CN112143690A

CN112143690A - 一种酸耐受性提高的重组菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN112143690A
Application number: CN201910575684.0A
Authority: CN
Inventors: 赵广; 刘敏; 许莹
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: CN112143690B

Abstract

一种酸耐受性提高的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域，为了提高大肠杆菌的耐酸性，本发明以大肠杆菌为出发菌株，过表达不饱和脂肪酸合成途径关键基因，羟脂酰‑ACP脱水异构酶基因fabA。制备获得酸耐受性提高的重组菌，进一步地，在上述获得的重组菌中过表达3HP的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc和丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr，可用于生产3HP及其衍生物，解决了发酵过程中需要添加碱调节pH的问题，具有重要的应用价值。

Description

一种酸耐受性提高的重组菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种酸耐受性提高的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌有一套精妙的系统在酸性环境下来维持细胞内的稳定pH，已知有五类酸抗性(acid resistance,AR)途径。目前对耐酸系统仍然知之甚少，但是AR1系统至少需要信号因子σs和cAMP受体蛋白(CRP)二者之一才能起作用。AR2-AR5路径分别依赖于细胞外谷氨酸，精氨酸，赖氨酸和鸟氨酸。实际应用中，有机酸发酵常以葡萄糖为碳源，导致AR1系统无法发挥功能，而AR2-AR5需要在培养基中额外加入氨基酸，造成发酵成本的增加，所以目前已知的5种大肠杆菌AR系统难以应用于有机酸发酵。

3-羟基丙酸(3HP)是一种三碳无旋光的有机化合物，分子内含羧基和羟基，是乳酸的同分异构体，因而3-羟基丙酸可作为多种有机物合成的前体物质，生产一些具有商业价值的化合物，诸如丙烯酸、1,3-丙二醇、丙二酸、丙内酯等。此外，它还是组成诸多大分子化合物和酯类聚合物的单体，可用于包装材料、金属润滑剂、纺织品抗静电材料、个人日常用品，及可吸收医用材料等。目前3HP的生物合成已经进行了大量研究，例如通过功能域拆分MCR为MCR-N和MCR-C两个蛋白，MCR-C端定向进化获得高活性突变体MCR-C(N940V/K1106W/S1114R)、更换启动子调控两个功能域表达平衡，最终构建MCR的重组质粒pETDuet-Plac,P2-51-mcrN-T7-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)，与乙酰辅酶A羧化酶基因acc的重组质粒pACYCDuet1-acc共表达时，3HP的产量达到40g/L，是MCR途径合成3HP的最高报道(Changshui Liu et al,Functional balance between enzymes in malonyl-CoApathway for 3-hydroxypropionate biosynthesis[J].Metabolic Engineering 34(2016)104–111)。然而高浓度有机酸的积累会造成发酵液pH的降低，严重抑制工程菌株的生长。目前发酵过程中通常以自动添加碱液的方式维持发酵液的中性状态，生产结束后再添加大量的强酸来回收质子化的有机酸。大量酸碱的使用不仅增加了有机酸的生产成本，而且在发酵液中积累了高浓度的无机盐，产生难以处理的高渗透压废水。

发明内容

针对大肠杆菌酸耐受性差，以及3-羟基丙酸生物合成中出现的有机酸抑制菌株生长以及环境污染等问题，本发明提供了一种酸耐受性提高的重组菌，该重组菌过表达羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，宿主菌为大肠杆菌。

进一步地限定，所述羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，Genbank登录号为945568。

本发明还提供了上述重组菌的制备方法，是将羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，连入表达载体，构建重组质粒，将构建好的重组质粒转化至宿主细胞，获得重组菌。

进一步地限定，所述制备方法，步骤如下：

1)以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组为模板，通过PCR扩增获得羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA的目标片段，并回收目标片段；

2)将步骤1)所得的fabA目标片段，通过SalI和NotI酶切后连接至经同样酶切后的表达载体pACYCDuet1，获得重组质粒pACYCDuet1-fabA；

3)将步骤2)所得的重组质粒转化至宿主细胞，获得重组菌。

进一步地限定，步骤1)所述的PCR扩增用的引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示。

本发明还提供了上述重组菌在生产3-羟基丙酸及其衍生物中的应用。

进一步地限定，是指在重组菌中过表达3-羟基丙酸的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc和丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr，获得酸耐受性提高的3-羟基丙酸基因工程菌株，将该工程菌株接种到发酵培养基中经发酵培养制备获得3-羟基丙酸及其衍生物。

进一步地限定，所述3-羟基丙酸的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc，来自于大肠杆菌(Escherichia coli)，其中，亚基accA的GeneBank ID为6062185，亚基accB的GeneBank ID为6058890，亚基accC的GeneBank ID为6058863，亚基accD的GeneBank ID为6059083；所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr，来自于橙色绿曲挠菌(Chloroflexusaurantiacus)，所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr由经N端改造的片段mcrN和经C端改造的片段mcrC组成，所述经N端改造的片段mcrN，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述经C端改造的片段mcrC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步地限定，所述发酵培养，是指在37℃，180rpm的条件下培养至OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为100μM异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导，诱导后置于30℃，180rpm的条件下继续培养48h后终止发酵，发酵过程中不添加任何碱调节pH。

本发明还提供了上述过表达羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA重组菌在制备具有酸耐受性基因工程菌中的应用，是指以过表达羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA的重组菌为宿主菌，构建具有酸耐受性的基因工程菌。

优选地，本发明所述重组质粒转化宿主细胞的方法为热激转化法。

本发明中所涉及的定义和缩写对照如下：

3-羟基丙酸：3HP；

酸抗性系统：AR；

细菌菌落总数：在一定条件下(如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等)每克(每毫升)检样所生长出来的菌落总数，结果单位用CFU/ml或CFU/g表示。

氯霉素：Cm；

氨苄青霉素：Amp；

“酸胁迫”，细胞生长的环境中由于酸过多引起pH的降低，对细胞是一种不利的生长环境。

“存活率”，酸胁迫单位体积的细胞数占非酸胁迫单位体积细胞数的比重。

本发明中“热激转化”或“热转化”指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，其利用受到热激后，细胞膜出现裂隙，将外来基因导入宿主基因或将外来质粒导入宿主原生质体，又热激转化或热转化等。

本发明中“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

本发明中通过提高不饱和脂肪酸的生物合成获得酸耐受性提高的重组菌以及重组菌在发酵生产3HP及其衍生产品中的应用在本发明的保护范围之内。

有益效果

本发明提供了一种可以提高酸耐受性的重组菌，具体是通过过表达不饱和脂肪酸合成途径的关键基因，羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，获得酸耐受性提高的重组菌。本发明也为3HP及其衍生物的生物合成提供高耐酸宿主细胞，将3HP的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc和丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr同时导入该耐酸性的重组菌，获得酸耐受性提高的3HP工程菌株，在不添加任何碱调节pH的条件下，3HP的产量比对照菌株提高2倍，实现了3HP及其衍生物的低成本生物合成。

本发明首次通过调控不饱和脂肪酸的生物合成，通过遗传工程改造获得酸耐受性提高的重组菌，实现在低pH值下的发酵过程，规避大量酸碱的额外消耗，降低整体生产成本，解决了3HP及其衍生物发酵过程中需要添加碱调节pH的问题，提高有机酸生物合成过程的经济合理性和环境友好度，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为fabA催化的不饱和脂肪酸的生物合成路径；

图2为酸胁迫条件下，重组菌的存活率检测；其中对照菌含有pACYCDuet1空载体，重组菌含有pACYCDuet1-fabA质粒，图中为pfabA；

图3为不添加任何碱调节pH的条件下，发酵48h结束后，工程菌株Q3132和对照菌株Q2191的细胞OD₆₀₀吸光值和3HP产量的结果，纵坐标可分别代表吸光值或3HP的产量，当其代表3HP产量时，单位为g/L。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

培养基配方：

1)LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。

2)E培养基：0.8mM MgSO₄，10mM柠檬酸，57.5mM K₂HPO₄，16.7mM NaNH₃HPO₄，0.5％(质量分数)葡萄糖，其余为水。

3)3HP发酵培养基：14g/l K₂HPO₄·3H₂O，5.2g/l KH₂PO₄，1g/l NaCl,1g/l NH₄Cl，0.25g/l MgSO₄·7H₂O，0.2g/l酵母提取物，20g/l葡萄糖，其余为水。

在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如50mg/L的氯霉素，100mg/L的氨苄青霉素。

重组质粒pACYCDuet1-acc和重组质粒pETDuet-P_lac,P2-51-mcrN-T₇-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)，均记载在Chang shui Liu et al,Functional balance betweenenzymes in malonyl-CoA pathway for 3-hydroxypropionate biosynthesis[J].Metabolic Engineering 34(2016)104–111)，公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得。

实施例1：酸耐受性提高的重组菌的构建。

1)以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.1和SEQID NO.2经PCR克隆获得羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA；

2)将步骤1)所得的羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA与载体pACYCDuet1分别经SalI、NotI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段fabA和载体pACYCDuet-1，再利用T₄DNA连接酶进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，利用引物SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.2筛选阳性克隆，得到重组质粒pACYCDuet1-fabA。

3)按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备受体菌株E.coli BL21(DE3)感受态，将重组质粒pACYCDuet1-fabA通过热激法转化至宿主细胞E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌株E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-fabA。

酸胁迫下重组菌株的存活率检测：

共进行二组实验，以说明本发明所能够获得的效果，具体实验方法如下：

对照菌株:E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1，即转化pACYCDuet1质粒的E.coliBL21(DE3)；

重组菌株:E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-fabA，即转化重组质粒pACYCDuet1-fabA的E.coli BL21(DE3)。

1)将对照菌株和重组菌株分别接种至3mL含有终浓度为50mg/L氯霉素LB液体培养基中，37℃、180rpm条件下振荡过夜培养；

2)将活化后对照菌株和重组菌株按1:100的体积比例接种到含有50mL E培养基(pH7)的250mL摇瓶中(内含终浓度50mg/L的氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD₆₀₀达到0.4左右时，加入500μM IPTG诱导表达2h。

3)分别收集对照菌株和重组菌株的菌液，10000g离心5min，弃上清，利用无菌水清洗两次，将清洗后的菌液分别利用1mL无菌水重悬，吸取500uL重悬菌液接种至pH7的E培养基，剩余500uL接种至pH4.2的E培养基中，上述各E培养基中均含有终浓度50mg/L氯霉素，37℃、180rpm条件下振荡培养1h；

4)分别计数对照菌株和重组菌株在不同pH条件的细菌菌落数目(CFU/mL)，pH4.2条件下与pH7条件下CFU的比值即为酸胁迫条件下对照菌株和重组菌株的存活率。

根据附图2检测结果，对照菌株在pH4.2酸胁迫下1h，细胞的存活率仅为0.25，而过表达fabA的重组菌株相同酸刺激条件下，细胞的存活率达到0.83，是对照菌株的3.2倍。由此表明，通过过表达fabA提高不饱和脂肪酸的生物合成可以提高菌株在酸胁迫条件下的存活率。

实施例2.实施例1制备的重组菌在生产3-羟基丙酸及其衍生物中的应用。

本实施例所述为在实施例1获得的重组菌中过表达3-羟基丙酸的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc和丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr，所述3-羟基丙酸的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc，来自于大肠杆菌(Escherichia coli)，其中，亚基accA的GeneBank ID为6062185，亚基accB的GeneBank ID为6058890，亚基accC的GeneBank ID为6058863，亚基accD的GeneBank ID为6059083；获得酸耐受性提高的3-羟基丙酸基因工程菌株，将该工程菌株接种到发酵培养基中经发酵培养可制备获得3-羟基丙酸及其衍生物；上述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr由经N端改造的片段mcrN和经C端改造的片段mcrC组成，所述经N端改造的片段mcrN，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述经C端改造的片段mcrC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本实施例中所使用的乙酰辅酶A羧化酶基因acc来自于重组质粒pACYCDuet1-acc，所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr来自于重组质粒pETDuet-P_lac,P2-51-mcrN-T₇-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)。

下面举例描述酸耐受性提高的3-羟基丙酸基因工程菌株的制备方法：是将重组质粒pACYCDuet1-acc和pETDuet-P_lac,P2-51-mcrN-T₇-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)通过热激法共同转化至实施例1制备获得的过表达羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA的重组菌中，培养获得过表达3-羟基丙酸的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr和羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，获得酸耐受性提高的3-羟基丙酸基因工程菌株，编号为Q3132。

所述酸耐受性提高的3-羟基丙酸基因工程菌也可通过如下方法制备获得，不影响3-羟基丙酸及其衍生物的合成。

1)以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.1和SEQID NO.2克隆羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA；

2)步骤1)所得的羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA与载体pACYCDuet1-acc经SalI、NotI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段fabA和载体pACYCDuet1-acc，再利用T₄DNA连接酶进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，利用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4筛选阳性克隆，得到重组质粒pACYCDuet1-acc-fabA。

3)工程菌株的构建。

按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备受体菌株E.coli BL21(DE3)感受态，将重组质粒pACYCDuet1-acc-fabA和pETDuet-P_lac,P2-51-mcrN-T₇-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)通过热激法转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到酸耐受性3HP工程菌株E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-acc-fabA/pETDuet-P_lac,P2-51-mcrN-T₇-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)，即过表达3-羟基丙酸的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr和羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，获得酸耐受性提高的3-羟基丙酸基因工程菌株。

3HP的发酵检测：

(一)3HP检测方法的建立

1)3HP的发酵采用高效液相层析法(HPLC)检测。发酵液4℃下10000g离心10min，用0.22μm滤膜过滤后经HPLC检测产物，根据标准曲线计算3HP的浓度。

2)HPLC检测体系为：采用安捷伦Agilent 1200系统，检测柱选用HPX-87H column(300mm×7.8mm)，紫外检测210nm吸收峰，流速为0.4mL/min，流动相为0.5mM H₂SO₄，检测温度为60℃。

3)标准曲线制作：配置10g/L的3HP纯物质溶液，适当稀释到0.05g/L，0.1g/L，0.5g/L，1.0g/L，2.0g/L，5.0g/L进行HPLC分析，将测得的峰面积与已知浓度进行线性拟合，绘制标准曲线。

(二)3HP的发酵检测

本实施例共进行两组实验，以说明本发明所能够获得的有益效果，具体实验如下：

对照菌株：E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-acc/pETDuet-P_lac,P2-51-mcrN-T₇-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)，编号为Q2191，即过表达3-羟基丙酸的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc和丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr的菌株。

工程菌株：E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-acc-fabA/pETDuet-P_lac,P2-51-mcrN-T₇-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)，编号为Q3132，即过表达3-羟基丙酸的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr和羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA的基因工程菌株。

1)将对照菌株Q2191和工程菌株Q3132分别接种至含有终浓度为50mg/L氯霉素和终浓度为100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm条件下振荡过夜培养；

2)将活化后的对照菌株Q2191及工程菌株Q3132按1:100的体积比例接种到含有50mL的3HP发酵培养基的250mL摇瓶中(内含终浓度为100mg/L的氨苄青霉素和终浓度为50mg/L的卡那霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD₆₀₀达到0.6左右时，加入100μM/LIPTG诱导表达，诱导后置于30℃、180rpm继续培养48至发酵结束，发酵过程中不添加任何碱调节发酵液的pH。

3)取1mL发酵液，4℃，12000rpm离心10min，取上清进行HPLC的检测，并根据标准曲线计算3HP的浓度。

4)根据本实施例操作步骤，结果如附图3所示，在含有相同的3HP合成基因，不添加任何碱调节pH条件下，对照菌株Q2191的3HP产量为1.29g/L，工程菌株Q3132的3HP产量为2.35g/L，由此表明，本发明通过过表达不饱和脂肪酸合成途径关键基因fabA，可以提高3HP合成菌株的酸耐受性。本发明构建的酸耐受性工程菌株的3HP产量比对照菌株提高2倍。

本领域技术人员应该理解，上述各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

核苷酸序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种酸耐受性提高的重组菌及其构建方法和应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> pACYCDuet1-fabA-5’

<400> 1

acgcgtcgac actggtttat tccgaactga 30

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> pACYCDuet1-fabA-3’

<400> 2

aaggaaaaaa gcggccgctc agaaggcaga cgtatcctg 39

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> pACYCDuet1-up1

<400> 3

gattatgcgg ccgtgtacaa 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> T7-ter

<400> 4

gctagttatt gctcagcgg 19

<210> 5

<211> 1647

<212> DNA

<213> mcrN基因序列

<400> 5

atgagcggaa caggacgact ggcaggaaag attgcgttaa ttaccggtgg cgccggcaat 60

atcggcagtg aattgacacg tcgctttctc gcagagggag cgacggtcat tattagtgga 120

cggaatcggg cgaagttgac cgcactggcc gaacggatgc aggcagaggc aggagtgccg 180

gcaaagcgca tcgatctcga agtcatggat gggagtgatc cggtcgcggt acgtgccggt 240

atcgaagcga ttgtggcccg tcacggccag atcgacattc tggtcaacaa tgcaggaagt 300

gccggtgccc agcgtcgtct ggccgagatt ccactcactg aagctgaatt aggccctggc 360

gccgaagaga cgcttcatgc cagcatcgcc aatttacttg gtatgggatg gcatctgatg 420

cgtattgcgg cacctcatat gccggtagga agtgcggtca tcaatgtctc gaccatcttt 480

tcacgggctg agtactacgg gcggattccg tatgtcaccc ctaaagctgc tcttaatgct 540

ctatctcaac ttgctgcgcg tgagttaggt gcacgtggca tccgcgttaa tacgatcttt 600

cccggcccga ttgaaagtga tcgcatccgt acagtgttcc agcgtatgga tcagctcaag 660

gggcggcccg aaggcgacac agcgcaccat tttttgaaca ccatgcgatt gtgtcgtgcc 720

aacgaccagg gcgcgcttga acgtcggttc ccctccgtcg gtgatgtggc agacgccgct 780

gtctttctgg ccagtgccga atccgccgct ctctccggtg agacgattga ggttacgcac 840

ggaatggagt tgccggcctg cagtgagacc agcctgctgg cccgtactga tctgcgcacg 900

attgatgcca gtggccgcac gacgctcatc tgcgccggcg accagattga agaggtgatg 960

gcgctcaccg gtatgttgcg tacctgtggg agtgaagtga tcatcggctt ccgttcggct 1020

gcggcgctgg cccagttcga gcaggcagtc aatgagagtc ggcggctggc cggcgcagac 1080

tttacgcctc ccattgcctt gccactcgat ccacgcgatc cggcaacaat tgacgctgtc 1140

ttcgattggg ccggcgagaa taccggcggg attcatgcag cggtgattct gcctgctacc 1200

agtcacgaac cggcaccgtg cgtgattgag gttgatgatg agcgggtgct gaattttctg 1260

gccgatgaaa tcaccgggac aattgtgatt gccagtcgcc tggcccgtta ctggcagtcg 1320

caacggctta cccccggcgc acgtgcgcgt gggccgcgtg tcatttttct ctcgaacggt 1380

gccgatcaaa atgggaatgt ttacggacgc attcaaagtg ccgctatcgg tcagctcatt 1440

cgtgtgtggc gtcacgaggc tgaacttgac tatcagcgtg ccagcgccgc cggtgatcat 1500

gtgctgccgc cggtatgggc caatcagatt gtgcgcttcg ctaaccgcag ccttgaaggg 1560

ttagaatttg cctgtgcctg gacagctcaa ttgctccata gtcaacgcca tatcaatgag 1620

attaccctca acatccctgc caacatt 1647

<210> 6

<211> 2013

<212> DNA

<213> mcrC 基因序列

<400> 6

agcgccacca ccggcgcacg cagtgcatcg gtcggatggg cggaaagcct gatcgggttg 60

catttgggga aagttgcctt gattaccggt ggcagcgccg gtattggtgg gcagatcggg 120

cgcctcctgg ctttgagtgg cgcgcgcgtg atgctggcag cccgtgatcg gcataagctc 180

gaacagatgc aggcgatgat ccaatctgag ctggctgagg tggggtatac cgatgtcgaa 240

gatcgcgtcc acattgcacc gggctgcgat gtgagtagcg aagcgcagct tgcggatctt 300

gttgaacgta ccctgtcagc ttttggcacc gtcgattatc tgatcaacaa cgccgggatc 360

gccggtgtcg aagagatggt tatcgatatg ccagttgagg gatggcgcca taccctcttc 420

gccaatctga tcagcaacta ctcgttgatg cgcaaactgg cgccgttgat gaaaaaacag 480

ggtagcggtt acatccttaa cgtctcatca tactttggcg gtgaaaaaga tgcggccatt 540

ccctacccca accgtgccga ttacgccgtc tcgaaggctg gtcagcgggc aatggccgaa 600

gtctttgcgc gcttccttgg cccggagata cagatcaatg ccattgcgcc gggtccggtc 660

gaaggtgatc gcttgcgcgg taccggtgaa cgtcccggcc tctttgcccg tcgggcgcgg 720

ctgattttgg agaacaagcg gctgaatgag cttcacgctg ctcttatcgc ggctgcgcgc 780

accgatgagc gatctatgca cgaactggtt gaactgctct tacccaatga tgtggccgca 840

ctagagcaga atcccgcagc acctaccgcg ttgcgtgaac tggcacgacg ttttcgcagc 900

gaaggcgatc cggcggcatc atcaagcagt gcgctgctga accgttcaat tgccgctaaa 960

ttgctggctc gtttgcataa tggtggctat gtgttgcctg ccgacatctt tgcaaacctg 1020

ccaaacccgc ccgatccctt cttcacccga gcccagattg atcgcgaggc tcgcaaggtt 1080

cgtgacggca tcatggggat gctctacctg caacggatgc cgactgagtt tgatgtcgca 1140

atggccaccg tctattacct tgccgaccgc gtggtcagtg gtgagacatt ccacccatca 1200

ggtggtttgc gttacgaacg cacccctacc ggtggcgaac tcttcggctt gccctcaccg 1260

gaacggctgg cggagctggt cggaagcacg gtctatctga taggtgaaca tctgactgaa 1320

caccttaacc tgcttgcccg tgcgtacctc gaacgttacg gggcacgtca ggtagtgatg 1380

attgttgaga cagaaaccgg ggcagagaca atgcgtcgct tgctccacga tcacgtcgag 1440

gctggtcggc tgatgactat tgtggccggt gatcagatcg aagccgctat cgaccaggct 1500

atcactcgct acggtcgccc agggccggtc gtctgtaccc ccttccggcc actgccgacg 1560

gtaccactgg tcgggcgtaa agacagtgac tggagcacag tgttgagtga ggctgaattt 1620

gccgagttgt gcgaacacca gctcacccac catttccggg tagcgcgctg gattgccctg 1680

agtgatggtg cccgtctcgc gctggtcact cccgaaacta cggctacctc aactaccgag 1740

caatttgctc tggctaactt catcaaaacg acccttcacg cttttacggc tacgattggt 1800

gtcgagagcg aaagaactgc tcagcgcatt ctgatcaatc aagtcgatct gacccggcgt 1860

gcgcgtgccg aagagccgcg tgatccgcac gagcgtcaac aagaactgga acgttttatc 1920

gaggcagtct tgctggtcac tgcaccactc ccgcctgaag ccgatacccg ttacgccggg 1980

cggattcatc gcggacgggc gattaccgtg taa 2013

Claims

1.一种酸耐受性提高的重组菌，其特征在于，该重组菌过表达羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，宿主菌为大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，Genbank登录号为945568。

3.权利要求1或2所述的重组菌的制备方法，其特征在于，将羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，连入表达载体，构建重组质粒，将构建好的重组质粒转化至宿主细胞，获得重组菌。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的基因组为模板，通过PCR扩增获得羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA的目标片段，并回收目标片段；

3)将步骤2)所得的重组质粒转化至宿主细胞，获得重组菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的PCR扩增用的引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示。

6.权利要求1或2所述的重组菌在生产3-羟基丙酸及其衍生物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，是指在重组菌中过表达3-羟基丙酸的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc和丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr，获得酸耐受性提高的3-羟基丙酸基因工程菌株，将该工程菌株接种到发酵培养基中经发酵培养制备获得3-羟基丙酸及其衍生物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述3-羟基丙酸的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc，来自于大肠杆菌(Escherichia coli)，其中，亚基accA的GeneBank ID为6062185，亚基accB的GeneBank ID为6058890，亚基accC的GeneBank ID为6058863，亚基accD的GeneBank ID为6059083；所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr，来自于橙色绿曲挠菌(Chloroflexus aurantiacus)，所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr由经N端改造的片段mcrN和经C端改造的片段mcrC组成，所述经N端改造的片段mcrN，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述经C端改造的片段mcrC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养，是指在37℃，180rpm的条件下培养至OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为100μM异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导，诱导后置于30℃，180rpm的条件下继续培养48h后终止发酵，发酵过程中不添加任何碱调节pH。

10.权利要求1或2所述重组菌在制备具有酸耐受性基因工程菌中的应用。