CN114606146A

CN114606146A - 一种生产d-柠檬烯的酵母及其应用

Info

Publication number: CN114606146A
Application number: CN202210243089.9A
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 陈坚; 吕雪芹; 堵国成; 李江华; 刘延峰; 孔晓
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-03-11
Also published as: CN114606146B

Abstract

本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种生产D‑柠檬烯的酿酒酵母及其应用。本发明以酿酒酵母为出发菌株，将自然界中不存在于同一生物体的柠檬烯合成酶基因有机整合到酿酒酵母中，优化外源基因的表达，过表达MVA途径基因关键基因、增加乙酰辅酶A和NADPH前体供应等方面，实现柠檬烯在酿酒酵母中的高效合成，最终得到的菌株相对于原菌株具有较好的生长速率。摇瓶发酵最终实现柠檬烯产量达657mg/L，比原产量提高2.021倍，实现柠檬烯在酿酒酵母中的高效合成，具有较大的应用推广价值。

Description

一种生产D-柠檬烯的酵母及其应用

技术领域

本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种生产D-柠檬烯的酵母及其应用。

背景技术

萜类化合物，又称类异戊二烯，由异戊二烯单元组成的化合物及其衍生物构成，是植物的次生代谢产物。柠檬烯属于单环单萜类化合物，化学式为C₁₀H₁₆，是一种来源于植物的天然活性化合物，易挥发，性质较稳定，应用范围较广。在食品工业中，柠檬烯具有防腐保鲜、抑菌、抗氧化等功能；在医药行业中，柠檬烯可以用于制备具有抗肿瘤、祛痰平喘、利胆溶石功能的药物；在香料、洗护行业，柠檬烯做精油、温和洗涤剂等；在农业方面，柠檬烯可用于制备天然源农药，具有环境易降解的优点。2020年，全球柠檬烯市场规模达到了20亿元，预计2026年将达到24亿元，年复合增长率(CAGR)为2.3％。

目前D-柠檬烯的工业生产主要是从植物的果皮或者果肉中提取的，但提取方法存在着分离纯化复杂、产率低、能耗大等缺点。本世纪初合成生物学技术的兴起，为微生物异源合成天然活性化合物带来了全新的理念与工具，打破了物种间的界限，使微生物异源合成D-柠檬烯成为现实。构建定向、高效的异源合成D-柠檬烯的微生物细胞工厂，实现微生物发酵法替换传统的植物提取法，具有重要的经济与社会效益。目前代谢工程应用于柠檬烯的生产主要以酿酒酵母与大肠杆菌为底盘细胞，酿酒酵母作为极具潜力的细胞工厂，被广泛的应用于各种生物燃料、化工产品、医药保健品等的合成，酿酒酵母在萜类化合物的生产中应用较广泛。

2019年国外Codruta Ignea等人采用对正交途径的动态调节，ERG1启动子的动态设计以及关键基因ERG20启动子替换，引入工程化的NPPS等策略，连续发酵实现柠檬烯产量166.0mg/L。2019年Si Cheng等人通过工程改造竞争性基因ERG20的葡萄糖感应启动子HXT1以及引入由植物NPPS和植物LS利用底物NPP组成的OLB途径等策略，补料分批发酵实现柠檬烯产量917.7mg/L。2020年胡智慧等人采用过表达或共过表达MVA关键基因、关键酶启动子优化，关键酶点突变随机突变相结、表达相关转运蛋白以增加耐受性等策略，连续发酵实现柠檬烯产量62.31mg/L。

综上，柠檬烯的传统分离提取技术存在产率低、能耗大等问题，并且受到原料以及地域的限制。关于合成生物学的技术和方法，目前国内外现有技术柠檬烯产量无法满足工业化应用的要求。单萜类物质倾向于粘附或渗透细胞膜，最终导致酵母膜功能受损，因此还会存在柠檬烯对酵母生长的抑制问题。

发明内容

本发明旨在提供一种生产D-柠檬烯的酵母及其应用，从外源柠檬烯合成关键基因整合与优化、过表达MVA途径基因关键基因、增加乙酰辅酶A和NADPH前体供应三个方面，实现柠檬烯在酵母中的高效合成，具有较大的应用推广价值。

按照本发明的技术方案，所述重组酵母，以酵母为出发菌，异源表达截短的柠檬烯合成酶基因tLimS，表达了法尼基焦磷酸突变体基因ERG20^ww，过表达内源MVA合成途径中关键基因和MVA途径相关基因；

所述截短的柠檬烯合成酶基因tLimS由柠檬烯合成酶基因LimS去除前56个氨基酸序列形成；

所述法尼基焦磷酸突变体基因ERG20^ww是对法尼基焦磷酸基因ERG20的96与127位氨基酸进行突变得到；

所述内源MVA合成途径中关键基因为甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI和截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1；

所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1由3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1去除前530个氨基酸序列形成；

所述MVA途径相关基因为乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a合酶基因ERG13、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸ERG8和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶ERG19。

进一步的，所述酵母为酿酒酵母、异常汉逊氏酵母、粟酒裂殖酵母、黏红酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、解脂假丝酵母或巴斯德毕赤酵母。

进一步的，所述的柠檬烯合成酶的NCBI编号是AAC37366.1，所述的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的NCBI编号是NP_015208.1，所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的NCBI编号是NP_013636.1，所述的乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因的NCBI编号是NP_015297.1，β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a合酶的NCBI编号是NP_013580.1，甲羟戊酸激酶的NCBI编号是NP_013935.1，磷酸甲羟戊酸的NCBI编号是NP_013947.1、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶的NCBI编号是NP_014441.1。

具体的，所述截短的柠檬烯合成酶基因tLimS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述法尼基焦磷酸突变体基因ERG20^ww的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a合酶基因ERG13的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、所述甲羟戊酸激酶基因ERG12的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示、磷酸甲羟戊酸ERG8的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶ERG19的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

进一步的，所述法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20^ww通过与截短的柠檬烯合成酶基因tLimS采用双向诱导型启动子GAL1,10进行表达。

进一步的，所述双向诱导型启动子GAL1,10的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

进一步的，所述重组酵母还将法尼基焦磷酸基因ERG20的启动子替换为葡萄糖感应型启动子。

进一步的，所述葡萄糖感应型启动子为P_HXT1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明采用诱导型启动子表达基因tLimS，以及D-柠檬烯合成关键基因ERG20^ww，使得化合物IPP和DMAPP更趋向于合成D-柠檬烯的前体化合物GPP。采用诱导型启动子过表达MVA途径的多个基因，并优化了关键基因的拷贝数，用采用P_HXT1动态调控ERG20，克服因前体供应不足而导致的D-柠檬烯产量发酵产量低的因素。

进一步的，所述重组酵母还敲除了乙醛酸循环的关键酶苹果酸合成酶基因MLS1，谷氨酸脱氢酶(NAD(+))GDH2。

进一步的，所述的苹果酸合成酶MLS1的NCBI编号为NP_014282.1，所述谷氨酸脱氢酶(NAD(+))GDH2的NCBI编号为NP_010066.1(SEQ ID NO.16)。

进一步的，依次敲除苹果酸合成酶基因MLS1和谷氨酸脱氢酶(NAD(+))基因GDH2。

本发明通过敲除乙醛酸循环的关键基因来增加乙酰辅酶A的含量，调节细胞代谢流往产物合成方向。由于类异戊二烯途径的过度表达导致细胞NADPH池的大量消耗，运用辅因子策略调控NADPH前体供应，克服因还原力不足而导致的D-柠檬烯发酵产量低的因素，促使氧化还原平衡以提高途径效率，摇瓶发酵最终实现柠檬烯产量达657mg/L，比原产量提高2.021倍，实现柠檬烯在酵母中的高效合成。

本发明的另一方面提供了上述重组酵母在发酵生产D-柠檬烯中的应用。

进一步的，所述发酵的温度为28-32℃，时间为80-120h。

本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：本发明以酿酒酵母为出发菌株，将自然界中不存在于同一生物体的柠檬烯合成酶基因有机整合到酿酒酵母中，优化外源基因的表达，过表达MVA途径基因关键基因、增加乙酰辅酶A和NADPH前体供应等方面，实现柠檬烯在酿酒酵母中的高效合成，最终得到的菌株相对于原菌株具有较好的生长速率。摇瓶发酵最终实现柠檬烯产量达657mg/L，比原产量提高2.021倍，实现柠檬烯在酿酒酵母中的高效合成，具有较大的应用推广价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中气相-质谱联用检测方法如下：使用带有FID检测器和色谱柱(Thermo；25m，0.32mm，0.25μm)的Thermofisher Scientific TSQ8000仪器进行检测。进样器温度为180℃，载气为氦气，流速为1mL/min，压力为5.8psi。程序从70℃开始，以20℃/min的速率将温度升至150℃，保持3分钟，然后以2℃/min的速度将温度升至190℃，保持3分钟。

启动子P_GAL1，10的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，启动子P_GAL7的核苷酸序列如SEQID NO.12所示，终止子T_CYC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，终止子T_ADH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，终止子T_TDH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

实施例1构建D-柠檬烯合成途径

(a)人工合成基因片段P_GAL1-tLimS-T_CYC1-P_GAL10-ERG20^WW-T_ADH1，其中tLimS基因是基因LIS去除前56个氨基酸序列所形成，ERG20^WW基因是对ERG20基因的96与127位氨基酸进行突变得到，采用引物911b-F、911b-R对上述片段扩增；以酿酒酵母S288C基因组为模版，分别扩增得到基因片段911b-U(引物911b-U-F、911b-U-R)、基因片段911b-D(引物911b-D-F、911b-D-R)；

(b)使用核酸酶SwaI和BelI^*对pML104质粒进行酶切，得到线性化质粒片段；

(c)采用引物911b-oligo2-F和911b-oligo1-R梯度退火，具体方法是，体系中按照1:1比例加入上述两种引物，设置PCR仪温度从98℃至12℃，按照每秒0.1℃的速率退火；

(d)将(b)所得线性化质粒片段与(c)经退火后的引物使用T4 DNA连接酶连接，具体方法是加入(b)(c)所得体系各1μL、T4 DNA连接酶1μL，T4 DNA连接酶10×buffer 1μL，去离子水6μL，置于22℃反应3小时。即可得到pML104-911b CRISPR-Cas9的质粒；连接完成后转入大肠JM109或DH5α感受态均可。将转化成功的菌送测序，测序正确的单菌落接入2mL LB培养基内，培养16h后利用质粒提取试剂盒提取得到质粒用于后续酵母化转。

(e)制备酿酒酵母CEN.PK2-1C感受态，并将扩增好的基因片段911b-U、基因片段911b-D，PP_GAL1-tLimS-T_CYC1-P_GAL10-ERG20^WW-T_ADH1片段，pML104-911b质粒共同转入CEN.PK2-1C感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用两对引物分别是YZ-911b-tLimS-F，YZ-tLimS-911b-R与

YZ-ERG20^WW-911b-F，YZ-911b-ERG20^WW-R进行菌落PCR验证。

(f)将步骤(e)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL1。

引物序列：

911b-F：TGAATGGGCATAAATATAAATGTATATATAAggccgcaaattaaagccttc

911b-R：tgctatttcaTTTTTCATTTACTTCTCCAgagcgacctcatgctatacct

911b-U-F：CACTCATCAAACAGCCTTAACAAT

911b-U-R：

aaggctttaatttgcggccTTATATATACATTTATATTTATGCCCATTCAACATCCG

911b-D-F：

aggtatagcatgaggtcgctcTGGAGAAGTAAATGAAAAATGAAATAGCATAC

911b-D-R：AATATGGGTACGAGAGAAACTCTCG

911b-oligo2-F：CTAGCTCTAAAACGGGAAACAAGACAATATTAC

911b-oligo1-R：gatcGTAATATTGTCTTGTTTCCCGTTTTAGAGCTAG

YZ-911b-tLimS-F：CCGCAATTTTCATTGCAGCACTG

YZ-tLimS-911b-R：cgcagaaagagtttctaaggattcacc

YZ-ERG20^WW-911b-F：gcttccgcagaacaaagaaagac

YZ-911b-ERG20^WW-R：GCCTATACAGCTACCGCGC。

实施例2优化内源MVA途径

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段P_GAL1-tHMG1-T_ADH1-P_GAL10-IDI-T_CYC1，后采用引物GAL80-F、GAL80-R将其扩增。以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物GAL80-U-F、GAL80-U-R扩增得到GAL80上游1000bp基因片段，采用引物GAL80-D-F、GAL80-D-R扩增得到基因GAL80下游1000bp基因片段。

(b)参照实施例1中步骤(b)和(c)类似的方法，采用引物GAL80-oligo2-F和GAL80-oligo1-R梯度退火，参照例实施1中步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-GAL80CRISPR-Cas9的质粒。

(c)制备酿酒酵母MKL1感受态，并将扩增好的GAL80上、下游1000bp基因片段，基因片段P_GAL1-tHMG1-T_ADH1-P_GAL10-IDI-T_CYC1，pML104-GAL80质粒共同转入MKL1感受态中，待SDUra筛选固体平板上长出单菌落后采用两对引物分别是YZ-GAL80U-IDI-F、YZ-IDI-GAL80-R与YZ-tHMG1-GAL80D-F、YZ-GAL80D-tHMG1-R进行菌落PCR验证。

(d)将步骤(c)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL2。

引物序列：

GAL80-F：CCAGGATAAATGCAATGGTTTTCAATAATAggccgcaaattaaagccttc

GAL80-R：cttggaatAAAAGATGATCCGGTACTGgagcgacctcatgctatacct

GAL80-U-F：TCTCTGTTTAAATGGCGCAAGTTT

GAL80-U-R：tttaatttgcggccTATTATTGAAAACCATTGCATTTATCCTGGAA

GAL80-D-F：ggtatagcatgaggtcgctcCAGTACCGGATCATCTTTTATTCCAAG

GAL80-D-R：CGGTGATAACAGCAAAACATGC

GAL80-oligo2-F：CTAGCTCTAAAACAATCGGTTACCACGCTCATC

GAL80-oligo1-R：gatcGATGAGCGTGGTAACCGATTGTTTTAGAGCTAG

YZ-GAL80U-IDI-F：AAGGCTGCTGCTGAACGT

YZ-IDI-GAL80-R：cttgactgtcaacccaaacgtc

YZ-tHMG1-GAL80D-F：cctggtaccaacgcacgt

YZ-GAL80D-tHMG1-R：TGCATCATACCCCGGGTCTAAAGG。

(e)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段P_GAL1-ERG10-T_ADH1-P_GAL10-ERG13-T_CYC1，后采用引物ERG10-13-F、ERG10-13-R将其扩增，人工合成基因P_GAL7-ERG12-T_TDH3，后采用引物ERG12-F、ERG12-R将其扩增。以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物416d-U-F、416d-U-R扩增得到416d上游500bp基因片段，采用引物416d-D-F、416d-D-R扩增得到整合位点416d下游500bp基因片段。采用引物loxP-HIS-F、loxP-HIS-R扩增loxP-HIS标签片段。

(f)制备酿酒酵母MKL2感受态，并将扩增好的基因片段P_GAL1-ERG10-T_ADH1-P_GAL10-ERG13-T_CYC1，P_GAL7-ERG12-T_TDH3，416d上、下游500bp基因片段，loxP-HIS标签片段共同转入MKL2感受态中，待SD His筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-10-13-F，YZ-12-R进行菌落PCR验证，验证成功的菌送测序。测序无误的单菌落即为正确的基因工程菌，对并命名为MKL3。引物序列：

ERG10-13-F：GCaagtcgaccttggcactggccgtcgttttagttttcccagtcacgacgttgtaaaa

ERG10-13-R：CCGCTGTATAGCTCATATCTTTCCCTTgagcgacctcatgctatacctga

ERG12-F：tctcaggtatagcatgaggtcgctcAAGGGAAAGATATGAGCTATACAGCG

ERG12-R：

CCACATGTTAAAATAGTGAAGGAGCATCCTTTTGGAAAGCTATACTTCGGAG

416d-U-F：GGCCTTTTGAAAAGCAAGCATAA

416d-U-R：gtaatcatggtcatagctgtttcctgATGAGGCAACGCTAATTATCAACATA

416d-D-F：

TCCGAAGTATAGCTTTCCAAAAGGATGCTCCTTCACTATTTTAACATGTGGAA

416d-D-R：ATATCCACATCAATGGCTAATGGCAA

YZ-10-13-F：cgacttctaatctaccaattttgttgg

YZ-12-R：aattccaaggtctacaaaagatcttgt。

(g)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段P_GAL1-ERG8-T_ADH1-P_GAL10-ERG19-T_CYC1，后采用引物ERG8-19-F、ERG8-19-R将其扩增，人工合成基因P_GAL7-tHMG1-T_TDH3，后采用引物tHMG1-F、tHMG1-R将其扩增。以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物1309a-U-F、1309a-U-R扩增得到1309a上游500bp基因片段，采用引物1309a-D-F、1309a-D-R扩增得到整合位点1309a下游500bp基因片段。采用引物loxP-Trp-F、loxP-Trp-R扩增loxP-Trp标签片段。

(h)制备酿酒酵母MKL3感受态，并将扩增好的基因片段P_GAL1-ERG8-T_ADH1-P_GAL10-ERG19-T_CYC1，P_GAL7-tHMG1-T_TDH3，1309a上、下游500bp基因片段，loxP-Trp标签片段共同转入MKL3感受态中，待SD His Trp筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-10-13-F，YZ-12-R进行菌落PCR验证,验证成功的菌送测序。测序无误的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL4。

引物序列：

ERG8-19-F：gatgcggtattttctccttacgcatggccgcaaattaaagccttc

ERG8-19-R：ATTCCGCTGTATAGCTCATATCTTTCCCTTgagcgacctcatgctatacct

tHMG1-F：ctcaggtatagcatgaggtcgctcAAGGGAAAGATATGAGCTATACAGCG

tHMG1-R：

GGGGCTTTACGATGGAGTAGTAGACCTTCCTTTTGGAAAGCTATACTTCGGA

1309a-U-F：CAGAAAAACAGATGTGCCCAAATC

1309a-U-R：ttgttatccgctcacaattccacaGATCCTAAACTGCGTCATAGTAAGTTTC

1309a-D-F：

CTCCGAAGTATAGCTTTCCAAAAGGAAGGTCTACTACTCCATCGTAAAGC

1309a-D-R：TGAGGAATTTACAATAAGGTGGTTCCT

YZ-10-13-F：

AAGAAACTTACTATGACGCAGTTTAGGATCtgtggaattgtgagcggataacaa

YZ-12-R：gggacgctcgaaggctttaatttgcggccatgcgtaaggagaaaataccgca。

(i)将法尼基焦磷酸合酶基因ERG20的启动子替换为P_HXT1，以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物ERG20-U-F、ERG20-U-R扩增ERG20基因上游序列，采用引物ERG20-D-F、ERG20-D-R扩增ERG20基因下游序列，采用引物P_HXT1-U、P_HXT1-D扩增启动子P_HXT1，采用引物Leu-ERG20-F、Leu-P_HXT1-R，扩增Leu标签。

(j)制备酿酒酵母MKL4感受态，并将扩增好的启动子P_HXT1基因片段,ERG20基因上、下游基因片段，loxP-Leu标签片段共同转入MKL4感受态中，待SD His Trp Leu筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-P_HXT1-F，YZ-ERG20D-R进行菌落PCR验证,验证成功的菌送测序。测序无误的单菌落即为正确的基因工程菌，对上述测序成功的菌进行消标签并命名为MKL5。引物序列：

ERG20-U-F：GACAATCATTACCACAAGATGAACAC

ERG20-U-R：

GTAatcatggtcatagctgtttcctgACCGCTTAGAATACCTCACACTGTATA

ERG20-D-F：

ATCGTCAACTAGTTGATATACGTAAAATCATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGAGA

ERG20-D-R：GTCGACTTTGTCTTCAGGTGC

P_HXT1-U：gaccttggcactggccgtcgttttaTGCAGGTCTCATCTGGAATATAATTCC

P_HXT1-D：

CTAATTTCTTTTTCTGAAGCCATGATTTTACGTATATCAACTAGTTGACGATTATG

Leu-ERG20-F：

ATACAGTGTGAGGTATTCTAAGCGGTcaggaaacagctatgaccatgattac

Leu-P_HXT1-R：GGAATTATATTCCAGATGAGACCTGCAtaaaacgacggccagtgcca

YZ-P_HXT1-F：GCGCACAAGATCCAATACGT

YZ-ERG20D-R：GCAATTTCCCCAACTTCAGGAACC。

实施例3优化D-柠檬烯合成途径关键基因拷贝数

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段P_GAL1-ERG20^WW-T_ADH1-P_GAL10-tLimS-T_CYC1，后采用引物SAP155b-F、SAP155b-R将其扩增，以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物SAP155b-U-F、SAP155b-U-R扩增得到SAP155b上游500bp基因片段，采用引物SAP155b-D-F、SAP155b-D-R扩增得到整合位点SAP155b下游500bp基因片段。

(b)参照实施例1步骤(b)(c)类似的方法，采用引物SAP155b-oligo2-F和SAP155b-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-SAP155bCRISPR-Cas9的质粒。

(c)制备酿酒酵母MKL5感受态，并将扩增好的SAP155b上、下游500bp基因片段，pML104-SAP155b质粒，并将扩增好的基因片段P_GAL1-ERG20^WW-T_ADH1-P_GAL10-tLimS-T_CYC1共同转入MKL5感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用两对引物分别是YZ-SAP155b-ERG20^WW-F、YZ-tLimS-SAP155b-R与YZ-tLimS-SAP155b-F、YZ-SAP155b-tLimS-R进行菌落PCR验证。验证成功的菌送测序。测序无误的单菌落即为正确的基因工程菌，对上述测序成功的菌进行消标签并命名为MKL6。

引物序列：

SAP155b-F：ACGTTGATAATAAGAACACGGAAAATGGggccgcaaattaaagccttcga

SAP155b-R：ATGTTACTATTACTGTTCTTGTCCTCCGgagcgacctcatgctatacctg

SAP155b-U-F：CTACAGACTTCATATTAAGGGGCTAC

SAP155b-U-R：

cgctcgaaggctttaatttgcggccCCATTTTCCGTGTTCTTATTATCAACG

SAP155b-D-F：

ctcaggtatagcatgaggtcgctcCGGAGGACAAGAACAGTAATAGTAAC

SAP155b-D-R：TAGAGCCTGATGGAAGTGAAACACTA

SAP155b-oligo2-F：CTAGCTCTAAAACGCGGCCCCAGTATGAAAACC

SAP155b-oligo1-R：gatcGGTTTTCATACTGGGGCCGCGTTTTAGAGCTAG

YZ-SAP155b-ERG20^WW-F：CATCATTCCGCAGCTGCCTG

YZ-tLimS-SAP155b-R：gggtacatctgttgaagaagtttcaag

YZ-tLimS-SAP155b-F：acttagactgcttcggtacccc

YZ-SAP155b-tLimS-R：GGCCAAAAGAAAATGGAATTGCCTAACG。

实施例4重构酿酒酵母工程菌MKL7

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物MLS1-U-F、MLS1-U-R扩增得到基因MLS1上游500bp基因片段，采用引物MLS1-D-F、MLS1-D-R扩增得到基因MLS1下游500bp基因片段。

(b)参照实施例1中步骤(b)和(c)类似的方法，采用引物MLS1-oligo2-F和MLS1-oligo1-R梯度退火，参照例实施1中步骤(d)类似的方法，即可以得到pML104-MLS1 CRISPR-Cas9的质粒。

(c)制备酿酒酵母MKL6感受态，并将扩增好的MLS1上、下游500bp基因片段，pML104-MLS1质粒共同转入MKL6感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物MLS1-U-F，MLS1-D-R进行菌落PCR验证。

(d)将步骤(e)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL7。

引物序列：

MLS1-U-F：ccattgggccgatgaagttag

MLS1-U-R：cttagacagtctttccacttgttctttttcttaattcttttatgtgcttttactactttgttt

MLS1-D-F：aaagcacataaaagaattaagaaaaagaacaagtggaaagactgtctaag

MLS1-D-R：gatgccttcgccgtcga

MLS1-oligo2-F：CTAGCTCTAAAACacttggaacaacatggttta

MLS1-oligo1-R：gatctaaaccatgttgttccaagtGTTTTAGAGCTAG。

实施例5重构酿酒酵母工程菌MKL8

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物GDH2-U-F、GDH2-U-R扩增得到基因GDH2上游1000bp基因片段，采用引物GDH2-D-F、GDH2-D-R扩增得到基因GDH2下游1000bp基因片段。

(b)参照例1(b)(c)步骤类似的方法，采用引物GDH2-oligo2-F和GDH2-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-GDH2 CRISPR-Cas9的质粒。

(c)制备酿酒酵母MKL7感受态，并将扩增好的GDH2上、下游1000bp基因片段，pML104-GDH2质粒共同转入MKL7感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-GDH2U-F，YZ-GDH2D-R进行菌落PCR验证。

(d)将步骤(c)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL8。

引物序列：

GDH2-U-F：gagaagcaactagatcgtcgttc

GDH2-U-R：gaaaaagtggagccttttaagaatgggcccagatgaaggaactgc

GDH2-D-F：aaccagcagttccttcatctgggcccattcttaaaaggctccactttttccag

GDH2-D-R：gccgtcggaaacgatactttgg

GDH2-oligo2-F：CTAGCTCTAAAACggaacagactatacgaatac

GDH2-oligo1-R：gatcgtattcgtatagtctgttccGTTTTAGAGCTAG

YZ-GDH2U-F：ggtgtttctgaaggttgtgccg

YZ-GDH2D-R：ccagagacgtcaattctcgccc。

实施例6重构酿酒酵母工程菌的发酵培养

挑取固体YPD平板上的酿酒酵母工程菌单菌落，接种到在2ml YPD液体培养基中，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种初始OD为0.2的原则接入含有40mL大豆蛋白胨液体培养基的250mL圆底带挡板摇瓶内，10％正12烷直接覆盖于发酵液上方进行双相发酵，30℃，220rpm培养96h。发酵结束后，发酵结束后离心取有机相用于气相质谱联用检测。

过表达MVA途径关键基因，增加ERG10，ERG13，tHMG1，ERG12，ERG8，ERG9及IDI的基因拷贝数，将柠檬烯产量提升至46.96mg/L。采用P_HXT1动态调控ERG20，比较不同培养基下菌的生产能力，优化发酵培养基为大豆蛋白胨培养基，柠檬烯产量达到213.08mg/L。增加关键基因ERG20^WW与tLimS拷贝数，柠檬烯产量提升至459.59mg/L。敲除MLS1基因的菌株产量明显提高至521.4mg/L，在单独敲除MLS1基因基础上敲除GDH2基因产量提升至656.8mg/L。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种生产D-柠檬烯的酵母及其应用

<130> 3.7

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 1

agcaaatggt tcgaacaatg ttctagtcat ttgttgatgg atgattggat gttgagtacc 60

atgaccgtca ccattatgat acattaattg tgccattcta cccaaatcaa cagcacaacc 120

gatgaaatct ttaccgaatg gtgaatcctt agaaactctt tctgcgttca ttttcttcca 180

aacttcagca atcaaccatt taacatgttt tcttgcttca gcttctgatg cattgtaatc 240

agacatgtaa cattgcaaag actttggaac gtcacctctt gaaacttctt caacagatgt 300

acccaaatca tcagccaatc tcaaaacgaa tgaagaccat ctaaccaaat catggtactt 360

gtacaatgaa tcaactgttt ccttagtaaa agaatctgta actctaaaga aaatatgagt 420

taacatacat ggacctgaga tagattgcca tgagttttct aagtattctt ccaaagatgg 480

cttatgacca ccgtagaacc atcttgcttc aaccatgtac ttatcagcca aatcaaccca 540

agattgtctc aagtatggga taacgttaac acccttttcc ttcataacat cgtatgaagt 600

atcatcaacg aagttgttca aagccaagaa acacaattgc atgtaatctg gcaattgatc 660

gatagagttg atatcccatc ttctgatcaa atcagtgaat tgttccaatt cttccaaagt 720

accgtaaaca tcatagatat catcaataac tgtgatcaat gcgttaactt tacccatcat 780

gattcttgca gaagcatgtt gtcttggttc aataatacca gtgttccaga agtaacattc 840

aaccaatcta tctctagcaa atggcaactt ttcaacgaaa cctgtgtttc tccaccatct 900

aaaagattcc ttcaattctt cttggaattg tgcttgaacg atgttcaaat ccaagatagc 960

caattccaaa acaactggat tcatatctgg tctttttctg taccattcaa tccaaactgg 1020

tgcatttggt cttttaattc tccaatgcaa tgggatatcc aaagagtaag cgattctagt 1080

caacaagtca ccatcaacac caccttcgtt aaccttttct tccaagaact tagttgcgaa 1140

ttctctagca gattccaatg tagtttcacc ttctgtcaac aaaaatgaag cttcgtacaa 1200

ttgcaacaaa cctctagtat catctgacaa agattctttg aattcaccct cttcgttttt 1260

aaaagaatcg aaaacttctt gtgcaacttg gaaaccatgt tctctcaaca atctaaaagc 1320

caatgatgta gagtacaaat ctctttcttc ctttgggaat gggttcttgt agtaatgatg 1380

atccaaatat attgaagaca agatttcttt gaattcgttt tggaaatgat cagacaaacc 1440

cattctttgc aaatcatcga tcaattccaa ttgtctgatt tgatctgttt ctttttccaa 1500

ttccatctta accaaagtaa ccaattctga tgctctgata acatgcttat cttctttata 1560

atctgacaac aaagattgga tgaagttaac atcccatctt gatgggttgt agttaccaga 1620

tcttctttcc at 1632

<210> 2

<211> 1059

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 2

atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60

gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120

gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180

gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240

aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300

gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360

gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420

aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480

accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540

gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600

tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660

gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720

gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780

gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840

aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900

attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960

gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020

actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaatag 1059

<210> 3

<211> 1123

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 3

tgcaggtctc atctggaata taattccccc ctcctgaagc aaatttttcc tttgagccgg 60

aatttttgat attccgagtt ctttttttcc attcgcggag gttattccat tcctaaacga 120

gtggccacaa tgaaacttca attcatatcg accgactatt tttctccgaa ccaaaaaaat 180

agcagggcga gattggagct gcggaaaaaa gaggaaaaaa ttttttcgta gttttcttgt 240

gcaaattagg gtgtaaggtt tctagggctt attggttcaa gcagaagaga caacaattgt 300

aggtcctaaa ttcaaggcgg atgtaaggag tattggtttc gaaagttttt ccgaagcggc 360

atggcaggga ctacttgcgc atgcgctcgg attatcttca tttttgcttg caaaaacgta 420

gaatcatggt aaattacatg aagaattctc tttttttttt tttttttttt ttttttacct 480

ctaaagagtg ttgaccaact gaaaaaaccc ttcttcaaga gagttaaact aagactaacc 540

atcataactt ccaaggaatt aatcgatatc ttgcactcct gatttttctt caaagagaca 600

gcgcaaagga ttatgacact gttgcattga gtcaaaagtt tttccgaagt gacccagtgc 660

tctttttttt tttccgtgaa ggactgacaa atatgcgcac aagatccaat acgtaatgga 720

aattcggaaa aactaggaag aaatgctgca gggcattgcc gtgccgatct tttgtctttc 780

agatatatga gaaaaagaat attcatcaag tgctgataga agaataccac tcatatgacg 840

tgggcagaag acagcaaacg taaacatgag ctgctgcgac atttgatggc ttttatccga 900

caagccagga aactccacca ttatctaatg tagcaaaata tttcttaaca cccgaagttg 960

cgtgtccccc tcacgttttt aatcatttga attagtatat tgaaattata tataaaggca 1020

acaatgtccc cataatcaat tccatctggg gtctcatgtt ctttccccac cttaaaatct 1080

ataaagatat cataatcgtc aactagttga tatacgtaaa atc 1123

<210> 4

<211> 867

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 4

ttatagcatt ctatgaattt gcctgtcatt ttccacttca gaaaggtcat ctaattgctc 60

ccaccagttg aataagtaat tctcgcaaat aatcttaaac caaggcgtaa acttgtaact 120

tgggtcagca aacatagttt tcaaatcatt tggtgaaacc catttgaagt ctctaacttc 180

attgacgttt gggttgacag tcaagttttc tttagcgttg atcttataaa ataggatgta 240

atcaatttca tgttcacccc atggttcatt gcttggtgcc atgtaatgga ttctgtttaa 300

aaagtgaaac ttaccccttg tcttagtttc atcttctgga atacctaatt catgatctag 360

ttttctcacc gccgcagtaa tagcgccctt aatcttatcg tctagcttac ccttcaaacc 420

taattcgtca tcaatacata gtggatgaga gcagcatgtg ttagtccaaa gatcagggaa 480

agttattttt tcagtggctc tttgttgtaa aagtaattca ccttgttcat tgaaaataaa 540

gacggagaat gcacgatgta gtaaaccctt ttcaatattt tccattaaat gacaaacttt 600

cttggtaccg gcaccaatag cattatcgtc ccaatccaaa acaatacaat tttcattcat 660

taacttaatt tgctcctcat catgaccaga aaaacatgtt tctccgcttt cgtcatttga 720

cgtctcacta gatcgggtat taggtctttg ttgtaatgga ataatttcag gaaactcttc 780

caaaatgtct tcaggtgttt ggttttgcac taatttggcg taactagata ctgcaccatg 840

gggcatacta ttgttgtcgg cagtcat 867

<210> 5

<211> 1578

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 5

atggaccaat tggtgaaaac tgaagtcacc aagaagtctt ttactgctcc tgtacaaaag 60

gcttctacac cagttttaac caataaaaca gtcatttctg gatcgaaagt caaaagttta 120

tcatctgcgc aatcgagctc atcaggacct tcatcatcta gtgaggaaga tgattcccgc 180

gatattgaaa gcttggataa gaaaatacgt cctttagaag aattagaagc attattaagt 240

agtggaaata caaaacaatt gaagaacaaa gaggtcgctg ccttggttat tcacggtaag 300

ttacctttgt acgctttgga gaaaaaatta ggtgatacta cgagagcggt tgcggtacgt 360

aggaaggctc tttcaatttt ggcagaagct cctgtattag catctgatcg tttaccatat 420

aaaaattatg actacgaccg cgtatttggc gcttgttgtg aaaatgttat aggttacatg 480

cctttgcccg ttggtgttat aggccccttg gttatcgatg gtacatctta tcatatacca 540

atggcaacta cagagggttg tttggtagct tctgccatgc gtggctgtaa ggcaatcaat 600

gctggcggtg gtgcaacaac tgttttaact aaggatggta tgacaagagg cccagtagtc 660

cgtttcccaa ctttgaaaag atctggtgcc tgtaagatat ggttagactc agaagaggga 720

caaaacgcaa ttaaaaaagc ttttaactct acatcaagat ttgcacgtct gcaacatatt 780

caaacttgtc tagcaggaga tttactcttc atgagattta gaacaactac tggtgacgca 840

atgggtatga atatgatttc taaaggtgtc gaatactcat taaagcaaat ggtagaagag 900

tatggctggg aagatatgga ggttgtctcc gtttctggta actactgtac cgacaaaaaa 960

ccagctgcca tcaactggat cgaaggtcgt ggtaagagtg tcgtcgcaga agctactatt 1020

cctggtgatg ttgtcagaaa agtgttaaaa agtgatgttt ccgcattggt tgagttgaac 1080

attgctaaga atttggttgg atctgcaatg gctgggtctg ttggtggatt taacgcacat 1140

gcagctaatt tagtgacagc tgttttcttg gcattaggac aagatcctgc acaaaatgtt 1200

gaaagttcca actgtataac attgatgaaa gaagtggacg gtgatttgag aatttccgta 1260

tccatgccat ccatcgaagt aggtaccatc ggtggtggta ctgttctaga accacaaggt 1320

gccatgttgg acttattagg tgtaagaggc ccgcatgcta ccgctcctgg taccaacgca 1380

cgtcaattag caagaatagt tgcctgtgcc gtcttggcag gtgaattatc cttatgtgct 1440

gccctagcag ccggccattt ggttcaaagt catatgaccc acaacaggaa acctgctgaa 1500

ccaacaaaac ctaacaattt ggacgccact gatataaatc gtttgaaaga tgggtccgtc 1560

acctgcatta aatcctaa 1578

<210> 6

<211> 1197

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 6

atgtctcaga acgtttacat tgtatcgact gccagaaccc caattggttc attccagggt 60

tctctatcct ccaagacagc agtggaattg ggtgctgttg ctttaaaagg cgccttggct 120

aaggttccag aattggatgc atccaaggat tttgacgaaa ttatttttgg taacgttctt 180

tctgccaatt tgggccaagc tccggccaga caagttgctt tggctgccgg tttgagtaat 240

catatcgttg caagcacagt taacaaggtc tgtgcatccg ctatgaaggc aatcattttg 300

ggtgctcaat ccatcaaatg tggtaatgct gatgttgtcg tagctggtgg ttgtgaatct 360

atgactaacg caccatacta catgccagca gcccgtgcgg gtgccaaatt tggccaaact 420

gttcttgttg atggtgtcga aagagatggg ttgaacgatg cgtacgatgg tctagccatg 480

ggtgtacacg cagaaaagtg tgcccgtgat tgggatatta ctagagaaca acaagacaat 540

tttgccatcg aatcctacca aaaatctcaa aaatctcaaa aggaaggtaa attcgacaat 600

gaaattgtac ctgttaccat taagggattt agaggtaagc ctgatactca agtcacgaag 660

gacgaggaac ctgctagatt acacgttgaa aaattgagat ctgcaaggac tgttttccaa 720

aaagaaaacg gtactgttac tgccgctaac gcttctccaa tcaacgatgg tgctgcagcc 780

gtcatcttgg tttccgaaaa agttttgaag gaaaagaatt tgaagccttt ggctattatc 840

aaaggttggg gtgaggccgc tcatcaacca gctgatttta catgggctcc atctcttgca 900

gttccaaagg ctttgaaaca tgctggcatc gaagacatca attctgttga ttactttgaa 960

ttcaatgaag ccttttcggt tgtcggtttg gtgaacacta agattttgaa gctagaccca 1020

tctaaggtta atgtatatgg tggtgctgtt gctctaggtc acccattggg ttgttctggt 1080

gctagagtgg ttgttacact gctatccatc ttacagcaag aaggaggtaa gatcggtgtt 1140

gccgccattt gtaatggtgg tggtggtgct tcctctattg tcattgaaaa gatatga 1197

<210> 7

<211> 1476

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 7

ttatttttta acatcgtaag atcttctaaa tttgtcatcg atgttggtca agtagtaaac 60

accactttgc aaatgctcaa tggaaccttg aggtttgaag ttcttcttca aatgggcatt 120

ttctctcaat tcgatggcag cttcgtaatc ctttggagtt tcggtgattc tcttggctaa 180

tttgttagta atatctaatt ccttgataat atgttggacg tcaccaacaa ttttgcaaga 240

atatagagat gcagctaaac cggaaccgta agaaaataaa ccaacacgct tgccttgtaa 300

gtcgtcagat ccaacatagt ttaatagaga tgcaaaggcg gcataaacag atgcggtgta 360

catgttacct gtgtttgttg gaacaatcaa agattgggca actctctctt tgtggaatgg 420

cttagcaaca ttaacaaaag ttttttcaat gttcttatcg gttaaagatt cgtcataatc 480

gcgagtagct aattcggcgt caacttctgg gaacaattga ggattggctc tgaaatcgtt 540

atatagtaat ctaccgtatg attttgtgac caatttacag gttggaacat ggaaaacgtt 600

gtagtcgaaa tatttcaaaa cgttcaaagc atccgaacca gcgggatcgc taaccaaccc 660

tttagaaata gccttcttgg aataactctt gtaaacttga tcaagagcct tgacgtaaca 720

agttaatgaa aaatgaccat cgacgtaagg atattcgctg gtgaaatctg gcttgtaaaa 780

atcgtaggcg tgttccatgt aagaagctct tacagagtca aatacaattg gagcatcagg 840

accgatccac atagcaacag taccggcacc accggttggt cttgcggcac ccttatcgta 900

gatggcaata tcaccgcaaa ctacaatggc gtctctacca tcccatgcgt tagattcaat 960

ccagttcaaa gagttgaaca acgcgttggt accaccgtaa caggcattaa gcgtgtcaat 1020

accttcgacg tcagtgtttt caccaaacaa ttgcatcaag acagacttga cagacttgga 1080

cttgtcaatc agagtttcag taccgacttc taatctacca attttgttgg tgtcgatgtt 1140

gtaactcttg atcaacttag acaaaacagt tagggacatc gagtagatat cttctctgtc 1200

attgacaaaa gacatgttgg tttggcccag accaattgtg tatttacctt gagaaacgcc 1260

atcaaatttc tctagctcag attggttgac acattgagtt gggatgtaaa tttggatacc 1320

tttaataccg acattttgag gtctggtttt ttgttcagcg gtcttttgtt tttttagttc 1380

agtcatttgc aagtttgtat tgtgtaattg ttgttgcttt tgcggcctaa gtcttccttt 1440

aataccacac caacaaagtt tagttgagag tttcat 1476

<210> 8

<211> 1332

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 8

ttatgaagtc catggtaaat tcgtgtttcc tggcaataat agatcgtcaa tttgttgctt 60

tgtggtagtt ttattttcaa ataattggaa tactagggat ttgattttaa gatctttatt 120

caaatttttt gcgcttaaca aacagcagcc agtcccaccc aagtctgttt caaatgtctc 180

gtaactaaaa tcatcttgca atttcttttt gaagctgtca atttgctctt gagtaatgtc 240

tcttcgtaac aaagtcaaag agcaaccgcc gccaccagca ccggtaagtt ttgtggagcc 300

aattctcaaa tcatcgctca gatttttaat aagttctaat ccaggatgag aaacaccgat 360

tgagacaagc agtccatgat ttattcttat caattccaat agttgttcat acagttcatt 420

attagtttct acagcctcgt catcggtgcc tttacattta cttaacttag tcatgatctc 480

taagccttgt agggcacatt cacccatggc atctagaatt ggcttcataa cttcaggaaa 540

tttctcggtg accaacacac gaacgcgagc aacaagatct tttgtagacc ttggaattct 600

agtataggtt aggatcattg gaatggctgg gaaatcatct aagaacttaa aattgtttgt 660

gtttattgtt ccattatgtg agtctttttc aaatagcagg gcattaccat aagtggccac 720

agcgttatct attcctgaag gggtaccgtg aatacacttt tcacctatga aggcccattg 780

attcactata tgcttatcgt tttctgacag cttttccaag tcattagatc ctattaaccc 840

ccccaagtag gccatagcta aggccagtga tacagaaata gaggcgcttg agcccaaccc 900

agcaccgatg ggtaaagtag actttaaaga aaacttaata ttcttggcat gggggcatag 960

gcaaacaaac atatacagga aacaaaacgc tgcatggtag tggaaggatt cggatagttg 1020

agctaacaac ggatccaaaa gactaacgag ttcctgagac aagccatcgg tggcttgttg 1080

agccttggcc aatttttggg agtttacttg atcctcggtg atggcattga aatcattgat 1140

ggaccactta tgattaaagc taatgtccgg gaagtccaat tcaatagtat ctggtgcaga 1200

tgactcgctt attagcaggt aggttctcaa cgcagacaca ctagcagcga cggcaggctt 1260

gttgtacaca gcagagtgtt caccaaaaat aataaccttt cccggtgcag aagttaagaa 1320

cggtaatgac at 1332

<210> 9

<211> 1356

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 9

ttatttatca agataagttt ccggatcttt ttctttccta acaccccagt cagcctgagt 60

tacatccagc cattgaacct tagaaaatct tttgtcatta gcggtttgag ccctaagatc 120

aacatcttgc ttagtaatca ctgcaatggc gtcataacca ccagcaccag gtattaagca 180

agtaagaact ccttttaagg tctggcaatc atccaataag ctagtttgta cgggaggttc 240

gatatcggca ccagattctt tagttatttt tctaaaggaa cgtctaattg tggcaactgc 300

atctctaact tctgtgattt caggatactt ttgacaggta cagtcattcc tctcaagaga 360

ctcaaatatc tgatcgctgt aatcgtcatg agtctcgtgt aagcgatcta gtttagatag 420

tccatccata aatctagaat ttgcatgatc gagttctgta tatattttca agctttctgg 480

catatgcgaa tcataccaat tttttacctt ctggaccagt tttactgttt ctgaaccatt 540

cttaatatcg cccatccata aagttaatcc cgaaggtaaa tggttacttt taatcgtaat 600

attccagtct tcttcatcaa ccaaatgcgc cagtttactg ccgtaagtag cacttccaat 660

atctggcaaa ttagagatta atgcgggtgg gaatcttcta tatctgatag atccatatgc 720

tgccgccgct acatcaaacc cgcttccaat tttaccctga gcttgacaat gagcaacttg 780

tgctaaatta tgaataactt ctctatattt gtctacatta ttttccaggt ccgatacaaa 840

aaaggaggcc aaagctgtag ttaaaactgt gactaaacct gccgaggagc ccagccctgt 900

tttgggaact tcttcaattc tgtgcgaatg aaaactcaat cttctgttgc cacgatgttc 960

ggtaacgcta tcctcctgag aatggtaggc atcatcagag aaaatatcaa taacgaacaa 1020

gtttctattg cagtagtcgt ccatgttagg tttaaagtag ctaaatacgt tagcgataac 1080

tttttcaatg aaagggttct tagatccgcc tatcgaaaca ggaatgaagc cacttttagg 1140

acttatatgg tacagccact ccccatcttt aaattgttta cttttcacac gcacttcaaa 1200

cttatcagac ccttgcaatg aaccgtaagg atgggctaca gcatgcattc ttgccgataa 1260

tccgactaca aatgcttcat attttgtatc taaaactaaa tatccaccag ctagtaacgc 1320

tttccctggg gcactgaagg ctctcaactc tgacat 1356

<210> 10

<211> 1191

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 10

atgaccgttt acacagcatc cgttaccgca cccgtcaaca tcgcaaccct taagtattgg 60

gggaaaaggg acacgaagtt gaatctgccc accaattcgt ccatatcagt gactttatcg 120

caagatgacc tcagaacgtt gacctctgcg gctactgcac ctgagtttga acgcgacact 180

ttgtggttaa atggagaacc acacagcatc gacaatgaaa gaactcaaaa ttgtctgcgc 240

gacctacgcc aattaagaaa ggaaatggaa tcgaaggacg cctcattgcc cacattatct 300

caatggaaac tccacattgt ctccgaaaat aactttccta cagcagctgg tttagcttcc 360

tccgctgctg gctttgctgc attggtctct gcaattgcta agttatacca attaccacag 420

tcaacttcag aaatatctag aatagcaaga aaggggtctg gttcagcttg tagatcgttg 480

tttggcggat acgtggcctg ggaaatggga aaagctgaag atggtcatga ttccatggca 540

gtacaaatcg cagacagctc tgactggcct cagatgaaag cttgtgtcct agttgtcagc 600

gatattaaaa aggatgtgag ttccactcag ggtatgcaat tgaccgtggc aacctccgaa 660

ctatttaaag aaagaattga acatgtcgta ccaaagagat ttgaagtcat gcgtaaagcc 720

attgttgaaa aagatttcgc cacctttgca aaggaaacaa tgatggattc caactctttc 780

catgccacat gtttggactc tttccctcca atattctaca tgaatgacac ttccaagcgt 840

atcatcagtt ggtgccacac cattaatcag ttttacggag aaacaatcgt tgcatacacg 900

tttgatgcag gtccaaatgc tgtgttgtac tacttagctg aaaatgagtc gaaactcttt 960

gcatttatct ataaattgtt tggctctgtt cctggatggg acaagaaatt tactactgag 1020

cagcttgagg ctttcaacca tcaatttgaa tcatctaact ttactgcacg tgaattggat 1080

cttgagttgc aaaaggatgt tgccagagtg attttaactc aagtcggttc aggcccacaa 1140

gaaacaaacg aatctttgat tgacgcaaag actggtctac caaaggaata a 1191

<210> 11

<211> 668

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 11

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccca ttatcttagc ctaaaaaaac cttctctttg gaactttcag 180

taatacgctt aactgctcat tgctatattg aagtacggat tagaagccgc cgagcgggcg 240

acagccctcc gacggaagac tctcctccgt gcgtcctcgt cttcaccggt cgcgttcctg 300

aaacgcagat gtgcctcgcg ccgcactgct ccgaacaata aagattctac aatactagct 360

tttatggtta tgaagaggaa aaattggcag taacctggcc ccacaaacct tcaaattaac 420

gaatcaaatt aacaaccata ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt atttctgggg 480

taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat ggaaaagctg 540

cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct tattcaaatg 600

tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt caaggagaaa 660

aaactata 668

<210> 12

<211> 300

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 12

ttttgaggga atattcaact gttttttttt atcatgttga tgctctgcat aataatgccc 60

ataaatattt ccgacctgct tttatatctt tgctagccaa actaactgaa catagctaca 120

cattattttc agcttggcta ttttgtgaac actgtatagc cagtccttcg gatcacggtc 180

aacagttgtc cgagcgcttt ttggaccctt tcccttattt ttgggttaag gaaaatgaca 240

gaaaatatat ctaatgagcc ttcgctcaac agtgctccga agtatagctt tccaaaagga 300

<210> 13

<211> 252

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 13

ggccgcaaat taaagccttc gagcgtccca aaaccttctc aagcaaggtt ttcagtataa 60

tgttacatgc gtacacgcgt ctgtacagaa aaaaaagaaa aatttgaaat ataaataacg 120

ttcttaatac taacataact ataaaaaaat aaatagggac ctagacttca ggttgtctaa 180

ctccttcctt ttcggttaga gcggatgtgg ggggagggcg tgaatgtaag cgtgacataa 240

ctaattacat ga 252

<210> 14

<211> 166

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 14

gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta 60

tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct 120

ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctc 166

<210> 15

<211> 582

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 15

aagggaaaga tatgagctat acagcggaat ttccatatca ctcagatttt gttatctaat 60

tttttccttc ccacgtccgc gggaatctgt gtatattact gcatctagat atatgttatc 120

ttatcttggc gcgtacattt aattttcaac gtattctata agaaattgcg ggagtttttt 180

tcatgtagat gatactgact gcacgcaaat ataggcatga tttataggca tgatttgatg 240

gctgtaccga taggaacgct aagagtaact tcagaatcgt tatcctggcg gaaaaaattc 300

atttgtaaac tttaaaaaaa aaagccaata tccccaaaat tattaagagc gcctccatta 360

ttaactaaaa tttcactcag catccacaat gtatcaggta tctactacag atattacatg 420

tggcgaaaaa gacaagaaca atgcaatagc gcatcaagaa aaaacacaaa gctttcaatc 480

aatgaatcga aaatgtcatt aaaatagtat ataaattgaa actaagtcat aaagctataa 540

aaagaaaatt tatttaaatg caagatttaa agtaaattca ct 582

<210> 16

<211> 3279

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 16

tcaagcactt gcctccgctt ctctttttaa cccaccaata aattccaaga attttccaat 60

gttaacatcg ataccgttct ggtaaacaaa agtgcttgat aagtaactcg acagaagaac 120

tttcaaatag ctctctggaa tgttttccaa tacggactga ggcccagcaa catcaatcag 180

aatttttgga attattttat ccaacaatag gtagtttctt aattttagat cattgagcca 240

caactcttga gaagcaacta gatcgtcgtt caatttgttt atagtgaagg acaattggtt 300

tgaaatttct gaaatgtggg ttccatttag ttgattcaaa ttccataact gaccaaactc 360

taattcagca tttttctgaa ttcttgactg cacttctaca acgtacgact tgtacaacgc 420

agacctctca ccactaacat ctccaataaa tttgtgcacg aagtcgttat cgttaagcgc 480

tagtgaggcc aacacttcca ttgatgaaga tgtgacacca cctttgtttg cagaagcatc 540

tttgaacaga atacagccat gttcctccaa agcattttta gcaggttgcg ttataaatag 600

attggcaccc tccacaatat atggaatttt acatttccca gtcttttcgt caacaaaata 660

atgtagatta tttagagtaa ttgagtttgg tctaccaccg catggaacaa aaatgtcgac 720

atgatccaca aatttgaaaa tttgagtatg aaaggtgttt ctgaaggttg tgccgttagc 780

tacaattgta ccatttggta gcatgatatc cattgcatcc acagaaacaa aaaatccgtt 840

gtttgataat ttggaagtgt cgaaatcgga aatcattttc ctttcatgtg ccaagcggca 900

taattcatct ttatctaaac ctttaggatc acacaggaca cctgaaccgt ccagaattgc 960

caaataacat tcgtttggcg aagataaaag aatttcattg gatcccaaat caccatccgg 1020

accaccagtt tggaatttgt aaacagtaga atttgtcaag tttaaagttt cgtaaatttt 1080

attaacataa gcacgaacac ccagagaagt cataccatat tcgtcatggg gaataccacc 1140

caaagatggg gattttccag tcaaaaatga tttccaccat gggcagttcc tcacacgagc 1200

atggttagtt gcccaatcca cgaaaccagc agttccttca tctgggccaa aaaataatat 1260

ttcctccttt ggtaaaaggt tgacatagtt ttcctttaat ggatcgttga ttagaatgtc 1320

aatcattgca tccacatatt gggaaaaggc gacaaatgtc tggtcatgtt ctaccaatcc 1380

tgggttcaat aagatgacac ctttagagcc accctctgga atatccttat ttttacgttg 1440

ctgagtagag gccaattgat agttctcatc aataacgttc ttggaattca aatcataaat 1500

atcctgattc ctggaacaga ctatacgaat accgcccctt gcgatatctc tgaacctgat 1560

atggaaccct ttgaaagtat taccaacgac aaaaaatata ccatagggtg tctctggata 1620

ttcgaatttt gtcatcacca gggaaggatc taatctgaat gatattgcta cttttcttgt 1680

aataaagaaa tttgtcttca aaatagactt gttgaagatg ttcagtgttt tcaggatcaa 1740

caaatcaggt gaatcatttg gaatgaattt attcaagtaa gcttcgaact cttggtcatt 1800

cttaaaaggc tccacttttt ccagtctttg aaaagataat gtcttctcca tatctttagt 1860

actattatga taatagtgaa tttgagcaaa atttttatac aacttggaaa ttatagtgta 1920

atgcttcgac atgatgttga taatagtttg ctgagttaag gtttcatttc ttaactttct 1980

ttttaggttt tctacaatct ccaaaagagt agtatcatta cgcttaatgg tgatttgaga 2040

taaaaggttt tgataatcag agcctaaacg attaacaaaa tggttaatga atatagcacc 2100

aatatgagca tatatagctt ctttgggcga gaattgacgt ctctggtaaa cctcatggaa 2160

agaattgttt gggatagcgt atagcaatga agcttctctt tcaacctgtt tcaatgctgc 2220

ctccacatcg tgaagtagaa catcttccaa ttgctggttc tcgttcaaat aaacggaaaa 2280

gataatgatg tcatcatcct taacattaaa cgactctaaa tagaacttag aaggtttcaa 2340

cttgtaatag tggaacaaag agttcaaagc agagtaataa cgcttagtgg tgaatcgctt 2400

gtaagcgact aataacctaa tttcatcctt attttctacg gagcgagtag tcttaatgac 2460

aggaccttct ctttctttaa ccaacttaag taagagaccg tatagttttt tattttcgtt 2520

cgacgaaact ttgtacatgg tcttatcact aatcgattca atatcacctt tcagcaaatc 2580

ctgagaggaa atatctacgc cggctggatc atcattaggg taaacactct cataaacaaa 2640

agttagcttt aattcgcttt ctggagccca aaaagaaact aatctgcagt ttttttgaga 2700

cttgttatcc aggaaaaggt catcaatttc ggaatctaat tcataaggtg gacaagaatc 2760

atccatttca atcctatttt ttttgatggt atccttacca tgctccaaag tatcgtttcc 2820

gacggcgtca ctagcaaatt taaagttttt ttgctgagaa tcgcttatgc tgacaccagt 2880

attagattcc ataaagatgg catgattatc attagttata attttgtttt taatgctgaa 2940

tagccttggc tgaattccgt tgaatttgga cttcgcaaag aaatctagct ttgaagcata 3000

caaagaatgt atgatattcg agattaattg gggagattct ctcgagaaga acaaatcgtc 3060

aatacccaat gagttataaa accaatctac ttcttgttcg atcaaatcgt cgggaataaa 3120

cccttgctga tctagcaaat ctatcacttc ctctctctgc aggtccttac cgggaaaatc 3180

aaacacgtga tagtccgaca tggatgatat tgataaagaa gcaatatctg gtgtgttcag 3240

tgagtttaaa gcaccgcgat ttttgttatc aaaaagcat 3279

Claims

1.一种重组酵母，其特征在于，以酵母为出发菌，异源表达截短的柠檬烯合成酶基因tLimS，表达了法尼基焦磷酸突变体基因ERG20^ww，过表达内源MVA合成途径中关键基因和MVA途径相关基因；

所述法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20^ww是对法尼基焦磷酸合酶基因ERG20的96与127位氨基酸进行突变得到；

2.如权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母、异常汉逊氏酵母、粟酒裂殖酵母、黏红酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、解脂假丝酵母或巴斯德毕赤酵母。

3.如权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，所述截短的柠檬烯合成酶基因tLimS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述法尼基焦磷酸突变体基因ERG20^ww的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a合酶基因ERG13的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、所述甲羟戊酸激酶基因ERG12的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、磷酸甲羟戊酸ERG8的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶ERG19的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

4.如权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，所述法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20^ww通过与截短的柠檬烯合成酶基因tLimS采用双向诱导型启动子GAL1,10进行表达。

5.如权利要求4所述的重组酵母，其特征在于，所述双向诱导型启动子GAL1,10的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

6.如权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，所述重组酵母还将法尼基焦磷酸基因ERG20的启动子替换为葡萄糖感应型启动子。

7.如权利要求6所述的重组酵母，其特征在于，所述葡萄糖感应型启动子为P_HXT1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.如权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，所述重组酵母还敲除了乙醛酸循环的关键酶苹果酸合成酶基因MLS1，谷氨酸脱氢酶(NAD(+))基因GDH2。

9.如权利要求1-8中任一项所述的重组酵母在发酵生产D-柠檬烯中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为28-32℃，时间为80-120h。