CN110669713A - 一种合成d-柠檬烯的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种合成D‑柠檬烯的基因工程菌及其构建方法与应用，涉及基因工程及发酵工程领域，本发明在所述基因工程菌中过表达HMG‑CoA合成酶基因mvaS、乙酰CoA乙酰基转移酶mvaE、牦牛儿基焦磷酸合成酶GPPS基因、D‑柠檬烯合成酶基因ClLS、MVA激酶ERG12基因、MVAP激酶ERG8基因、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因、异戊焦磷酸异构酶IDI基因。在LB培养基中摇瓶发酵后，能够异源合成D‑柠檬烯，D‑柠檬烯的产量27.3mg/L发酵液。本发明可用于D‑柠檬烯工业化生产。

Description

一种合成D-柠檬烯的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程及发酵工程领域，具体涉及一种合成D-柠檬烯的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
柠檬烯又称苧烯、苎烯，属于单环萜类化合物，化学式C10H16，是一种来源植物的天然化合物。它主要存在于柑橘类(如柠檬、橙子、柑橘等)的果皮和果肉中，并且已被美国食用香料与提取物制造商协会(FEMA)认定其毒性属GRAS级(一般公认安全)，并已被FDA批准食用(刘树文.合成香料技术手册[M].2009.)
在农业上，D-柠檬烯还被用作农作物的生物杀虫剂。在卫生医疗领域中，D-柠檬烯具有抑菌、抗菌活性，可以作为良好的天然抗菌活性物质；同时，它还具有很好的药用价值，如具有抗癌活性、促进消化和减肥作用等(Johnson T J,Jahandideh A,Johnson M D,etal.Producing next-generation biofuels from filamentous cyanobacteria:Aneconomic feasibility analysis[J].Algal Research,2016,20:218-228.Ciriminna R,Lomeli-Rodriguez M,Demma C P,et al.Limonene:a versatile chemical of thebioeconomy[J].Chemical Communications,2014,50(97):15288-15296.Jongedijk E,Cankar K,Buchhaupt M,et al.Biotechnological production of limonene inmicroorganisms[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100(7):2927-2938.)柠檬烯还可以作为多种具有重要应用价值的单萜类衍生物如紫苏醇、薄荷醇、松油醇、香芹醇、香芹酮的前体物(Leonard E,Ajikumar P K,Thayer K,et al.Combiningmetabolic and protein engineering of a terpenoid biosynthetic pathway foroverproduction and selectivity control[J].Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America,2010,107(31):13654-13659.)
D-柠檬烯具有重要的生理功能和很高的应用价值，但由于大量提取D-柠檬烯受来源与工艺的限制，合成生物学为更高效地获取D-柠檬烯提供了新思路。目前关于利用微生物代谢工程技术生产D-柠檬烯的并不多见，主要是有关L-柠檬烯的生物合成报道。2004年，Shimada等从蜜柑Citrusunshiu中分离得到了一个D-柠檬烯合酶基因(GenBank AccessionNo.AB110636.1)[从柑桔中分离到3个新的单萜合酶基因cDNA克隆，分别为CitMTSE1、CitMTS61和CitMTS62。体外翻译功能测试表明，CitMTSE1、CitMTS61和CitMTS62分别编码的D-柠檬烯合成酶、γ-萜烯合成酶和β-蒎烯合成酶。(Shimada T,Endo T,Fujii H,etal.Molecular cloning and functional characterization of four monoterpenesynthase genes from Citrus unshiu Marc.[J].Plant Science(Oxford),2004,166(1):0-58.)2015年，Beekwilder研究组在酿酒酵母中分别引入一个来自紫苏的L-柠檬烯合酶基因和一个来自柠檬的D-柠檬烯合酶基因，再加上一个突变的香叶基焦磷酸合成酶基因，成功构建了L-柠檬烯和D-柠檬烯的合成途径。采用几种方法对酵母生产的柠檬烯进行了捕获。结果表明，表达柠檬烯合酶的菌株在培养过程中添加正十二烷，通过顶空收集的方式，分别为0.12mg/L D-柠檬烯和0.49mg/L L-柠檬烯(Jongedijk E,Cankar K,Ranzijn J,etal.Capturing of the monoterpene olefin limonene produced in\r,Saccharomycescerevisiae[J].Yeast,2014，32(1)：159-171)。上述报道的D-柠檬烯生物合成水平较低，制约了D-柠檬烯的工业化生产。
发明内容
为了提高D-柠檬烯的合成水平，本发明提供了一种合成D-柠檬烯的基因工程菌，所述基因工程菌表达HMG-CoA合成酶基因mvaS、乙酰CoA乙酰基转移酶mvaE、牦牛儿基焦磷酸合成酶GPPS基因、D-柠檬烯合成酶基因ClLS、MVA激酶ERG12基因、MVAP激酶ERG8基因、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因、异戊焦磷酸异构酶IDI基因，宿主菌为大肠杆菌。
进一步地限定，所述HMG-CoA合成酶基因mvaS，GeneBank ID为AAG02439，来源于粪肠球菌E.facecalis；乙酰CoA乙酰基转移酶mvaE，GenBank NO.AAG02438，来源于粪肠球菌E.facecalis；牦牛儿基焦磷酸合成酶GPPS基因，Genbank No.AF513112.1，来源于巨冷衫Abies grandis；D-柠檬烯合成酶ClLS基因，Genbank No.AF514287.1，来源于柠檬Citruslimon；MVA激酶ERG12基因，GeneBank ID：855248，来源Saccharomyces cerevisiae；MVAP激酶ERG8基因，GeneBank ID：855260，来源Saccharomyces cerevisiae、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因，GeneBank ID：855779，来源Saccharomyces cerevisiae、异戊焦磷酸异构酶IDI基因，GeneBank ID：855986，来源Saccharomyces cerevisiae。
进一步地限定，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法，步骤如下：
1)构建包含mvaS、mvaE、GPPS、ClLS基因的重组质粒I和包含ERG12、ERG8、ERG19、IDI基因的重组质粒II；
2)将步骤1)构建的重组质粒I和重组质粒II转化入宿主菌，得到合成D-柠檬烯的基因工程菌。
进一步地限定，所述重组质粒I构建所用的中间载体为pET28a(+)；所述重组质粒II构建所用的中间载体为pTrcHis2B。
本发明还提供了上述基因工程菌在合成D-柠檬烯中的应用。
进一步地限定，所述合成D-柠檬烯是指将含有上述基因工程菌的种子液接种至发酵培养基中，培养至OD600为0.6-1.0，然后加入诱导剂IPTG，以及正十二烷或邻苯二甲酸二异壬酯中的一种，继续发酵，将发酵液离心后，上清液过滤得到D-柠檬烯。
进一步地限定，所述种子液接种至发酵培养基中培养条件为：培养温度为30-37℃，搅拌速度为220rpm，pH6.0-8.0。
进一步地限定，所述IPTG在发酵液中的终浓度为0.2mmol/L；所述正十二烷或邻苯二甲酸二异壬酯在发酵液中的终浓度为5％-10％(质量体积比)。
进一步地限定，所述继续发酵的时间为60-72h。
有益效果
1、本发明导入了D-柠檬烯合成酶基因首次构建异源合成柠檬烯的大肠杆菌基因工程菌，其生物合成途径见图1，筛选得到菌株生存环境广泛，对发酵设备无特殊要求，具有广泛应用前景，为柠檬烯产业化生产奠定基础。
2、本发明获得的大肠杆菌基因工程菌：在LB培养基中摇瓶发酵后，能够合成D-柠檬烯，发酵72h，产量达到27.3mg/L发酵液，而现有技术通过在酿酒酵母中表达，通过顶空收集法，合成D-柠檬烯产量仅有0.12mg/L(Jongedijk E,Cankar K,Ranzijn J,etal.Capturing of the monoterpene olefin limonene produced in\r,Saccharomycescerevisiae[J].Yeast,2014，32(1)：159-171)。
附图说明
图1 D-柠檬烯生物合成路径图；
图2 pET28a-mvaS-mvaE-GPPS-ClLS重组质粒结构示意图。
具体实施方式
定义和缩写
在本文中使用下列的缩写或简称：
异丙基硫代半乳糖苷：IPTG
HMG-CoA合成酶基因：mvaS
乙酰CoA乙酰基转移酶基因：mvaE
牦牛儿基焦磷酸合成酶基因：GPPS
D-柠檬烯合成酶基因：ClLS
MVA激酶ERG12基因：甲羟戊酸激酶基因ERG12
MVAP激酶ERG8基因：甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8
甲羟戊酸脱羧酶基因：ERG19
异戊焦磷酸异构酶基因：IDI
大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)：E.coli
“过量表达”或“过表达”指细胞内特定基因受到各种信号调控后，在生物体中超过原有水平表达，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
下面通过实例来详细阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所涉及的实验方法若无特殊说明，均为常规技术。
下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。所用无缝的同源重组酶均购自诺唯赞生物技术公司，质粒提取及胶回收所用试剂盒购自美国OMEGA公司，操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
1)LB种子液培养基：酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，接种时补加卡那霉素50μg/mL。
2)发酵培养基：K2HPO4·3H2O 9.8g/L，Citric acid·H2O 2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L，葡萄糖24g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，1000×微量元素((NH4)6Mo7O24·4H2O 3.7g/L；ZnSO4·7H2O 2.9g/L；H3BO3 24.7g/L；CuSO4·5H2O 2.5g/L；MnCl2·4H2O 15.8g/L)，卡那霉素50μg/mL。
其中：K2HPO4·3H2O 9.8g/L，Citric acid·H2O 2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。葡萄糖储液为500g/L，115℃，20min单独灭菌，MgSO4·7H2O储液为200g/L，121℃，20min单独灭菌，1000×微量元素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌，转接种子液时分别补加上述单独除菌的葡萄糖、MgSO4·7H2O、1000×微量元素储液及抗生素。
pGH-mvaS、pGH-mvaE、pGH-GPPS、pUC57-ClLS，通过商业化公司根据相应的目的基因序列合成到克隆载体pGH-T中获得，pET28a(+)载体通过商业化途径购买获得。
实施例1.合成D-柠檬烯的基因工程菌的构建。
本实施例所述的合成D-柠檬烯的基因工程菌，表达HMG-CoA合成酶基因mvaS、乙酰CoA乙酰基转移酶mvaE、牦牛儿基焦磷酸合成酶GPPS基因、D-柠檬烯合成酶基因ClLS、MVA激酶ERG12基因、MVAP激酶ERG8基因、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因、异戊焦磷酸异构酶IDI基因，宿主菌为大肠杆菌。所述HMG-CoA合成酶基因mvaS，GeneBank ID为AAG02439，来源于粪肠球菌E.facecalis；乙酰CoA乙酰基转移酶mvaE，GenBank NO.AAG02438，来源于粪肠球菌E.facecalis；牦牛儿基焦磷酸合成酶GPPS基因，Genbank No AF5131121，来源于巨冷衫Abies grandis；D-柠檬烯合成酶ClLS基因，Genbank No.AF514287.1，来源于柠檬Citruslimon；MVA激酶ERG12基因，GeneBank ID：855248，来源Saccharomyces cerevisiae；MVAP激酶ERG8基因，GeneBank ID：855260，来源Saccharomyces cerevisiae、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因，GeneBank ID：855779，来源Saccharomyces cerevisiae、异戊焦磷酸异构酶IDI基因，GeneBank ID：855986，来源Saccharomyces cerevisiae。
具体构建方法如下：
(一)质粒构建：
1.构建重组质粒I：pET28a-mvaS-mvaE-GPPS-ClLS
表1本实例用到的引物
引物名称 序列(5’-3’)
mvaE-F <u>tcatcaccacagccaggatcc</u>GGATCCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTA
mvaE-R <u>cctcctggtatatctcctt</u>TTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGCC
mvaS-F <u>AAAGGAGATATAC</u>CAGGAGGTAAAAAAA
mvaS-R <u>acctgcaggcgcgccgagctc</u>GAGCTCTTAGTTTCGATAAGAGCGAACGG
GPPS-F-Bgl II <u>agatatacatatggcagatct</u>AGATCTATGGAATTCGACTTCAACAAATACA
GPPS-R <u>gccgatatccaattgagatc</u>tTTAGTTCTGACGGAAAGCAACG
ClLS-5Nae I <u>aacaattggatatcggccggc</u>GCCGGCAAGGAGATATACCATGAGTAGCTGTATTAACC
ClLS-3Xho I <u>ggtttctttaccagactcgag</u>CTCGAGTTAACCTTTGGTGCCCGGA
划线部分为同源臂。
1)分别以mvaE-F、mvaE-R和mvaS-F、mvaS-R为引物，以质粒pGH-mvaS,pGH-mvaE为模板，分别扩增mvaE及mvaS基因，诺唯赞的无缝克隆试剂盒(ClonExpress Ultra One StepCloning Kit C115-01)中的重组酶exnase的作用下，利用同源臂完成mvaE、mvaS和pET28a(+)连接，构建出pET28a-mvaS-mvaE。
2)以GPPS-F和GPPS-R为引物，以质粒pGH-GPPS为模板，扩增GPPS基因，在诺唯赞的无缝克隆试剂盒(ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit C115-01)中的重组酶exnase的作用下，利用同源臂完成GPPS和pET28a-mvaS-mvaE的连接，构建出pET28a-mvaS-mvaE-GPPS。
3)以ClLS-5Nae I和ClLS-3Xho I为引物，以质粒pUC57-ClLS为模板，扩增ClLS基因，在诺唯赞的无缝克隆试剂盒(ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit C115-01)中的重组酶exnase的作用下，利用同源臂完成ClLS和pET28a-mvaS-mvaE-GPPS的连接，构建出pET28a-mvaS-mvaE-GPPS-ClLS，其重组质粒结构图见图2。
2.构建重组质粒II：pYJM14
本发明所用的重组质粒II为重组质粒pYJM14，包含MVA激酶ERG12基因、MVAP激酶ERG8基因、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因、异戊焦磷酸异构酶IDI基因，该质粒记载在Yang J,Xian M,Su S,et al.Enhancing production of bio-isoprene using hybrid MVApathway and isoprene synthase in E.coli[J].Plos One,2012.详细构建过程参见该文章，公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得该质粒。
(二)制备合成D-柠檬烯的基因工程菌
按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备E.coli BL21(DE3)的感受态细胞，将步骤1得到的重组质粒pET28a-mvaS-mvaE-GPPS-ClLS和和步骤2得到的pYJM14质粒通过热激法共同转化至上述制备的感受态细胞，获得重组菌株。
实施例2.利用基因工程菌株发酵生产D-柠檬烯。
摇瓶发酵实验：
1)一级种子液的培养：在LB种子液培养基中分别接种固体LB平板上的实施例1得到重组菌株单菌落，并加入终浓度为50μg/mL卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素，37℃生长12h，得到一级种子液。
2)将步骤1)得到的一级种子液分别按2％(wt)接种量转接至250mL盐水瓶中，含50mL发酵培养基，转接种子液时各补加200g/L的MgSO4·7H2O 100μL、500g/L葡萄糖2.4mL、1000×微量元素50μL((NH4)6MoO24·4H2O 0.37g；ZnSO4·7H2O 0.29g；H3BO4 2.47g；CuSO4·5H2O 0.25g；MuCl2·4H2O 1.58g；用蒸馏水定容到100mL)、终浓度50μg/mL卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素，37℃、180rpm培养。
3)细胞OD600达到0.6-1.0间加入终浓度200μmol/L的IPTG诱导，并加入10％(质量体积分数)正十二烷。诱导后，30℃、180rpm继续培养72h发酵结束。
4)发酵后收集菌液，7500rpm，4℃离心5min，取有机膜过滤，气相色谱-质谱联用备用检测其含量，利用Cyclosil-B手性色谱柱检测其产物结构为D-柠檬烯，经气质检测，发酵72h，产D-柠檬烯异源合成柠檬烯的产量为27.3mg/L发酵液。
气相-质谱联用检测条件：
色谱条件：色谱柱为DB_5MS(30m×0.320mm×0.25um)；检测器为氢火焰离子检测器；分析条件如下：柱温50℃保持0min，然后以10℃/min，从50℃升温到250℃，保持10min，汽化温度250℃，检测器温度260℃。
扫描质量数：40-500；离子源温度230度，四级杆150度。
SIM：扫描荷质比68、93m/z
气相色谱检测手性检测条件：
色谱柱：Cyclosil-B(112-6632)
进样量：1μL
进样口：250℃；分流模式，分流比20:1
柱流量：1mL/min，氮气为载气
柱箱：初始50℃，以2℃/min速率，升到190℃(最终温度可以适当降低以缩短采集时间z)
检测器(FID)：250℃，空气300mL/min，氢气30mL/min，尾吹气+柱流量25mL/min。
实施例3.利用基因工程菌株发酵生产D-柠檬烯。
摇瓶发酵实验：
1)一级种子液的培养：在LB种子液培养基中分别接种固体LB平板上的实施例3得到重组菌株单菌落，并加入终浓度为50μg/mL卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素，37℃生长12h，得到一级种子液。
2)将步骤1)得到的一级种子液分别按2％(wt)接种量转接至250mL盐水瓶中，含50mL发酵培养基，转接种子液时各补加200g/L的MgSO4·7H2O 100μL、500g/L葡萄糖2.4mL、1000×微量元素50μL((NH4)6MoO24·4H2O 0.37g；ZnSO4·7H2O 0.29g；H3BO4 2.47g；CuSO4·5H2O 0.25g；MuCl2·4H2O 1.58g；用蒸馏水定容到100mL)、终浓度50μg/mL卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素，37℃、180rpm培养。
3)细胞OD600达到0.6-1.0间加入终浓度200μmol/L的IPTG诱导，并加入10％(质量体积分数)DINP(邻苯二甲酸二异壬酯)。诱导后，30℃、180rpm继续培养72h发酵结束
4)发酵后收集菌液，7500rpm，4℃离心5min，取有机膜过滤，气相色谱-质谱联用备用检测其含量，发酵72h，产D-柠檬烯异源合成柠檬烯的产量为10.2mg/L发酵液。
气相-质谱联用检测条件：
色谱条件：色谱柱为DB_5MS(30m×0.320mm×0.25um)；检测器为氢火焰离子检测器；分析条件如下：柱温50℃保持0min，然后以10℃/min，从50℃升温到250℃，保持10min，汽化温度250℃，检测器温度260℃。
扫描质量数：40-500；离子源温度230度，四级杆150度。
SIM：扫描荷质比68、93m/z。
本实施例所列数据为多次重复试验的平均数值。虽然本发明已经公开了示例性示范方案，但是本领域人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
核苷酸序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种合成D-柠檬烯的基因工程菌及其构建方法与应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> mvaE-F
<400> 1
tcatcaccac agccaggatc cggatccagg aggtaaaaaa acatgaaaac agta 54
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> mvaE-R
<400> 2
cctcctggta tatctccttt tattgttttc ttaaatcatt taaaatagcc 50
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> mvaS-F
<400> 3
aaaggagata taccaggagg taaaaaaa 28
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> mvaS-R
<400> 4
acctgcaggc gcgccgagct cgagctctta gtttcgataa gagcgaacgg 50
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> GPPS-F-Bgl II
<400> 5
agatatacat atggcagatc tagatctatg gaattcgact tcaacaaata ca 52
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> GPPS-R
<400> 6
gccgatatcc aattgagatc tttagttctg acggaaagca acg 43
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> ClLS-5Nae I
<400> 7
aacaattgga tatcggccgg cgccggcaag gagatatacc atgagtagct gtattaacc 59
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> ClLS-3Xho I
<400> 8
ggtttcttta ccagactcga gctcgagtta acctttggtg cccgga 46

Claims (10)

1.一种合成D-柠檬烯的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达HMG-CoA合成酶基因mvaS、乙酰CoA乙酰基转移酶mvaE、牦牛儿基焦磷酸合成酶GPPS基因、D-柠檬烯合成酶基因ClLS、MVA激酶ERG12基因、MVAP激酶ERG8基因、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因、异戊焦磷酸异构酶IDI基因，宿主菌为大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述HMG-CoA合成酶基因mvaS，GeneBank ID为AAG02439，来源于粪肠球菌E.facecalis；乙酰CoA乙酰基转移酶mvaE，GenBank NO.AAG02438，来源于粪肠球菌E.facecalis；牦牛儿基焦磷酸合成酶GPPS基因，Genbank No.AF513112.1，来源于巨冷衫Abies grandis；D-柠檬烯合成酶ClLS基因，Genbank No.AF514287.1，来源于柠檬Citrus limon；MVA激酶ERG12基因，GeneBank ID：855248，来源Saccharomyces cerevisiae；MVAP激酶ERG8基因，GeneBank ID：855260，来源Saccharomyces cerevisiae、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因，GeneBank ID：855779，来源Saccharomyces cerevisiae、异戊焦磷酸异构酶IDI基因，GeneBank ID：855986，来源Saccharomyces cerevisiae。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
4.权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
1)构建包含mvaS、mvaE、GPPS、ClLS基因的重组质粒I和包含ERG12、ERG8、ERG19、IDI基因的重组质粒II；
2)将步骤1)构建的重组质粒I和重组质粒II转化入宿主菌，得到合成D-柠檬烯的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒I构建所用的中间载体为pET28a(+)；所述重组质粒II构建所用的中间载体为pTrcHis2B。
6.权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌在合成D-柠檬烯中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述合成D-柠檬烯是指将含有权利要求-3任意一项所述的基因工程菌的种子液接种至发酵培养基中，培养至OD600为0.6-1.0，然后加入诱导剂IPTG，以及正十二烷或邻苯二甲酸二异壬酯中的一种，继续发酵，将发酵液离心后，上清液过滤得到D-柠檬烯。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述种子液接种至发酵培养基中培养条件为：培养温度为30-37℃，搅拌速度为220rpm，pH6.0-8.0。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述IPTG在发酵液中的终浓度为0.2mmol/L；所述正十二烷或邻苯二甲酸二异壬酯在发酵液中的终浓度为5％-10％(质量体积比)。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述继续发酵的时间为60-72h。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113355340A (zh) * 2020-03-09 2021-09-07 深圳蓝晶生物科技有限公司 一种构建生产柠檬醛的重组菌的方法及由其构建的重组菌及其应用
CN114606146A (zh) * 2022-03-11 2022-06-10 江南大学 一种生产d-柠檬烯的酵母及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102071153A (zh) * 2010-12-08 2011-05-25 江南大学 一种产d-柠檬烯的酵母工程菌及其构建方法
CN107815424A (zh) * 2016-09-12 2018-03-20 华东理工大学 一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
CN108587934A (zh) * 2018-05-10 2018-09-28 天津科技大学 一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与应用
WO2018200888A1 (en) * 2017-04-27 2018-11-01 Regents Of The University Of California Microorganisms and methods for producing cannabinoids and cannabinoid derivatives
CN110229804A (zh) * 2019-05-23 2019-09-13 天津大学 一种柠檬烯合成酶SynLS1及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102071153A (zh) * 2010-12-08 2011-05-25 江南大学 一种产d-柠檬烯的酵母工程菌及其构建方法
CN107815424A (zh) * 2016-09-12 2018-03-20 华东理工大学 一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
WO2018200888A1 (en) * 2017-04-27 2018-11-01 Regents Of The University Of California Microorganisms and methods for producing cannabinoids and cannabinoid derivatives
CN108587934A (zh) * 2018-05-10 2018-09-28 天津科技大学 一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与应用
CN110229804A (zh) * 2019-05-23 2019-09-13 天津大学 一种柠檬烯合成酶SynLS1及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
秦泽华等: "大肠杆菌通过甲羟戊酸途径合成紫苏醇", 《生物工程学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113355340A (zh) * 2020-03-09 2021-09-07 深圳蓝晶生物科技有限公司 一种构建生产柠檬醛的重组菌的方法及由其构建的重组菌及其应用
CN114606146A (zh) * 2022-03-11 2022-06-10 江南大学 一种生产d-柠檬烯的酵母及其应用

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