CN102071153A

CN102071153A - 一种产d-柠檬烯的酵母工程菌及其构建方法

Info

Publication number: CN102071153A
Application number: CN 201010578421
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 刘继栋; 孙明雪; 周景文; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-12-08
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2011-05-25

Abstract

本发明公开了一种产d-柠檬烯的酵母工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明通过代谢工程改造，将来源于温州蜜柑（Citrusunshiu）的柠檬烯合成酶异源表达于酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1C)中，增加萜类合成途径——甲羟戊酸(MVA)途径碳代谢流，获得了一株高产d-柠檬烯的酵母工程菌CEN.PK2Limonene。与出发菌株CEN.PK2-1C相比，改造后酵母工程菌能够代谢生产d-柠檬烯，且d-柠檬烯反馈抑制明显降低，d-柠檬烯的产量可达13mg/L，具有很好的应用前景。

Description

一种产d-柠檬烯的酵母工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种高产d-柠檬烯的酵母工程菌及其构建方法，尤其是一种分子手段改造萜类生产(MVA)途径并异源引入d-柠檬烯合成酶，从而调控代谢流实现d-柠檬烯过量积累的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

柠檬烯(limonene)，又名宁烯。柠檬烯属链状萜烯醇类，有α-和β-两种异构体，还有左旋(d)、右旋(l)两种光异构体。在不同的来源中，多为异构体的混合物。消旋体存在于香紫苏油、茉莉油中，或是化学合成的柠檬烯中；左旋体d-柠檬烯存在于芳樟油、黄樟油、香柠檬油、薰衣草油、玫瑰木油等精油中。

柠檬烯是重要的香料，用于花香型香精、香水、香皂和芳香工业等，是香水香精、家化产品香精及皂用香精配方中使用频率最高的香料品种。柠檬烯也是重要的化工原料，如用作维生素E和异植醇的合成前体。目前以松节油合成d-柠檬烯是最主要的生产方式，但存在很多问题，如合成线路长、副产物多且无法控制、有害中间产物残留等，严重影响了其使用的安全性。利用发酵法生产d-柠檬烯和其它单萜类化合物及其衍生物是一种可行的技术思路。萜类化合物的生物合成均来源于共同的前体——异戊二烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)。在酿酒酵母中，IPP是由乙酰辅酶A经过甲羟戊酸(MVA)途径生成的。IPP可以进一步生成香叶基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP)和法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate，FPP)等异戊二烯二磷酸同系物，在特定的萜类合成酶和修饰酶作用下，最终形成种类繁多的萜类化合物。

代谢工程改造酿酒酵母生产d-柠檬烯国内未见有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种产d-柠檬烯的酵母工程菌。

所述工程菌含有外源d-柠檬烯合成酶基因。

所述d-柠檬烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述d-柠檬烯合成酶基因克隆于PRS304整合表达质粒上。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种产d-柠檬烯的酵母工程菌基因工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明的具体方案为：

1) 优化Genebank AB110637序列合成d-柠檬烯合成酶基因；

2) 将d-柠檬烯合成酶基因与载体连接得到重组表达载体；

3) 将重组表达载体转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)后得到酵母工程菌。

下面是本发明技术方案的具体描述：

质粒及酵母工程菌的构建：

根据NCBI公布的d-柠檬烯合成酶序列，经密码子优化后，进行全基因合成；将人工合成的d-柠檬烯合成酶克隆到整合质粒PRS304(购自德而宝生物技术有限公司，货号:YV8002)中上构建整合表达载体；将构建好的表达质粒转化酿酒酵母CEN.PK2-1C (MATa; ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3D 1; MAL2-8 ^C; SUC2)，所述菌株购买于德国EUROSCARF菌种保藏中心。

PCR(引物为F1:5’CGGGATCCGCGGCCGCAATGTCTTCTT3’; R15’CGGAATTCAGATCTTTAACCCTTCGTTCCAG3’)，验证阳性转化子（含有1.8kbp条带），对照未PCR出同样条带，证明该d-柠檬烯合成酶已经被整合到染色体上，提取cDNA进行PCR验证，也能PCR出同样大小条带，证明有表达柠檬烯能力。

酵母工程菌CEN.PK2 Limonene的种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸铵g，亮氨酸0.2 g，组氨酸0.2 g，尿嘧啶0.2 g，pH5.6。在制作斜面和平板时加入20 g琼脂，115 °C灭菌20 min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸铵g，亮氨酸0.4 g，组氨酸0.4 g，尿嘧啶0.4 g，pH5.6。在制作斜面和平板时加入20 g琼脂，115 °C灭菌20 min。

培养条件：从斜面中接种工程菌于20 mL的种子培养基中，放置于30°C转速为200 rpm的摇床上，培养20-24 h至对数中期，以10%的转接量转接入发酵培养基中，发酵培养40-46 h。

d-柠檬烯含量测定：气象色谱-质谱联用（GC-MS）

样品处理：顶空微固相萃取

仪器装置：VARIAN 1200LGC/MS-MS 气相色谱-串联质谱联用仪；

仪器分析条件：

气相色谱柱：VF17，30 m，0.32 mm×0.25 μm；

进样口温度250°C；不分流进样；

载气：Ae(氦气)，载气流速：1.3 mL/min；恒流方式；

色谱分离条件：程序升温：40°C维持3 min；5°C /min升温至120°C (第一阶段)；

10°C /min升温至250°C (第二阶段)；250°C维持5 min;

采集方式：全扫描，扫描范围 33—450 Amu；

电离方式：电子轰击(EI)；灯丝发射电流：50μA；检测器电压：1000V；

离子源温度200°C，接口温度250℃。

本发明通过代谢工程改造，将来源于Citrus unshiu的柠檬烯合成酶异源表达于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，增加萜类合成途径——甲羟戊酸(MVA)途径碳代谢流，获得了一株高产d-柠檬烯的酵母工程菌CEN.PK2 Limonene。与出发菌株CEN.PK2-1C相比，改造后酵母工程菌能够代谢生产d-柠檬烯，且d-柠檬烯反馈抑制明显降低，d-柠檬烯的产量可达13mg/L，具有很好的应用前景。本发明提供的构建方法简单，适于标准化。

具体实施方式

实例1 表达载体的构建

根据NCBI公布的d-柠檬烯合成酶序列，经密码子优化后，进行全基因合成；将人工合成的d-柠檬烯合成酶基因到整合质粒PRS304中，构建整合表达载体。转化大肠杆菌DH5a后，挑选转化子，提取质粒并经BamHI及SpeI酶切后，出现1.8kb条带，证明已经构建成功整合表达载体。

实施例2 酵母工程菌的构建

将构建好的表达质粒转化酿酒酵母CEN.PK2-1C (MATa; ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3D 1; MAL2-8 ^C; SUC2)。由于重组质粒上带有trp1基因，转化酿酒酵母CEN.PK2-1C感受态，涂布到含有组氨酸、亮氨酸、尿嘧啶的YNB (葡萄糖20 g/L，YNB 6.7 g /L，固体培养基加20 g/L琼脂，调节pH5.6，115°C灭菌20 min)，挑取转化后平板上正常生长的转化子，提取基因组PCR验证，出现1.8kb条带，对照未能PCR同样条带，证明成功整合到基因组上。

实例3发酵生产柠檬烯

种子培养基(g/L)：葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸铵g，亮氨酸0.2g，组氨酸0.2g，尿嘧啶0.2g，pH5.6。在制作斜面和平板时加入20琼脂，115 °C灭菌20 min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸铵，亮氨酸0.4g，组氨酸0.4g，尿嘧啶0.4g，pH5.6。在制作斜面和平板时加入20琼脂，115 °C灭菌20 min。

从斜面中接种酵母工程菌于20 mL的种子培养基中，放置于30°C转速为200 rpm的摇床上，培养20-24 h至对数中期，以10%的转接量转接入发酵培养基中，发酵培养48-56 h，摇瓶发酵30°C，200rpm，d-柠檬烯产量为6mg/L。

实施例 4 发酵生产柠檬烯

发酵参数：转速400rpm， pH4.5，通气量1.5vvm，3L罐上发酵添加碳酸钙后流加碳源，流加量为2.5g/L.h，发酵结束后d-柠檬烯产量达到13mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种产d-柠檬烯的酵母工程菌及其构建方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1827

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因表达。

<400> 1

atgtcttctt gcattaatcc ctcaaccttg gctacctctg taaatggttt caaatgtctt 60

cctcttgcaa caaatagagc agccatcaga atcatggcaa aaaataagcc agtccaatgc 120

cttgtcagca ccaaatatga taatttgaca gttgatagga gatcagcaaa ctaccaacct 180

tcaatttggg accatgattt tttgcagtca ctgaatagca actatacgga tgaaacatac 240

aaaagacgag cagaagagct gaagggaaaa gtgaagacag cgattaagga tgtaaccgag 300

cctctggatc agttggagct gattgataat ttgcaaagac ttggattggc ttatcatttt 360

gagcctgaga ttcggaacat attgcgtaat atccacaacc ataataaaga ttataattgg 420

agaaaagaaa atctgtatgc aacctccctt gaattcagac ttcttagaca acatggctat 480

cctgtttctc aagaggtttt cagtggtttt aaagacgaca aggtaggctt catttgtgat 540

gatttcaagg gaatactgag cttgcatgaa gcctcgtatt acagcttaga aggagaaagc 600

atcatggagg aggcctggca attcaccagt aagcatctta aagaaatgat gatcaccagc 660

aacagcaagg aagaggatgt atttgtagca gaacaagcga agcgggcgct ggagctccct 720

ctgcattgga aaaaagtgcc tatgttagag gcaaggtggt tcatacacgt ttatgagaaa 780

agagaggaca agaaccacct tttacttgag ctcgctaagt tggagtttaa cactttgcag 840

gcaatttacc aggaagaact taaagacatt tcagggtggt ggaaggatac aggtcttgga 900

gagaaattga gctttgcgag gaacaggttg gtagcgtcct tcttatggag catggggatc 960

gcgtttgagc ctcaattcgc ctactgcagg agagtgctca caatctcgat agccctaatt 1020

acagtgattg atgacattta tgatgtctat ggaacattgg atgaacttga gatattcact 1080

gatgctgttg cgaggtggga catcaattat gctttgaagc accttccggg ctatatgaaa 1140

atgtgttttc ttgcccttta caactttgtt aatgaatttg cttattacgt tctcaaacaa 1200

caggattttg atatgcttct gagcataaaa catgcatggc ttggcttaat acaagcctac 1260

ttggtggagg cgaaatggta ccatagcaag tacacaccga aactggaaga atacttggaa 1320

aatggattgg tatcaataac gggcccttta attataacga tttcatatct ttctggtaca 1380

aatccaatca ttaagaagga actggaattt ctagaaagta atccagatat agttcactgg 1440

tcatccaaga ttttccgtct gcaagatgat ttgggaactt catcggacga gatacagaga 1500

ggggatgttc cgaaatcaat ccagtgttac atgcatgaaa ctggtgcctc ggaggaagtt 1560

gctcgtgaac acatcaagga tatgatgaga cagatgtgga agaaggtgaa tgcatacaca 1620

gccgataaag actctccctt gactcgaaca actgctgagt tcctcttgaa tcttgtgcga 1680

atgtcccatt ttatgtatct acatggagat gggcatggtg ttcaaaacca agagactatc 1740

gatgtcggct ttacattgct ttttcagccc attcccttgg aggacaaaga catggctttc 1800

acagcatctc ctggcaccaa aggctga 1827

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 2

cgggatccgc ggccgcaatg tcttctt 27

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 3

cggaattcag atctttaacc cttcgttcca g 31

Claims

1.一种产d-柠檬烯的酵母工程菌，其特征在于含有外源d-柠檬烯合成酶基因。

2.权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于所述d-柠檬烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于所述d-柠檬烯合成酶基因克隆于PRS304质粒。

4.权利要求1所述酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

优化Genebank AB110637序列合成d-柠檬烯合成酶基因；

将d-柠檬烯合成酶基因与载体连接得到重组表达载体；

将重组表达载体转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C)后得到酵母工程菌。

5.权利要求1所述酵母工程菌应用于d-柠檬烯生产。