CN103842502A - 制备具有改良的脂肪链长度和饱和度特性的脂肪酸及其衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含多核苷酸序列、氨基酸序列、重组微生物和重组微生物培养物的组合物，所述重组微生物和重组微生物培养物产生具有目标脂肪链长度和/或优选的百分比饱和度的脂肪酸和衍生物的组合物。另外，本发明涉及制备和使用所述组合物的方法。所述组合物和方法可提供高滴度、高产率和高生产力的脂肪酸及其衍生物。

Description

制备具有改良的脂肪链长度和饱和度特性的脂肪酸及其衍生物
技术领域
本发明涉及制备具有选定的脂肪链长度和/或饱和度特性的脂肪酸及其衍生物以及它们的组合物的方法。另外，本发明涉及重组宿主细胞(例如，微生物)、重组宿主细胞培养物以及制备和使用重组宿主细胞的方法，例如，利用所述重组宿主细胞培养物发酵产生具有选定的脂肪链长度和饱和度特性的脂肪酸及其衍生物。
本申请要求2011年8月3日递交的系列号为61/514,861的美国临时申请的优先权权益，其通过完整引用明确并入本文中。
通过引用并入电子递交的材料
本即时申请含有序列表，其以ASCII格式通过EFS-Web递交，并在此通过引用完整并入本文。所述ASCII拷贝于2012年7月27日生成，命名为LS0036PCT.txt，且大小为74,934字节。
发明背景
大多数生物体的脂肪酸生物合成涉及一系列酶对乙酰-CoA和丙二酰-CoA前体的作用。脂肪酸生物合成中的两种重要的辅因子为辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)。这两种辅因子涉及从一种酶将增长的酰基链运输至另一种酶，以及供应前体用于缩合反应。
大肠杆菌(Escherichia coli或E.coli)的脂肪酸生物合成循环为讨论该循环提供了便利的参考框架。Heath,R.J.,et al.,(J Biol.Chem.271(44):27795-801(1996))提供了大肠杆菌脂肪酸生物合成的综述。缩合酶所利用的丙二酰-ACP通过丙二酰-CoA转酰基至丙二酰-ACP产生，其由丙二酰-CoA:ACP转酰基酶(fabD)催化。在脂肪酸延伸的每个循环中，主要存在4个反应。该循环由利用乙酰-CoA缩合丙二酰-ACP的β-酮脂酰-ACP合酶III(fabH)起始。
以下参考图1给出延伸循环的描述。延伸循环以由β-酮脂酰-ACP合酶I(fabB)和β-酮脂酰-ACP合酶II(fabF)催化的丙二酰-ACP和酰基-ACP的缩合起始，以产生β-酮-酰基-ACP。
第二，所述β-酮-酰基-ACP被NADPH依赖性β-酮脂酰-ACP还原酶(fabG)还原，以产生β-羟基-酰基-ACP。
第三，β-羟基-酰基-ACP被fabA或fabZβ-羟酰基-ACP脱水酶脱水为反式-2-烯酰-酰基-ACP。FabA还可以将反式-2-烯酰-酰基-ACP异构化为顺式-3-烯酰-酰基-ACP，其可以绕开fabI并可以被fabB(通常为多达C16的脂肪链长度)利用，以产生β-酮-酰基-ACP。
每个循环的第四个步骤通过将反式-2-烯酰-酰基-ACP转变为酰基-ACP的NADH或NADHPH依赖性烯酰-ACP还原酶(fabI)催化。
在本文描述的方法中，脂肪酸合成的终止通过硫酯酶从酰基-ACP去除酰基以释放游离脂肪酸(FFA)发生。硫酯酶(例如，tesA)水解硫酯键，其通过巯基键在酰基链和ACP之间发生。
发明概述
本发明总体涉及重组宿主细胞、重组宿主细胞培养物、制备重组宿主细胞的方法以及利用重组宿主细胞的方法，所述重组宿主细胞产生多种脂肪链长度的脂肪酸衍生物，从所述重组宿主细胞中可得到产生特定脂肪酸衍生物的重组宿主细胞。本发明给本领域技术人员提供挑选产生具有所需目标脂肪链长度和所需饱和度水平的脂肪酸衍生物的重组宿主细胞的能力。相比先于本发明报道的滴度、产率和生产力，本发明的方法、重组微生物和培养物能用于以更大的滴度、产率和生产力产生脂肪酸衍生物的方法中。
在第一个方面，本发明涉及重组宿主细胞培养物，其经改造用于产生高滴度的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物，所述高滴度通常为约30g/L至约250g/L。
在本发明的重组宿主细胞的实施方案中，所述多核苷酸序列包含编码酶学委员会编号为EC2.3.1.–的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的开放阅读框。所述编码序列可操作地连接至促进重组宿主细胞中蛋白表达的调控序列。相对于从相应的宿主细胞中野生型基因表达的β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的活性，重组宿主细胞的β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的活性被改良。另外，培养物中的重组宿主细胞包含一个或多个多核苷酸序列，其含有编码酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–的硫酯酶的开放阅读框。所述编码序列可操作地连接至促进重组宿主细胞中蛋白表达的调控序列。相对于从相应的宿主细胞中相应野生型基因表达的硫酯酶活性，重组宿主细胞的硫酯酶活性被改良。
相比对照培养物，本发明的重组培养物通常产生更高滴度、更高产率和/或更高生产力的具有目标脂肪链长度和优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物。
本发明的重组宿主细胞和宿主细胞培养物还可以包含一个或多个编码酶学委员会编号为EC6.2.1.3或EC1.2.1.42的羧酸还原酶蛋白的核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。
本发明的第二个方面涉及提供所需饱和度的脂肪链的脂肪酸衍生物(例如，脂肪醇)。在该方面，本发明的重组宿主细胞还包含一个或多个包含编码酶学委员会编号为EC4.2.1.–或4.2.1.60的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的开放阅读框的多核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。相对于从相应的宿主细胞的野生型基因表达的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性，重组宿主细胞的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性被改良。
本发明的第三个方面涉及产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物的重组宿主细胞培养物。所述重组宿主细胞通常具有酶学委员会编号为EC4.2.1.–或4.2.1.60的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的改良的活性。相对于从相应的宿主细胞的野生型基因表达的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性，所述重组宿主细胞的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性被改良。
本发明的第四个方面涉及产生具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物组合物的重组宿主细胞培养物。所述重组宿主细胞包含缺少异构酶活性且酶学委员会编号为EC4.2.1.–的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的改良的活性。相对于从相应宿主细胞的野生型基因表达的缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性，所述重组宿主细胞中缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性被改良。
在本发明的重组宿主细胞培养物中，所述重组宿主细胞可以为哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻细胞或细菌细胞。
本发明的重组宿主细胞培养物的实施方案还可以包含一个或多个编码一个或多个其他蛋白的核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。此类其他蛋白的实例包括但不限于，酶学委员会编号为EC6.2.1.3或EC1.2.1.42的羧酸还原酶蛋白，及酶学委员会编号为EC1.1.–.–、EC1.1.1.1或EC1.2.1.10的醇脱氢酶蛋白。此类其他的蛋白可以表达于重组宿主细胞中，从而促进以酰基-ACPs作为底物产生特定的脂肪酸衍生物。
本发明的第五个方面涉及制备本发明的重组宿主细胞和重组宿主细胞培养物的方法。通过本发明的方法可以制备产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物(例如，脂肪醇)的重组宿主细胞。该方法通常包含选自步骤(A)、步骤(B)和步骤(C)的两个核心步骤。通常，所述两个步骤为不相同的步骤，并且所述两个步骤可按任何顺序进行，以产生所述重组宿主细胞；例如，步骤(A)之后为步骤(B)、步骤(A)之后为步骤(C)、步骤(B)之后为步骤(A)、步骤(B)之后为步骤(C)、步骤(C)之后为步骤(B)或步骤(C)之后为步骤(A)。
简单地说，方法步骤(A)涉及挑选产生具有长于目标脂肪链长度的脂肪链长度的脂肪酸衍生物的重组宿主细胞。方法步骤(B)涉及挑选产生高滴度的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的重组宿主细胞。方法步骤(C)涉及挑选产生高滴度的具有目标脂肪链长度和优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物的重组宿主细胞。
在本发明方法优选的实施方案中，所述重组宿主细胞还包含一个或多个编码羧酸还原酶蛋白的核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。所述羧酸还原酶蛋白通常是酶学委员会编号为EC6.2.1.3或EC1.2.1.42的蛋白。
在本发明方法的其他实施方案中，所述重组宿主细胞还包含一个或多个编码一个或多个其他蛋白的核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。此类其他蛋白的实例包括但不限于：醇脱氢酶；醛-醇脱氢酶；乙酰-CoA乙酰转移酶；β-羟基丁酰-CoA脱氢酶；巴豆酸酶丁酰-CoA脱氢酶；及辅酶A-酰化醛脱氢酶。此类其他蛋白可以表达于重组宿主细胞中，从而促进以酰基-ACPs作为底物产生特定的脂肪酸衍生物。
在第六个方面，本发明更具体涉及制备重组宿主细胞和重组宿主细胞培养物的方法，所述重组宿主细胞和重组宿主细胞培养物产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物。这些重组宿主细胞通常具有酶学委员会编号为EC4.2.1.–或4.2.1.60的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的改良的活性。本发明的用于产生这些重组宿主细胞的方法通常至少利用步骤(C)，或步骤(A)的变型。
本发明的第七个方面更具体涉及制备重组宿主细胞和重组宿主细胞培养物的方法，所述重组宿主细胞和重组宿主细胞培养物产生具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物组合物。这些重组宿主细胞通常具有缺少异构酶活性且酶学委员会编号为EC4.2.1.–的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的改良的活性。本发明的用于产生这些重组宿主细胞的方法通常至少利用步骤(C)，或步骤(A)的变型。
本发明的第八个方面更具体涉及制备具有目标脂肪链长度和/或优选的饱和度的脂肪酸衍生物组合物的方法，例如，通过在碳源存在下培养本文所述的重组宿主细胞。在该方法的一个实施方案中，所述培养包括发酵。
本发明的第九个方面涉及利用本发明的重组宿主细胞培养物产生的、具有目标脂肪链长度和/或优选的饱和度的基本上纯化的脂肪酸衍生物组合物。
根据本文的公开，本领域技术人员容易想到本发明的这些和其他方面以及实施方案。
附图说明
图1所示为根据来自大肠杆菌的基因产物的脂肪酸生物合成途径的实例的概略图。
图2所示为酰基-ACPs作为将其转化为脂肪酸衍生物的酶的底物的示意图。
图3所示为用于例示本发明实施方案的多种表达构建物的示意图(图A-D)。
图4所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的硫酯酶活性，所述重组微生物的硫酯酶活性被改良。在图中，Y轴为“%脂肪类(“FA”=游离脂肪酸+脂肪醛+脂肪醇)相对于对照株”，并且X轴为C12/C14比率。图中每个数据点都对应于培养的克隆或培养的对照株。
图5所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的硫酯酶活性，所述重组微生物的硫酯酶活性被改良。在图中，Y轴为“%FA相对于对照株”，并且X轴为C16/C18比率。图中每个数据点都对应于培养的克隆或培养物的对照株。
图6所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白，所述重组微生物的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白活性被改良。在图中，Y轴为“%FA相对于对照株”，并且X轴为C12/C14比率。图中每个数据点都对应于培养的克隆或培养物的对照株。
图7所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白，所述重组微生物的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白活性被改良。在图中，Y轴为“%FA相对于对照株”，并且X轴为C16/C18比率。图中每个数据点都对应于培养的克隆或培养物的对照株。
图8所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的硫酯酶活性，所述重组微生物的硫酯酶活性被改良。在图中，Y轴为“%FA相对于对照株”，并且X轴为C12/C14比率。图中每个数据点都对应于培养的克隆或培养物的对照株。
图9所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的硫酯酶活性，所述重组微生物的硫酯酶活性被改良。在图中，Y轴为“%FA相对于对照株”，并且X轴为C16/C18比率。图中每个数据点都对应于培养的克隆或培养物的对照株。
图10所示为克隆的筛选数据，其中重组微生物的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白活性被改良，以评估对脂肪链长度和饱和度的影响。在图中，左侧的Y轴为“%饱和物质”；右侧的Y轴为具有C12和C14脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C12/C14比率。来自筛选的重组微生物组的克隆基于它们的%饱和物质沿X轴布置，并且显示了它们C12/C14比率的对应数据点。
图11所示为克隆的筛选数据，其中重组微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白大肠杆菌fabA蛋白)活性被改良，以评估对脂肪链长度和饱和度的影响。在图中，左侧的Y轴为“%饱和物质”；右侧的Y轴为具有C8和C10脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C8/C10比率。来自筛选的重组微生物组的克隆基于它们的%饱和物质沿X轴布置，并且显示了它们C8/C10比率的对应数据点。
图12所示为克隆的筛选数据，其中重组微生物中的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白大肠杆菌fabA蛋白)活性被改良，以评估对脂肪链长度和饱和度的影响。在图中，左侧的Y轴为“%饱和物质”；右侧的Y轴为具有C12和C14脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C12/C14比率。来自筛选的重组微生物组的克隆基于它们的%饱和物质沿X轴布置，并且显示了它们C12/C14比率的对应数据点。
图13所示为克隆的筛选数据，其中重组微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白大肠杆菌fabA蛋白)活性被改良，以评估对脂肪链长度和饱和度的影响。在图中，左侧的Y轴为“%饱和物质”；右侧的Y轴为具有C16和C18脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C16/C18比率。来自筛选的重组微生物组的克隆基于它们的%饱和物质沿X轴布置，并且显示了它们C16/C18比率的对应数据点。
图14所示为克隆的筛选数据，其中重组微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白，大肠杆菌fabZ蛋白)活性被改良，以评估对脂肪链长度和饱和度的影响。在图中，左侧的Y轴为“%饱和物质”；右侧的Y轴为具有C8和C10脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C8/C10比率。来自筛选的重组微生物组的克隆基于它们的%饱和物质沿X轴布置，并且显示了它们C8/C10比率的对应数据点。
图15所示为克隆的筛选数据，其中重组微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白，大肠杆菌fabZ蛋白)活性被改良，以评估对脂肪链长度和饱和度的影响。在图中，左侧的Y轴为“%饱和物质”；右侧的Y轴为具有C12和C14脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C12/C14比率。来自筛选的重组微生物组的克隆基于它们的%饱和物质沿X轴布置，并且显示了它们C12/C14比率对应的数据点。
图16所示为克隆的筛选数据，其中重组微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白，大肠杆菌fabZ蛋白)活性被改良，以评估对脂肪链长度和饱和度的影响。在图中，左侧的Y轴为“%饱和物质”；右侧的Y轴为具有C16和C18脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C16/C18比率。来自筛选的重组微生物组的克隆基于它们的%饱和物质沿X轴布置，并且显示了它们C16/C18比率对应的数据点。
图17所示为菌株的筛选数据，其中重组微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白大肠杆菌fabA蛋白)活性被改良，以评估对脂肪链长度和饱和度的影响。在图中，左侧的Y轴为“%饱和物质”；右侧的Y轴为具有C12和C14脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C12/C14比率。图的X轴底部所示为两株菌株："ALC487"和"D178PT5_fabA/pALC487"。在图中，对于这两株菌株中的每一株，C12/C14比率用菱形表示，并且%饱和物质用柱状图表示。
图18所示为菌株的筛选数据，其中重组微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白大肠杆菌fabA蛋白)活性被改良，以评估对脂肪链长度和饱和度的影响。在图中，左侧的Y轴为“%饱和物质”；右侧的Y轴为具有C8和C10脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C8/C10比率。图的X轴底部所示为两株菌株："ALC487"和"D178PT5_fabA/pALC487"。在图中，对于这两株菌株中的每一株，C8/C10比率用菱形表示，并且%饱和物质用柱状图表示。
图19所示为菌株的筛选数据，其中重组微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白大肠杆菌fabA蛋白)活性被改良，以评估对脂肪链长度和饱和度的影响。在图中，左侧的Y轴为“%饱和物质”；右侧的Y轴为具有C16和C18脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C16/C18比率。图的X轴底部所示为两株菌株："ALC487"和"D178PT5_fabA/pALC487"。在图中，对于这两株菌株中的每一株，C16/C18比率用菱形表示，并且%饱和物质用柱状图表示。
图20A-B所示为于55小时，来自通过将FabB加入至carB操纵子而改良的脂肪醇生产菌株的脂肪类(“FAS”；脂肪醇和游离脂肪酸)产生的链长度分布。所示数据为亲本菌株(Alc-287；图20A)和具有细胞内表达的fabB的额外拷贝的变体(Alc-383；图20B)的数据。
图21A-D所示为于58小时，来自通过将FabA加入至carB操纵子而改良的脂肪醇生产菌株的脂肪类(“FAS”；脂肪醇和游离脂肪酸)产生的链长度分布。所示数据为亲本菌株(LC-302；图21A)和具有不同量的细胞内表达的fabA的3种变体(LC-369；图21B，LC-372；图21C，LC-375；图21D)的数据。
发明详述
为所有目的，本说明书引用的所有专利、出版物和专利申请均通过引用并入本文，就像明确和单独指出每个专利、出版物和专利申请均通过其完整引用并入。
定义
应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定的实施方案，并且不试图进行限制。如本说明书和所述权利要求中所使用，除非上下文另有明确说明，单数形式的“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“重组微生物”包括两种或更多种此类重组微生物，提及“脂肪酸衍生物”包括一种或多种脂肪酸衍生物或者脂肪酸衍生物的混合物，提及“多核苷酸序列”包括一个或多个多核苷酸序列，提及“酶”包括一种或多种酶，提及“对照序列”包括一个或多个对照序列，等等。
除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解相同的意义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的其他方法和材料可以用于本发明的实施，本文仍然描述了优选的材料和方法。
在本发明的描述和权利要求中，将根据下述定义来使用以下术语。
如本文所用，术语“核苷酸”是指由杂环碱基、糖及一个或多个磷酸基组成的多核苷酸的单体单元。天然存在的碱基(鸟嘌呤,(G)；腺嘌呤,(A)；胞嘧啶,(C)；胸腺嘧啶,(T)和尿嘧啶(U))通常为嘌呤或嘧啶衍生物，尽管应当理解还包括天然和非天然存在的碱基类似物。天然存在的糖为戊糖(五碳糖)脱氧核糖(其形成DNA)或核糖(其形成RNA)，尽管应当理解还包括天然和非天然存在的糖类似物。核酸通常通过磷酸键连接以形成核酸或多核苷酸，尽管本领域还已知许多其他连接(例如，硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯等)。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的聚合物，其可以为单链或双链的，并且其可以含有非天然的或改变的核苷酸。本文的术语“多核苷酸”、“核酸序列”和“核苷酸序列”可互换使用，是指任何长度的核苷酸聚合形式，包括RNA或DNA。这些术语是指分子的一级结构，并因此包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。该术语包括由核苷酸类似物构成的RNA或DNA等同物、类似物和修饰的多核苷酸诸如，但不限于甲基化和/或加帽的多核苷酸。多核苷酸可以为任何形式，包括但不限于质粒、病毒、染色体、EST、cDNA、mRNA和rRNA。
如本文所用，术语“多肽”和“蛋白”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。术语“重组多肽”是指通过重组技术产生的多肽，其中编码被表达蛋白的DNA或RNA通常被插入至合适的表达载体，其反过来被用于转化宿主细胞以产生所述多肽。
如本文所用，术语“同系物(homolog)”和“同源的(homologous)”是指包含与相应多核苷酸或多肽序列具有至少约50%同一性的序列的多核苷酸或多肽。优选地，同源的多核苷酸或多肽具有这样的多核苷酸序列或氨基酸序列，其与相应的氨基酸序列或多核苷酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的同源性。如本文所用，术语序列“同源性”和序列“同一性”可互换使用。
本领域技术人员早已知道测定两个或更多个序列之间的同源性的方法。简单地说，可以按下述进行两个序列之间的“同源性”的计算。比对序列以用于最优比较(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入空位以用于最优比对，并且为了比较目的可忽略非同源序列)。在优选的实施方案中，为比较目的进行比对的第一序列长度，为第二序列长度的至少约30%，优选至少约40%，更优选至少约50%，甚至更优选至少约60%，并且甚至更优选至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。然后比较在所述第一和第二序列中对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处相同。考虑到需要引入以用于两个序列的最优比对的空位数和每个空位的长度，两个序列之间的百分比同源性为序列共有的相同位置数的函数。
可以利用数学算法来实现两个序列之间的序列比较和百分比同源性的确定，如BLAST(Altschul,et al.,J.Mol.Biol.,215(3):403-410(1990))。还可以利用整合到GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位加权值，以及1、2、3、4、5或6的长度加权值，测定两个氨基酸序列之间的百分比同源性(Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:444-453(1970))。还可以利用GCG软件包的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵，以及40、50、60、70或80的空位加权值和1、2、3、4、5或6的长度加权值，测定两个核苷酸序列间的百分比同源性。本领域技术人员可以进行初始的同源性计算，并相应地调节算法参数。优选的参数集(以及如果实践者不确定应当使用何种参数来确定分子是否位于权利要求的同源性限制内时，应当使用的参数集)为Blossum62打分矩阵，其使用空位罚分12、空位延伸罚分4以及移码空位罚分5。序列比对的其他方法为生物技术领域已知(参见，例如，Rosenberg,BMCBioinformatics,6:278(2005);Altschul,et al.,FEBS J.,272(20):5101–5109(2005))。
如本文所用，术语“低严格、中严格、高严格或非常高严格条件下的杂交”描述杂交和洗涤条件。进行杂交反应的指导参见Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。该参考文献中描述了含水和无水方法，并且两种方法都可使用。本文提及的具体性杂交条件如下：1)低严格杂交条件——约45℃下，6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后在至少50℃下(对于低严格条件，洗涤温度可以增至55℃)，于0.2X SSC、0.1%SDS中洗涤两次；2)中严格杂交条件——约45℃下，6X SSC，然后在60℃下，于0.2X SSC、0.1%SDS中洗涤一次或多次；3)高严格杂交条件——约45℃下，6X SSC，然后在65℃下，于0.2.XSSC、0.1%SDS中洗涤一次或多次；和4)非常高严格杂交条件——65℃下，0.5M磷酸钠、7%SDS，然后在65℃下，于0.2X SSC、1%SDS中洗涤一次或多次。除非另有说明，非常高严格条件(4)为优选的条件。
如本文所用的术语“异源的”通常是指非天然存在于生物体中的核苷酸序列或蛋白。例如，可以通过重组方法将植物内源性多核苷酸序列引入到细菌细胞中，并且所述植物多核苷酸即为细菌细胞中的异源性多核苷酸。
如本文所用，术语多肽的“片段”是指全长多肽或蛋白的更短部分，其大小范围为4个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去一个氨基酸残基。在本发明的某些实施方案中，片段是指多肽或蛋白的结构域(例如，底物结合结构域或催化结构域)的整个氨基酸序列。
如本文所用，本文的术语“突变体”和“变体”多肽可互换使用，是指具有与相应野生型多肽存在至少一个氨基酸差异的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述突变体多肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺失。例如，所述突变体可以包含一个或多个保守氨基酸取代。如本文所用，“保守氨基酸取代”为其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的情形。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有β-分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)；以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。
优选的多肽或多肽片段变体保留有相应野生型多肽的一些或所有生物学功能(例如，酶活性)。在一些实施方案中，所述变体或片段保留有相应野生型多肽的至少约75%(例如，至少约80%、至少约90%或至少约95%)的生物学功能。在其他实施方案中，所述变体或片段保留有相应野生型多肽的约100%的生物学功能。在进一步的其他实施方案中，所述变体或片段具有相应野生型多肽的大于100%的生物学功能。可以利用本领域熟知的计算机程序找到确定哪些氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不影响生物学活性的指导，例如，LASERGENETM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)。
应当理解，本文所述的多肽可以具有其他对多肽功能没有本质影响的保守型或非必需氨基酸取代。可以按Bowie et al.(Science247:13061310(1990))所述确定是否特定的取代会被允许(即不会不利地影响诸如脱羧还原酶活性或硫酯酶活性的所需生物学功能)。
如本文所用，编码蛋白的“来源于野生型基因的开放阅读框”包括但不限于以下：编码由该基因编码的野生型蛋白的开放阅读框；编码由该基因编码的野生型蛋白的变体(例如，具有例如通过修饰野生型蛋白获得的不同序列的变体蛋白)的开放阅读框；和编码野生型蛋白的开放阅读框，其中所述开放阅读框得到密码子优化。本文阐述了来源于野生型基因的开放阅读框的一些实例(参见，例如，野生型耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)carB的优化核苷酸序列(SEQ ID NO:15)，脂肪酸还原酶蛋白；编码来源于大肠杆菌tesA的序列的变体蛋白(12H08:SEQID NO:18)，硫酯酶蛋白)。
如本文所用，术语“诱变”是指借此以稳定方式改变生物体的遗传信息的过程。编码核酸序列的蛋白的诱变产生突变体蛋白。诱变还指导致改良的蛋白活性的非编码性核酸序列的改变。
如本文所用，术语“基因”是指编码RNA产物或蛋白产物的核酸序列，以及影响RNA或蛋白表达的可操作地连接的核酸序列(例如，此类序列包括但不限于启动子或增强子序列)或编码影响RNA或蛋白表达的序列的可操作地连接的核酸序列(例如，此类序列包括但不限于核糖体结合位点或翻译控制序列)。
如本文所用，“酰基-CoA”是指烷基链的羰基碳与辅酶A(CoA)的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基(4’-phosphopantethionyl)部分的巯基之间形成的酰基硫酯，其具有式R-C(O)S-CoA，其中R为具有至少4个碳原子的任何烷基。
如本文所用，“酰基-ACP”是指烷基链的羰基碳与酰基载体蛋白(ACP)的磷酸泛酰巯基乙胺基(phosphopantetheinyl)部分的巯基之间形成的酰基硫酯。所述磷酸泛酰巯基乙胺基部分通过全酰基载体蛋白合酶(ACPS)（磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶）的作用，在翻译后连接至ACP上的保守丝氨酸残基。在一些实施方案中，酰基-ACP为合成完全饱和的酰基-ACPs的中间物。在其他实施方案中，酰基-ACP为合成不饱和酰基-ACPs的中间物。在一些实施方案中，碳链可具有约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个碳。这些酰基-ACPs中的每个都是将其转化为诸如图2中描述的那些脂肪酸衍生物的酶的底物。
如本文所用，“脂肪醛”指具有式RCHO的醛，其特征为具有羰基(C=O)。在一些实施方案中，所述脂肪醛为任何源自脂肪酸或脂肪酸衍生物的醛。在某些实施方案中，所述R基为至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或至少19个碳长度。可选地，或另外，所述R基为20个或更少、19个或更少、18个或更少、17个或更少、16个或更少、15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少，或者6个或更少的碳长度。因此，所述R基可以具有任何两个上述端点所约束的R基。例如，所述R基可以为6-16个碳长度、10-14个碳长度或12-18个碳长度。在一些实施方案中，所述脂肪醛为C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25或C26脂肪醛。在某些实施方案中，所述脂肪醛为C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17或C18脂肪醛。
如本文所用，“脂肪醇”指具有式ROH的醇。在一些施方案中，脂肪醇为任何源自脂肪酸或脂肪酸衍生物的醇。在某些实施方案中，R基为至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或至少19个碳长度。可选地，或另外，R基为20个或更少、19个或更少、18个或更少、17个或更少、16个或更少、15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少，或者6个或更少的碳长度。因此，R基可以具有任何两个上述端点所约束的R基。例如，R基可以为6-16个碳长度、10-14个碳长度或12-18个碳长度。在一些实施方案中，脂肪醇为C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25或C26脂肪醇。在某些实施方案中，脂肪醇为C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17或C18脂肪醇。经改造用于产生脂肪醛的微生物可将一些脂肪醛转化为脂肪醇。当产生脂肪醇的微生物被改造以用于表达编码酯合成酶的多核苷酸时，产生蜡酯。在优选的实施方案中，脂肪醇源自脂肪酸生物合成途径。例如，酰基-ACP可以通过硫酯酶(例如，大肠杆菌tesA)的作用转化为脂肪酸，其通过羧酸还原酶(例如，分枝杆菌carB、carA或fadD9)的作用转化为脂肪醛和脂肪醇。例如，通过醇脱氢酶(例如，大肠杆菌YqhD或不动杆菌alrAadp1)的作用可以进一步促进脂肪醛转化为脂肪醇。
如本文所用，术语“脂肪酸”指具有式RCOOH的羧酸。R表示脂肪族基团，优选烷基。R可以包含约4至约22个碳原子。脂肪酸可以为饱和的或单不饱和的。在优选的实施方案中，脂肪酸源自脂肪酸生物合成途径。
如本文所用，术语“脂肪酸生物合成途径”指产生酰基硫酯的生物合成途径。脂肪酸生物合成途径包括可以被改造用于产生酰基硫酯的脂肪酸合酶，并且在一些实施方案中，可以与其他酶一起表达，以产生具有期望的碳链特性的脂肪酸。本领域技术人员理解，脂肪酸并非作为“酸”，而是作为酰基硫酯被生物合成，即，该酸作为硫酯与ACP或CoA的4-磷酸泛酰巯基乙胺基辅基结合。脂肪酰基自身可以用于细胞以构建膜、细胞壁、脂肪、水解为脂肪酸，并且可以进一步进行生物化学修饰，以产生脂肪酸衍生物，如醛、醇、烯烃、烷烃、酯等。
如本文所用，术语“脂肪酸衍生物”指部分通过脂肪酸生物合成途径产生的产物。本文的术语“脂肪酸衍生物”可以与术语“脂肪酸或其衍生物”可互换使用，并且包括部分源自酰基-ACP或酰基-ACP衍生物的产物。示例性“脂肪酸衍生物”包括，例如，脂肪酸、酰基-CoA、脂肪醛、短链和长链醇、烃类(例如，烷烃、烯烃或链烯，如末端或内部链烯)、脂肪醇、酯(例如，蜡酯、脂肪酸酯(例如，甲基酯或乙基酯))，以及酮类。
如本文所用，术语“烷烃”指仅由碳(C)和氢(H)组成的饱和烃类或化合物，其中这些原子通过单键连接在一起(即，它们为饱和化合物)。
如本文所用，术语“链烯(olefin)”和“烯烃(alkene)”可互换使用，并且是指含有至少一个碳-碳双键的烃类(即，它们为不饱和化合物)。
如本文所用，关于化学式为CxH2x的α-链烯或烯烃，本文的术语“末端链烯(terminal olefin)”、“α-链烯”、“末端烯烃(terminal alkene)”和“1-烯烃”可互换使用，其与具有类似分子式的其他链烯的区别在于线性烃链和双键位于第一或α位置。
如本文所用，术语“脂肪酯”是指源自脂肪酸，例如脂肪酸酯的任何酯。在一些实施方案中，脂肪酯含有A侧和B测。如本文所用，酯的“A侧”是指结合所述酯的羧酸酯氧的碳链。如本文所用，酯的“B侧”是指包含所述酯的亲本羧酸酯的碳链。在脂肪酯源自脂肪酸生物合成途径的实施方案中，A侧由醇(例如，乙醇或甲醇)提供，并且B侧由脂肪酸提供。
任何醇都可以用来形成脂肪酯的A侧。例如，所述醇可以源自脂肪酸生物合成途径。可选地，所述醇可以通过非脂肪酸生物合成途径产生。此外，可以外源提供醇。例如，当脂肪酯由生物体产生时，可以在发酵液中提供醇。可选地，当脂肪酯由也可以产生醇的生物体产生时，可以外源提供羧酸如脂肪酸或乙酸。
包含A侧或B侧的碳链可以为任何长度。在一些实施方案中，酯的A侧为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16或18个碳长度。当脂肪酯为脂肪酸甲基酯时，酯的A侧为1个碳长度。当脂肪酯为脂肪酸乙酯时，酯的A侧为2个碳长度。酯的B侧可以为至少约4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26个碳长度。此外，A侧和/或B侧可以为饱和的或不饱和的。
在一些实施方案中，脂肪酯为蜡。蜡可以源自长链醇和长链脂肪酸。在另一实施方案中，脂肪酯为脂肪酸硫酯，例如酰基-ACP。脂肪酯可以，例如，用作生物燃料或表面活性剂。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”是指相对于相应的野生型宿主细胞，遗传组成发生改变的宿主，例如，通过有意引入新遗传元件和/或有意修饰宿主细胞中天然存在的遗传元件。此类重组宿主细胞的后代还含有这些新的和/或修饰的遗传元件。在本文描述的本发明的任何方面中，宿主细胞可以选自：哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞(例如，丝状真菌如假丝酵母(Candida sp.)或出芽酵母如酵母(Saccharomycessp.))、藻细胞和细菌细胞。在优选的实施方案中，重组宿主细胞为“重组微生物”。
如本文所用，“与重组宿主细胞种类相同的宿主细胞”通常指不具有重组宿主细胞中所描述的重组修饰的相同物种宿主细胞。例如，“与重组微生物种类相同的微生物”通常是指与重组微生物物种相同(例如，大肠杆菌)和株系相同(例如，大肠杆菌K-12)的微生物，其中所述微生物不包含重组微生物中所描述的重组修饰。
微生物宿主细胞的实例包括但不限于以下细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为革兰氏阳性细菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为革兰氏阴性细菌细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞选自以下属：埃希氏杆菌(Escherichia)、芽孢杆菌(Bacillus)、乳杆菌(Lactobacillus)、发酵单胞菌(Zymomonas)、红球菌(Rhodococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、曲霉菌(Aspergillus)、木霉菌(Trichoderma)、脉孢菌(Neurospora)、镰刀菌(Fusarium)、腐质霉菌(Humicola)、根毛霉菌(Rhizomucor)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、毛霉菌(Mucor)、毁丝霉菌(Myceliophtora)、青霉菌(Penicillium)、平革菌(Phanerochaete)、侧耳菌(Pleurotus)、栓菌(Trametes)、金孢子菌(Chrysosporium)、酵母(Saccharomyces)、寡养单胞菌(Stenotrophamonas)、裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母(Yarrowia)或链霉菌(Streptomyces)。
在某些优选的实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，大肠杆菌细胞为B株、C株、K株或W株大肠杆菌细胞。
在其他实施方案中，宿主细胞为迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)细胞、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)细胞、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenoformis)细胞、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)细胞、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)细胞、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)细胞、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)细胞、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)细胞、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)细胞。
在其他实施方案中，宿主细胞为康氏木霉(Trichoderma koningii)细胞、绿色木霉(Trichoderma viride)细胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)细胞、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)细胞、烟曲霉(Aspergillus fumigates)细胞、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、黑曲霉(Aspergillusniger)细胞、米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞、特异腐质霉(Humicolainsolens)细胞、棉毛状腐质霉(Humicola lanuginose)细胞、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)细胞、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)细胞或米黑毛酶(Mucor michei)细胞。
在进一步的其他实施方案中，宿主细胞是变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)细胞或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)细胞。
在其他实施方案中，宿主细胞为放线菌(Actinomycetes)细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
在其他实施方案中，宿主细胞来自真核植物、藻、蓝藻、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌、极端微生物、酵母、真菌、藻、及其改造的生物体或合成的生物体。在一些实施方案中，宿主细胞依赖光或固定碳。在一些实施方案中，宿主细胞依赖光或固定碳。在一些实施方案中，宿主细胞具有自养活性。在一些实施方案中，宿主细胞具有光合自养活性，如在光存在下。在一些实施方案中，宿主细胞在光存在下为异养型或为混合营养型。在某些实施方案中，宿主细胞为来自以下的细胞：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、奇岗(Miscanthus giganteus)、玉蜀黍(Zea mays)、葡萄藻(Botryococcuse braunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、杜氏盐藻(Dunaliela salina)、聚球蓝细菌PCC7002(Synechococcus Sp.PCC7002)、聚球蓝细菌PCC7942(Synechococcus Sp.PCC7942)、集胞藻PCC6803(Synechocystis Sp.PCC6803)、长嗜热聚球蓝细菌BP-1(Thermosynechococcus elongatus BP-1)、绿硫菌(Chlorobium tepidum)、嗜热光合绿丝菌(Chlorojlexus auranticus)、酒色着色菌(Chromatiummvinosum)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palusris)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、热纤梭菌(Clostridiuthermocellum)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)。
其他宿主细胞的实例包括但不限于：CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cvl细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞。
如本文所用，术语“克隆”通常是指起源于并且遗传上基本上与单一共同祖先相同的细胞或细胞群，例如，克隆细菌菌落的细菌产生于单一细菌细胞。
如本文所用，术语“培养物”通常是指包含活细胞的液体培养基，在优选的实施方案中，所述细胞获自克隆。在一个实施方案中，培养物包含于受控条件下在预定培养基中繁殖的细胞，例如，培养于包含选定的碳源和氮的液体培养基中的重组微生物克隆。
如本文所用，术语“发酵”广义是指宿主细胞将有机物质转化为目标物质，例如，重组微生物通过在包含碳源的培养基中繁殖重组微生物培养物，将碳源转化为脂肪酸或其衍生物。
如本文所用，重组微生物中蛋白例如酶的“改良的”活性，是指相对于亲本微生物而确定的在活性上的一个或多个可遗传特性差异。通常，测定具有改良的活性的重组微生物与相应野生型微生物之间的活性差异(例如，重组大肠杆菌的克隆培养物相对于野生型大肠杆菌进行比较)。改良的活性可源于以下原因，例如，重组微生物表达蛋白的修改的量(例如，由于编码该蛋白的DNA序列的拷贝数增加或减少、编码该蛋白的mRNA转录物的数目增加或减少和/或来自mRNA的蛋白的蛋白翻译量增加或减少)；蛋白结构的改变(例如，一级结构的改变，诸如，蛋白编码序列的改变引起底物特异性改变、观察到的动力学参数改变)；以及蛋白稳定性的改变(例如，蛋白降解增加或减少)。在一些实施方案中，多肽为本文描述的任何多肽的突变体或变体。
如本文所用，术语“调控序列”通常是指最终控制蛋白表达的元件如DNA中的碱基序列。调控序列的实例包括但不限于，DNA启动子序列、转录因子结合序列、转录终止序列、转录调节因子(如增强子元件)、影响RNA稳定性的核苷酸序列，以及翻译调控序列(如核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子)。
如本文所用，短语“相对于野生型核苷酸序列，所述核苷酸序列的表达被修改”指内源核苷酸序列的表达和/或活性水平，或者编码异源或非天然多肽的核苷酸序列的表达和/或活性增加或减少。在一些实施方案中，控制编码多肽的内源性或异源性多核苷酸表达的内源性调控元件，是通过重组整合到宿主细胞基因组中的可操作地连接至内源性或异源性多核苷酸的表达控制序列。在一些实施方案中，利用本领域已知的方法，通过同源重组将表达控制序列整合到宿主细胞染色体中。在一些实施方案中，编码多肽的序列为本文描述的任何编码多肽的序列的突变体或变体。
如本文所用，术语“氧酰基ACP合酶”和“β-酮脂酰-ACP合酶蛋白”可互换使用，是指将来自丙二酰-ACP(酰基载体蛋白)的双碳单元加入至另一脂肪酰基-ACP分子的长链脂肪酸合成酶，产生β-酮脂酰-ACP并释放二氧化碳，例如，EC2.3.1.41酶。III型β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)催化初始缩合反应；如本文所用，短语“初始缩合β-酮脂酰-ACP合酶”是指这些类型的多肽。I型和II型KAS负责催化脂肪酸生物合成中的延伸步骤；如本文所用，短语“延伸β-酮脂酰-ACP合酶”是指这些类型的多肽。该组酶包括但不限于：3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I(EC2.3.1.41)和3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II(EC2.3.1.179)，以及通过国际生物化学与分子生物学联盟(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)的数字分类鉴定的、酶学委员会编号为EC2.3.1.–的酶；名称EC2.3.1.–包括EC2.3.1.X，其中X为整数；EC2.3.1.nX，其中X为整数(初始的EC号包括‘n’，作为部分的第四个(系列)数字，例如，其中X=n1)，以及具有EC2.3.1分类的酶。由编码此类酶的基因编码的蛋白的实例包括但不限于：fabB蛋白，大肠杆菌(J Biol.Chem.13;279(33):34489-95(2004))；fabF蛋白，大肠杆菌(J Bacteriol.169(4):1469-73(1987))；CEM1蛋白，啤酒酵母(S.cerevisiae)(Mol.Microbiol.9(3):545-55(1993))；KAS2蛋白，拟南芥(Arabidopsis)(Plant J29(6):761-70(2002))；和fabF蛋白，粪球肠菌(Enterococcus faecalis)(J Biol.Chem.13;279(33):34489-95(2004))。在本发明的优选实施方案中，β-酮脂酰-ACP合酶蛋白为3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I(EC2.3.1.41)或3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II(EC2.3.1.179)。β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的其他实例列于以下的表1中。
如本文所用，术语“酰基-ACP水解酶”蛋白是指通过水解脂肪酸的酰基，终止脂肪酰基延伸的长链脂肪酸合成酶，通常为作用于硫酯键并水解1-酰基键的那些酶。该组酶包括但不限于，酰基-ACP硫酯酶，以及通过国际生物化学与分子生物学联盟的数字分类鉴定的、酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–的酶；名称EC3.1.2.–包括EC3.1.2.X，其中X为整数；EC3.1.2.nX，其中X为整数(初始的EC号包括‘n’，作为部分的第四个(系列)数字，例如，其中X=n1)，以及具有EC3.1.2分类的酶。由编码此类酶的基因编码的蛋白的实例包括但不限于：tesA蛋白，大肠杆菌(J Biol.Chem.268:9238-45(1993))；fatB蛋白，毛白杨(Populustomentosa)(J.Genet.Genomics34:267-273(2007))；及酰基-ACP硫酯酶，多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)(Science299:2074-2076(2003))。硫酯酶的其他实例列于以下的表1中。
如本文所用，术语“β-羟酰基-ACP脱水酶”通常是指催化β-羟酰基酰基载体蛋白(ACP)脱水的长链脂肪酸合成酶。该组酶包括但不限于，国际生物化学与分子生物学联盟的酶学委员会编号为EC4.2.1.–或EC4.2.1.60的酶；名称EC4.2.1.–包括EC4.2.1.X，其中X为整数；EC4.2.1.nX，其中X为整数(初始的EC号包括‘n’，作为部分的第四个(系列)数字，例如，其中X=n1)，以及具有EC4.2.1分类的酶。由编码此类酶的基因编码的蛋白的实例包括但不限于：fabA蛋白，大肠杆菌(Heath,R.J.,et al.,J Biol.Chem.271(44):27795-801(1996))；及fabZ蛋白，大肠杆菌(Heath,R.J.,et al.,J Biol.Chem.271(44):27795-801(1996))。β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的其他实例列于以下的表1中。大肠杆菌fabA和fabZ编码的蛋白催化β-羟酰基ACP脱水，如图1所示。fabA和fabZ底物特异性的细微差别已有报道。例如，已报道fabA起异构酶作用，而fabZ无报道。如本文所用，术语“滴度”是指每单位体积的宿主细胞培养物产生的脂肪酸或脂肪酸衍生物的量。在本文描述的组合物和方法的任何方面中，以下述滴度产生脂肪酸或其衍生物：约25mg/L、约50mg/L、约75mg/L、约100mg/L、约125mg/L、约150mg/L、约175mg/L、约200mg/L、约225mg/L、约250mg/L、约275mg/L、约300mg/L、约325mg/L、约350mg/L、约375mg/L、约400mg/L、约425mg/L、约450mg/L、约475mg/L、约500mg/L、约525mg/L、约550mg/L、约575mg/L、约600mg/L、约625mg/L、约650mg/L、约675mg/L、约700mg/L、约725mg/L、约750mg/L、约775mg/L、约800mg/L、约825mg/L、约850mg/L、约875mg/L、约900mg/L、约925mg/L、约950mg/L、约975mg/L、约1000mg/L、约1050mg/L、约1075mg/L、约1100mg/L、约1125mg/L、约1150mg/L、约1175mg/L、约1200mg/L、约1225mg/L、约1250mg/L、约1275mg/L、约1300mg/L、约1325mg/L、约1350mg/L、约1375mg/L、约1400mg/L、约1425mg/L、约1450mg/L、约1475mg/L、约1500mg/L、约1525mg/L、约1550mg/L、约1575mg/L、约1600mg/L、约1625mg/L、约1650mg/L、约1675mg/L、约1700mg/L、约1725mg/L、约1750mg/L、约1775mg/L、约1800mg/L、约1825mg/L、约1850mg/L、约1875mg/L、约1900mg/L、约1925mg/L、约1950mg/L、约1975mg/L、约2000mg/L(2g/L)、3g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、125g/L、150g/L、200g/L、250g/L，或任何两个前述值所约束的范围。在其他实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物以下述滴度产生：大于100g/L、大于200g/L、大于300g/L，或大于，诸如500g/L、700g/L、1000g/L、1200g/L、1500g/L或2000g/L。根据本发明的一些实施方案，重组宿主细胞产生的脂肪酸或其衍生物的优选的滴度为5g/L至200g/L、10g/L至150g/L、20g/L至120g/L、30g/L至100g/L或30g/L至250g/L。
如本文所用，术语“宿主细胞产生的脂肪酸或其衍生物的产率”是指宿主细胞将投入的碳源转化为产物(即，脂肪酸或脂肪酸衍生物如脂肪醇或脂肪酯)的效率。根据本发明方法的实施方案，经改造用于产生脂肪酸和脂肪酸衍生物的宿主细胞可以具有如下产率：至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%或至少40%，或任何两个前述值所约束的范围。在其他实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物以如下产率产生：大于30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。可选地，或另外，在一些实施方案中，产率为约40%或更少、约37%或更少、约35%或更少、约32%或更少、约30%或更少、约27%或更少、约25%或更少或约22%或更少。因此，产率可以落入任何两个上述端点所约束的范围。例如，根据本发明方法，通过重组宿主细胞的实施方案产生的脂肪酸或其衍生物的产率可以为：5%至15%、10%至25%、10%至22%、15%至27%、18%至22%、20%至28%、20%至30%、15%至30%、10%至30%或10%至40%。在本发明的优选实施方案中，根据本发明方法，重组宿主细胞产生的脂肪酸或其衍生物的产率为10%至30%，或10%至40%。
如本文所用，术语“产生的脂肪酸或其衍生物的生产力”是指每单位体积的宿主细胞培养物在每单位时间产生的脂肪酸或脂肪酸衍生物的量。在本文描述的组合物和方法的任何方面中，重组宿主细胞产生的脂肪酸或脂肪酸衍生物的生产力为：至少100mg/L/小时、至少200mg/L/小时、至少300mg/L/小时、至少400mg/L/小时、至少500mg/L/小时、至少600mg/L/小时、至少700mg/L/小时、至少800mg/L/小时、至少900mg/L/小时、至少1000mg/L/小时、至少1100mg/L/小时、至少1200mg/L/小时、至少1300mg/L/小时、至少1400mg/L/小时、至少1500mg/L/小时、至少1600mg/L/小时、至少1700mg/L/小时、至少1800mg/L/小时、至少1900mg/L/小时、至少2000mg/L/小时、至少2100mg/L/小时、至少2200mg/L/小时、至少2300mg/L/小时、至少2400mg/L/小时、至少2500mg/L/小时、至少2600mg/L/小时、至少2700mg/L/小时、至少2800mg/L/小时、至少2900mg/L/小时或至少3000mg/L/小时。可选地，或另外，在一些实施方案中，生产力为3500mg/L/小时或更少、3000mg/L/小时或更少、2500mg/L/小时或更少、2000mg/L/小时或更少、1500mg/L/小时或更少、120mg/L/小时或更少、1000mg/L/小时或更少、800mg/L/小时或更少，或者600mg/L/小时或更少。因此，生产力可以落入任何两个上述端点所约束的范围。例如，在一些实施方案中，生产力可以为：30至3000mg/L/小时、60至2000mg/L/小时，或100至1000mg/L/小时。在本发明的优选实施方案中，根据本发明方法，重组宿主细胞产生的脂肪酸或其衍生物的生产力为：150mg/L/小时至1500mg/L/小时、500mg/L/小时至2500mg/L/小时，或700mg/L/小时至3000mg/L/小时。
如本文所用，术语“过表达”指相比相应野生型细胞在相同条件下的正常表达，细胞的多核苷酸或多肽以更大的浓度表达或造成被表达。例如，当相比其在相同物种的非重组宿主细胞中于相同条件下的浓度，多核苷酸以更大的浓度存在于重组宿主细胞中时，多核苷酸可为在重组宿主细胞中“过表达”。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸序列和表达控制序列以这样的方式连接，即当合适的分子(例如，转录激活蛋白)被结合至所述表达控制序列时，允许基因表达。根据转录和翻译方向，可操作地连接的启动子位于选定的多核苷酸序列的上游。可操作地连接的增强子可以位于选定的多核苷酸的上游、内部或下游。可操作地连接的翻译控制元件可以位于编码蛋白的多核苷酸序列的外部、内部或下游。
如本文所用，术语“载体”是指能运输与其连接的另一核酸，即多核苷酸序列的核酸分子。一类有用载体为附加体(即，能进行染色体外复制的核酸)。有用的载体为能自主复制和/或表达与它们连接的核酸的那些载体。能指导可操作地与它们连接的基因进行表达的载体，在本文称为“表达载体”。一般来说，用于重组DNA技术的表达载体常常为“质粒”形式，其通常是指以它们的载体形式存在的环状双链DNA环，不局限于染色体。本文的术语“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒为最常使用的载体形式。然而，还包括此类其他表达载体形式，其具有等同功能并迄今为本领域已知。
可以通过常规转化或转染技术将载体引入到原核或真核细胞内。如本文所用，术语“转化”和“转染”可互换使用，是指多种本领域认可的用于将外来核酸(例如，DNA)引入至宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔。合适的转化或转染宿主细胞的方法可以参见，例如，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(Third Edition),Sambrook,et al.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2001)。
如本文所用，术语“在有效表达所述异源性核苷酸序列的条件下”指允许宿主细胞产生所需脂肪酸或脂肪酸衍生物的任何条件。合适的条件包括，例如，发酵条件。发酵条件可以包含许多参数，如温度范围、曝气水平和培养基组成。这些条件中的每一个单独地并联合地允许宿主细胞生长。示例性培养基包括培养液或凝胶。通常，培养基包含可以被宿主细胞直接代谢的碳源。发酵指生产宿主如重组微生物利用碳源。发酵可以为需氧的、厌氧的或其变体(如微需氧)。如本领域技术人员所理解，重组微生物能将碳源加工为酰基-ACP或所需脂肪酸或其衍生物(例如，脂肪酯、烷烃、链烯或醇)的条件存在差异，这部分取决于具体微生物。在一些实施方案中，该过程发生在需氧环境中。在一些实施方案中，该过程发生在缺氧环境中。在一些实施方案中，该过程发生在微需氧环境中。
如本文所用，术语“碳源”是指适合用作原核或简单的真核细胞生长的碳源的底物或化合物。碳源可以为各种形式，包括但不限于：聚合物、糖类、酸类、醇类、醛类、酮类、氨基酸、肽和气体(例如，CO和CO2)。示例性碳源包括但不限于，单糖如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖如淀粉、纤维素、果胶和木聚糖；二糖如蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和松二糖；纤维素原料及变体如半纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；饱和或不饱和脂肪酸、琥珀酸酯、乳酸酯和醋酸酯；醇类如乙醇、甲醇、丙三醇或其混合物。碳源还可以是光合作用的产物如葡萄糖。在某些优选的实施方案中，碳源为生物质。在其他优选的实施方案中，碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖或其组合。在其他优选的实施方案中，碳源直接或间接源自天然原料如甘蔗、甜高粱、柳枝稷、甜菜等。
如本文所用，术语“生物质”是指从中得到碳源的任何生物材料。在一些实施方案中，生物质被加工为适合生物转化的碳源。在其他实施方案中，生物质不需要进一步加工为碳源。碳源可以转化为脂肪酸或脂肪酸衍生物的任何组合物。生物质的示例性来源为植物材料或草木如玉米、甘蔗或柳枝稷。生物质的另一示例性来源为代谢废物如动物物质(例如，牛粪)。生物质的其他示例性来源包括藻类和其他海洋植物。生物质还包括来自工业、农业、林业和家庭的废物，包括但不限于发酵废物、青贮饲料、稻草、木材、污水、垃圾、纤维质城市废物和食物剩余物。术语“生物质”还可指诸如糖类(例如，单糖、二糖或多糖)的碳源。
如本文所用，关于产物(如脂肪酸及其衍生物)，术语“分离的”是指分离自细胞组分、细胞培养基或者化学或合成前体的产物。通过本文所述方法制备的脂肪酸及其衍生物在发酵液中可能是相对不混溶的，在细胞质中也是。因此，脂肪酸及其衍生物可以通过在细胞内或细胞外收集于有机相中。在有机相中收集产物可以减少脂肪酸衍生物——脂肪醛或脂肪醇对细胞功能的影响，并且可以允许重组微生物产生更多的产物。通过本发明方法制备的脂肪酸及其衍生物通常分离自重组微生物所培养的液体培养基中。
如本文所用的术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”指通过例如纯化或分离从分子的环境中移除或分离所述分子。“基本上纯化的”分子为至少约60%游离(例如，至少约70%游离、至少约75%游离、至少约85%游离、至少约90%游离、至少约95%游离、至少约97%游离、至少约99%游离)于与其结合的其他组分。如本文所用，这些术语还指从样品中去除污染物。例如，污染物的去除可以使得样品中脂肪醛或脂肪醇的百分比增加。例如，当脂肪醛或脂肪醇在重组微生物中产生时，可以通过去除重组微生物蛋白来纯化脂肪醛或脂肪醇。纯化后，同样的样品中脂肪醛或脂肪醇的百分比增加。术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”不要求绝对纯的相对术语。因此，例如，当脂肪醛或脂肪醇在重组微生物中产生时，纯化的脂肪醛或纯化的脂肪醇是基本与其他细胞组分(例如，核酸、多肽、脂质、糖类或其他烃类)分离的脂肪醛或脂肪醇。
如本文所用的“现代碳分数(fraction of modern carbon)”或“fM”与分别称为草酸标准HOxI和HOxII的、由国家标准技术研究院(National Instituteof Standards and Technology(NIST))标准参考物(SRMs)4990B和4990C所定义的含义相同。基本定义涉及0.95倍的14C/12C同位素比率HOxI(参考AD1950)。这粗略地等于衰变校正的工业革命前树木(decay-correctedpre-Industrial Revolution wood)。对于现今生命生物圈(植物物质)而言，fM约为1.1。
发明总体概述
在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于特定类型的重组宿主细胞、特定多核苷酸序列、特定突变、特定蛋白等，因为使用这类特定物质可能基于本发明的教导而选定。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述本发明特定实施方案的目的，并且不试图进行限制。
重组宿主细胞和重组宿主细胞培养物
在第一个方面，本发明涉及经改造用于产生高滴度的、具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物的重组宿主细胞培养物，所述滴度通常为约30g/L至约250g/L。本发明的重组宿主细胞可以产生大量的脂肪酸衍生物，包括但不限于脂肪酸、酰基-CoA、脂肪醛、短链和长链醇、烃类(例如，烷烃、烯烃或链烯如末端或内部链烯)、脂肪醇、酯(例如，蜡酯、脂肪酸酯(例如，甲基酯或乙基酯)，以及酮类。在一个实施方案中，本发明涉及脂肪醇的产生。
在本发明的一些实施方案中，相对于野生型宿主细胞的对照培养物产生的相同脂肪酸衍生物的滴度，重组宿主细胞产生的更高滴度的脂肪酸衍生物为更高滴度的、具有选定脂肪链长度的脂肪酸衍生物。此类更高滴度的实例包括但不限于以下：相对于相应野生型宿主细胞的对照培养物产生的具有脂肪链长度C8的脂肪醇的滴度，所述重组宿主细胞培养物产生更高滴度的、具有脂肪链长度C8的脂肪醇；相对于相应野生型宿主细胞的对照培养物产生的具有脂肪链长度C8和C10的脂肪醇的滴度，所述重组宿主细胞培养物产生更高滴度的、具有脂肪链长度C8和C10的脂肪醇；相对于相应野生型宿主细胞的对照培养物产生的具有脂肪链长度C12的脂肪醇的滴度，所述重组宿主细胞培养物产生更高滴度的、具有脂肪链长度C12的脂肪醇；相对于相应野生型宿主细胞的对照培养物产生的具有脂肪链长度C12和C14的脂肪醇的滴度，所述重组宿主细胞培养物产生更高滴度的、具有脂肪链长度C12和C14的脂肪醇；以及，相对于相应野生型宿主细胞的对照培养物产生的具有脂肪链长度C12、C14和C18的脂肪醇的滴度，所述重组宿主细胞培养物产生更高滴度的、具有脂肪链长度C12、C14和C18的脂肪醇。在本发明的其他实施方案中，相对于相应野生型宿主细胞的对照培养物产生的相同脂肪酸衍生物的滴度，所述更高滴度的脂肪酸衍生物是更高滴度的特定类型脂肪酸衍生物(例如，脂肪醇、脂肪酸酯或烃类)。
在本发明优选的实施方案中，多核苷酸序列包含编码酶学委员会编号为EC2.3.1.–的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的开放阅读框，以及可操作地连接的、促进重组宿主细胞的蛋白表达的调控序列。在重组宿主细胞中，相对于编码延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的相应的野生型基因，所述开放阅读框编码序列和/或所述调控序列被修改。相对于从相应宿主细胞的野生型基因表达的β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的活性，重组宿主细胞的β-酮脂酰-ACP合酶蛋白活性被改良。另外，培养物中的重组宿主细胞包含一个或多个含有编码酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–的硫酯酶的开放阅读框的多核苷酸序列，以及可操作地连接的、促进重组宿主细胞蛋白表达的调控序列。在重组宿主细胞中，相对于编码硫酯酶的相应野生型基因，所述开放阅读框编码序列和/或所述调控序列被修改。相对于从相应宿主细胞的相应野生型基因表达的硫酯酶的活性，重组宿主细胞的硫酯酶活性被改良。
制备具有改良的酶活性的蛋白的方法描述如下。另外，表达具有此类改良的活性的蛋白的示例性重组宿主细胞描述于本发明实施例中。
本发明的一个实施方案涉及产生高滴度的、具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物的重组宿主细胞培养物。所述重组宿主细胞培养物包含重组宿主细胞。所述重组宿主细胞经改造用于产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物。所述重组宿主细胞通常包含酶学委员会编号为EC2.3.1.–的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的改良的活性。所述改良的活性不同于在与重组宿主细胞种类相同的宿主细胞(例如，重组宿主细胞源自的野生型宿主细胞)中通过表达起始多核苷酸序列(SPSA)产生的β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的活性，所述SPSA包含编码延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的开放阅读框多核苷酸序列(ORFA)以及5'非编码多核苷酸序列(NCA)，所述ORFA具有5'和3'端，所述NCA包含邻近所述ORFA5'端的可操作地连接的调控序列。所述起始多核苷酸序列，例如，可以为编码延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的野生型基因。另外，所述重组宿主细胞包含一个或多个编码β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，包括与所述ORFA或所述NCA分别具有小于100%序列同一性的ORFA变体和/或NCA变体。另外，所述重组宿主细胞包含酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–的硫酯酶的改良的活性。所述改良的活性不同于在与重组宿主细胞种类相同的宿主细胞中通过表达起始多核苷酸序列(SPSB)产生的硫酯酶的活性，所述SPSB包含编码硫酯酶的开放阅读框多核苷酸序列(ORFB)以及5'非编码多核苷酸序列(NCB)，所述ORFB具有5'和3'端，所述NCB包含邻近所述ORFB5'端的可操作地连接的调控序列。所述起始多核苷酸序列，例如，可以为编码硫酯酶的野生型基因。另外，所述重组宿主细胞包含一个或多个编码硫酯酶的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，包括与所述ORFB或所述NCB具有小于100%序列同一性的ORFB变体和/或NCB变体。
重组宿主细胞培养物通常产生高滴度(约30g/L至约250g/L)的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物。
相比在与重组培养物相同的条件下培养的对照培养物所产生的脂肪酸衍生物的滴度，重组培养物通常产生的脂肪酸衍生物的滴度为至少约3倍大、至少约5倍大、至少约8倍大，或至少约10倍大。重组培养物通常包含重组宿主细胞，其含有诱变的多核苷酸序列(具有开放阅读框，其编码可操作地连接至促进该蛋白表达的调控序列的蛋白)。对照培养物通常包含宿主细胞，其表达编码延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白和硫酯酶的野生型基因。可选地，对照培养物可以包含宿主细胞，其含有多核苷酸序列(具有开放阅读框，其编码可操作地连接至促进该蛋白表达的调控序列的蛋白)，所述多核苷酸序列被用作在引入至本发明的重组宿主细胞前进行诱变的起始多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组宿主细胞培养物产生约30g/L至约250g/L滴度的脂肪酸衍生物。
在本发明的一些实施方案中，相比在与重组培养物相同条件下培养的对照培养物产生的脂肪酸衍生物的滴度，所述重组宿主细胞培养物产生的脂肪酸衍生物产率为至少约3倍大、约5倍大、约8倍大或约10倍大。脂肪酸衍生物产率的实例包括重组宿主细胞培养物产生约10%至约40%的脂肪酸衍生物。通常，滴度和产率具有正相关关系。
在一些实施方案中，相比与重组培养物相同条件下培养时的对照培养物的生产力，所述重组宿主细胞培养物的脂肪酸衍生物生产力为至少约3倍大、约5倍大、约8倍大，或约10倍大。所述重组宿主细胞培养物的脂肪酸衍生物生产力的实例包括约700mg/L/小时至约3000mg/L/小时。通常，滴度和生产力具有正相关关系。
在本发明的一个实施方案中，所述重组宿主细胞培养物培养在包含碳源的培养基中。合适的碳源包括但不限于单糖(例如，葡萄糖)、二糖(例如，蔗糖)、低聚糖、多糖(例如，纤维素或淀粉)、纤维素物质和生物质。
在任何前述实施方案的重组宿主细胞培养物中，编码β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的核苷酸序列的实例包括但不限于，编码3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白(酶学委员会编号EC2.3.1.41)或3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白(酶学委员会编号EC2.3.1.179)的序列。在利用3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白的优选实施方案中，所述合酶蛋白ORFA编码来自大肠杆菌fabB的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白，其具有SEQ ID NO:2所示的序列，并且变体合酶蛋白ORFA编码的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白与大肠杆菌fabB蛋白(SEQ ID NO:2)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%，优选约90%或约95%或更大的序列同一性。在利用3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白的优选实施方案中，合酶蛋白ORFA编码来自大肠杆菌fabF的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白，其具有SEQ ID NO:4所示的序列，并且变体合酶蛋白ORFA编码的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白与大肠杆菌fabF蛋白(SEQID NO:4)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%、优选约90%或约95%或更大的序列同一性。另外，例如，可以从通过NCA随机化产生的文库提供5'非编码多核苷酸序列变体(NCA变体)。当相比起始非编码多核苷酸序列(例如，NCA)时，非编码多核苷酸序列变体(例如，变体NCA)通常具有0%的百分比序列同一性至<100%的百分比序列同一性。
在任何前述实施方案的重组宿主细胞培养物中，编码硫酯酶的核苷酸序列的实例包括但不限于，编码硫酯酶蛋白(酶学委员会编号EC3.1.1.5或EC3.1.2.–)的序列。在利用硫酯酶蛋白的优选实施方案中，硫酯酶蛋白ORFB编码来自大肠杆菌tesA的硫酯酶蛋白，其具有SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19所示的序列，并且ORFB变体编码的硫酯酶蛋白与大肠杆菌tesA蛋白(分别为SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%，优选约90%或约95%或更大的序列同一性。另外，例如，可以从通过NCB的随机化产生的文库提供5'非编码多核苷酸序列变体(NCB变体)。当相比起始非编码多核苷酸序列(例如，NCB)时，非编码多核苷酸序列变体(例如，NCB变体)通常具有0%的百分比序列同一性至<100%的百分比序列同一性。
本发明培养物的重组宿主细胞还可以包含一个或多个编码酶学委员会编号为EC6.2.1.3或EC1.2.1.42的羧酸还原酶蛋白的核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。在优选的实施方案中，所述羧酸还原酶蛋白为与耻垢分枝杆菌carB脂肪酸还原酶蛋白(SEQ ID NO:10)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%，优选约90%或约95%或更大序列同一性的蛋白。在其他实施方案中，所述羧酸还原酶蛋白为与以下蛋白具有至少约70%、约75%、约80%、约85%，优选约90%或约95%或更大序列同一性的蛋白：(i)结核分枝杆菌fadD9蛋白(SEQ ID NO:21；也参见，美国专利公开第20100105963号)，或(ii)耻垢分枝杆菌carA蛋白(SEQ IDNO:23；也参见，美国专利公开第20100105963号)。
另外，本发明的重组宿主细胞还可以包含一个或多个编码酶学委员会编号为EC1.1.–.–、EC1.1.1.1或EC1.2.1.10的醇脱氢酶蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。此类醇脱氢酶蛋白的实例包括但不限于，大肠杆菌AdhE(醛-醇脱氢酶蛋白)或大肠杆菌yqhD(醇脱氢酶蛋白)。
在本发明的重组宿主细胞培养物中，所述高滴度的脂肪酸衍生物可以为具有选自以下脂肪链长度之间的脂肪链长度的高滴度脂肪酸衍生物：C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20，以及它们的组合。所述高滴度的脂肪酸衍生物可以为，例如，具有脂肪链长度C8的高滴度的脂肪醇、具有脂肪链长度C10的高滴度的脂肪醇、具有脂肪链长度C12的高滴度的脂肪醇、具有脂肪链长度C14的高滴度的脂肪醇、具有脂肪链长度C16的高滴度的脂肪醇、具有脂肪链长度C18的高滴度的脂肪醇、具有脂肪链长度C20的高滴度的脂肪醇，以及它们的组合。在一个实施方案中，两个选定的脂肪链长度的比率(CX/CY)被用于定征脂肪链长度。CX/CY比率为具有脂肪链长度CX的脂肪酸衍生物的滴度与具有脂肪链长度CY的脂肪酸衍生物的滴度的比率。在本发明的一些实施方案中，CX/CY具有约1.5至约6的值，其中X和Y为整数值，并且X小于Y。在本发明的其他实施方案中，CX/CY具有至少约2的值，其中X和Y为整数值，并且X小于Y。在优选的实施方案中，CX/CY具有约2至约4的值，其中X和Y为整数值，并且X小于Y。X和Y值的实例包括但不限于：X=8,Y=10；X=12,Y=14；X=14,Y=16；及X=18,Y=20。根据本说明书的教导，X和Y值的其他组合对本领域技术人员是显而易见的。
本发明的第二个方面涉及提供所需饱和度的脂肪链的脂肪酸衍生物(例如，脂肪醇)。在该方面，如上所述的重组宿主细胞还包含一个或多个多核苷酸序列，其含有编码酶学委员会编号为EC4.2.1.–或4.2.1.60的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的开放阅读框，以及可操作地连接的促进在重组宿主细胞中表达该蛋白的调控序列。在所述重组宿主细胞中，相对于编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的相应野生型基因，所述开放阅读框编码序列和/或调控序列被修改。相对于从相应宿主细胞的野生型基因表达的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性，所述重组宿主细胞的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性被改良。
在一些实施方案中，所述改良的活性不同于在与重组宿主细胞种类相同的宿主细胞中通过表达起始多核苷酸序列(SPSC)产生的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性，所述SPSC包含编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的开放阅读框多核苷酸序列(ORFC)以及5'非编码多核苷酸序列(NCC)，所述ORFC具有5'和3'端，所述NCC包含邻近所述ORFC5'端的可操作地连接的调控序列。所述重组宿主细胞通常包含一个或多个编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，包括分别与所述ORFC或所述NCC具有小于100%序列同一性的ORFC变体和/或NCC变体。
在一些实施方案中，所述ORFC编码来自大肠杆菌fabZ的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白，其具有SEQ ID NO:14所示的序列，并且所述ORFC变体编码的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白与大肠杆菌fabZ蛋白(SEQ ID NO:14)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%、优选约90%或约95%或更大的序列同一性。在一些实施方案中，所述ORFC编码来自大肠杆菌fabA的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白，其具有SEQ ID NO:12所示的序列，并且所述ORFC变体编码的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白与大肠杆菌fabA蛋白(SEQ ID NO:12)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%，优选约90%或约95%或更大的序列同一性。
另外，例如，可以从通过NCC的随机化产生的文库提供5'非编码多核苷酸序列变体(NCC变体)。当相比起始非编码多核苷酸序列(例如，NCC)时，非编码多核苷酸序列变体(例如，变体NCC)通常具有0%的百分比序列同一性至<100%的百分比序列同一性。
在一个实施方案中，具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物还具有优选的百分比饱和度。例如，具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物包含饱和的和不饱和的脂肪链，并且至少约90%的目标脂肪酸衍生物具有饱和脂肪链。根据本说明书的教导，本领域技术人员可以挑选所需百分比饱和度的目标脂肪酸衍生物。
本发明的第三个方面涉及重组宿主细胞培养物，其产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物。所述重组宿主细胞培养物包含重组宿主细胞。所述重组宿主细胞经改造用于产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物。所述重组宿主细胞通常具有酶学委员会编号为EC4.2.1.–或4.2.1.60的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的改良的活性。所述改良的活性不同于在与重组宿主细胞种类相同的宿主细胞中通过表达起始多核苷酸序列(SPSD)产生的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性，所述SPSD包含编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的开放阅读框多核苷酸序列(ORFD)以及5'非编码多核苷酸序列(NCD)，所述ORFD具有5'和3'端，所述NCD包含邻近所述ORFD5'端的可操作地连接的调控序列。所述重组宿主细胞包含一个或多个编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的SPSD变体以及可操作地连接的调控序列，包括分别与所述ORFD或所述NCD具有小于100%序列同一性的ORFD变体和/或NCD变体。相比与表达SPSD的重组宿主细胞种类相同的宿主细胞培养物产生的脂肪酸衍生物组合物，所述重组宿主细胞培养物产生的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物包含更高滴度的、具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物。所述起始多核苷酸序列可以为，例如，编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的野生型基因。
在一些实施方案中，所述ORFD编码来自大肠杆菌fabZ的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白，其具有SEQ ID NO:14所示的序列，并且所述ORFD变体编码的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白与大肠杆菌fabZ蛋白(SEQ ID NO:14)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%、优选约90%或约95%或更大的序列同一性。在一些实施方案中，所述ORFD编码来自大肠杆菌fabA的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白，其具有SEQ ID NO:12所示的序列，并且所述ORFD变体编码的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白与大肠杆菌fabA蛋白(SEQ ID NO:12)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%、优选约90%或约95%或更大的序列同一性。
另外，例如，可以从通过NCD的随机化产生的文库提供5'非编码多核苷酸序列变体(NCD变体)。当相比起始非编码多核苷酸序列(例如，NCD)时，非编码多核苷酸序列变体(例如，NCD变体)通常具有0%的百分比序列同一性至<100%的百分比序列同一性。
本发明的该第三方面的重组宿主细胞还可以包含如本文所述的其他元件，例如，延伸β-酮脂酰-ACP合酶基因、酰基-ACP水解酶基因、羧酸还原酶基因、醇脱氢酶基因等。
本发明的第四方面涉及重组宿主细胞培养物，其产生具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物组合物。所述重组宿主细胞培养物包含重组宿主细胞，其经改造用于产生具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物组合物。所述重组宿主细胞包含缺少异构酶活性且酶学委员会编号为EC4.2.1.–的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的改良的活性。所述改良的活性不同于在与重组宿主细胞种类相同的宿主细胞中通过表达起始多核苷酸序列(SSPE)产生的缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性，所述SSPE包含编码缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的开放阅读框多核苷酸序列(ORFE)以及5'非编码多核苷酸序列(NCE)，所述ORFE具有5'和3'端，所述NCE包含邻近所述ORFE5'端的可操作地连接的调控序列。所述重组宿主细胞包含一个或多个编码缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，包括分别与所述ORFE或所述NCE具有小于100%序列同一性的ORFE变体和/或NCE变体。相比与表达所述SPSE的重组宿主细胞种类相同的宿主细胞培养物产生的脂肪酸衍生物组合物，所述重组宿主细胞培养物产生的具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物组合物包含更高滴度的、具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物。所述起始多核苷酸序列可以为，例如，编码缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的野生型基因。
在一些实施方案中，所述ORFE编码来自大肠杆菌fabZ的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白，其具有SEQ ID NO:14所示序列，并且所述ORFE变体编码的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白与大肠杆菌fabZ蛋白(SEQ ID NO:14)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%、优选约90%或约95%或更大的序列同一性。
另外，例如，可以从通过NCE的随机化产生的文库提供5'非编码多核苷酸序列变体(NCE变体)。当相比起始非编码多核苷酸序列(例如，NCE)时，非编码多核苷酸序列变体(例如，NCE变体)通常具有0%的百分比序列同一性至<100%的百分比序列同一性。
本发明的该第四方面的重组宿主细胞还可以包含如本文所述的其他元件，例如，延伸β-酮脂酰-ACP合酶基因、酰基-ACP水解酶基因、羧酸还原酶基因、醇脱氢酶基因等。
在本文所述的重组宿主细胞培养物中，所述重组宿主细胞可以为哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻细胞或细菌细胞。在一个实施方案中，所述重组宿主细胞为微生物(例如，细菌或真菌)。在优选的实施方案中，所述重组宿主细胞为细菌。在优选的实施方案中，所述细菌为大肠杆菌。
在本发明的一些实施方案中，所述“脂肪酸衍生物”为脂肪醇。
在本发明的重组宿主细胞和培养物的一些实施方案中，所述可操作地连接的调控序列可以赋予可操作地连接的开放阅读框的组成型表达或可调控表达；引起由开放阅读框编码的蛋白的组成型或可调控表达。例如，可以通过组成型启动子，或通过可诱导的/可抑制的启动子介导宿主细胞的蛋白表达。可诱导/可抑制启动子的实例包括但不限于以下：大肠杆菌lac操纵子启动子以及GAL4-可诱导型启动子，其中lac操纵子的诱导物如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或异乳糖(天然诱导物)结合lac阻遏物，其不再能作用于启动子，并且启动子控制下的基因转录物被去抑制。
所述一个或多个包含编码蛋白的开放阅读框以及可操作地连接的调控序列的多核苷酸序列，可以整合到重组宿主细胞的染色体中、整合到位于重组宿主细胞中的一个或多个质粒表达系统中，或两者。在实施例中，质粒表达系统通常被用来阐述本发明的实施方案。
本发明培养物的重组宿主细胞的实施方案还可以包含一个或多个编码一种或多种其他蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。此类其他蛋白的实例包括但不限于，乙酰-CoA乙酰转移酶；β-羟基丁酰-CoA脱氢酶；巴豆酸酶丁酰-CoA脱氢酶；和辅酶A-酰化醛脱氢酶。此类其他蛋白可以表达于重组宿主细胞中，以促进从底物酰基-ACPs产生特定脂肪酸衍生物(参见，例如，图2和表1)。
表1
Figure BDA0000486249010000371
Figure BDA0000486249010000381
Figure BDA0000486249010000391
Figure BDA0000486249010000401
Figure BDA0000486249010000411
Figure BDA0000486249010000421
*还参见第2部分，具有“:0”的酶产物为不饱和(无双键)的，且具有“:1”的酶产物为饱和(1个双键)的。
在本发明的一些实施方案中，编码蛋白的野生型基因包含含有开放阅读框(ORF)和5'非编码多核苷酸序列(NC)的多核苷酸序列，所述NC包含邻近所述ORF5'端的、介导所述ORF表达和所编码蛋白产生的可操作地连接的调控序列。ORF具有5'和3'端，并且在野生型基因中天然的可操作地连接的调控序列邻近所述ORF的5'端；天然地邻近ORF5'端的可操作地连接的调控序列为已知来自于野生型基因的5'-非编码序列的基因组序列的调控序列。例如，在野生型大肠杆菌基因组中，天然可操作地连接的调控序列为已知邻近ORF的那些(参见，例如，大肠杆菌K-12的完整基因组序列;Blattner,F.R.,et al.,Science277(5331),1453-1474(1997);Riley,M.,et al.,Nucleic Acids Res.34(1),1-9(2006);登录号U00096.2)。在本发明的一些实施方案中，ORF变体和/或NC变体分别与野生型ORF或野生型NC具有小于100%序列同一性。当相比野生型基因中包含天然地邻近ORF5'端的可操作地连接的调控序列的野生型5'非编码多核苷酸序列时，非编码多核苷酸序列变体可以具有0%的百分比序列同一性至<100%的百分比序列同一性；即，所述序列变体与天然序列不同。
除了包含邻近ORF5'端的可操作地连接的调控序列的5'非编码多核苷酸序列，通常可以根据本文所述方法修饰其他的调控序列。此类其他的调控序列包括但不限于，包含邻近ORF3'端的可操作地连接的调控序列，或位于多核苷酸序列的内含子中的可操作地连接的调控序列的3'非编码多核苷酸序列。
制备本发明的重组宿主细胞和重组宿主细胞培养物的方法在本文有进一步详细的描述。
制备重组宿主细胞和培养物的方法
本发明的第五个方面涉及制备本发明的重组宿主细胞和重组宿主细胞培养物的方法。可以通过本发明的产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物(例如，脂肪醇)组合物的方法制备重组宿主细胞。在该方面，所述方法通常包括选自步骤(A)、步骤(B)和步骤(C)的两个主要步骤，其中所述两个步骤为不相同的步骤，并且所述两个步骤以任何顺序进行，以产生重组宿主细胞；例如，步骤(A)之后为步骤(B)、步骤(A)之后为步骤(C)、步骤(B)之后为步骤(A)、步骤(B)之后为步骤(C)、步骤(C)之后为步骤(B)，或者步骤(C)之后为步骤(A)。
除了这两个主要步骤，所述方法还可以包括其他步骤，包括但不限于另外的步骤(A)、(B)或(C)，以及其他宿主细胞操作(例如，诱变步骤)。另外，可以重复任何步骤一次或多次，以及以任何顺序进行(例如，(A)随后(A)然后(B)；(B)随后(A)然后(B)；(A)随后(B)然后(A)随后(B)然后(C)；等)。
在步骤(A)、(B)和(C)以下的描述中，起始多核苷酸可以为，例如，编码活性被改良的蛋白的野生型基因。在其他实施方案中，起始多核苷酸序列可以源自此类野生型基因(例如，利用野生型基因的多核苷酸序列变体)。
步骤(A)通常包括以下。利用起始多核苷酸序列(SPSA)制备重组宿主细胞的起始组，所述SPSA包含开放阅读框(ORFA)以及5'非编码多核苷酸序列(NCA)，所述ORFA具有5'和3'端，所述NCA包含邻近所述ORFA5'端的可操作地连接的调控序列。每个重组宿主细胞包含一个或多个SPSA变体，其中(i)所述ORFA编码酶学委员会编号为EC2.3.1.–的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白，且(ii)每个SPSA变体包含分别与所述ORFA或所述NCA具有小于100%序列同一性的ORFA变体和/或NCA变体。
在碳源存在下培养来自所述重组宿主细胞组的克隆。然后筛选克隆以测定脂肪酸衍生物的脂肪链长度，以及每个克隆产生的脂肪酸衍生物的滴度。在克隆中，确定了产生最大滴度的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的克隆。
挑选来自重组宿主细胞组的克隆(或一个或多个克隆)，其以小于所述最大滴度(即，确定为产生最大滴度的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的克隆的最大滴度)的滴度，产生具有长于目标脂肪链长度的脂肪链长度的脂肪酸衍生物。选定的克隆包含SPSA变体(SPSVA)，其包括ORFA变体(ORFVA)和/或NCA变体(NCVA)。在可选的实施方案中，例如当步骤(A)为进行的最后步骤时，可以挑选确定为产生最大滴度的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的克隆。
如上所示，可以以任何顺序进行所述方法的两个主要步骤。因此，(i)如果方法中步骤(A)在步骤(B)之后，则步骤(A)的起始组的每个重组宿主细胞还包含SPSVB(通常至少ORFB变体(ORFVB)和/或NCB变体(NCVB))，或者(ii)如果方法中步骤(A)在步骤(C)之后，则步骤(A)的起始组的每个重组宿主细胞还包含SPSVC(通常至少ORFC变体(ORFVC)和/或NCC变体(NCVC))。
步骤(B)通常包含以下。利用起始多核苷酸序列(SPSB)制备重组宿主细胞的起始组，所述SPSB包含开放阅读框(ORFB)以及5'非编码多核苷酸序列(NCB)，所述ORFB具有5'和3'端，所述NCB包含邻近所述ORFB5'端的可操作地连接的调控序列，每个重组宿主细胞包含一个或多个SPSB变体，其中(i)所述ORFB编码酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–的硫酯酶，且(ii)每个SPSB变体包含分别与所述ORFB或所述NCB具有小于100%序列同一性的ORFB变体和/或NCB变体。
在碳源存在下培养来自重组宿主细胞组的克隆。然后筛选克隆以测定脂肪酸衍生物的脂肪链长度，以及每个克隆产生的脂肪酸衍生物的滴度。在克隆中，确定了产生最大滴度的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的克隆。
挑选来自重组宿主细胞组的克隆(或一个或多个克隆)，其以近似等于最大滴度(即，确定为产生最大滴度的、具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的克隆的最大滴度)的滴度，产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物。选定的克隆包含SPSB变体(SPSVB)，其包括ORFB变体(ORFVB)和/或NCB变体(NCVB)。
通常，选定的产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的克隆以近似等于所述最大滴度的滴度，产生脂肪酸衍生物。在本发明方法其他的实施方案中，所述选定的克隆以如下滴度产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物：所述最大滴度的约2%以内的滴度、所述最大滴度的约5%以内的滴度、所述最大滴度的约10%以内的滴度、所述最大滴度的约20%以内的滴度或所述最大滴度的约30%以内的滴度。
如上所示，所述方法的两个主要步骤可按任何顺序进行。因此，(i)如果方法中步骤(B)在步骤(A)后，则步骤(B)的起始组的每个重组宿主细胞还包含SPSVA(通常至少ORFA变体(ORFVA)和/或NCA变体(NCVA))，或者(ii)如果方法中步骤(B)在步骤(C)后，则步骤(B)的起始组的每个重组宿主细胞还包含SPSVC(通常至少ORFC变体(ORFVC)和/或NCC变体(NCVC))。
步骤(C)通常包括如下。利用起始多核苷酸序列(SPSC)制备重组宿主细胞的起始组，所述SPSC包含开放阅读框(ORFC)以及5'非编码多核苷酸序列(NCC)，所述ORFC具有5'和3'端，所述NCC包含邻近所述ORFC5'端的可操作地连接的调控序列。每个重组宿主细胞包含一个或多个SPSC变体，其中(i)所述ORFC编码酶学委员会编号为EC4.2.1.–或4.2.1.60的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白，且(ii)每个SPSC变体包含分别与所述ORFC或所述NCC具有小于100%序列同一性的ORFC变体和/或NCC变体。
在碳源存在下培养来自重组宿主细胞组的克隆。然后筛选克隆以测定每个克隆的脂肪酸衍生物的脂肪链长度、脂肪酸衍生物的脂肪链百分比饱和度，以及脂肪酸衍生物的滴度。在克隆中，确定了产生最大滴度的具有目标脂肪链长度和优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物的克隆；以及
挑选来自重组宿主细胞组的克隆(或一个或多个克隆)，其以近似等于所述最大滴度的滴度，产生具有目标脂肪链长度和优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物，其中选定的克隆包含SPSC变体(SPSVC)，其包括ORFC变体(ORFVC)和/或NCC变体(NCVC)。在本发明方法其他的实施方案中，选定的克隆以如下滴度产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物：所述最大滴度的约2%以内的滴度、所述最大滴度的约5%以内的滴度、所述最大滴度的约10%以内的滴度、所述最大滴度的约20%以内的滴度，或所述最大滴度的约30%以内的滴度.
如上所示，所述方法的两个主要步骤可以以任何顺序进行。因此，(i)如果方法中步骤(C)在步骤(B)后，则步骤(C)的起始组的每个重组宿主细胞还包含SPSVB(通常至少ORFB变体(ORFVB)和/或NCB变体(NCVB))，或者(ii)如果方法中步骤(C)在步骤(A)后，则步骤(C)的起始组的每个重组宿主细胞还包含SPSVA，(通常至少ORFA变体(ORFVA)和/或NCA变体(NCVA))。
在本发明方法的一些实施方案，具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物还具有优选的百分比饱和度。例如，具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物包含饱和的和不饱和的脂肪链，并且通常，脂肪酸衍生物脂肪链的优选百分比饱和度为具有饱和脂肪链的目标脂肪酸衍生物的约90%或更大。然而，根据本发明方法，本领域技术人员可以挑选任何值的优选百分比饱和度，例如，约5%的优选百分比饱和度(即，约95%的脂肪链为不饱和的)、约60%的优选百分比饱和度(即，约40%的脂肪链为不饱和的)等。
步骤(A)通常用于优化具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的产生。步骤(B)通常用于优化具有目标脂肪链长度和/或优选百分比饱和度的脂肪酸衍生物的滴度。步骤(C)通常用于优化具有目标脂肪链长度和优选百分比饱和度的脂肪酸衍生物的产生。在步骤(C)的可选实施方案中，利用起始多核苷酸序列(SPSF)制备重组宿主细胞的起始组，所述SPSF包含开放阅读框(ORFF)以及5'非编码多核苷酸序列(NCF)，所述ORFF具有5'和3'端，所述NCF包含邻近所述ORFF5'端的可操作地连接的调控序列。每个重组宿主细胞包含一个或多个SPSF变体，其中(i)所述ORFF编码β-酮脂酰-ACP合酶蛋白，例如，酶学委员会编号为EC2.3.1.41的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白，且(ii)每个SPSF变体包含分别与所述ORFF或所述NCF具有小于100%序列同一性的ORFF变体和/或NCF变体。按如上所述的步骤(C)进行培养、筛选和挑选。
可以通过本领域技术人员已知的多种方法测定总脂肪酸衍生物的滴度、具有不同脂肪链长度脂肪酸衍生物的滴度和脂肪酸衍生物的脂肪链的百分比饱和度(参见，例如，2010年10月7日公布的美国专利公开第20100251601号)，例如，薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱/火焰离子化监测器(GC/FID)、气相色谱/质谱(GC/MS)、液相色谱/质谱(LC/MS)和质谱(MS)。
在本发明的一个实施方案中，两个选定的脂肪链长度的比率(CX/CY)被用来定征脂肪链长度和目标脂肪链长度，所述CX/CY比率为具有脂肪链长度CX的脂肪酸衍生物的滴度与具有脂肪链长度CY的脂肪酸衍生物的滴度的比率，其中X和Y为整数值，并且X小于Y。
在本发明方法的一些实施方案中，具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物可以为具有选自以下脂肪链长度之间的脂肪链长度的脂肪酸衍生物：C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20和它们的组合。所述目标脂肪酸衍生物可以为，例如，具有脂肪链长度C8的脂肪酸衍生物、具有脂肪链长度C10的脂肪酸衍生物、具有脂肪链长度C12的脂肪酸衍生物、具有脂肪链长度C14的脂肪酸衍生物、具有脂肪链长度C16的脂肪酸衍生物、具有脂肪链长度C18的脂肪酸衍生物、具有脂肪链长度C20的脂肪酸衍生物，以及它们的组合。在一个实施方案中，两个选定的脂肪链长度的比率(CX/CY)被用来定征脂肪链长度。CX/CY比率为具有脂肪链长度CX的脂肪酸衍生物的滴度与具有脂肪链长度CY的脂肪酸衍生物的滴度。在本发明的一些实施方案中，CX/CY的值为约1.5至约6，其中X和Y为整数值，并且X小于Y。在本发明的其他实施方案中，CX/CY的值为至少约2，其中X和Y为整数值，并且X小于Y。在优选的实施方案中，CX/CY的值为约2至约4，其中X和Y为整数值，并且X小于Y。X和Y值的实例包括但不限于：X=8,Y=10；X=12,Y=14；X=14,Y=16；和X=18,Y=20。根据本说明书的教导，X和Y值的其他组合对本领域技术人员是显而易见的。
根据本说明书的教导，可通过本领域技术人员已知的方法制备变体多核苷酸序列。通常，多核苷酸序列变体通过引起一个或多个基因突变的诱变产生，所述基因突变包括但不限于以下的一个或多个突变：编码启动子序列的多核苷酸序列(例如，RNA聚合酶结合位点)；编码翻译控制序列的多核苷酸序列(例如，核糖体结合位点或翻译起始位点)；编码开放阅读框(编码蛋白)的多核苷酸序列；以及它们的组合。示例性诱变方法描述如下。
在本发明方法的一些实施方案中，NCVZ变体(即，5'非编码多核苷酸序列变体)获自通过NCVZ的随机化产生的文库，其中Z=A、B或C。可以随机化的非编码多核苷酸序列包括但不限于，启动子序列、翻译控制序列(例如，核糖体结合位点)、增强子序列和基因活化剂或抑制因子的结合位点。
在本发明方法的一些实施方案中，ORFVZ变体(即，编码多核苷酸序列的开放阅读框的蛋白)通过ORFVZ的诱变获得，其中Z=A、B或C。
在本发明方法的一些实施方案中，编码延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的ORFA编码3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白(酶学委员会编号EC2.3.1.41)或3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白(酶学委员会编号EC2.3.1.179)。在利用3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白的优选实施方案中，合酶蛋白ORFA编码具有SEQ ID NO:2所示序列的来自大肠杆菌fabB的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白，并且合酶蛋白ORFA变体编码与大肠杆菌fabB蛋白(SEQ ID NO:2)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%，优选约90%或约95%或更大序列同一性的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白。在利用3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白的优选实施方案中，合酶蛋白ORFA编码具有SEQ ID NO:4所示序列的来自大肠杆菌fabF的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白，并且合酶蛋白ORFA变体编码与大肠杆菌fabF蛋白(SEQ ID NO:4)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%，优选约90%或约95%或更大序列同一性的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白。另外，例如，可以从通过NCA的随机化产生的文库提供5'非编码多核苷酸序列变体(NCA变体)。当相比起始非编码多核苷酸序列(例如，NCA)时，非编码多核苷酸序列变体(例如，NCA变体)通常具有0%的百分比序列同一性至<100%的百分比序列同一性。
在本发明方法的一些实施方案中，编码硫酯酶的ORFB包括但不限于，编码硫酯酶蛋白(酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–)的序列。在利用硫酯酶蛋白的优选实施方案中，硫酯酶蛋白ORFB编码具有SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19所示序列的来自大肠杆菌tesA的硫酯酶蛋白，并且ORFB变体编码与大肠杆菌tesA蛋白(分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%，优选约90%或约95%或更大序列同一性的硫酯酶蛋白。另外，例如，可以从通过NCB的随机化产生的文库，提供5'非编码多核苷酸序列变体(NCB变体)。当相比起始非编码多核苷酸序列(例如，NCB)时，非编码多核苷酸序列变体(例如，NCB变体)通常具有0%的百分比序列同一性至<100%的百分比序列同一性。
在本发明方法的一些实施方案中，编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的ORFC编码酶学委员会编号为EC4.2.1.–或EC4.2.1.60的蛋白。在优选的实施方案中，ORFC编码具有SEQ ID NO:14所示序列的来自大肠杆菌fabZ的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白，并且ORFC变体编码与大肠杆菌fabZ蛋白(SEQ ID NO:14)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%，优选约90%或约95%或更大序列同一性的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白。在一些实施方案中，ORFC编码具有SEQ IDNO:12所示序列的来自大肠杆菌fabA的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白，并且ORFC变体编码与大肠杆菌fabA蛋白(SEQ ID NO:12)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%，优选约90%或约95%或更大序列同一性的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白。
另外，例如，可以从通过NCC的随机化产生的文库提供5'非编码多核苷酸序列变体(NCC变体)。当相比起始非编码多核苷酸序列(例如，NCC)时，非编码多核苷酸序列变体(例如，NCC变体)通常具有0%的百分比序列同一性至<100%的百分比序列同一性。
通过本发明方法制备的重组宿主细胞还可以包含一个或多个编码酶学委员会编号为EC6.2.1.3或EC1.2.1.42的羧酸还原酶蛋白的核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。在一些实施方案中，所述羧酸还原酶蛋白为与耻垢分枝杆菌carB脂肪酸还原酶蛋白(SEQ ID NO:10)具有至少约70%、约75%、约80%、约85%、优选约90%或约95%或更大序列同一性的蛋白。在其他实施方案中，所述羧酸还原酶蛋白为与以下蛋白具有至少约70%、约75%、约80%、约85%、优选约90%或约95%或更大序列同一性的蛋白：(i)结核分枝杆菌fadD9蛋白(SEQ ID NO:21；还参见，美国专利公开第20100105963号)，或(ii)耻垢分枝杆菌carA蛋白(SEQID NO:23；还参见，美国专利公开第20100105963号)。
另外，通过本发明方法制备的重组宿主细胞还可以包含一个或多个编码酶学委员会编号为EC1.1.–.–、EC1.1.1.1或EC1.2.1.10的醇脱氢酶蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。此类醇脱氢酶蛋白的实例包括但不限于，大肠杆菌AdhE(醛-醇脱氢酶蛋白)或大肠杆菌yqhD(醇脱氢酶蛋白)。
通过本发明方法制备的重组宿主细胞的实施方案还可以包含一个或多个编码一个或多个其他蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。此类其他蛋白的实例包括但不限于，乙酰-CoA乙酰转移酶；β-羟基丁酰-CoA脱氢酶；巴豆酸酶丁酰-CoA脱氢酶；和辅酶A-酰化醛脱氢酶。此类其他蛋白可以表达于重组宿主细胞中，以促进由酰基-ACPs作为底物产生特定脂肪酸衍生物(参见，例如，图2和表1)。
在本发明方法的一些实施方案中，可操作地连接的调控序列可以赋予可操作地连接的开放阅读框的组成型表达或调控性表达；导致开放阅读框编码的蛋白的组成型或调控性表达。例如，可以通过组成型启动子，或通过可诱导的/可抑制的启动子，介导宿主细胞中蛋白的表达。可诱导的/可抑制的启动子的实例为本领域已知，并且包括但不限于如下：大肠杆菌lac操纵子启动子；和酿酒酵母GAL4-可诱导的启动子。
可以将一个或多个包含编码蛋白的开放阅读框的多核苷酸序列和可操作地连接的调控序列整合到重组宿主细胞的染色体中，整合到重组宿主细胞中存在的一个或多个质粒表达系统中，或两者。在实施例中，质粒表达系统被用来阐述本发明的实施方案。
在如本文所述的方法步骤(A)、(B)和(C)，下标的使用被用来简单地描述步骤，例如，“SPSA”、“SPSB”、“SPSC”、“选定的克隆包含SPSA变体(SPSVA)，所述SPSVA包括ORFA变体(ORFVA)和/或NCA变体(NCVA)”、“选定的克隆包含SPSB变体(SPSVB)，所述SPSVB包括ORFB变体(ORFVB)和/或NCB变体(NCVB)”，和“选定的克隆包含SPSC变体(SPSVC)，所述SPSVC包括ORFC变体(ORFVC)和/或NCC变体(NCVC)”。描述步骤中使用此类下标不试图具有限制意义。关于步骤可以进行的顺序，本领域技术人员可以根据本说明书的教义恰当地修改步骤，例如，如下。当任何步骤在特定方法步骤(A)、(B)或(C)前时，针对步骤(A)、(B)或(C)“制备重组宿主细胞的起始组”通常包括，当在随后的特定方法步骤(A)、(B)或(C)中制备起始重组宿主细胞组时，从所使用的前述步骤向前方移一个或多个多核苷酸序列变体。
通过本发明的方法可制备重组宿主细胞，其产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物(例如，脂肪醇)组合物。所述方法通常包括选自步骤(A)、步骤(B)和步骤(C)的两个主要步骤，其中所述两个步骤为不相同的步骤，并且所述两个步骤以任何顺序进行，以制备重组宿主细胞；例如，步骤(A)然后步骤(B)、步骤(A)然后步骤(C)、步骤(B)然后步骤(A)、步骤(B)然后步骤(C)、步骤(C)然后步骤(B)，或步骤(C)然后步骤(A)。
在本发明方法的一个实施方案中，具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物为具有目标脂肪链长度的脂肪醇组合物。
在本发明的一个实施方案中，在碳源存在下培养通过本发明方法制备的重组宿主细胞，产生具有目标脂肪链长度和30g/L至250g/L的组合物滴度的脂肪酸衍生物组合物。
在本发明其他的实施方案中，在碳源存在下培养通过本发明方法制备的重组宿主细胞产生10%至40%产率的、具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物。
在本发明的另一实施方案中，在碳源存在下培养通过本发明方法制备的重组宿主细胞提供700mg/L/小时至3000mg/L/小时生产力的、具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物。
本发明的重组宿主细胞及其培养物可以为哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、藻细胞、真菌细胞或细菌细胞。在一个实施方案中，所述重组宿主细胞为微生物(例如，细菌或真菌)。在优选的实施方案中，所述重组宿主细胞为细菌。在优选的实施方案中，所述细菌为大肠杆菌。
本发明包括通过本发明方法制备的重组宿主细胞(例如，重组微生物)，以及所述重组宿主细胞的培养物。此类重组宿主细胞通常产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物，和/或具有优选饱和度的脂肪链的脂肪酸衍生物。
用于制备多核苷酸序列变体的诱变方法
在本发明方法的各方面中，诱变被用来制备用于筛选的重组宿主细胞组。通常，所述重组宿主细胞包含一个或多个含有蛋白的开放阅读框的多核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。可用于实施本发明方法的蛋白的众多实例在本文有描述，并且包括但不限于：延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白、硫酯酶、β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白和羧酸还原酶蛋白。可用于实施本发明方法的调控序列实例在本文也有描述，例如，RNA启动子序列、转录因子结合序列、转录终止序列、转录调节子、影响RNA稳定性的核苷酸序列，以及翻译调控序列。可以利用遗传工程技术如定点诱变、随机化学诱变、外切酶III删除方法或标准克隆技术，进行此类多核苷酸序列的诱变。可选地，可以利用化学合成或修饰方案制备多核苷酸序列的突变。
诱变方法为本领域熟知，并且包括，例如如下。易错PCR(参见，例如，Leung et al.,Technique1:11-15,1989;和Caldwell et al.,PCR MethodsApplic.2:28-33,1992)，在DNA聚合酶的复制保真度低的条件下进行PCR，以便沿PCR产物的整个长度得到高点突变率。简单地说，在此类方案中，将待诱变的多核苷酸(例如，调控序列如图3的R2、R4和R6；或包含编码蛋白的开放阅读框的多核苷酸如car、tesA、fabB、fabF、fabA和fabZ)与PCR引物、反应缓冲液、MgCl2、MnCl2、Taq聚合酶及合适浓度的dNTPs混合，以沿PCR产物的整个长度获得高点突变率。例如，可以利用20飞摩尔的待诱变核酸、30皮摩尔的每种PCR引物、反应缓冲液包含50mM KCl、10mM Tris HCl(pH8.3)和0.01%明胶、7mMMgCl2、0.5mM MnCl2、5个单位的Taq聚合酶、0.2mM dGTP、0.2mMdATP、1mM dCTP和1mM dTTP，进行反应。可以进行30个循环的PCR，即94oC1min、45℃1min和72℃1min。应当理解这些参数可以根据需要发生改变。然后将诱变的多核苷酸克隆至合适的载体中，并评估诱变的多核苷酸所编码的受影响多肽的活性。
还可以利用寡核苷酸定向诱变进行诱变(参见，例如，Reidhaar-Olsonet al.,Science241:53-57,1988)，以在任何克隆的目标DNA中产生定点突变。简单地说，在此类方案中，合成了多个带有一个或多个要引入至克隆的DNA中的突变的双链寡核苷酸，并插入至克隆的诱变DNA。回收含有诱变DNA的克隆，并评估受影响多肽的活性。
用于产生多核苷酸序列变体的另一诱变方法为组装PCR(assemblyPCR)。组装PCR包括从小DNA片段混合物组装PCR产物。大量不同的PCR反应在相同的小瓶中平行发生，其中一个反应的产物引发另一反应的产物。组装PCR描述于，例如，美国专利第5,965,408号中。
产生多核苷酸序列变体的又一诱变方法为有性PCR(sexual PCR)诱变(Stemmer,PNAS,USA91:10747-10751,1994)。在有性PCR诱变中，由于基于序列同源性的DNA分子随机片段化，不同但高度相关DNA序列的DNA分子之间在体外发生强迫性同源重组。此后通过PCR反应中的引物延伸固定交联。
还可以通过体内诱变制备多核苷酸序列变体。在一些实施方案中，通过在一个或多个DNA修复通路中携带有突变的细菌菌株如大肠杆菌菌株中扩增多核苷酸序列，产生核酸序列的随机突变。此类“增变(mutator)”菌株相比野生型菌株具有更高的随机突变率。在这些菌株中的一种中扩增DNA序列，最终会在DNA内产生随机突变。适合用于体内诱变的突变株描述于，例如，PCT国际公开第WO91/16427号。
还可以利用盒式诱变(cassette mutagenesis)产生多核苷酸序列变体。在盒式诱变中，双链DNA分子的小区域被不同于起始多核苷酸序列的合成寡核苷酸“盒”取代。寡核苷酸通常含有起始多核苷酸序列的完全和/或部分随机化的型式。盒式诱变存在许多应用；例如，通过盒式诱变制备突变体蛋白(参见，例如，Richards,J.H.,Nature323,187(1986);Ecker,D.J.,et al.,J.Biol.Chem.262:3524-3527(1987))；密码子盒式诱变以插入或取代单个的密码子(参见，例如，Kegler-Ebo,D.M.,et al.,Nucleic Res.22(9):1593–1599(1994))；通过包含调控序列的非编码多核苷酸序列的随机化制备多核苷酸序列变体(例如，核糖体结合位点，参见，例如，Barrick,D.,etal.,Nucleic Res.22(7):1287–1295(1994);Wilson,B.S.,et al.,Biotechniques17:944-953(1994))。
递归整体诱变(Recursive ensemble mutagenesis)(参见，例如，Arkin etal.,PNAS,USA89:7811-7815,1992)也可以用来产生多核苷酸序列变体。递归整体诱变为开发用于产生不同的表型相关突变体群的蛋白工程(即，蛋白诱变)的算法，所述突变群成员的氨基酸序列存在差异。该方法利用了反馈机制，以控制组合的盒式诱变的连续循环。
指数整体诱变(Exponential ensemble mutagenesis)(参见，例如，Delegrave et al.,Biotech.Res.11:1548-1552,1993)也可以用于产生多核苷酸序列变体。指数整体诱变为产生具有高百分比独特的和功能性突变体的组合文库的过程，其中小组的残基被平行随机化，以在每个改变的位置确定产生功能性蛋白的氨基酸。还可以使用随机和定点诱变(参见，例如，Arnold,Curr.Opin.Biotech.4:450-455,1993)。
另外，可以利用体内诱变的标准方法。例如，可以通过暴露至辐射(例如，UV光或X-射线)或暴露至化学物质(例如，乙基化剂、烷化剂或核酸类似物)，使包含一个或多个含有蛋白的开放阅读框以及可操作地连接的调控序列的多核苷酸序列的宿主细胞经历诱变。在一些宿主细胞类型中，例如，细菌、酵母和植物、转座元件也可以用于体内诱变。
在本发明利用一个或多个多核苷酸序列的诱变的方法的方面中，产生的表达蛋白产物通常保留有相同的生物学功能，即使所述蛋白展示所述生物学功能的改良的活性。例如，当通过一个或多个多核苷酸序列的诱变制备重组微生物组时，在重组微生物中观察到从产生的突变多核苷酸序列表达的蛋白，维持了硫酯酶生物学功能，但为硫酯酶的改良的活性，所述多核苷酸序列包含(i)编码大肠杆菌tesA硫酯酶蛋白的开放阅读框，和(ii)可操作地连接的调控序列。
在本发明方法的方面中，测定了重组宿主细胞和对应的野生型宿主细胞之间的活性差异。例如，使一个或多个包含编码蛋白的开放阅读框和可操作地连接的调控序列的起始多核苷酸序列经历诱变(即，“起始”多核苷酸序列为待诱变的多核苷酸序列，并产生“突变的”多核苷酸序列)。将包含一个或多个突变的多核苷酸序列的重组宿主细胞中蛋白的活性与包含所述一个或多个起始多核苷酸序列的相应野生型宿主细胞中蛋白的活性进行比较。作为一个例证，在如本文所述的方法步骤(B)的实施方案中，制备了重组微生物组，这些重组微生物包含一个或多个含有编码硫酯酶的开放阅读框的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，其中重组微生物中硫酯酶的活性被改良。一个或多个包含编码硫酯酶的开放阅读框和可操作地连接的调控序列的起始多核苷酸序列的诱变被用来制备重组微生物组。将包含一个或多个诱变的多核苷酸序列的重组微生物中的硫酯酶活性与包含所述一个或多个起始多核苷酸序列的相应野生型微生物中的硫酯酶活性进行比较。
在本发明方法的一个实施方案中，可以按如下测定蛋白的改良的活性。对重组宿主细胞(包含一个或多个编码蛋白的诱变的多核苷酸序列)进行培养和筛选，以确定重组宿主细胞产生的脂肪酸衍生物的特性；例如，脂肪酸衍生物的脂肪链长度、脂肪酸衍生物的滴度、脂肪酸衍生物的产率、脂肪酸衍生物的生产力、脂肪酸衍生物的脂肪链饱和度，以及它们的组合。通过比较相应野生型宿主细胞(包含一个或多个编码蛋白的起始多核苷酸序列)产生的脂肪酸衍生物的相同特征，以及确定特性差异来测定蛋白的改良的活性。
根据本说明书的教导、涉及脂肪酸生物合成(如本文所述)的蛋白的EC名和酶活性，以及可得到的这些蛋白的结构/功能信息，根据本说明书的教导，本领域技术人员具有足够的指导来进行编码序列的诱变，以获得具有改良的活性的蛋白。
对宿主细胞进行遗传改造以制备重组宿主细胞
各种重组宿主细胞可以被用来产生如本文所述的脂肪酸衍生物。宿主细胞可以为任何原核或真核细胞。例如，编码本文所述多肽(例如，延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白、硫酯酶、β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白和/或羧酸还原酶蛋白)的基因可以表达于细菌细胞(例如，大肠杆菌)、昆虫细胞、藻、酵母或哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞)。其他示例性宿主细胞在上文已有描述。在优选的实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌细胞、酿酒酵母细胞或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的实施方案中，宿主细胞为来自大肠杆菌菌株B、C、K或W的细胞。其他合适的宿主细胞为本领域技术人员已知。
可以用于本文所述方法的其他宿主细胞描述于公开的美国专利申请第20110008861号和第20090275097号。
本领域熟知的各种法可以被用来遗传改造宿主细胞，以提供重组细胞。方法可以包括利用载体，优选含有编码本文所述蛋白的序列的表达载体。
用于本发明的重组表达载体可以包含一个或多个编码蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地连接的适于提供在宿主细胞中表达编码的蛋白的调控序列。重组表达载体可以包含一个或多个基于用于表达的宿主细胞所选定的调控序列。此类调控序列描述于，例如，Goeddel,Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。调控序列包括指导许多类型宿主细胞中核苷酸序列的组成型表达的那些，以及指导仅存在于某些宿主细胞中的核苷酸序列的表达的那些(例如，组织特异性调控序列)。本领域技术人员应当理解，可以基于诸如待转化宿主细胞的选择、期望的蛋白表达水平等因素，设计表达载体。可以将本文所述的表达载体引入宿主细胞，以产生如本文所述的核酸编码的多肽。
原核生物例如大肠杆菌中编码多肽的基因的表达，最经常利用含有指导多肽表达的组成型或可诱导启动子的载体进行。融合载体可将多个氨基酸加入至其中编码的多肽，通常加入至重组多肽的氨基端。此类融合载体可以，例如，为缺少此类起始密码子的序列提供起始ATG。
可诱导性大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann et al.,Gene(1988)69:301-315)和pET11d(Studier et al.,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)60-89)。来自pTrc载体的目标基因表达，依赖来自杂合的trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。来自pET11d载体的目标基因表达，依赖于来自由共表达的T7病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的T7基因10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由例如，来自存在的λ原噬菌体的宿主病毒株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，所述λ原噬菌体具有位于lacUV-5启动子转录控制下的T7gn1基因。
在另一个实施方案中，宿主细胞为酵母细胞。在该实施方案中，表达载体为酵母表达载体。酵母啤酒酵母(S.cerevisiae)中的表达载体的实例包括pYepSec1(Baldari et al.,EMBO J.(1987)6:229-234)、pMFa(Kurjan etal.,Cell(1982)30:933-943)、pJRY88(Schultz et al.,Gene(1987)54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)和picZ(Invitrogen Corp,Carlsbad,CA)。
在另一个实施方案中，可以利用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达本文所述的蛋白。培养的昆虫细胞中可用于蛋白表达的杆状病毒载体(例如，Sf9细胞)包括，例如，pAc系列(Smith et al.,Mol.Cell Biol.(1983)3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow et al.,Virology(1989)170:31-39)。
在又一实施方案中，可以利用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本文所述的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,Nature(1987)329:840)和pMT2PC(Kaufman et al.,EMBO J.(1987)6:187-195)。当用于哺乳动物细胞时，可以通过病毒调控元件提供表达载体的控制功能。例如，通常使用的启动子来源于多瘤病毒、2型腺病毒、巨细胞病毒和猿猴病毒40。原核和真核细胞的其他合适的表达系统已有描述(参见，例如，Sambrook et al.,eds.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual.2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。
可以通过常规转化或转染技术将载体引入至原核或真核细胞，包括但不限于领域认可的多种将核酸(例如，DNA)引入至宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以参见，例如，Sambrook et al.(同上)。
对于细菌细胞的稳定转化，已知取决于表达载体和使用的转化技术，仅小部分的细胞会摄取并复制表达载体。为了识别并挑选这些转化株，可以将编码可选择标记(例如，耐抗生素)的基因与目标基因一起引入至宿主细胞。可选择标记包括赋予耐药性的那些，如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、大观霉素或四环素。编码可选择标记的核酸，可以在与编码本文所述多肽相同的载体上引入至宿主细胞，或可以在单独的载体上引入。可以通过药物选择识别用引入的核酸稳定转染的细胞(例如，整合了可选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
除了染色体外的表达载体(如质粒)，还可以根据标准技术将多核苷酸表达载体整合至宿主细胞的基因组，例如，通过同源重组和整合。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知取决于表达载体和使用的转染技术，仅小部分的细胞可将外来DNA整合至它们的基因组。为了识别并挑选这些整合体，可以将编码可选择标记(例如，耐抗生素)的基因与目标基因一起引入至宿主细胞。优选的可选择标记包括赋予耐药性的那些，如G418、潮霉素和氨甲喋呤。编码可选择标记的核酸，可以在编码与本文所述多肽相同的载体上引入至宿主细胞，或可以在单独的载体上引入。可以通过药物选择识别用引入的核酸稳定转染的细胞。
本发明的其他方面
本发明的其他方面包括如下：本发明的第六个方面更具体地涉及制备重组宿主细胞的方法和产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物的重组宿主细胞。
这些重组宿主细胞通常具有酶学委员会编号为EC4.2.1.–或4.2.1.60的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的改良的活性。本发明用来产生这些重组宿主细胞的方法通常利用至少步骤(C)或步骤(A)的变型，其中起始多核苷酸序列(SPS)包含编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的开放阅读框多核苷酸序列(ORF)以及5'非编码多核苷酸序列(NC)，所述ORF具有5'和3'端，所述NC包含邻近所述ORF5'端的可操作地连接的调控序列。重组宿主细胞包含一个或多个编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的SPS变体和可操作地连接的调控序列，包括分别与所述ORF或所述NC具有小于100%序列同一性的ORF变体和/或NC变体。如果需要或期望进一步优化具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的滴度，步骤(C)或步骤(A)的变型之后可以为例如，步骤(B)。
本发明的第七个方面更具体地涉及制备重组宿主细胞的方法和产生具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物组合物的重组宿主细胞。这些重组宿主细胞通常具有缺少异构酶活性且酶学委员会编号为EC4.2.1.–的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的改良的活性。本发明用于制备这些重组宿主细胞的方法通常使用至少步骤(C)或步骤(A)的变型，其中起始多核苷酸序列(SPS)包含编码缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的开放阅读框多核苷酸序列(ORF)以及5'非编码多核苷酸序列(NC)，所述ORF具有5'和3'端，所述NC包含邻近所述ORF5'端的可操作地连接的调控序列。重组宿主细胞包含一个或多个编码缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的SPS变体以及可操作地连接的调控序列，包括分别与所述ORF或所述NC具有小于100%序列同一性的ORF变体和/或NC变体。如果需要或期望进一步优化具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物的滴度，步骤(C)或步骤(A)的变型之后可以为例如，步骤(B)。
本发明的第八个方面更具体地涉及制备具有目标脂肪链长度和/或优选程度的饱和度的脂肪酸衍生物组合物的方法。所述方法通常包括在碳源存在下培养如本文所述的重组宿主细胞。在该方法的一个实施方案中，所述培养包括发酵。在优选的实施方案中，利用了发酵，并且所述方法还包括脂肪酸衍生物的基本纯化。
本发明的第九个方面涉及利用本发明的重组宿主细胞培养物产生的、基本上纯化的脂肪酸衍生物(例如，脂肪醇)组合物。
发酵生产和脂肪酸衍生物的分离
可以利用发酵技术实现利用本文所述的重组宿主细胞培养物产生和分离脂肪酸衍生物。用于最大化地产生脂肪酸衍生物并同时减少成本的一种方法为增加被转化为碳氢化合物产物的碳源百分比。
在正常细胞生命周期中，碳被用于细胞功能如产生脂质、糖类、蛋白、有机酸和核酸。减少用于生长相关活动所需碳的量可以增加碳源转化为产物的效率。这可以通过，例如，首先使宿主细胞生长至期望的密度(例如，对数生长期峰值处达到的密度)实现。
可以将宿主细胞进一步改造用于表达重组纤维小体(cellulosomes)，如公开的美国专利申请第20110097769号中所描述。这些纤维小体可以允许宿主细胞使用纤维素物质作为碳源。例如，可以将宿主细胞进一步改造用于表达转化酶(EC3.2.1.26)，以便可以将蔗糖用作碳源。类似地，可以利用美国专利第5,000,000号；第5,028,539号；第5,424,202号；第5,482,846号；和第5,602,030号中描述的教导改造宿主细胞；以便宿主细胞可以有效同化碳，并利用纤维素物质作为碳源。
对于小规模生产，可以将改造的宿主细胞培养在例如，约100mL、500mL、1L、2L、5L或10L的批次；发酵；并诱导，以基于合适的质粒中编码的或整合至宿主细胞基因组的特定基因，表达所需脂肪酸衍生物的生物合成基因。对于大规模生产，可以将改造的宿主细胞培养在约10L、100L、1000L、10,000L、100,000L、1,000,000L或更大的批次；发酵；并诱导，以基于合适的质粒中编码的或整合至宿主细胞基因组的特定基因，表达所需脂肪酸衍生物的生物合成基因。
可以从发酵培养基分离发酵期间产生的脂肪酸衍生物。可以利用任何从含水培养基中分离脂肪酸衍生物的已知技术。一种示例性分离方法为双相(二相)分离方法。该方法包括在足以产生脂肪酸衍生物(例如，脂肪醇)的条件下，将遗传改造的宿主细胞发酵，允许脂肪酸衍生物收集在有机相中，以及从含水发酵液中分离有机相。该方法可按分批和连续发酵方法实施。
重组宿主细胞、培养物和本发明方法提供的优势和改进
本发明的一个方面涉及酶学委员会编号为EC4.2.1.60的β-羟酰基-ACP脱水酶/异构酶蛋白(例如，大肠杆菌fabA蛋白)的活性的改良，以作为一种调节重组宿主细胞产生的脂肪酸衍生物的脂肪链长度的方式。这是意想不到的，因为在本公开前，人们并不认为β-羟酰基-ACP脱水酶/异构酶蛋白与脂肪酸衍生物脂肪链的延伸有关。
本发明的另一方面涉及缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性的改良，酶学委员会编号为EC4.2.1.–的所述蛋白(例如，大肠杆菌fabZ蛋白)，提供了调节重组宿主细胞产生的脂肪酸衍生物脂肪链长度的方式。另外，通过进行支持本发明的实验，证明了缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性的改良，从而提供了调节重组宿主细胞产生的脂肪酸衍生物脂肪链饱和度的方式。这些发现是意想不到的，因为在本公开前，(i)人们并不认为缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白与脂肪酸衍生物的脂肪链的延伸有关；且(ii)这些蛋白缺少异构酶活性，因此不认为它们影响饱和度。
本发明的又一个方面涉及发现在重组宿主细胞中，以下蛋白活性的平衡提供了产生高滴度的、具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的方式：(i)与脂肪酸衍生物脂肪链的延伸有关的蛋白(例如，酶学委员会编号为EC2.3.1.–的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白；如大肠杆菌fabB蛋白和大肠杆菌fabF蛋白)，和(ii)与脂肪酸衍生物的合成终止有关的蛋白(例如，酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–的硫酯酶；如大肠杆菌tesA硫酯酶蛋白)。本发明的该方面提供了制备和应用重组宿主细胞以产生高滴度的、具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的方法，其为从可再生资源产生脂肪酸衍生物，以减少对石化资源依赖的领域中的重要进展。
实施例
提出以下实施例是为了给本领域技术人员提供如何实施本发明的完整公开和描述，并且不试图限制本发明的发明人所认为的本发明范围。已经作出了努力来确保关于所用数字(例如，量、浓度、百分比变化等)的精确性，但应当考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，温度为摄氏度，且压力为或接近大气压。
实施例1
表达构建物的实例
图3所示为用来阐述本发明某些实施方案的重组微生物、培养物和方法的各种遗传构建物。图中指定的基因可以在表1中发现。所述基因包含可操作地连接至编码蛋白产物的多核苷酸序列的调控区(R)。R2至R6为包含核糖体结合位点和翻译终止信号的不同调控元件。
基础质粒(base plasmid)OP-80从可商购的质粒pCL1920(Lerner et al.,Nucleic Acids Res.18:4631(1990))产生。修改了pCL1920质粒以包含PTRC启动子和lacI序列，其从质粒pTrcHis2(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)获得。图3中概述的构建物被整合至邻近并可操作地连接至Ptrc启动子的OP-80基础质粒。
实施例2
细菌菌株的实例
如下所述，表2所示为引入含有图3的表达构建物(实施例1)的质粒的多种大肠杆菌K12菌株的遗传特征。这些菌株和质粒被用于阐述本发明某些实施方案的重组微生物、培养物和方法。表2中的遗传名称为本领域技术人员已知的标准名称。
表2
实施例3
优化脂肪酸衍生物的产生和脂肪链长度
本实施例中的数据提供了本发明方法的实施方案制备经改造用于产生高滴度的、具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的重组宿主细胞的有效性的清楚阐述。本实施例阐述了本文所述方法通过优化延伸β-酮脂酰-AC合酶蛋白(这里为大肠杆菌fabB蛋白)和硫酯酶(这里为大肠杆菌tesA蛋白)的表达/活性来优化脂肪酸衍生物产生的结果。
A.优化脂肪酸衍生物滴度
以下数据提供了如本文所述的方法步骤(B)的实例。进行的支持本发明的实验证明，硫酯酶(这里为大肠杆菌tesA硫酯酶蛋白)表达的操控可以促进脂肪酸衍生物产生的优化。
通过调控序列的随机化，调节邻近tesA基因的开放阅读框5'端的5'非编码多核苷酸序列(包含可操作地连接的调控序列)的活性，优化了TesA表达(图3的图A,R2)。通过非编码多核苷酸序列的随机化，修改了可操作地连接至硫酯酶编码序列的调控序列即R2区域，以制备质粒文库。质粒文库包含基础质粒OP-80中携带的、图3的图A中阐述的随机化表达构建物。将该文库转化至克隆株(TOP10;Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，并利用含有合适抗生素的Luria-Bertani琼脂平板挑选克隆。将存活的克隆合并，并利用标准方案提取DNA以提供文库。
将产生的文库转化至菌株DV2(实施例2)，以制备用于筛选的重组微生物组。在所有培养基中都包含有大观霉素(100μg/mL)，以维持外源性质粒DNA的选择。
简单地说，挑选集落(克隆)，并接种至含2mL Luria-Bertani(LB)培养基的玻璃培养管中。过夜培养后，将每管的50μL转移至新鲜LB培养基的新管中。将克隆培养3小时，之后使用每种培养物接种125mL烧瓶中的20mL V-9培养基。V-9培养基为具有2%葡萄糖的M9培养基，其补充有抗生素、1μg/L硫胺和1:1000稀释的表3中所述的微量矿物质溶液。
表3
Figure BDA0000486249010000641
在OD600为1.0时，将1mM IPTG加入至培养物中以诱导蛋白表达。发酵20小时后，用乙酸丁酯提取培养物为筛选做准备。粗提取液用BSTFA(N,O-二[三甲硅烷基]三氟乙酰胺)衍生化，并按2010年10月7日公布的美国专利公开第20100251601号中所述，用GC-FID测量脂肪醇和游离脂肪酸(组合)的滴度。
图中的数据证明，该方法提供了高滴度克隆，相对于对照微生物，改造的重组微生物产生的脂肪衍生物的滴度增加为3倍多(例如，图4，300%线以上的数据点)。
图5所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的硫酯酶蛋白活性，重组微生物的硫酯酶蛋白的活性被改良。在图中，Y轴为“%FA相对于对照株”，如图4所述。X轴为具有C16和C18脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C16/C18比率。图中的每个数据点对应于培养的克隆或对照株。在图中，100%附近聚集的4个数据点对应于对照株的培养物。
图中的数据证明，该方法提供了高滴度克隆，相对于对照微生物，改造的重组微生物产生的脂肪衍生物的滴度增加为3倍多(例如，图5，300%线以上的数据点)。
这些数据证明，，利用本发明方法得到了相对于对照微生物，提供显著增加的滴度的重组微生物。另外，根据CX/CY的范围，培养本发明改造的重组微生物可提供一系列定制的目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物。
改造的产生最大滴度的重组微生物被选定用于下述方法。
B.优化脂肪酸衍生物的滴度和脂肪链长度
以下数据提供如本文所述的方法步骤(A)的实例。进行的支持本发明的实验证明，操控延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白(这里为大肠杆菌fabB,3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白)的表达可以促进具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的产生的优化。
纯化来自上述文库的最高生产菌的质粒DNA，并分离包含R2-tesA基因的多核苷酸。用编码tesA(13G04)蛋白(图5C;SEQ ID NO:17)的核苷酸序列取代编码tesA蛋白的序列。将R2-tesA(13G04)整合至图9的图B中阐述的构建物(即，起始多核苷酸)。因此，以下数据还提供了方法步骤(B)之后为方法步骤(A)的实例。
通过调控序列的随机化，调节邻近fabB基因开放阅读框5'端的5'非编码多核苷酸序列(包含可操作地连接的调控序列)的活性，优化了FabB表达(图9的图B,R4)。通过非编码多核苷酸序列的随机化，修改了可操作地连接至3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白编码序列的调控序列即R4区域，以制备质粒文库。所述质粒文库包含基础质粒OP-80中携带的、图9的图B中阐述的随机化表达构建物；其中与构建物的tesA(13G04)编码序列相关的R2，为从上述最高生产菌分离的R2。将该文库转化至克隆株(例如，TOP10;Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，并利用含有合适抗生素的Luria-Bertani琼脂平板挑选克隆。合并存活的克隆，并利用标准方案提取DNA以提供大肠杆菌fabB基因的文库。
将生成的文库转化至菌株D178(实施例2，表2)，以制备用于筛选的重组微生物组。所有培养基中都包含有大观霉素(100μg/mL)，以维持外源性质粒DNA的挑选。简单地说，挑选集落(克隆)并用来接种含有Luria-Bertani(LB)培养基的96孔板的孔。过夜培养后，从所述板中每个孔转移40μL至具有新鲜LB的新板的新孔中。培养3小时后，将40μL的每种培养物用来接种96孔板中的400μL的FA2培养基。FA2培养基为具有3%葡萄糖的M9培养基，其补充有抗生素、1μg/L硫胺、10μg/L柠檬酸铁和1:1000稀释的表3中所述的微量矿物质溶液。
培养5小时后，在OD600为1.0时，将1mM IPTG加入至培养物以诱导蛋白表达。发酵20小时后，用乙酸丁酯提取培养物为筛选作准备。将粗提取物用BSTFA(N,O-二[三甲硅烷基]三氟乙酰胺)衍生化，并按2010年10月7日公布的美国专利公开第20100251601号中所述，用GC-FID测量脂肪醇和游离脂肪酸(组合)的滴度。
图6所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白(这里为大肠杆菌fabB,3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白)的活性，重组微生物的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白(这里为大肠杆菌fabB,3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白)的活性被改良。在图中，Y轴为“%FA相对于对照株”，所述%FA为每个克隆的包括所有脂肪链长度的脂肪酸衍生物的总测量滴度(这里为组合的游离脂肪酸和脂肪醇)，除以“对照株”的包括所有脂肪链长度的脂肪酸衍生物的总测量滴度(这里为组合的游离脂肪酸和脂肪醇)。这里的“对照株”为先前经改造用于产生良好滴度的脂肪酸衍生物的大肠杆菌菌株；因此100%线指产生与“对照株”相比滴度相当的克隆。X轴为具有C12和C14脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C12/C14比率。图中每个数据点对应于培养的克隆或“对照株”。100%附近聚集的4个数据点对应于“对照株”的培养物，其被用作对照和比较点。
图中的数据证明，所述方法提供了高滴度的改造的重组微生物克隆，相比“对照株”，其具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的滴度显著增加(例如，图6，通过约3.1的C12/C14比率定征的、具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物，滴度为160%；因此增加为1.5倍)。
图7所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白(这里为大肠杆菌fabB,3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白)的活性，重组微生物的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白(这里为大肠杆菌fabB,3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白)的活性被改良。在图中，Y轴为“%FA相对于对照株”，如图6所述。X轴为具有C16和C18脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C16/C18比率。图中每个数据点对应于培养的克隆或“对照株”。100%附近聚集的4个数据点对应于“对照株”的培养物，其被用作对照和比较点。
图中的数据证明，所述方法提供了高滴度的改造重组微生物克隆，相比“对照株”，其具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的滴度显著增加(例如，图7，具有通过约4.0的C16/C18比率定征的目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物，滴度为160%，因此增加为1.5倍)。
这些数据证明，利用本发明方法，得到了提供具有不同脂肪链长度的脂肪酸衍生物滴度显著增加的重组微生物，因此表明所述方法提供具有众多目标脂肪链长度中任何一种的脂肪酸衍生物的灵活性。
C.进一步优化脂肪酸衍生物的滴度和脂肪链长度
以下数据提供了如本文所述方法步骤(B)的另一实例。进行的支持本发明的实验证明，操控硫酯酶(这里为大肠杆菌tesA,硫酯酶蛋白)的表达可以促进脂肪酸衍生物产生的优化。相对于来自先前的步骤(A)的重组微生物的生产力，利用例如从先前的步骤(A)挑选的重组微生物的重复步骤(B)，提供了分离具有增加的脂肪酸衍生物生产力的其他重组微生物的方法。
来自实施例3B的fabB文库的两个不同克隆被用来产生新的tesA文库。这些菌株均不是文库中的最高生产株，即，该菌株具有小于它们选自的重组微生物组的最大滴度的滴度。另外，所述两个克隆选自产生较长的脂肪链长度的那些，如通过C12/C14和C16/C18的比率所测定。例如，关于图6和图7，所述两个克隆具有小于最大滴度的滴度(图6和图7,160%处的数据点清楚地为最大滴度)。所述两个克隆中每一个具有的CX/CY比率均小于如下的示例性目标脂肪链长度CX/CY比率：对于C12/C14，示例性目标比率为C12/C14～3.2(图6，数据点在X轴上为3.1，且Y轴上为160%)，选定的两个克隆具有小于160%的滴度和小于～3.1的C12/C14比率；并且，对于C16/C18，示例性目标比率为C16/C18～4.0(图7，数据点在X轴上为4.0，且Y轴上为160%)，选定的两个克隆具有小于160%的滴度和小于～4.0的C16/C18比率。
质粒DNA分离自来自实施例3B的fabB文库的两个克隆中每一个，并且质粒DNAs被用来构建起始多核苷酸(图9的图B,R4)。起始多核苷酸被用于产生新的tesA文库。因此，以下数据还提供了方法步骤(B)之后为方法步骤(A)随后为方法步骤(B)的实例。
通过调控区域的随机化，调节邻近tesA基因开放阅读框5'端的5'非编码多核苷酸序列(包含可操作地连接的调控序列)的活性，优化了TesA表达(图9的图B,R2)。所述tesA蛋白编码序列为编码tesA(12H08)蛋白的多核苷酸序列(图5D;SEQ ID NO:19)。通过非编码多核苷酸序列的随机化，修改了可操作地连接至硫酯酶编码序列的调控序列即R2区域，以制备质粒文库。质粒文库包含基础质粒OP-80中携带的、图9的图B中阐述的随机化表达构建物。将该文库转化至克隆株(TOP10;InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)，并利用含有合适抗生素的Luria-Bertani琼脂平板挑选克隆。合并存活的克隆，并利用标准方法提取DNA，以提供文库。
将生成的文库转化至菌株EG149(实施例2,表2)，以制备用于筛选的重组微生物组。所有培养基中都包含有大观霉素(100μg/mL)，以维持外源质粒DNA的挑选。简单地说，挑选集落(克隆)并用来接种含有Luria-Bertani(LB)培养基的96孔板。过夜培养后，从所述板中每个孔转移40μL至具有新鲜LB的新板的新孔中。培养3小时后，40μL的每种培养物被用来接种96孔板中的400μL的FA2培养基。
培养5小时后，在OD600为1.0时，将1mM IPTG加入至培养物以诱导蛋白表达。发酵20小时后，用乙酸丁酯提取培养物为筛选作准备。粗提取物用BSTFA(N,O-二[三甲硅烷基]三氟乙酰胺)衍生化，并用如2010年10月7日公布的第20100251601号美国专利公开中所述的GC-FID，测量脂肪醇和游离脂肪酸(组合)的滴度。
图8所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的硫酯酶蛋白活性，重组微生物的硫酯酶蛋白的活性被改良。在图中，Y轴为“%FA相对于对照株”，如图6所述。X轴为具有C12和C14脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C12/C14比率。图中每个数据点都对应于培养的克隆或“对照株”。
图中的数据证明，所述方法提供了高滴度的改造的重组微生物克隆，相比“对照株”，其具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的滴度显著增加(例如，图8，利用通过约1.5至约2.0的C12/C14比率定征的示例性目标脂肪链长度)。
图9所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的硫酯酶蛋白活性，重组微生物的硫酯酶蛋白的活性被改良。在图中，Y轴为“%FA相对于对照株”，如图6所述。X轴为具有C16和C18脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)滴度的C16/C18比率。图中每个数据点对应于培养的克隆或“对照株”。图中的数据证明，所述方法提供了高滴度的改造的重组微生物克隆，相比“对照株”，其具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的滴度显著增加(例如，图9，利用通过～4.0至～5.0的C16/C18比率定征的示例性目标脂肪链长度)。
这些数据证明，利用本发明的方法得到了提供大量不同脂肪链长度的滴度显著增加的重组微生物，因此表明所述方法提供具有众多目标脂肪链长度中任何一种的脂肪酸衍生物的灵活性。
实施例4
优化脂肪酸衍生物的脂肪链饱和度
本实施例中的数据提供了本发明方法的实施方案有效性的清楚阐述，以制备经改造的重组宿主细胞用于产生具有目标脂肪链长度和期望水平饱和度的脂肪酸衍生物。本实施例阐述了本文所述方法的结果，通过优化延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白(这里为3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白，大肠杆菌fabB蛋白)和β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白即大肠杆菌FabA蛋白，以及(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白即大肠杆菌FabZ蛋白)的表达/活性，优化脂肪酸衍生物产生。
A.大肠杆菌fabB蛋白
可以利用编码3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白的大肠杆菌fabB基因，优化脂肪酸衍生物的饱和度和链长度。
纯化来自以上实施例3A所述文库的最高生产菌的质粒DNA，并分离包含R2-tesA基因的多核苷酸。用编码tesA(13G04)蛋白的核苷酸序列(图5C;SEQ ID NO:17)取代tesA蛋白编码序列。因此，下述数据还提供了方法步骤(B)之后为方法步骤(C)的实例，所述步骤(C)利用一个或多个包含编码延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的开放阅读框的多核苷酸序列以替代一个或多个包含编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的开放阅读框的多核苷酸序列。
通过将邻近fabB基因的开放阅读框5'端的5'非编码多核苷酸序列(包含可操作地连接的调控序列)随机化来调节FabB表达(图9的图B,R4)。通过非编码多核苷酸序列的随机化修改了可操作地连接至3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白编码序列的调控序列即R4区域，以制备质粒文库。所述质粒文库包含基础质粒OP-80中携带的、图9的图B中阐述的诱变的表达构建物；其中构建物的R2-tesA基因为按上述分离的R2-tesA(13G04)基因。将该文库转化至克隆株(TOP10;InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)，并利用含有合适抗生素的Luria-Bertani琼脂平板挑选克隆。合并存活的克隆，并利用标准方案提取DNA，以提供大肠杆菌fabB基因文库。
将生成的文库转化至菌株D178(实施例2,表2)，以制备用于筛选的重组微生物组。所有培养基中都包含有大观霉素(100μg/mL)，以维持外源性质粒DNA的挑选。简单地说，挑选集落(克隆)，并用来接种含有Luria-Bertani(LB)培养基的96孔板的孔。培养过夜后，从所述板中每个孔转移40μL至具有新鲜LB的新板的新孔中。培养3小时后，40μL每种培养物被用来接种96孔板中的400μL FA2培养基。
培养5小时后，在OD600为1.0时，将1mM IPTG加入至培养物以诱导蛋白表达。发酵20小时后，用乙酸丁酯从提取培养物为筛选作准备。粗提取物用BSTFA(N,O-二[三甲硅烷基]三氟乙酰胺)衍生化，并用如2010年10月7日公布的美国专利公开第20100251601号中所述的GC-FID，测量脂肪醇和游离脂肪酸(组合)的滴度。
图10所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白(这里为大肠杆菌fabB,3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白)的活性，重组微生物的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白(这里为大肠杆菌fabB,3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白)的活性被改良。在图中，左侧Y轴为“%饱和物质”，其为每个克隆的具有饱和脂肪链且包括所有脂肪链长度的脂肪酸衍生物(这里为组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的测量滴度，除以包括所有脂肪链长度的脂肪酸衍生物(这里为组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的测量总滴度。右侧的Y轴为具有C12和C14脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C12/C14比率。图中每个数据点都对应于培养的克隆或对照。4个数据点对应于用作对照和比较点的“对照株”(如图6所示，如上所述)的培养物。来自筛选的重组微生物组的克隆基于它们的%饱和物质沿X轴排列，并显示了它们的C12/C14比率相应的数据点。
图中的数据分析证明，本发明的方法提供了产生众多脂肪链长度的脂肪酸衍生物的改造的重组微生物，本领域技术人员从这些脂肪酸衍生物中可以挑选期望的目标脂肪链长度和期望水平的饱和度。本发明的方法、重组微生物和培养物给予本领域技术人员定制脂肪链长度和饱和度的工具，以获得期望的结果。
B.大肠杆菌fabA蛋白
可以利用编码β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白的大肠杆菌fabA基因，优化脂肪酸衍生物的饱和度和链长度。
纯化来自以上实施例3C所述文库的质粒DNA，并分离包含R2-tesA(12H08)基因和R4-fabB基因的多核苷酸。因此，以下数据还提供了方法步骤(B)然后方法步骤(A)随后方法步骤(B)然后方法步骤(C)的实例。
通过邻近fabA基因的开放阅读框5'端的5'非编码多核苷酸序列(包含可操作地连接的调控序列)的随机化，调节FabA表达(图9的图C,R6)。通过非编码多核苷酸序列的随机化，修改了可操作地连接至β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白编码序列的调控序列即R6区域，以制备质粒文库。所述质粒文库包含基础质粒OP-80中携带的、图9的图C中阐述的随机化的表达构建物；其中构建物的R2-tesA和R4-fabB基因为实施例3C中得到的R2-tesA(12H08)基因和R4-fabB基因。将该文库转化至克隆株(TOP10;Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，并利用含有合适的抗生素的Luria-Bertani琼脂平板挑选克隆。合并存活的克隆，并利用标准方案提取DNA以提供文库。
将生成的文库转化至菌株V668(实施例2,表2)，以制备用于筛选的重组微生物组。所有培养基中都包含有大观霉素(100μg/mL)，以维持外源性质粒DNA的挑选。简单地说，挑选集落(克隆)，并用来接种含有Luria-Bertani(LB)培养基的96孔板的孔。过夜培养后，从所述板中每个孔转移40μL至具有新鲜LB的新板的新孔中。培养3小时后，40μL每种培养物被用来接种96孔板中的400μL FA2培养基。
培养5小时后，在OD600为1.0时，将1mM IPTG加入至培养物以诱导蛋白表达。发酵20小时后，用乙酸丁酯提取培养物为筛选作准备。粗提取物用BSTFA(N,O-二[三甲硅烷基]三氟乙酰胺)衍生化，并用如2010年10月7日公布的美国专利公开第20100251601号中所述的GC-FID，测量脂肪醇和游离脂肪酸(组合的)的滴度。
图11所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白大肠杆菌FabA蛋白)的活性，重组微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白大肠杆菌FabA蛋白)的活性被改良。在图中，左侧Y轴为“%饱和物质”，其为每个克隆的具有饱和脂肪链且包括所有脂肪链长度的脂肪酸衍生物(这里为组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的测量滴度，除以包括所有脂肪链长度的脂肪酸衍生物(这里为组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的测量总滴度。右侧的Y轴为具有C8和C10脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C8/C10比率。图中每个数据点对应于培养的克隆或对照。来自筛选的重组微生物组的克隆基于它们的%饱和物质沿X轴排列，并且显示了它们的C8/C10比率对应的数据点。
通过C12/C14和C16/C18定征的目标脂肪链长度的类似数据分析分别显示在图12和图13中。
图中的数据分析证明，本发明方法提供了产生众多脂肪链长度的脂肪酸衍生物的改造的重组微生物，本领域技术人员可以从这些脂肪酸衍生物中挑选期望的目标脂肪链长度和期望水平的饱和度。本发明的方法、重组微生物和培养物给予本领域技术人员定制脂肪链长度和饱和度的工具，以获得期望的结果。
C.大肠杆菌fabZ蛋白
可以利用编码(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白的大肠杆菌fabZ基因优化脂肪酸衍生物的饱和度和链长度。
纯化来自以上实施例3C所述文库的质粒DNA，并分离包含R2-tesA(12H08)基因和R4-fabB基因的多核苷酸。因此，下述数据还提供了方法步骤(B)然后方法步骤(A)随后方法步骤(B)然后方法步骤(C)的实例。
通过将邻近fabZ基因的开放阅读框5'端(图9的图D,R6)的5'非编码多核苷酸序列(包含可操作地连接的调控序列)随机化，调节FabZ表达。通过非编码多核苷酸序列的随机化，修改了可操作地连接至(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白编码序列的调控序列即R6区域，以制备质粒文库。所述质粒文库包含基础质粒OP-80中携带的、图9的图D中阐述的随机化的表达构建物；其中构建物的R2-tesA基因和R4-fabB基因为实施例3C中得到的tesA(12H08)基因和R4-fabB基因。基于通过约1.7至1.8的C12/C14比率定征的目标脂肪链长度，挑选高生产菌；对于该目标脂肪链长度，所述高生产菌产生约140%的滴度(图84;实施例3C)。将该文库转化至克隆株(TOP10;Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，并利用含有合适抗生素的Luria-Bertani琼脂平板挑选克隆。合并存活的克隆，并利用标准方案提取DNA，以提供文库。
将生成的文库转化至菌株V668(实施例2,表2)，以制备用于筛选的重组微生物组。所有培养基中都包含有大观霉素(100μg/mL)，以维持外源性质粒DNA的挑选。简单地说，挑选集落(克隆)，并用来接种含有Luria-Bertani(LB)培养基的96孔板的孔。过夜培养后，从所述板中每个孔转移40μL至具有新鲜LB的新板的新孔中。培养3小时后，40μL每种培养物被用来接种96孔板中的400μL FA2培养基。
培养5小时后，在OD600为1.0时，将1mM IPTG加入至培养物以诱导蛋白表达。发酵20小时后，用乙酸丁酯提取培养物为筛选作准备。粗提取物用BSTFA(N,O-二[三甲硅烷基]三氟乙酰胺)衍生化，并用如2010年10月7日公布的美国专利公开第20100251601号中所述的GC-FID，测量脂肪醇和游离脂肪酸(组合)的滴度。
图14所示为克隆的筛选数据，其中相对于对照微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白,大肠杆菌FabZ蛋白)的活性，重组微生物的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白,大肠杆菌FabZ蛋白)的活性被改良。在图中，左侧Y轴为“%饱和物质”，其为每个克隆的具有饱和脂肪链且包括所有脂肪链长度的脂肪酸衍生物(这里为组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的测量滴度，除以包括所有脂肪链长度的脂肪酸衍生物(这里为组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的测量总滴度。右侧的Y轴为具有C8和C10脂肪链长度的脂肪酸衍生物(组合的游离脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C8/C10比率。图中每个数据点对应于培养的克隆或对照。来自筛选的重组微生物组的克隆基于它们的%饱和物质沿X轴排列，并且显示了它们的C8/C10比率对应的数据点。
通过C12/C14和C16/C18定征的目标脂肪链长度的类似数据分析分别显示在图15和图16中。
图中的数据分析证明，本发明方法提供了产生众多脂肪链长度的脂肪酸衍生物的改造的重组微生物，本领域技术人员可以从这些脂肪酸衍生物挑选期望的目标脂肪链长度和期望水平的饱和度。本发明的方法、
重组微生物和培养物给予本领域技术人员定制脂肪链长度和饱和度的工具，以获得期望结果。
实施例5
利用FabA优化脂肪酸衍生物的脂肪链长度
本实施例中的数据提供了本发明方法的实施方案有效性的清楚阐述，以制备经改造的重组宿主细胞用于产生具有目标脂肪链长度和期望水平饱和度的脂肪酸衍生物。本实施例阐述了本文所述方法的结果，通过优化β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(这里为β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白,大肠杆菌FabA蛋白)的表达/活性，优化脂肪酸衍生物产生。
可以利用编码β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白的大肠杆菌fabA基因优化脂肪产物的饱和度和链长度。
构建的表达质粒包含carB、tesA(12H08)、alrAadp1和fabB(A329G)，所有这些都在PTRC启动子的控制下表达。fabB(A329G)为在大肠杆菌fabB蛋白氨基酸位置329处将丙氨酸取代为甘氨酸。将表达质粒(称为ALC487)转化至菌株EG149(表2)。
FabA表达置于菌株D178的PT5启动子的控制下，并将表达质粒ALC487引入至该菌株。
筛选这两个菌株的具有选定的脂肪链长度的脂肪酸衍生物的百分比饱和度。来自该筛选的数据证明，fabA活性的调节影响脂肪链长度和脂肪酸衍生物饱和度。
在图17中，获自含有表达质粒ALC487的筛选株EG149的数据显示为“ALC487”。获自含有表达质粒ALC487且具有位于PT5启动子控制下的fabA表达的筛选株D178的数据显示为“D178PT5_fabA/pALC487”。从图中的数据可知，fabA表达的调节导致饱和物质和具有较长脂肪链长度(基于C12/C14比率)的脂肪酸衍生物产生的增加。
在图18中，获自含有表达质粒ALC487的筛选株EG149的数据显示为“ALC487”。获自含有表达质粒ALC487且具有位于PT5启动子的控制下的fabA表达的筛选株D178的数据显示为“D178PT5_fabA/pALC487”。从图中数据可知，fabA表达的调节导致饱和物质和具有较长脂肪链长度(基于C8/C10比率)的脂肪酸衍生物产生的增加。
在图19中，获自含有表达质粒ALC487的筛选株EG149的数据显示为“ALC487”。获自含有表达质粒ALC487且具有位于PT5启动子控制下的fabA表达的筛选株D178的数据显示为“D178PT5_fabA/pALC487”。从图中数据可知，fabA表达的调节导致饱和物质和具有较短脂肪链长度(基于C16/C18比率)的脂肪酸衍生物产生的增加。
图中的数据分析证明，fabA活性的调节为本领域技术人员提供了另一定制脂肪链长度和/或饱和度的工具，以获得期望的结果。
实施例6
用于发展性生物反应器的脂肪醇菌株种子培养物扩增
将选定的大肠杆菌菌株的冷冻细胞库小瓶用来在含有115μg/mL浓度的大观霉素抗生素的125mL有挡板的摇瓶中，接种20mL的LB液体培养基。将该摇瓶于32℃下在定轨摇床中孵育约6小时，然后在500mL有挡板的Erlenmeyer摇瓶中，将1.25mL培养基转移至125mL的低P FA2种子培养基(2g/L NH4Cl、0.5g/L NaCl、3g/L KH2PO4、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、30g/L葡萄糖、1mL/L的微量矿物质溶液(2g/L的ZnCl2·4H2O、2g/L的CaCl2·6H2O、2g/L的Na2MoO4·2H2O、1.9g/L的CuSO4·5H2O、0.5g/L的H3BO3和10mL/L的浓缩的HCl)、10mg/L的柠檬酸铁、100mM的Bis-Tris缓冲液(pH7.0)和115μg/mL的大观霉素)，并于32℃下在摇床上孵育过夜。
A.生物反应器发酵程序。
将100mL的该低P FA2种子培养物用来接种5L Biostat Aplus生物反应器(Sartorius BBI)，其最初含有1.9L无菌的F1生物反应器发酵培养基。该培养基最初由以下物质组成：3.5g/L的KH2PO4、0.5g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的MgSO4七水化物、10g/L的过滤除菌的葡萄糖、80mg/L柠檬酸铁、5g/L酪蛋白氨基酸、10mL/L的过滤除菌的微量矿物质溶液、1.25mL/L的过滤除菌的维生素溶液(0.42g/L的核黄素、5.4g/L的钒酸、6g/L的烟酸、1.4g/L的吡哆醇、0.06g/L的生物素和0.04g/L的叶酸)和与种子培养基中所用浓度相同的大观霉素。利用28%w/v氨水将培养物的pH维持在6.9，温度为33℃，曝气率为1lpm(0.5v/v/m)，并且溶氧张力为30%的饱和度，其利用级联至DO控制器的搅动环和氧补充。通过自动添加基于硅树脂乳剂的止泡剂(Dow Corning1410)控制发泡。
基于2L的正常发酵体积，当初始培养基中的葡萄糖几乎耗尽时(接种后约4-6小时)，以0.3hr-1的指数填充率至10-12g/L/hr的恒定的最大葡萄糖填充率开始填充由3.9g/L MgSO4七水化物和600g/L葡萄糖组成的营养物。当培养物达到5AU的OD时(接种后约3-4小时)，通过将1M IPTG储备液加入至1mM终浓度，在生物反应器中诱导了脂肪醇的产生。此后每天对生物反应器取样两次，并在接种后约72小时收获。
B.样品提取和脂肪醇/游离脂肪酸浓度分析。
将0.5mL充分混合的发酵液样品转移至15mL圆锥管(VWR)中，并与5mL乙酸丁酯充分混合。将管反转几次以混合，剧烈涡旋约2分钟，然后离心5分钟，以分离有机层和水层。将部分的有机层转移至玻璃小瓶，用于气相色谱分析。
C.其他FabB对Alc-287基础株的影响。
在相同的条件下，测试了生物反应器中除了天然基因拷贝，在质粒操纵子上还具有(Alc-383)和无(Alc-287)大肠杆菌fabB的另外拷贝的两株菌株，以确定其他脂肪酸生物合成能力对发酵结果和生成的产物谱的影响。菌株Alc-383为具有其他fabB的质粒荷载拷贝的Alc-287基础株。基于fabB拷贝数的该增加观察到的初始效应为，相比Alc-287，Alc-383生成的产物量和葡萄糖的产率的增加，以及产物谱倾向于产生较长链乙醇的变化。链的该增长具有减少脂肪醇产物库的总体饱和度的其他影响。
表4.Alc-287和Alc-383发酵期间的FAS产生
Figure BDA0000486249010000771
图20A-B显示了观察到的、由Alc-287基础株的FabB摄入导致的链长度分布差异。
D.其他TesA对LC-302菌株的影响。
在相同的条件下，测试了生物反应器中除了整合到质粒上的一个外，在染色体上还具有12H08硫酯酶的其他拷贝的两株菌株，以确定其他硫酯酶“拉动(pull)”对发酵结果和所生成产物谱的影响。菌株LC341为具有另外的染色体12H08硫酯酶的LC-302基础株。观察到的硫酯酶活性的该增加的主要益处为，其增加了特定菌株生成的产物量和葡萄糖产率。
表5.发酵期间的FAS产生
Figure BDA0000486249010000772
添加fabA至操纵子的影响。
测试了具有添加至操纵子末端的fabA基因的LC-302亲本菌株，和IGR文库的3个变体(LC-369,LC-372,LC-375)，以观察生产的产物谱。这3株菌株的不同基因间隔区导致在细胞中表达不同量的fabA蛋白。以下使用的FAS首字母缩写指“脂肪类”，其为脂肪醇和游离脂肪酸的组合。
表6.发酵期间的FAS产生(将FabA添加至操纵子)
Figure BDA0000486249010000781
图21A-D显示了观察到的、将FabA包含至操纵子导致的链长度分布差异。
对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明精神和范围下可以进行上述方面和实施方案的各种修改和变化。此类修改和变化位于本发明的范围内。
Figure IDA0000486249090000021
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Claims (88)

1.一种重组微生物培养物，其产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物，所述重组微生物培养物包含重组微生物：
所述重组微生物经改造用于产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物，所述重组微生物包含：
酶学委员会编号为EC4.2.1.–或4.2.1.60的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的改良的活性，其中(i)所述改良的活性不同于在与所述重组微生物种类相同的微生物中由起始多核苷酸序列(SPSD)表达产生的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性，所述SPSD包含编码所述β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的开放阅读框多核苷酸序列(ORFD)以及5'非编码多核苷酸序列(NCD)，所述ORFD具有5'和3'端，所述NCD包含邻近所述ORFD5'端的可操作地连接的调控序列；并且(ii)所述重组微生物包含编码所述β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的所述SPSD的一个或多个变体以及可操作地连接的调控序列，包括分别与所述ORFD或所述NCD具有小于100%序列同一性的ORFD变体和/或NCD变体；
其中，相比由与表达所述SPSD的所述重组微生物种类相同的微生物培养物产生的脂肪酸衍生物组合物，由所述重组微生物培养物产生的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物包含更高滴度的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物。
2.如权利要求1所述的重组微生物培养物，其中编码所述β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的ORFD编码酶学委员会编号为EC4.2.1.–的蛋白。
3.如权利要求2所述的重组微生物培养物，其中所述ORFD编码具有SEQ ID NO:14所示序列的大肠杆菌fabZ来源的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白，并且所述ORFD变体编码与所述大肠杆菌fabZ蛋白(SEQ ID NO:14)具有至少约90%序列同一性的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白。
4.如权利要求2所述的重组微生物培养物，其中编码所述β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的ORFD编码酶学委员会编号为EC4.2.1.60的蛋白。
5.如权利要求4所述的重组微生物培养物，其中所述ORFD编码具有SEQ ID NO:12所示序列的大肠杆菌fabA来源的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白，并且所述ORFD变体编码与大肠杆菌fabA蛋白(SEQ IDNO:12)具有至少约90%序列同一性的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白。
6.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述NCD变体获自所述NCD随机化产生的文库。
7.一种重组微生物培养物，其产生具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物组合物，所述重组微生物培养物包含重组微生物：
所述重组微生物经改造用于产生具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物组合物，所述重组微生物包含：
缺少异构酶活性且酶学委员会编号为EC4.2.1.–的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的改良的活性，其中(i)所述改良的活性不同于在与所述重组微生物种类相同的微生物中由起始多核苷酸序列(SSPE)表达产生的、缺少异构酶活性的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性，所述SSPE包含编码缺少异构酶活性的所述β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白(FabA/Z)的开放阅读框多核苷酸序列(ORFE)以及5'非编码多核苷酸序列(NCE)，所述ORFE具有5'和3'端，所述NCE包含邻近所述ORFE5'端的可操作地连接的调控序列；并且(ii)所述重组微生物包含一个或多个编码缺少异构酶活性的所述β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，包括分别与所述ORFE或所述NCE具有小于100%序列同一性的ORFE变体和/或NCE变体；
其中，相比由与所述重组微生物种类相同的、表达所述SPSE的微生物培养物产生的脂肪酸衍生物组合物，由所述重组微生物培养物产生的具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物组合物包含更高滴度的具有优选的百分比饱和度的脂肪酸衍生物。
8.如权利要求7所述的重组微生物培养物，其中所述ORFE编码具有SEQ ID NO:14所示序列的大肠杆菌fabZ来源的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白，并且所述ORFE变体编码与大肠杆菌fabZ蛋白(SEQ ID NO:14)具有至少约90%序列同一性的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白。
9.如权利要求7或8所述的重组微生物培养物，其中所述NCE变体获自所述NCE随机化产生的文库。
10.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述重组微生物还包含一个或多个含有编码延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的开放阅读框的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，所述蛋白的酶学委员会编号为EC2.3.1.–。
11.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述重组微生物还包含一个或多个含有编码硫酯酶的开放阅读框的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，所述蛋白的酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–。
12.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述重组微生物还包含一个或多个含有编码羧酸还原酶蛋白的开放阅读框的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，所述蛋白的酶学委员会编号为EC6.2.1.3或EC1.2.1.42。
13.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物培养物，还包含一个或多个含有编码其他蛋白的开放阅读框的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，所述其他蛋白选自：乙酰-CoA乙酰转移酶；β-羟基丁酰-CoA脱氢酶；巴豆酸酶丁酰-CoA脱氢酶；及辅酶A-酰化醛脱氢酶。
14.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述重组微生物为细菌。
15.如权利要求14所述的重组微生物培养物，其中所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。
16.一种重组微生物培养物，其产生高滴度的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物，所述重组微生物培养物包含重组微生物：
所述重组微生物经改造用于产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物，所述重组微生物包含：
酶学委员会编号为EC2.3.1.–的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的改良的活性，其中(i)所述改良的活性不同于在与所述重组微生物种类相同的微生物中由起始多核苷酸序列(SPSA)表达产生的β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的活性，所述SPSA包含编码延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的开放阅读框多核苷酸序列(ORFA)以及5'非编码多核苷酸序列(NCA)，所述ORFA具有5'和3'端，所述NCA包含邻近所述ORFA5'端的可操作地连接的调控序列；并且(ii)所述重组微生物包含一个或多个编码β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，包括分别与所述ORFA或所述NCA具有小于100%序列同一性的ORFA变体和/或NCA变体；和
酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–的硫酯酶的改良的活性，其中(i)所述改良的活性不同于在与所述重组微生物种类相同的微生物中由起始多核苷酸序列(SPSB)表达产生的硫酯酶的活性，所述SPSB包含编码所述硫酯酶的开放阅读框多核苷酸序列(ORFB)以及5'非编码多核苷酸序列(NCB)，所述ORFB具有5'和3'端，所述NCB包含邻近所述ORFB5'端的可操作地连接的调控序列；并且(ii)所述重组微生物包含一个或多个编码所述硫酯酶的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，包括分别与所述ORFB或所述NCB具有小于100%序列同一性的ORFB变体和/或NCB变体；
其中所述重组微生物培养物产生具有约30g/L至约250g/L的高滴度的脂肪酸衍生物组合物，其中所述组合物具有目标脂肪链长度。
17.如权利要求16所述的重组微生物培养物，其中所述重组微生物还包含：
酶学委员会编号为EC4.2.1.–或4.2.1.60的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的改良的活性，其中(i)所述改良的活性不同于在与所述重组微生物种类相同的微生物中由起始多核苷酸序列(SPSC)表达产生的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的活性，所述SPSC包含编码所述β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的开放阅读框多核苷酸序列(ORFC)以及5'非编码多核苷酸序列(NCC)，所述ORFC具有5'和3'端，所述NCC包含邻近所述ORFC5'端的可操作地连接的调控序列；并且(ii)所述重组微生物包含一个或多个编码所述β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，包括分别与所述ORFC或所述NCC具有小于100%序列同一性的ORFC变体和/或NCC变体。
18.如权利要求17所述的重组微生物培养物，其中所述具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物还具有优选的百分比饱和度。
19.如权利要求18所述的重组微生物培养物，其中所述具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物包含饱和及不饱和脂肪链，并且至少约90%的所述目标脂肪酸衍生物具有饱和脂肪链。
20.如权利要求17-19中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的ORFC编码酶学委员会编号为EC4.2.1.–的蛋白。
21.如权利要求20所述的重组微生物培养物，其中所述ORFC编码具有SEQ ID NO:14所示序列的大肠杆菌fabZ来源的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白，并且所述ORFC变体编码与所述大肠杆菌fabZ蛋白(SEQ ID NO:14)具有至少约90%序列同一性的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白。
22.如权利要求20所述的重组微生物培养物，其中所述编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的ORFC编码酶学委员会编号为EC4.2.1.60的蛋白。
23.如权利要求22所述重组微生物培养物，其中所述ORFC编码具有SEQ ID NO:12所示序列的大肠杆菌fabA来源的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白，并且所述ORFC变体编码与大肠杆菌fabA蛋白(SEQ IDNO:12)具有至少约90%序列同一性的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白。
24.如权利要求17-23中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述NCC变体获自所述NCC随机化产生的文库。
25.如权利要求16-24中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物为具有目标脂肪链长度的脂肪醇组合物。
26.如权利要求16-25中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述重组微生物培养物以10%至40%产率产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物。
27.权利要求16-26中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述重组微生物培养物特征为700mg/L/小时至3000mg/L/小时的具有目标脂肪链长度的所述脂肪酸衍生物组合物的生产力。
28.如权利要求16-27中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述编码β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的ORFA编码选自以下的蛋白：酶学委员会编号为EC2.3.1.41的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白，及酶学委员会编号为EC2.3.1.179的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白。
29.如权利要求28所述的重组微生物培养物，其中所述ORFA编码具有SEQ ID NO:2所示序列的大肠杆菌fabB来源的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白，并且所述ORFA变体编码与大肠杆菌fabB蛋白(SEQ IDNO:2)具有至少约90%序列同一性的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白。
30.如权利要求28所述的重组微生物培养物，其中所述ORFA编码具有SEQ ID NO:4所示序列的大肠杆菌fabF来源的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白，并且所述ORFA变体编码与所述大肠杆菌fabF蛋白(SEQ ID NO:4)具有至少约90%序列同一性的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白。
31.如权利要求16-30中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述变体NCA获自所述NCA随机化产生的文库。
32.如权利要求16-31中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述编码硫酯酶的ORFB编码酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–的tesA蛋白。
33.如权利要求32所述的重组微生物培养物，其中所述ORFB编码具有SEQ ID NO:6所示序列的大肠杆菌tesA来源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFB变体编码与所述大肠杆菌tesA蛋白(SEQ ID NO:6)具有至少约90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
34.如权利要求32所述的重组微生物培养物，其中所述ORFB编码具有SEQ ID NO:8所示序列的大肠杆菌tesA来源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFB变体编码与所述大肠杆菌tesA蛋白(SEQ ID NO:8)具有至少约90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
35.如权利要求32所述的重组微生物培养物，其中所述ORFB编码具有SEQ ID NO:17所示序列的大肠杆菌tesA来源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFB变体编码与所述大肠杆菌tesA蛋白(SEQ ID NO:17)具有至少约90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
36.如权利要求32所述的重组微生物培养物，其中所述ORFB编码具有SEQ ID NO:19所示序列的大肠杆菌tesA来源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFB变体编码与所述大肠杆菌tesA蛋白(SEQ ID NO:19)具有至少约90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
37.如权利要求16-36中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述NCB变体获自所述NCB随机化产生的文库。
38.如权利要求16-37中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述重组微生物还包含一个或多个编码酶学委员会编号为EC6.2.1.3或EC1.2.1.42的羧酸还原酶蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。
39.如权利要求38所述的重组微生物培养物，其中所述羧酸还原酶蛋白与选自以下的羧酸还原酶蛋白具有至少约90%的序列同一性：耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)carB蛋白(SEQ ID NO:10)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)fadD9蛋白(SEQ ID NO:21)和耻垢分枝杆菌carA蛋白(SEQ ID NO:23)。
40.如任何前述权利要求所述的重组微生物培养物，其中所述重组微生物还包含一个或多个编码酶学委员会编号为EC1.1.–.–、EC1.1.1.1或EC1.2.1.10的醇脱氢酶蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。
41.如权利要求16-40中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述目标脂肪链长度选自以下长度之间的脂肪链长度：C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20及其组合。
42.如权利要求16-40中任一项所述的重组微生物培养物，其中两个选定的脂肪链长度的比率(CX/CY)被用来定征所述脂肪酸衍生物的脂肪链长度和所述目标脂肪链长度，所述比率为具有脂肪链长度CX的所述脂肪酸衍生物的滴度与具有脂肪链长度CY的所述脂肪酸衍生物的滴度的比率，其中X和Y为整数值，并且X小于Y。
43.如权利要求42所述的重组微生物培养物，其中CX/CY的值为2至4。
44.如权利要求42或43所述的重组微生物，其中X和Y选自：X=8,Y=10；X=12,Y=14；X=14,Y=16；及X=18,Y=20。
45.如权利要求16-44中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述重组微生物为细菌。
46.如权利要求16-45中任一项所述的重组微生物培养物，其中所述细菌为大肠杆菌。
47.如权利要求16-46中任一项所述的重组微生物培养物，进一步包含一个或多个编码一个或多个其他蛋白的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，所述其他蛋白选自：乙酰-CoA乙酰转移酶；β-羟基丁酰-CoA脱氢酶；巴豆酸酶丁酰-CoA脱氢酶；及辅酶A-酰化醛脱氢酶。
48.制备重组微生物的方法，所述重组微生物产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物，所述方法包括选自步骤(A)、步骤(B)和步骤(C)中的两个步骤，其中所述两个步骤为不相同的步骤，并且所述两个步骤以任何顺序进行，以产生所述重组微生物：
步骤(A)包括：
利用起始多核苷酸序列(SPSA)制备重组微生物起始组，所述SPSA包含开放阅读框(ORFA)以及5'非编码多核苷酸序列(NCA)，所述ORFA具有5'和3'端，所述NCA包含邻近所述ORFA5'端的可操作地连接的调控序列，每个重组微生物包含一个或多个所述SPSA的变体，其中(i)所述ORFA编码酶学委员会编号为EC2.3.1.–的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白，并且(ii)每个SPSA变体包括分别与所述ORFA或所述NCA具有小于100%序列同一性的ORFA变体和/或NCA变体；
在碳源存在下培养来自所述重组微生物组的克隆；
筛选所述克隆，以测定每个克隆产生的脂肪酸衍生物的脂肪链长度和脂肪酸衍生物的滴度，其中存在产生最大滴度的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的克隆；和
从所述重组微生物组挑选克隆，选定的克隆以小于所述最大滴度的滴度产生具有长于目标脂肪链长度的脂肪链长度的脂肪酸衍生物，其中所述选定的克隆包含SPSA变体(SPSVA)，其包括ORFA变体(ORFVA)和/或NCA变体(NCVA)；
条件为：(i)如果所述方法中步骤(A)在步骤(B)后，则步骤(A)的所述起始组的每个重组微生物还包含SPSVB，或者(ii)如果所述方法中步骤(A)在步骤(C)后，则步骤(A)的所述起始组的每个重组微生物还包含SPSVC；
步骤(B)包括：
利用起始多核苷酸序列(SPSB)制备重组微生物起始组，所述SPSB包含开放阅读框(ORFB)以及5'非编码多核苷酸序列(NCB)，所述ORFB具有5'和3'端，所述NCB包含邻近所述ORFB5'端的可操作地连接的调控序列，每个重组微生物包含一个或多个所述SPSB的变体，其中(i)所述ORFB编码酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–的硫酯酶，并且(ii)每个SPSB变体包括分别与所述ORFB或所述NCB具有小于100%序列同一性的ORFB变体和/或NCB变体；
在碳源存在下培养来自所述重组微生物组的克隆；
筛选所述克隆，以测定每个克隆产生的脂肪酸衍生物的脂肪链长度和脂肪酸衍生物的滴度，其中存在产生最大滴度的具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物的克隆；和
从所述重组微生物组挑选克隆，选定的克隆以近似等于所述最大滴度的滴度产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物，其中所述选定的克隆包含SPSB变体(SPSVB)，其包括ORFB变体(ORFVB)和/或NCB变体(NCVB)；
条件为：(i)如果所述方法中步骤(B)在步骤(A)后，则步骤(B)的所述起始组的每个重组微生物还包含SPSVA，或者(ii)如果所述方法中步骤(B)在步骤(C)后，则步骤(B)的所述起始组的每个重组微生物还包含SPSVC；并且
步骤(C)包括：
利用起始多核苷酸序列(SPSC)制备重组微生物起始组，所述SPSC包含开放阅读框(ORFC)以及5'非编码多核苷酸序列(NCC)，所述ORFC具有5'和3'端，所述NCC包含邻近所述ORFC5'端的可操作地连接的调控序列，每个重组微生物包含所述SPSC的一个或多个变体，其中(i)所述ORFC编码酶学委员会编号为EC4.2.1.–或4.2.1.60的β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白，并且(ii)每个SPSC变体包括分别与所述ORFC或所述NCC具有小于100%序列同一性的ORFC变体和/或NCC变体；
在碳源存在下培养来自所述重组微生物组的克隆；
筛选所述克隆，以测定每个克隆的所述脂肪酸衍生物的脂肪链长度、所述脂肪酸衍生物的脂肪链百分比饱和度以及所述脂肪酸衍生物的滴度，其中存在产生最大滴度的具有目标脂肪链长度和优选的百分饱和度的脂肪酸衍生物的克隆；和
从所述重组微生物组挑选克隆，选定的克隆以近似等于所述最大滴度的滴度产生具有目标脂肪链长度和优选的百分饱和度的脂肪酸衍生物，其中所述选定的克隆包含SPSC变体(SPSVC)，其包括ORFC变体(ORFVC)和/或NCC变体(NCVC)；
条件为：(i)如果所述方法中步骤(C)在步骤(A)后，则步骤(C)的所述起始组的每个重组微生物还包含SPSVA，或者(ii)如果所述方法中步骤(C)在步骤(B)后，则步骤(C)的所述起始组的每个重组微生物还包含SPSVB。
49.如权利要求48所述的方法，其中两个选定的脂肪链长度的比率(CX/CY)被用来定征所述脂肪酸衍生物的脂肪链长度和所述目标脂肪链长度，所述比率为具有脂肪链长度CX的脂肪酸衍生物的滴度与具有脂肪链长度CY的脂肪酸衍生物的滴度的比率，其中X和Y为整数值，并且X小于Y。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述目标脂肪链长度CX/CY比率的值为至少约2。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中所述目标脂肪链长度CX/CY比率的值为2至4。
52.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中X和Y选自：X=8,Y=10；X=12,Y=14；X=14,Y=16；及X=18,Y=20。
53.如权利要求48所述的方法，其中所述目标脂肪链长度选自以下长度之间的脂肪链长度：C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20及其组合。
54.如权利要求48-53中任一项所述的方法，其中Z=A、B或C的NCVZ变体获自所述NCVZ随机化产生的文库。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述随机化为启动子序列的随机化。
56.如权利要求54或55所述的方法，其中所述随机化为翻译控制序列的随机化。
57.如权利要求48-56中任一项所述的方法，其中Z=A、B或C的ORFVZ变体通过ORFVZ诱变获得。
58.如权利要求48-57中任一项所述的方法，其中所述方法包括步骤(B)和其后的步骤(A)。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述方法包括步骤(B)和其后的步骤(A)以及随后的步骤(B)。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述方法包括步骤(B)和其后的步骤(A)和随后的步骤(B)以及随后的步骤(C)。
61.如权利要求48-57中任一项所述的方法，其中所述方法包括步骤(B)和其后的步骤(C)。
62.如权利要求48-61中任一项所述的方法，其中在碳源存在下培养所述重组微生物，产生具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物且所述组合物的滴度为30g/L至250g/L。
63.如权利要求48-62中任一项所述的方法，其中在碳源存在下培养所述重组微生物，产生10%至40%产率的具有目标脂肪链长度的所述脂肪酸衍生物组合物。
64.如权利要求48-63中任一项所述的方法，其中在碳源存在下培养所述重组微生物，提供700mg/L/小时至3000mg/L/小时生产力的具有目标脂肪链长度的所述脂肪酸衍生物组合物。
65.权利要求48-64中任一项所述的方法，其中具有目标脂肪链长度的所述脂肪酸衍生物组合物还具有优选的百分比饱和度。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述优选的百分饱和度为至少约90%。
67.如权利要求48-66中任一项所述的方法，其中所述具有目标脂肪链长度的脂肪酸衍生物组合物，为具有目标脂肪链长度的脂肪醇组合物。
68.如权利要求48-67中任一项所述的方法，其中所述编码β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的ORFA编码选自以下的蛋白：酶学委员会编号为EC2.3.1.41的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白，和酶学委员会编号为EC2.3.1.179的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述ORFA编码具有SEQ IDNO:2所示序列的大肠杆菌fabB来源的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白，并且所述ORFA变体编码与所述大肠杆菌fabB蛋白(SEQ ID NO:2)具有至少约90%序列同一性的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶I蛋白。
70.如权利要求68所述的方法，其中所述ORFA编码具有SEQ IDNO:4所示序列的大肠杆菌fabF来源的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白，并且所述ORFA变体编码与所述大肠杆菌fabF蛋白(SEQ ID NO:4)具有至少约90%序列同一性的3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合酶II蛋白。
71.如权利要求48-70中任一项所述的方法，其中所述ORFB是酶学委员会编号为EC3.1.1.5或EC3.1.2.–的硫酯酶蛋白。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述ORFB编码具有SEQ IDNO:6所示序列的大肠杆菌tesA来源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFB变体编码与所述大肠杆菌tesA蛋白(SEQ ID NO:6)具有至少约90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
73.如权利要求71所述的方法，其中所述ORFB编码具有SEQ IDNO:8所示序列的大肠杆菌tesA来源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFB变体编码与所述大肠杆菌tesA蛋白(SEQ ID NO:8)具有至少约90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
74.如权利要求71所述的方法，其中所述ORFB编码具有SEQ IDNO:17所示序列的大肠杆菌tesA来源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFB变体编码与所述大肠杆菌tesA蛋白(SEQ ID NO:17)具有至少约90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
75.如权利要求71所述的方法，其中所述ORFB编码具有SEQ IDNO:19所示序列的大肠杆菌tesA来源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFB变体编码与所述大肠杆菌tesA蛋白(SEQ ID NO:19)具有至少约90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
76.如权利要求48-75中任一项所述的方法，其中所述编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的ORFC编码酶学委员会编号为EC4.2.1.–的蛋白。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述ORFC编码具有SEQ IDNO:14所示序列的大肠杆菌fabZ来源的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白，并且所述ORFC变体编码与所述大肠杆菌fabZ蛋白(SEQ IDNO:14)具有至少约90%序列同一性的(3R)-羟基肉豆蔻酰酰基载体蛋白脱水酶蛋白。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述编码β-羟酰基-ACP脱水酶蛋白的ORFC编码酶学委员会编号为EC4.2.1.60的蛋白。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述ORFC编码具有SEQ IDNO:12所示序列的大肠杆菌fabA来源的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白，并且所述ORFC变体编码与大肠杆菌fabA蛋白(SEQ ID NO:12)具有至少约90%序列同一性的β-羟基癸酰基硫酯脱水酶/异构酶蛋白。
80.如权利要求48-79中任一项所述的方法，其中所述重组微生物还包含一个或多个编码酶学委员会编号为EC6.2.1.3或EC1.2.1.42的羧酸还原酶蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述羧酸还原酶蛋白与选自以下的羧酸还原酶蛋白具有至少约90%的序列同一性：耻垢分枝杆菌carB蛋白(SEQ ID NO:10)、结核分枝杆菌fadD9蛋白(SEQ ID NO:21)和耻垢分枝杆菌carA蛋白(SEQ ID NO:23)。
82.如权利要求48-81中任一项所述的方法，其中所述重组微生物还包含一个或多个编码酶学委员会编号为EC1.1.–.–、EC1.1.1.1或EC1.2.1.10的醇脱氢酶蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地连接的调控序列。
83.如权利要求48-82中任一项所述的方法，其中所述重组微生物还包含一个或多个编码一个或多个其他蛋白的多核苷酸序列以及可操作地连接的调控序列，所述其他蛋白选自：乙酰-CoA乙酰转移酶；β-羟基丁酰-CoA脱氢酶；巴豆酸酶丁酰-CoA脱氢酶；及辅酶A-酰化醛脱氢酶。
84.如权利要求48-83中任一项所述的方法，其中所述重组微生物为细菌。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述细菌为大肠杆菌。
86.通过权利要求48-85中任一项所述的方法制备的重组微生物。
87.制备具有目标脂肪链长度的肪酸衍生物组合物的方法，包括在碳源存在下培养权利要求1-47中任一项所述的重组微生物培养物，或在碳源存在下培养权利要求86所述的重组微生物。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述培养包括发酵。
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