＰＱ配列のモチーフを有さない。
ｉｉｉ．１個の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ候補体。
１．（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲ配列のモチーフを有する。
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ候補体のリスト。
上記の基準に基づいて選択された３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを列挙する。更に、各シンターゼを、ＮｐｈＴ７、ｅｃＦａｂＨ、ｍｔＦａｂＨ及びｓａＦａｂＨと整列させて、配列同一性（％）、類似性及びギャップを決定した。シンターゼ１〜１０は、全ての基準を満たすことに基づいて選択される。シンターゼ１１〜２１は、保存された疎水性残基を除き、全ての基準を満たすことに基づいて選択される。シンターゼ２２は、（Ａ／Ｇ）ＧＧＳＲ配列のモチーフを有することに基づいて選択される。
Figure 0006603658
実施例３：ＮｐｈＴ７変異体及び／又はｆａｂＨホモログ及びチオエステラーゼの組み合わせによる、特定の鎖長を有する脂肪酸の産生：
Ｃ４、Ｃ６、及びＣ１０の鎖長のアシル−ＣｏＡを伸長できるＮｐｈＴ７の変異体を工学操作したが、これらの酵素の比活性は、より長い鎖長では比較的低い。アシル−ＣｏＡの炭素数を２つ伸長させて３−ケト−アシルＣｏＡを形成する反応はまた、ＫＡＳＩＩＩ酵素として知られ、ｆａｂＨ遺伝子ホモログによってコードされるケト−アシル−ＣｏＡシンターゼによって触媒される反応である。多くのかかる遺伝子ホモログは、ＤＮＡ合成業者（ＤＮＡ２．０）により、大腸菌において最適に発現させるためのコドンを使用して合成され、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の精製のために、Ｎ末端で６×Ｈｉｓ残基と融合される。遺伝子を大腸菌で発現させて、ＫＡＳ活性を、種々の鎖長のアシル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡとの縮合によるＣｏＡ−ＳＨ放出を、ＤＴＮＢアッセイを用いてアッセイした。表２０は、十分に高レベルなＫＡＳ活性を有する酵素ホモログであって、が表に示す様々な鎖長のアシル−ＣｏＡを伸長する能力を有する酵素を列挙する。表２０の結果から明らかなように、様々な給源からのＦａｂＨ酵素は、様々な基質鎖長選好性を示す。
Figure 0006603658
鎖長特異性に対する更なるアプローチは、アシル−ＣｏＡ前駆体からの脂肪酸の放出を標的とすることによって可能となる。種々のチオエステラーゼをコードする遺伝子は、ＤＮＡ合成業者（ＤＮＡ２．０）によって、大腸菌において発現させるために最適化されたコドンと発現遺伝子とを使用して合成した。酵素の精製は、Ｎ末端の６Ｈｉｓ親和性タグに基づくアフィニティークロマトグラフィーによって行った。異なる鎖長のアシル−ＣｏＡに対する、この種のチオエステラーゼ活性を評価した（図１６）。すなわち、チオエステラーゼＰＡ２８０１ＴＥには、Ｃ６−ＣｏＡからＣ１６−ＣｏＡまで幅広い特異性を有する一方、チオエステラーゼ‘ｔｅｓＡには、Ｃ１０より短いアシルＣｏＡに対する検出可能な活性がなく、Ｃ１０−ＣｏＡに対する活性も最小である。
このように、ＮｐｈＴ７変異体、表２０に示す所望の特異性を有するＦａｂＨ、及び図１６に示す適切なチオエステラーゼを、工学操作設計された脂肪酸経路を構成する酵素と共に組み換え型生物へ組み入れることにより、特定の鎖長を有する脂肪酸の標的産生が可能となる。
実施例４：フラスコ振とうによる遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の製造：
多くの遺伝子組み換え大腸菌株を、遊離脂肪酸の産生に関して評価した。これらの株は、宿主株ＢＷ２５１１３を基礎として、以下のような追加の遺伝子組み換えを有する組み換え宿主を含む：ΔｌｄｈＡ：：ｆｒｔ、ΔｐｆｌＢ：：ｆｒｔ、ΔｍｇｓＡ：：ｆｒｔ、ΔｐｏｘＢ：：ｆｒｔ、Δｐｔａ−ａｃｋ：：ｆｒｔ；ｆａｂＩ（ｆａｂＩｔｓ Ｓ２４１Ｆ）の温度感受性アレル；及びアシルＣｏＡ基質又は脂肪酸生産物の流用を最小限にする追加的な組み換え：Δｔｉｇ：：ｆｒｔ、ΔａｔｏＤＡＥＢ：：ｆｒｔ、ΔｆａｄＤ：：ｆｒｔ。ＮｐｈＴ７、１つ又は２つ以上のチオエステラーゼ、ケトＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）、３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡデヒドラターゼ（３ＨＤｈ）、及びエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥｎＣｒ）をコードする遺伝子も、プラスミド上に提供する。サンプル１〜５に存在する遺伝子を、表２１に示す。
Figure 0006603658
これらのサンプルによるＣ８〜Ｃ１８ ＦＦＡの産生速度を図１７に示し、Ｃ６〜Ｃ１８ ＦＦＡ産生の力価を図１８に示す。株サンプル３による鎖長特異性の分布を、図１９に示す。生産物の３６％は、Ｃ１４〜Ｃ１６ ＦＦＡである。これらの結果は、これらの工学操作株においてサンプル３による、４．０７ｇ／Ｌの力価の、脂肪酸産生の増加が可能となることを証明する。
代替的なＫＣＲ、３ＨＤｈ、及びＥｎＣｒ酵素を用いることにより、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７変異体又はｆａｂＨホモログのケト−アシル−ＣｏＡ生産物を、２個の炭素原子分伸長された完全飽和生産物に変換（すなわち、ＫＣＲによるケト−アシル−ＣｏＡの３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、３ＨＤｈによる３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡのエノイル−ＣｏＡへの脱水、及びＥｎＣｒによるエノイル−ＣｏＡのアシル−ＣｏＡへの還元）するために必要な活性が提供され得る。例えば、代替的なＫＣＲはＦａｄＩＪ、Ｈｂｄ、及びＦａｄＢを含む。ＦａｄＢには、Ｃ１６まで、ＫＣＲとしての充分な活性を有する（下記の表２２を参照）。
Figure 0006603658
二官能性ＦａｄＢ、ＦａｂＧ、ＦａｄＪ、及びＨｂｄを含む代替的な３ＨＤｈｓを、活性及び生産物特異性に関して試験した。結果を、最も好ましい基質で達成された活性のパーセントとして、図２０に示す。
脂肪酸生産物の消費を防止し、鎖長特異性を維持するために、チオエステラーゼを除去する追加的な宿主遺伝子の組み換えが必要であり得る。これらの組み換えは、ｔｅｓＢ、ｙｃｉＡ、ｆａｄＭ、ｙｂｇＣ、及びｙｂｆＦの欠失又は調節を含む。
実施例５：３−ケト−Ｃ５−ＣｏＡの産生：
遺伝子組み換え酵素と本発明の方法とを使用して、奇数鎖長の脂肪酸を産生できることが証明された。特に、酵素ＮｐｈＴ７及びＮｐｈＴ７変異体が、プライマーとしてのプロピオニル−ＣｏＡと伸長ドナーとしてのマロニル−ＣｏＡとを用いてＣ５ケト−アシルＣｏＡを生成する活性を有することが証明された。本明細書に記載のＮｐｈＴ７変種及びｆａｂＨｓは、Ｃ５ケト−アシルＣｏＡを更に伸長して、より長い鎖の奇数鎖脂肪酸生産物を産生する。
精製直後のＨｉｓ６−ＮｐｈＴ７、Ｈｉｓ６−ＮｐｈＴ７（Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ）、Ｈｉｓ６−ＮｐｈＴ７（Ｉ１４７Ｓ、Ｆ２１７Ｖ）、及びＨｉｓ６−Ｈｂｄを、本実施例の全ての実験で用いた。ＮｐｈＴ７反応液（２００μＬ）には、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのマロニル−ＣｏＡ、１ｍＭのプライマーＣｏＡ（Ｃ２−又はＣ３−ＣｏＡ）、及び様々な濃度の野生型ＮｐｈＴ７又は変異体酵素を添加した。いかなるプライマーＣｏＡも含まないが、マロニル−ＣｏＡを含む反応も行った。Ｍｇ２＋−３−ケト−アシルＣｏＡ付加物の形成を、３７℃で１５分間、３０３ｎｍでモニターした。ＮｐｈＴ７−Ｈｂｄ共役反応液（２００μＬ）には、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、０．７５ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのマロニル−ＣｏＡ、１ｍＭのプライマーＣｏＡ（Ｃ２又はＣ３−ＣｏＡ）、１０μｇの部分的に精製されたＨｂｄ、及び様々な濃度の野生型ＮｐｈＴ７又は変異体酵素を添加した。いかなるプライマーＣｏＡも含まないが、マロニル−ＣｏＡを含む反応も行った。３７℃で１５分間、ＮＡＤＨの酸化を３４０ｎｍでモニターした。１５分間の酵素反応の終了後、１００μＬのサンプルを各反応から取り出し、２５μＬのアセトニトリルと直ちに混合して、酵素反応を終了させた。混合液を少なくとも１５分間、氷中上でインキュベートし、４℃で１５分間、３，２２０×ｇで遠心単離した。３−ケト−及び３−ＯＨ−Ｃ４及びＣ５−ＣｏＡの検出のため、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用に上清を残しておいた。特定の実行においては、Ｈｂｄ酵素を用いて、産生されたケトＣｏＡがヒドロキシアシルＣｏＡに還元されうるか否かを決定した。実験の結果を表２３に示す。
Figure 0006603658
Figure 0006603658
Figure 0006603658
Ｃ３−及びマロニル−ＣｏＡが同時に存在した場合にのみ、３−ケト−Ｃ５−ＣｏＡがＮｐｈＴ７によって生じた（表２３の実行２）。ＮｐｈＴ７とＨｂｄとを組み合わせた場合、大部分の３−ケト−Ｃ５−ＣｏＡが３−ＯＨ−Ｃ５−ＣｏＡに還元された。これらの結果は、野生型ＮｐｈＴ７が３−ケト−Ｃ５−ＣｏＡの合成の際にプライマーとしてＣ３−ＣｏＡを利用できること、並びに、クロストリジウム・アセトブチリクム由来のＨｂｄが３−ケト−Ｃ５−ＣｏＡを還元できることを示した。
ＮｐｈＴ７（Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ）又はＮｐｈＴ７（Ｉ１４７Ｓ、Ｆ２１７Ｖ）変異体を使用した反応は、野生型ＮｐｈＴ７で得られるの反応と類似していた。両方の変異体とも、プライマーとしてＣ３−ＣｏＡを使用して３−ケト−Ｃ５−ＣｏＡを産生でき、それは更にＨｂｄ＋ＮＡＤＨの存在下で３−ＯＨ−Ｃ５−ＣｏＡに還元された（表２３、実行７〜１８）。アセチル−ＣｏＡ＋マロニル−ＣｏＡ、又はマロニル−ＣｏＡ単独の場合、３−ケト−Ｃ４−ＣｏＡのみがこれらの酵素によって生じた。ＮｐｈＴ７（Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ）又はＮｐｈＴ７（Ｉ１４７Ｓ、Ｆ２１７Ｖ）のいずれかでは、野生型ＮｐｈＴ７を用いた反応と比較してこれら２つの反応ではより多くの酵素を用いたため、より高濃度の産生物が検出された。
３−ケト−Ｃ５−ＣｏＡの濃度を各反応における酵素量に関してプロットしたところ、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７（Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ）、及びＮｐｈＴ７（Ｉ１４７Ｓ、Ｆ２１７Ｖ）の比活性（１５分にわたる平均）は各々、０．３、０．２、及び０．２７Ｕ／ｍｇであった。
奇数鎖脂肪酸（例えばＣ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１１、Ｃ１３、Ｃ１５とＣ１７の鎖長の脂肪酸）の産生は、ＮｐｈＴ７及び／又はＮｐｈＴ７変異体、所望の鎖長特異性を有するｆａｂＨ、ＫＣＲ、３ＨＤｈ、及びＥｎＣｒ、並びに、チオエステラーゼ又は所望の鎖長特異性を有するエステルシンターゼなどの終結酵素を発現する遺伝子を有する組み換え系の構築と、伸長剤としてのプライマーとマロニル−ＣｏＡとしてプロピオニル−ＣｏＡの提供と、によって可能となる。
実施例７：Ｃ４及びＣ６脂肪酸の産生：
Ｃ４及びＣ６脂肪酸が、遺伝子組み換え酵素と本発明の方法を使用して産生されることが証明された。特に、ＰＡ２８０１ＴＥチオエステラーゼと特定のＮｐｈＴ７変異体酵素をコードする遺伝子組み換え微生物との組合せによって、Ｃ４及びＣ６脂肪酸を産生できることが証明された。これらのアミノ酸の修飾は、マロニル−ＣｏＡとアシルＣｏＡ（Ｃ４−ＣｏＡ及びＣ６−ＣｏＡ）との縮合反応を可能にする。特に、遺伝子組み換え微生物は、野生型ＮｐｈＴ７（Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ変異を有するＮｐｈＴ７変異体、又は、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ変異を有するＮｐｈＴ７変異体）とそれらの任意の組合せを含む群から選択される１つ又は２つ以上の変異３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと、以下の、ａ）異種ＫＣＲ（例えばｆａｄＢ）；ｂ）異種３ＨＤｈ（例えばｆａｄＢ）；ｃ）異種ＥｎＣｒ（例えばｔｅｒ）；及びｄ）チオエステラーゼＰＡ２８０１ＴＥのうちの少なくとも１つと、を含む。
以下の遺伝子組み換え大腸菌株を、遊離脂肪酸の産生に関して評価した：
Figure 0006603658
シングルコロニーを、３５μｇ／ｍｌのナカマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１５０ｍＬのＳＭ１１培地中、３０℃で２０時間インキュベートした。培養液を５０ｍＬの円錐管へ移し、１５分間、４，０００ＲＰＭで遠心分離した。光学密度が２０となるように、ペレットを、調製直後のＳＭ１１培地（リン酸塩を含む）中に懸濁した。各株の懸濁液を混合し、混合した懸濁液２．５ｍｌ（５％）を用いて、リン酸塩を含まない５０ｍＬのＳＭ１１培地に添加した。培養液を３０℃で４時間培養し、その後、温度を３７℃にシフトさせた。更に２０時間後にサンプルを採取し、存在する遊離脂肪酸量を分析した。産生されたＣ４〜Ｃ１８として測定したＣ４、Ｃ６、及び総遊離脂肪酸の量を、図２１に示す。更に、温度シフトの１８時間後の時点で、サンプルを採取し、遊離脂肪酸分布の分析を行った。この分析の結果を図２２に示す。
実施例８：Ｃ４、Ｃ６及びＣ８脂肪酸の産生：
本発明の遺伝子組み換え酵素と方法とを使用し、Ｃ４、Ｃ６及びＣ８脂肪酸を産生した。特に、Ｃ４、Ｃ６及びＣ８脂肪酸は、特定のＮｐｈＴ７変異体酵素をコードする遺伝子組み換え微生物とチオエステラーゼとの組合せにより産生された。これらのアミノ酸の修飾により、マロニル−ＣｏＡとアシルＣｏＡ（Ｃ２−ＣｏＡ、Ｃ４−ＣｏＡ、及びＣ６−ＣｏＡ）の縮合反応が可能となる。遺伝子組み換え微生物は、野生型ＮｐｈＴ７、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖの変異を有するＮｐｈＴ７の変種、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は２つ以上の異種３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼと、ａ）異種ＫＣＲ（例えばｆａｄＢ）；ｂ）異種３ＨＤｈ（例えばｆａｄＢ）ｃ）異種ＥｎＣｒ（例えばｔｅｒ）；及びｄ）チオエステラーゼ‘ｔｅｓＡ；のうちの少なくとも１つと、を含む。
以下の遺伝子組み換え大腸菌株を、遊離脂肪酸の産生に関して評価した：
Figure 0006603658
 ｃｏａＡ＊は、フィードバック阻害に抵抗性を示すｃｏａＡ（パントテン酸キナーゼ）のアレルを意味する。実施例７で概説したのと同じ方法を用いたが、温度シフト後、培養液を６８時間発酵させて、サンプルを採取し遊離脂肪酸の存在量を分析した。産生されたＣ４、Ｃ６、及びＣ８遊離脂肪酸の量を図２３に示し、産生された総脂肪酸（Ｃ４−Ｃ１８）の量を図２４に示す。様々な株から産生される遊離脂肪酸の分布を、図２５に示す。これらの結果は、Ｊ及びＫ株が高い特異性でＣ６−脂肪酸を産生することを示す。
高い特異性による、＞Ｃ８鎖長の脂肪酸（例えばＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、及びＣ１８の鎖長の脂肪酸）の産生が可能となるのは、ＮｐｈＴ７及び／又はＮｐｈＴ７変異体と、所望の鎖長特異性を有するｆａｂＨと、ＫＣＲ、３ＨＤｈ、及びＥｎＣｒと、チオエステラーゼ又は所望の特異性を有するエステルシンターゼなどの終結酵素と、を発現する遺伝子を有する組み換え型株の構築と、プライマーとしてアセチル−ＣｏＡ及び伸長剤としてマロニル−ＣｏＡを提供することと、による。
本発明の好ましい実施形態を示し、本明細書に記載したが、かかる実施形態が例として提供されることは、当業者にとって明らかである。当業者であれば、本発明から逸脱しない範囲で、多数の変形、変更、及び置換をなし得るであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な代替形態が、本発明の実施の際に適用され得ることを理解すべきである。

Claims (10)

  1. ＮｐｈＴ７ポリペプチドと、ワックスエステルシンターゼとをコードする異種核酸配列を含む、遺伝子組み換え微生物であって、前記微生物はＣ６以上の炭素鎖長を有する脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生でき、
    ここに、前記ＮｐｈＴ７は
    Ｆ２１７Ｖ；
    Ｉ１４７Ｔ；
    Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ；
    Ｖ１５７Ｆ、Ｆ２１７Ｖ；
    Ｉ１４７Ｍ、Ｆ２１７Ｖ；
    Ｉ１４７Ｓ、Ｆ２１７Ｖ；および
    Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ
    からなる群から選択される１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む、前記微生物。
  2. 前記異種核酸配列が、さらに配列番号３から１２０のいずれか１つと少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
  3. 脂肪族アルコール、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルケン、脂肪族アミド、脂肪族アルカン、及び脂肪族二塩基酸を含む群から選択される脂肪酸誘導体の産生を触媒する終結酵素をコードする異種核酸配列を更に含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
  4. 前記ワックスエステルシンターゼが、Ｍａｑ１、Ｐｃｒｙ１、Ｒｊｏｓ１、及びＡｂｏｒｋ１を含む群から選択され、前記微生物が脂肪エステルを産生できる、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
  5. 前記ワックスエステルシンターゼが、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、及び配列番号２９２のいずれか１つと少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ワックスエステルシンターゼ活性を有し、前記微生物が脂肪エステルを産生できる、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
  6. 微生物が
    ａ）ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、
    ｂ）３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ；及び
    ｃ）エノイル−ＣｏＡレダクターゼ
    をコードする異種核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
  7. 前記ａ）ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼがｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択され、
    前記ｂ）３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼがｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択され；及び
    前記ｃ）エノイル−ＣｏＡレダクターゼがｔｅｒである、請求項６に記載の遺伝子組み換え微生物。
  8. 前記微生物が、アセチル−ＣｏＡをプライマーとして、及びマロニル−ＣｏＡを伸長分子として使用して、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選択される炭素鎖長の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
  9. ｆａｂＨをコードする異種核酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
  10. 所望の鎖長特異性を有するｆａｂＨをコードする異種核酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
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