CN111286482A - 一种快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用，其中，该工程菌共表达甲羟戊酸途径的基因——ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、GPPS2和GES。由于我们不仅对以上九个基因进行了大肠杆菌偏好密码子优化（优化后的序列分别为SEQ.No1至SEQ.No9），而且在每个基因前都加了独立的强启动子T7和终止子，所以该工程菌生产香叶醇所用的时间更短，发酵24h后香叶醇即可达到150mg/L，无论是在发酵时间上还是在发酵成本上，该工程菌都明显优于已报到的产香叶醇的工程菌株，这为香叶醇的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

Description

一种快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种工程菌及其构建方法和应用，具体涉及一种快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
香叶醇是无环单萜类化合物，天然存在于天竺葵、芸香草、香茅、玫瑰花等250多种植物中，具有温和典雅的玫瑰香气。香叶醇广泛用于花香型日用香精、食用香精、酯类香料等，也是制造香草醇、香草醛、柠檬醛、羟基香草醛、紫罗兰酮和维生素A的原料。除此之外，香叶醇还具有广泛的药理作用，具有提高机体免疫功能等；香叶醇广泛用于抗菌和驱虫，是市场中驱蚊、驱虫产品中的重要成分。此外，由于香叶醇能量高、吸湿性低、挥发性相对较弱的特性，它还被认为是一种优于乙醇的汽油替代品。可见，香叶醇在香精香料产业、药物产业等领域都具有广泛的应用，市场需求量大。
从天然植物中提取挥发油，仍是目前市场上香叶醇的主要来源之一。但是，植物中香叶醇含量很低，导致提取成本过高，且提取出来后与其他挥发油成分较难分离。另外，天然植物容易受到人工培植时季节气候变化、植物病害和环境的影响，天然香叶醇的数量和价格难维持稳定，供应不能得到保证。在现有技术中，香叶醇的生产采用以香叶醇为底物进行化学合成的方法，化学合成多存在环境污染、合成步骤复杂、得率低等问题，且化学合成产物＂非天然＂，这样作为食品添加剂，消费者的认可度低。面对香叶醇传统合成方法的瓶颈及市场对天然香叶醇需求的日益增长的问题，以廉价、可再生的生物质为原料合成香叶醇己成为发展趋势。
生物法合成香叶醇具有催化效率高、产物专一性强、反应条件温和、绿色经济等优势。随着合成生物学技术的进步，以环境友好的微生物发酵生产香叶醇成为发展趋势。自然界中存在两条途径合成萜类前体的途径：一条是甲基赤藓糖途径（methylerythritol-4-phosphate pathway），即MEP途径，存在于植物、大多数细菌和原生动物体内；另一条是甲羟戊酸途径（Mevalonate pathway），即MVA途径，除了存在于植物和少数细菌中外，还存在于古细菌和大多数的真核生物体内。目前，研究较多的是MVA途径。
在酿酒酵母中，MVA途径的起始反应物为乙酰辅酶A，在乙酰辅酶A硫解酶（ERG10）和羟甲基戊二酰辅酶A合成酶（ERG13）的共同催化下形成甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA），接着HMG-CoA在3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（Hmgr）的催化下产生甲羟戊酸（MVA）。甲羟戊酸在甲羟戊酸激酶（Mevalonate kinase，ERG12）的催化下生成甲羟戊酸-5-磷酸，甲羟戊酸-5-磷酸进一步在甲羟戊酸-5-磷酸激酶（ERG8）的催化下生成甲羟戊酸-5-焦磷酸。甲羟戊酸-5-焦磷酸在脱羧酶（ERG19）的催化下生成异戊烯基焦磷酸IPP，IPP在异戊二烯基焦磷酸异构酶（IDI1）的催化下异构化形成丙烯基焦磷酸DMAPP。IPP和DMAPP在法呢基焦磷酸合成酶（ERG20）的催化下，一分子的IPP和一分子的DMAPP合成一分子的香叶基焦磷酸GPP，GPP为单萜类化合物的合成前体，然后通过相应的催化酶在GPP分子基础上添加不同数量的IPP单元，形成其他萜类化合物的合成前体法呢基焦磷酸FPP、香叶基香叶基焦磷酸GGPP等。单萜前体GPP和倍半萜前体FPP的合成均是由同一个酶ERG20连续催化生成的。在这一反应过程中，GPP作为过渡中间产物，很少从ERG20催化位点上脱离，而是作为底物直接进行FPP的合成。由于ERG20兼具GPP和FPP合成酶的双重活性以及顺序催化的特性，导致胞内游离的前体GPP含量极低，阻碍了构建酿酒酵母单萜的合成。酿酒酵母本身不能产生香叶醇，需要通过构建具有香叶醇合成酶GES的工程菌形成香叶醇。
目前，香叶醇等单萜合成的瓶颈问题主要体现在：
1）关键前体GPP供应不足限制了酿酒酵母高产单萜；
2）酿酒酵母对单萜物质的耐受性差，香叶醇的浓度达到150mg/L会显著抑制酿酒酵母细胞的生长；
3）内源性转化限制了酿酒酵母内单萜物质产量的提高。
可见，在酿酒酵母中，乙酰辅酶A是MVA途径的起始反应物，其充足供给是提高萜类化合物产量的重要保证。然而，乙酰辅酶A的分布在细胞质、线粒体、过氧化物酶体和细胞核中，呈现高度区室化，且各区室之间不能相互穿梭利用。只有增加细胞质中乙酰辅酶A的合成，才可能有效促进香叶醇的产量提高。因此，利用酿酒酵母生产香叶醇具有一定的局限性。相比于香叶醇在大肠杆菌中的产量，香叶醇在酿酒酵母中的产量仍相对较低。随着合成生物学技术的进步，以环境友好的重组大肠杆菌发酵生产香叶醇成为发展趋势。利用大肠杆菌生物法合成具有催化效率高、产物专一性强、反应条件温和、绿色经济等优势。
目前，已报道的产香叶醇的大肠杆菌工程菌，是通过把pACYCDuet-1-Trc pro-mvaE-mvaS-GPPS2-GES和pTrcHis2B-T7 pro-ERG12-ERG8-ERG19-IDI1共转化到受体菌——大肠杆菌BL21 DE3中。该工程菌在发酵48h后，发酵液中香叶醇的量即可达223.24mg/L，优于目前报道的产香叶醇的酿酒酵母菌株。然而，由于香叶醇具有挥发性，在工业生产中，长时间的发酵降低了香叶醇的经济价值和社会效益。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌及其构建方法，本发明的第二个目的在于提供该快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌在产香叶醇中的应用方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌，其特征在于，前述大肠杆菌工程菌共表达甲羟戊酸途径的基因，前述共表达甲羟戊酸途径的基因包括：
乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、脱羧酶基因ERG19、异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和香叶醇合成酶基因GES共九个基因，这九个基因都进行了大肠杆菌偏好密码子优化，并且每个基因都具有独立的强启动子T7和终止子，其中，这九个基因密码子优化后的序列分别为SEQ.No1、SEQ.No2、SEQ.No3、SEQ.No4、SEQ.No5、SEQ.No6、SEQ.No7、SEQ.No8和SEQ.No9。
前述的快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌，其特征在于，前述大肠杆菌工程菌以大肠埃希式菌BL21 DE3 作为受体菌。
前述的快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌，其特征在于，前述大肠杆菌工程菌采用三个表达载体共表达前述九个基因，其中：
前述乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1引入至第一表达载体；
前述甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8和脱羧酶基因ERG19引入至第二表达载体；
前述异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和香叶醇合成酶基因GES引入至第三表达载体。
前述的快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌，其特征在于，前述第一表达载体为pCOLADuet-1-T7pro-ERG10-T7ter-T7pro-ERG13-T7ter-T7pro-tHMG1-T7ter；前述第二表达载体为pTrcHis2B-T7pro-ERG19-T7ter-T7pro-ERG8-T7ter-T7pro-ERG12-T7ter；前述第三表达载体为pACYCDuet-1-T7pro-IDI1-T7ter-T7pro-GPPS2-T7ter-T7pro-GES-T7ter。
构建前述的快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1引入至第一表达载体；
步骤2：将甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8和脱羧酶基因ERG19引入至第二表达载体；
步骤3：将异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和香叶醇合成酶基因GES引入至第三表达载体；
步骤4：将前述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体共同转化到受体菌中获得工程菌。
前述的快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌在产香叶醇中的应用，其特征在于，以葡萄糖为原料，在有氧条件诱导下，利用前述的大肠杆菌工程菌生物合成香叶醇。
前述的应用，其特征在于，利用前述的大肠杆菌工程菌生物合成香叶醇的方法具体包括以下步骤：
步骤1：将前述的大肠杆菌工程菌置于LB液体培养基中，30-37℃震荡培养，获得新鲜的种子液；
步骤2：按1%接种量将上述种子液接种到新鲜的发酵培养基中，25-30℃震荡培养，直至菌液OD600达到0.8；
步骤3：向上述菌液中加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG，25-30℃震荡诱导培养24h；
步骤4：将发酵液离心，取上清液，用乙酸乙酯对上清液中的香叶醇进行萃取，取上层有机相进行氮吹浓缩。
前述的应用，其特征在于，在步骤2中，前述发酵培养基的配方如下：
酵母浸粉6g/L、磷酸氢二钾3.5g/L、一水合柠檬酸1.4g/L、柠檬酸铁铵0.13g/L、硫酸镁17.6mmol/L，用去离子水定容至1L，pH调至7.0，灭菌后每100mL发酵培养基中再加10mL浓度为8g/L的无菌葡萄糖和1.67mL微量元素。
前述的应用，其特征在于，前述微量元素的种类和含量具体如下：
七水硫酸锌2.9g/L、钼酸铵3.7g/L、硼酸24.7g/L、五水硫酸铜2.5g/L、氯化锰15.8g/L。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明构建的大肠杆菌工程菌
该工程菌整合了乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、脱羧酶基因ERG19、异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和香叶醇合成酶基因GES共九个基因，我们不仅对以上九个基因进行了大肠杆菌偏好密码子优化，而且在每个基因前都加了独立的强启动子T7和终止子，所以该工程菌生产香叶醇所用的时间更短，在摇瓶中发酵24h后，发酵液中的香叶醇即可达到150mg/L的较高浓度，与已报道的产香叶醇的大肠杆菌工程菌48h产香叶醇223.24mg/L的量相比，无论是在发酵时间上，还是在发酵成本上，本发明构建的工程菌明显优于已报到的产香叶醇的大肠杆菌工程菌株，这为香叶醇的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益，应用前景好。
（2）本发明提供的利用该大肠杆菌工程菌生产香叶醇的方法
不涉及高温、高压操作，经济、绿色，从根本上解决了目前香叶醇从植物或精油中分离提取或化学合成的不足，提供了一条利用可持续的方法合成香叶醇。
附图说明
图1是本发明构建的大肠杆菌工程菌发酵12h、24h、48h后香叶醇的气相色谱-质谱检测图；
图2是ERG10基因产物与载体pCOLADuet-1连接，其中，A是ERG10的PCR产物电泳图谱，B是ERG10基因与pCOLADuet-1载体连接后产生的重组载体PL287-34的PCR产物电泳图，Marker由上至下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
图3是ERG13基因产物与重组载体PL287-34连接，其中，A是ERG13的PCR产物电泳图谱（左起第一、二泳道），B是ERG13基因与PL287-34连接后产生的重组载体PL288-A-51的PCR产物电泳图，Marker由上至下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
图4是tHMG1基因产物与重组载体PL288-A-51连接，其中，A是HMG1基因的PCR扩增产物电泳图谱（左起第三、四泳道），B是HMG1基因与PL288-A-51连接后重组载体的PCR产物电泳图，Marker由上至下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
图5是ERG19基因产物与载体pTrcHis2B连接，其中，A是ERG19基因的PCR产物电泳图谱，B是ERG19基因与pTrcHis2B连接后的重组载体PL295-72的PCR产物电泳图，阳性克隆为Marker左边第1个，Marker由上至下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
图6是ERG8基因与载体PL295-72连接，其中，A是ERG8基因的PCR产物电泳图谱（Marker左侧第五、六泳道），B是ERG8基因序列与PL295-72连接后产生的PL295-27重组载体的PCR产物电泳图，阳性克隆为Marker左边第1个，Marker由上至下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
图7是ERG12基因产物与PL295-27连接，其中，A是ERG12基因的PCR产物电泳图谱（Marker左侧第三、四泳道），B是ERG12基因与PL295-27连接后产生重组载体的PCR产物电泳图，阳性克隆为Marker右侧第10个（设计一对约850bp的内引物用于检测），Marker由上至下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
图8是IDI1基因产物与pACYCDuet-1连接，其中，A是IDI1基因的PCR产物电泳图谱，B是IDI1基因与pACYCDuet-1连接后产生的重组载体PL290-42的PCR产物电泳图，阳性克隆为Marker左边第9个（设计一对约650bp内引物用于检测），Marker由上至下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
图9是GPPS2基因产物与PL290-42连接，其中，A是GPPS2基因的PCR产物电泳图谱（左起第五、六泳道），B是GPPS2基因序列与PL290-42连接后产生的载体PL291-A-39的PCR产物电泳图，阳性克隆为左起第1个（设计一对约750bp的内引物用于检测，Marker由上至下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
图10是GES基因产物与PL291-A-39的连接，其中，A是GES基因的PCR产物电泳图谱，B是GES基因序列与PL291-A-39连接后产生重组载体后的PCR产物电泳图，阳性克隆为左起第1个（设计一对约250bp的内引物用于检测），Marker由上至下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
图11是香叶醇标准品的色谱图；
图12是香叶醇标准品的特征离子峰质谱图；
图13是发酵24h后发酵液中香叶醇的色谱图；
图14是发酵24h后发酵液中香叶醇的特征离子峰质谱图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、构建快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌
1、将共表达甲羟戊酸途径（Mevalonate pathway）的基因进行大肠杆菌偏好密码子优化
本发明涉及的共表达甲羟戊酸途径的基因共有九个，具体包括：乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、脱羧酶基因ERG19、异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和香叶醇合成酶基因GES，其中：
前七个基因均来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ATCC 4040002），其中，乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10的核苷酸序列GenBank登录号为CP036481.1；羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13的核苷酸序列GenBank登录号为CP036475.1；羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1的核苷酸序列GenBank登录号为CP036475.1，甲羟戊酸激酶基因ERG12的核苷酸序列GenBank登录号为AJS99582.1；磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8的核苷酸序列GenBank登录号为AJS99594.1；脱羧酶基因ERG19的核苷酸序列GenBank登录号为KZV08671.1，异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1的核苷酸序列GenBank登录号为AJU24162.1；
后两个基因均来源于植物，其中，香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2来源于冷衫针茅（Abies grandis），其核苷酸序列GenBank登录号为AF513112.1，香叶醇合成酶基因GES来源于天竺，其核苷酸序列GenBank登录号为AY362553.1。
我们对这九个基因都进行了大肠杆菌偏好密码子优化，其中：
（1）乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10密码子优化后的序列为SEQ.No1；
（2）羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13密码子优化后的序列为SEQ.No2；
（3）羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1密码子优化后的序列为SEQ.No3；
（4）甲羟戊酸激酶基因ERG12密码子优化后的序列为SEQ.No4；
（5）磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8密码子优化后的序列为SEQ.No5；
（6）脱羧酶基因ERG19密码子优化后的序列为SEQ.No6；
（7）异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1密码子优化后的序列为SEQ.No7；
（8）香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2密码子优化后的序列为SEQ.No8；
（9）香叶醇合成酶基因GES密码子优化后的序列为SEQ.No9。
我们不仅对这九个基因都进行了大肠杆菌偏好密码子优化，而且在每个基因上都加了独立的强启动子T7和终止子。
我们通过将酵母中从乙酰辅酶A合成通路的基因（乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、脱羧酶基因ERG19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1）以及植物中合成香叶醇途径的基因（香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和香叶醇合成酶基因GES）整合进大肠杆菌，在工程菌株中重构了香叶醇合成的通路，并且通过对以上九个外源基因进行大肠杆菌偏好密码子优化以及在每个基因前都加上独立的强启动子T7，因此当大肠杆菌工程菌共表达上述九个基因后，在较短时间内生产的香叶醇便能达到较高浓度，经试验，发酵24h后发酵液中的香叶醇即可达到150mg/L的较高浓度。
2、将表达甲羟戊酸途径的基因连接到表达载体上
本发明共涉及三种表达载体，其中：
乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1引入至第一表达载体，在本具体实施例中，第一表达载体具体为：
pCOLADuet-1-T7pro-ERG10-T7ter-T7pro-ERG13-T7ter-T7pro- tHMG1-T7ter；
甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8和脱羧酶基因ERG19引入至第二表达载体，在本具体实施例中，第二表达载体具体为：
pTrcHis2B-T7pro-ERG19-T7ter-T7pro-ERG8-T7ter-T7pro-ERG12-T7ter；
异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和香叶醇合成酶基因GES引入至第三表达载体，在本具体实施例中，第三表达载体具体为：
pACYCDuet-1-T7pro-IDI1-T7ter-T7pro-GPPS2-T7ter-T7pro-GES-T7ter。
（1）第一表达载体pCOLADuet-1-T7pro-ERG10-T7ter-T7pro- ERG13-T7ter-T7pro-tHMG1-T7ter的构建
①根据终载体pCOLADuet-1的图谱设计NcoI--BamHI为插入位点并合成引物，使用高保真酶扩增得到目的片段ERG10（图2A），其中，所合成的引物的编号和序列具体如下：
PL287F：5’-ATGCCATGGGCATGTCTCAGAACGTT-3’
PL287R：5’-CGCGGATCCATCCGGATATAGTTC-3’
将用NcoI--BamHI酶切的ERG10片段与同样用NcoI--BamHI酶切的载体pCOLADuet-1进行体外连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂布于LB平板，37℃恒温培养箱中培养16-20h。将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定（图2B）。阳性菌液进一步测序验证，重组载体命名为PL287-34。
②根据终载体PL287-34的图谱设计BamHI--SalI为插入位点并合成引物，使用高保真酶扩增得到ERG13片段（图3A），其中，所合成的引物的编号和序列具体如下：
PL288F：5’-CGCGGATCCTAATACGACTCACTA-3’
PL288R：5’-GACGTCGACATCCGGATATAGTTC-3’
将用BamHI--SalI酶切的目的基因与同样用BamHI--SalI酶切的载体PL287-34进行体外连接、转化，将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定（图3B）并进行序列验证，重组载体命名PL288-A-51。
③根据终载体PL288-A-51的图谱设计SalI--XhoI为插入位点并合成引物，使用高保真酶扩增得到目的片段（图4A），其中，所合成的引物的编号和序列具体如下：
PL289F ：5’-CGCGTCGACTAATACGACTCACTA-3’
PL289R ：5’-CCGCTCGAGTTAGGATTTAATGCA-3’
将用SalI--XhoI酶切的目的基因与同样用SalI--XhoI酶切的载体PL288-A-51（去磷酸化载体）进行体外连接、转化，将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定（图4B）并测序验证。
（2）第二表达载体pTrcHis2B-T7pro-ERG19-T7ter-T7pro-ERG8-T7ter-T7pro- ERG12-T7ter的构建
①根据终载体pTrcHis2B的图谱设计KpnI--SalI为插入位点并合成引物，使用高保真酶扩增得到ERG19片段（图5A），其中，所合成的引物的编号和序列具体如下：
PL295F：5’-CGGGGTACCTAATACGACTCACTA-3’
PL295R：5’-GACGTCGACTTATTCTTTCGGCAG-3’
将用KpnI--SalI酶切的目的基因与同样用KpnI--SalI酶切的载体pTrcHis2B进行体外连接、转化，将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定（图5B）并测序验证，重组载体命名为PL295-72。
②根据载体PL295-72的图谱设计XhoI--KpnI为插入位点并合成引物，扩增得到ERG8片段（图6A），其中，所合成的引物的编号和序列具体如下：
PL294F：5’-CCGCTCGAGTAATACGACTCACTA-3’
PL294R：5’-CGGGGTACCATCCGGATATAGTTC-3’
将用XhoI--KpnI酶切的目的基因与用XhoI--KpnI酶切的载体PL295-72进行体外连接、转化，将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定（图6B）并测序验证，重组载体命名为PL295-27。
③根据终载体PL294-27的图谱设计BamHI--XhoI为插入位点并合成引物，扩增得到ERG12片段（图7A），其中，所合成的引物的编号和序列具体如下：
PL293F：5’-CGCGGATCCGATGTCTCTGCCGTTC-3’
PL293R：5’-CCGCTCGAGATCCGGATATAGTTC-3’
将用BamHI--XhoI酶切的目的基因与同样用BamHI--XhoI酶切的载体PL294-27进行体外连接、转化，将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定（图7B）并测序验证。
（3）第三表达载体pACYCDuet-1-T7pro-IDI1-T7ter-T7pro-GPPS2-T7ter-T7pro- GES-T7ter的构建
①根据终载体pACYCDuet-1的图谱设计NcoI--BamHI为插入位点并合成引物，扩增得到IDI1片段（图8A），其中，所合成的引物的编号和序列具体如下：
PL290F：5’-ATGCCATGGGCATGACCGCTGACAAC-3’
PL290R：5’-CGCGGATCCATCCGGATATAGTTC-3’
将用NcoI--BamHI酶切的目的基因与同样用NcoI--BamHI酶切的载体pACYCDuet-1进行体外连接、转化，将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定（图8B）并测序验证，重组载体命名为PL290-42。
②根据终载体PL290-42的图谱设计BglII--SalI为插入位点并合成引物，扩增得到GPPS2片段（图9A），其中，所合成的引物的编号和序列具体如下：
PL291F：5’-GGAAGATCTTAATACGACTCACTA-3’
PL291R：5’-GACGTCGACATCCGGATATAGTTC-3’
将用BglII--SalI酶切的目的基因与用BamHI--SalI酶切的载体PL290-42进行体外连接、转化，将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定（图9B）并测序验证，重组载体命名为PL291-A-39。
③根据终载体PL291-A-39的图谱设计BglII--PvuI为插入位点并合成引物，扩增得到GES片段（图10A），其中，所合成的引物的编号和序列具体如下：
PL292F：5’-GGAAGATCTCATGTCTTGCGCTCGT-3’
PL292R：5’-TCGCGATCGTTACTGGGTGAAGAA-3’
将用BglII--PvuI酶切的目的基因与同样用BglII--PvuI酶切的载体PL291-A-39进行体外连接、转化，转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定（图10B）并测序验证。
3、将表达载体导入到受体菌中
以大肠埃希式菌BL21 DE3 作为受体菌，将上述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体共同转化到受体菌——大肠埃希式菌BL21 DE3 中，获得工程菌，具体的：
分别吸取5μL第一表达载体pCOLADuet-1-T7pro-ERG10-T7ter-T7pro-ERG13-T7ter-T7pro- tHMG1-T7ter、第二表达载体pTrcHis2B-T7pro-ERG19-T7ter-T7pro-ERG8-T7ter-T7pro-ERG12-T7ter和第三表达载体pACYCDuet-1-T7pro-IDI1-T7ter-T7pro-GPPS2-T7ter-T7pro-GES-T7ter于100μl处于冻结状态下的大肠杆菌感受态（E. coli BL21 DE3 ）中，冰浴20min；然后在42℃水浴中热激60s，立即放入冰浴中静止2min；加入600μL的LB培养基，在37℃、180rpm摇床上活化1h；菌液5000rpm离心30s弃大部分上清，留100μL上清与菌混合，均匀涂在含有卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养12h，挑取单克隆进行验证，保存在-80℃用于后续发酵。
二、利用上述快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌生产香叶醇
1、菌种活化
将保存在-80℃的单克隆进行小瓶活化，5mL LB 液体培养基（Kan+Cm+Amp），37℃摇床，180rpm摇菌培养，获得新鲜的种子液。
2、接种
将新鲜制备的种子液按1%接种量接种到新鲜发酵培养基中，25℃摇床，180rpm摇菌培养，直至菌液OD600达到0.8。
发酵培养基的配方如下：酵母浸粉6g/L、磷酸氢二钾（K2HPO4）3.5g/L、一水合柠檬酸（C6H8O7·H2O）1.4g/L、柠檬酸铁铵（C6H8FeNO7）0.13g/L、硫酸镁（MgSO4）17.6mmol/L，用去离子水定容至1L，pH调至7.0，灭菌后每100mL发酵培养基中再加10mL浓度为8g/L的无菌葡萄糖和1.67mL微量元素，微量元素的种类和含量具体如下：七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）2.9g/L、钼酸铵（(NH4)6Mo7O24）3.7g/L、硼酸（H3BO3）24.7g/L、五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）2.5g/L、氯化锰（MnCl2·4H2O）15.8g/L，使用前过0.22μm的水膜。
3、诱导表达
当菌液浓度长至0.8时，向菌液中加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG进行诱导发酵培养，25℃，180rpm摇菌培养24h。
4、萃取
取发酵液100mL，然后8000g离心10min，取上清液，向上清液中加入等体积乙酸己酯，在涡旋振荡器上锅旋混匀10min，然后静置10min，取上层有机相进行氮吹浓缩至2mL，待检测。
三、对发酵产物进行检测
利用气相色谱（GC）或气相色谱-质谱（GC-MS）对发酵产物进行检测。
在本具体实施例中，利用气相色谱-质谱（GC-MS）对发酵产物进行检测，具体采用Agilent7890B型气相色谱-四极杆质谱联用仪，色谱柱Rxi-5ms为30m×0.25mm×0.25um柱，检测器分别为氨火焰离子化检测器和四级杆质谱检测器，柱室温度50℃起步以10℃/min的速度升温至250℃，保温5min，气化室和检测室温度均为250℃。
香叶醇标品的色谱图如图11所示，该标品的特征离子峰质谱图如图12所示。
本发明构建的大肠杆菌工程菌发酵24h后，产物中香叶醇的色谱图如图13所示，该产物中香叶醇的特征离子峰质谱图如图14所示。
由图13和图14所示的检测结果可知，本发明构建的大肠杆菌工程菌发酵24h后，发酵产物峰的保留时间与香叶醇标品峰的保留时间（图11）相同，且质谱图中的特征离子峰与香叶醇标品的特征离子峰（图12）一致。
随后，我们利用谱图库得到了香叶醇的结构式，确定了该发酵产物为香叶醇。
我们在发酵的第12h、24h和48h，分别取样，对发酵产物中的香叶醇进行气相色谱-质谱检测，检测结果如图1所示。由图1可知，本发明构建的大肠杆菌工程菌在发酵的第24h就能产大量的香叶醇。与已有的产香叶醇的大肠杆菌工程菌相比，发酵时间整整缩短了一半（已有的产香叶醇的大肠杆菌工程菌发酵时间是48h），并且与已有的产香叶醇的大肠杆菌工程菌在48h内产香叶醇的量相差不是很多（已有的产香叶醇的大肠杆菌工程菌发酵培养48h后产物浓度达到高峰，具体为223.24mg/L，本发明构建的工程菌发酵培养24h后产物浓度即达到高峰，具体为150mg/L），综合发酵时间和成本，本发明构建的工程菌比目前已报到的大肠杆菌工程菌株具有明显优势，这为香叶醇的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益，应用前景好。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所
中科海洋微生物产业技术研究院（山东）有限公司
<120> 一种快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 936
<212> RNA
<213> ERG10密码子优化后的序列(ERG10)
<400> 2
agccagaacg acacgcaccg ccgaccccga aggcagccca gggcccccaa aaccgcggaa 60
cggggcggcc gaaagggccg gcaaagccgg aacggacgcc aaagaccgac gaaacaccgg 120
aacgcgcgca accgggcagg cccggccgca gggccggcgc ggcgcaacca cacggccacc 180
gaacaaaggc gccgcagaaa gcacaccggg gccagcacaa agcggaacgc gacggggcgg 240
gggcgaacag accaacgccc gacacagccg gcgccggcgg gcaaacggca gaccgcggga 300
cggggaacgg acggcgaacg acgcacgacg gcggcagggg cacgcgaaaa agcgccggac 360
gggacacacc cggaacagca ggacaaccgc acgaacacca gaaaccagaa accagaaaga 420
aggaaacgac aacgaaacgc cggaccacaa aggccgggaa accggacacc caggaccaaa 480
gacgaagaac cggccgcgca cggaaaaacg cgcgccgacc gccagaaaga aaacggaccg 540
accgcgcaac gccccgacaa cgacgggcgc gcgaccggcg aaaaagcgaa agaaaaaaac 600
cgaaaccgcg gcacacaaag ggggggaagc gccaccagcc ggcgaccacc gggcccgccg 660
gcgccgaaag ccgaaacacg cggacgaaga cacaaccgag acaccgaaca acgaagcgcc 720
ggggccggaa caccaaaacc gaaacggacc cgcaaagaac gacgggggcg gccgggcacc 780
cgcggggccg ggccggggac ccgcgcaccg cagcaggaag gggaaaacgg ggcgcacgca 840
acgggggggg gcccacgacg aaaaaacaac accgcgagca aaacagcaaa ccccggggcc 900
caaacgggcg agggggcgaa aggaggaaca accgga 936
<210> 2
<211> 1233
<212> RNA
<213> ERG13密码子优化后的序列(ERG13)
<400> 2
aaacgaccac aaggggaagg agcggaaaca acccccagaa aaagaacaag aaggagaaac 60
cagaaacgca ccaaacggcg ggcggacaaa ggcgcgcgcc gcagaaacag cagcagcgca 120
caacaccaac cgcagagacc gaacgaaaaa acagaaaacc gcgaacagaa aacccgccgc 180
agaacgggac aaaggaccag acacacccga cccaggcgaa ccagcgaacg gaaaaacgac 240
gggccaggga aaacaccacg gcgggcagac caacagccga acgaccggaa gacacaccag 300
ccgaccgcgc aaacgacaaa cacaacacga caccaacaaa acggcgcgga agggaccgaa 360
acccgacgac aaacaaacga aacgcgagca gcgcgggaaa acaccgacgg aaggacgaca 420
cccgaacgcg cacggggacc aacgccgcaa cccgaacgga cgaacaacgc gggacggcgg 480
acgcacgggc gggacacgca cacgacaaag ggcgccgccg accgggggcg gaccggcagg 540
gacggccaga cgcgccgacg gcgacagcgc ggccacagga acacgcacga ccacaaaccg 600
gaccacccga aacccgacgg acggcacccc gaccgcacga aagccggacc aggacaaaca 660
ccaaaaaagc accaaaggcg gcgacccggc ggcgacgccg aacgcgaaaa ccgacacaac 720
gccacgccga ccgcaaacgg accaaacacg gcgcgcgaca acgacccggc aacccgcagc 780
gcccggaagg acgcgaacgg cacccggaca cgacgaaccg accgacaaaa acacgaaaaa 840
acccgaacgg caaaccgcca caaagaacgg gccagccgac gccgaccaac accggaacag 900
acaccgccga cgcgccgccc gcgaacacgg gcgacgaccg cagggaaacg gggcgccacg 960
gcggcggcgc ccgaccgcaa aacggggacg cagcacacac aaagaacgga cacaccaaca 1020
aacggcaaac gacaccgaaa ccccgaaaga cacgaagcgc acgaacgcgg aaaacgccac 1080
cgaaaaaaaa ccaaaccgca gggcacgaac accgcagcgg gggacaccga caaacacgac 1140
gacaaaccgc gcacgacgaa aaaaaacacc gcgagcaaaa cagcaaaccc cggggcccaa 1200
acgggcgagg gggcgaaagg aggaacaacc gga 1233
<210> 3
<211> 1194
<212> RNA
<213> HMG1密码子优化后的序列(HMG1)
<400> 3
aaacgaccac aaggggaagg agcggaaaca acccccagaa aaagaacaag aaggagaaac 60
caggaccaag ggaaaacgaa gcaccaagaa gcacgcccga caaaaggcca caccagaacc 120
aaaaaacagc acggacgaaa gcaaaagaca cgcgcaacga gccacaggac ccacacagga 180
ggaagagacc cgcgaagaaa gcggaaagaa aaacgccaga agaaagaagc aaaagaggga 240
aaacaaaaca agaagaacaa agaggcgcgc cggacacgga agaccgacgc ggagaaaaaa 300
agggaacacg agagcgggcg gacgaggaag gcccaaggca gaagcccgaa gcacgacgac 360
caaaaaaaag acacgaccgc gaggcgcggg aaaagaagga cagccgcccg gggaaggccc 420
cggacgagga cacacaaacc aaggcaacac agagggggga gccgccagcg ggcgaaggca 480
acaagcggcg ggggcaacaa cgaacaagga ggagacaaga ggcccagagc cgcccaacga 540
aaagacgggc cgaagaagga gaccagaaga gggacaaaac gcaaaaaaaa gcaaccacac 600
aagagcacgc gcaacaacaa acgcagcagg agaacccaga gaagaacaac acgggacgca 660
agggagaaag acaaagggcg aaaccaaaag caaaggagaa gagaggcggg aagaaggagg 720
gcccgcggaa cacgaccgac aaaaaaccag cgccacaacg gacgaaggcg ggaagaggcg 780
cgcagaagca caccgggagg cagaaaagga aaaaggagcc gcagggagga acagcaagaa 840
ggggacgcaa ggcgggcggg ggaaacgcac agcagcaaag gacagcgcgg caaggacaag 900
accgcacaaa aggaaagcca acgaaacaga gaaagaaggg acgggagaga accgaccagc 960
caccacgaag aggaccacgg ggggacgcag aaccacaagg gccagggaca agggaagagg 1020
cccgcagcac cgcccggacc aacgcacgca aagcaagaaa ggccggccgc ggcagggaaa 1080
ccaggcgccc agcagccggc caggcaaagc aagacccaca acaggaaacc gcgaaccaac 1140
aaaaccaaca aggacgccac gaaaaacgga aagagggccg caccgcaaaa ccaa 1194
<210> 4
<211> 1053
<212> RNA
<213> ERG12密码子优化后的序列(ERG12)
<400> 4
agccgccgcc gacccgcccg ggaaagacac cgggaacacc gcgacaacaa accggcggcg 60
ccgcgccgcg accaccgcga ccgaaccgcc cggacaccac gaacggaccc cggacaccca 120
accacaaagg cacaacgacc aacgcacacc gaagaccagg aacccagaaa cggcaaagcc 180
agcaggcacc gacggcgcca ggaacggccg cggacccgcg cggccagcgc gaacccacac 240
cacgcgccgc ccgacagcgg ccggcccgca cgcaaaaaca caaacccgaa acacccgccg 300
acgggcggcg ggccgccacc gccggccggc aggcaccggg ggcgacggca acgaccggaa 360
aaacgcgaaa acgacaaaca cacgaaccag gggccacggg aaaaagcacc acggaccccg 420
cggacgacaa cgcggcacca cggaacgccg cgcgaaaaag acccacaacg gaccacaaca 480
ccaacaacca aaccggacga ccccggcacc cgagaccgac cacacccgac ccgcgcacca 540
aagaccgggc cggcggcgga ccgaaaaacc cggaagagaa accgaccgga cgcaggggaa 600
gcgccgcagg gcggaaacag accaaacgca aagcaaagga ccgacgacga agcggaaacc 660
aacaacgaac gacgaacagc gcggaacgac cgacaaccac ggcgcggcac gggccacccg 720
ggcggaacga caaaaaccgc gacgaccgcg acggcaccaa acgaccgggc gggggggggc 780
ccgacccgcg cgcggacaca cccaggaaca gacgacccaa aaaaaaacgc aggacgaccc 840
acgaaacccg aaaccgaccg ggggaccggg cgccgcgcgc aaaaaccgaa caaagaccga 900
aaacaaaccg gccagcgcga aaacaaaacc accaccaaac agcagacgac gaccgcgcgc 960
cgggaacacc aaccgccggg acccaacacc gcgagcaaaa cagcaaaccc cggggcccaa 1020
acgggcgagg gggcgaaagg aggaacaacc gga 1053
<210> 5
<211> 1129
<212> RNA
<213> ERG8密码子优化后的序列(ERG8)
<400> 5
aaacgaccac aaggggaagg agcggaaaca acccccagaa aaagaacaag aaggagaaac 60
cagcgaacgc ggcccgcccg ggaaagccgc ggcggggacc ggcggacacc aaaacgaagc 120
cggggcgcgc cgagcacgcg gccacccgac ggccgcaggg cgacaaacga agcggaaaca 180
aacagcaaag acgggaaggc gaccacaccc cgaagcggca cccggaagca cggggcaaaa 240
acccgcacga aaaagaaagc aacgacagca ccaaaccgaa caggacgaca cgcaaccgaa 300
ccgcgacgac acccgacgac gcaccaccca ggaagaccga ccgaacaccg ggaaccgcgc 360
gcccacccac cgacgaagaa gccgaaaacc ggcgggccgc ggcggaccgc gaccaccgcc 420
ggccccgcga ccggaaaaca acggacaaaa ccggaagacc acaaccggcc agggccacgc 480
caggccaggg aaaacggcgg cgacggcgcg cgcacggcac cgaccgcgcc cgccggccga 540
ccaaccgccg gacacggcgc accacggcaa acggccaccg ggacgaagaa gacggaacac 600
accacaaaca accaccgccg cggcgacccg ggaggggaca caaaaacggc gaaaccgaaa 660
cggcagaaag aaaaacggac gacccacagc cggaaccgaa aacacaccga acggaccacg 720
caacccgcag gacggcgcaa acggaccgcg cacgaaaccc acgacgacac cgaccagacc 780
gaaccggaac gaacgacgca ccgccagaaa acccggaaac accgaagcgg acgcggcacc 840
accgcgcccg aaaacaccaa agaacgggcg acacgaaccg ccggcagacc ccgcggacga 900
cgccagaccc gaaagggcga ccgccgaccc ggggcgggga cgacgcacgc gacaccaaac 960
aggacggacc gcggccagac cgcaacgaca aacgccaaag cagggcggac gacccaggcg 1020
acgggggcga aagaaaaaga cccggaaacc accggacaaa aacaccgcga gcaaaacagc 1080
aaaccccggg gcccaaacgg gcgagggggc gaaaggagga acaaccgga 1129
<210> 6
<211> 935
<212> RNA
<213> ERG19密码子优化后的序列(ERG19)
<400> 6
aaacgaccac aaggggaagg agcggaaaca acccccagaa aaagaacaag aaggagaaac 60
cagaccgaca ccgccgaccg cccggaacac gcacccgaaa acggggaaac ggacaccaaa 120
cgaaccgccg accaacccac cgacccgcca ggacgaccgc gacccgaccc gcgcaccgcc 180
cggaacgaac ggacacccgg gcgaacggga accgcaccac gacaacgaac gacccagaac 240
gccgcggacc gcgcagcgcg aaagaaagga acaaagacgc ccgccgaccc gccagggaaa 300
cgcacacgcg aaaacaaccc cgaccgcgcg gcggcccgcg cggcgcgccg gcgcacgcaa 360
acgaccagcg ccgcagcacc cgaaacccga cgccgaaagg cggcgcgccg ccgcggggac 420
ggcgggaaag ggaaagcgaa gacggcacga ccaggcgcag acgcgacccg acggccgcag 480
agaaagcgcg cgggcgacac aaaaaagacg ccacccaggg agcagcgacc ggcacccgaa 540
cgcaaagaac gacgaacacg gccaaagagg cgaagagcga aagcacggaa aaagaccgca 600
cccgcaaaga aaccagagga ccaaccccac gcaccgcccg acagccccgc cgacacagaa 660
cgacacccaa acgacaccgg gccacaccac aaccagcacg ggaaaccacg gcacacccga 720
cgcggccgaa cgcgcgacac cggcgaaaac gaacaaacgc gccacacaaa cgcggcgccg 780
gggggacaaa aaacaccacc gaacagcgga agccaaccac cagcgaacca accaccgccg 840
gaacggaccg gaacgcagaa agacggccgg accgacccag gggcggccgc aggaaaccaa 900
cgaaccgacg acgcaaaacc ggcgccgaaa gaaaa 935
<210> 7
<211> 749
<212> RNA
<213> IDI1密码子优化后的序列(IDI1)
<400> 7
agaccgcgac aacaaccagc cgcaggcgcg aagccacgca aacggcagaa ccagaccccg 60
gaagacaccg gaagaacccg gaaacacccg cgcagcagcg ccgaacaccc gccgaaaccc 120
aacgacgaac gggaaaccgc ccggcacgac gaagaacaga caaacgagaa cgaaaacgca 180
cgcggacggg acgacaacgc acgggcggac caaaaaaggc caccgaggaa aacacgaaaa 240
aggcgcgcac cggcccgcac caacgaacag gggaacgcgc gcagcagcgg caccgaaaaa 300
acacccccgg accgggacca acaccgcgcc cacccgcggc acgacgacga acgggcgaaa 360
ggaaacggac gacaaaacaa agggcacacc gcgcgcgaaa cggaccacga acgggacccg 420
gaagacgaaa ccaaaacccg ggaaaccacc cgaaccgacc acacaggccc gcaacgaacc 480
ggggggaaca cgaaacgaca caccgcacaa aacaacgcaa agaaaaccga ccgaacccga 540
acgaacgaag cggaccaaag ggcccgaacg accgaaaacc agcgcgaccc gcacaaacac 600
cccgggcaaa acacgcgaaa acaccgcaac gggggaacag cggacgaccg cgaaggaaaa 660
cgaccgcaga ccaccgagcg aacaccgcga gcaaaacagc aaaccccggg gcccaaacgg 720
gcgagggggc gaaaggagga acaaccgga 749
<210> 8
<211> 968
<212> RNA
<213> GPPS2密码子优化后的序列(GPPS2)
<400> 8
aaacgaccac aaggggaagg agcggaaaca acccccagaa aaagaacaag aaggagaaac 60
caggcaccgc aggcaccagg gacaacggag gcgccgccac acccgcaccc gacccccgcg 120
aaaccgccac gggccacccc cgaggcgcaa cgggaacaag ggcgcgcggg accaaacgaa 180
acgccacaaa aacccggccc gccaacgcac cggccagcgc gaacccgccg cagaaaggaa 240
aaaagcggaa cgaccaacaa aacaggacca aagcagaccg aacgaagccg aacaaagcac 300
ccgcgcgacc cgcagaaaac acgaacagcg acccgcggcg gggaaacggc gccggcggca 360
cgcgcgcgaa cggggggacc gaagaacggc acccgaccgc gcgcacgaaa gaccacacca 420
gccgagcacg acgaccgccg gcacgacaac gacgaccgcg cgggaaaccg accaaccaca 480
aaaccgggaa gacaccgcga ccgcggaacg ccgcaccacg ccgaacacac gcgcacccaa 540
aaccggggcg accgaccgcg aggcgaacgg gcggcaccgg cgaagggagg gggcagaggg 600
acacgccgaa gggacccgca cgaccgcaga cccggaagga ccacaccaca aaaccgcagc 660
gcggaagccg ggcgggcaca cgggggccga aacgacgaac ggccgcgacg ccggcgggcg 720
cgccagggga cgacaccgga cgaccaaacc gacgaacggg aaaaccgcgg aaagaccgac 780
cgacaaagca ccacccgaaa cgagggcgga aaaagcaaag aaccgacgaa cgcgaaccgg 840
caaagggaac gcgccgaccc ggaaagcgcc cgcgcgggcg gcgacacggc ccgcagaaca 900
acaccgcgag caaaacagca aaccccgggg cccaaacggg cgagggggcg aaaggaggaa 960
caaccgga 968
<210> 9
<211> 1277
<212> RNA
<213> GES密码子优化后的序列(GES)
<400> 9
aggaggaaaa aaagcgcgcc gacaccgacc cgccgaccgc gcaaaaccca ccagcgggac 60
acccacaccc ggccgaccgc cgcgccgcgc accccgcggc cgcagccgcg ccaccccgcg 120
acaacgggac aacccagcga aaaacacccg cagcacagga agaacccaaa cgcggaaacc 180
gcggaagaaa ccacccgaaa cgcagcgaac gacaccgaac ggaaaaacga aacgacgaca 240
acaccagcag cgggacggac accgaagacg cacaacgcgc gcgcccgcca ccgggaagaa 300
gaccgcaccg cgccgcgccg cgcgcgcaca acggacgaaa ccccggaaac ccgaaacaaa 360
gacgaacggg aaacgacgaa cgacacccgg gcgcgccgac gaagccaacc gggggcggga 420
agaaaccgga agaagcagga acgcgaagcc gcgcgcgccg cgaaccggcg cccgcgcacg 480
ggaaggccag gccggacgcc gcgcaccgcg aggccgcgga agccgcgcac gaacagacgg 540
aaacagcgac cacgacggga ccgcggaacg gcaccggaca caaccaggca ggccagcacc 600
agcgaacgac cgaaacaccg ggggaaagaa cgggcgggac aagccagccg gcggaccgcc 660
gcggaagccc gggaccgggc gcgccggaac cgaaaacccg cgacgaacgg caaagcacca 720
ccgcggacga cgacaccgac accacgggaa aggacgaccg accgcaccga cgcaccgcgg 780
ggaccggaag caggaaggcg ccggaaacag aaaacgcaca ggccgacaac accaccaacg 840
aaggcacaaa gcgcggacac cggcgacgcg cgaaccgaaa caccggacga cagacgaagg 900
caggaagaag caaaggcaac ggggcgcccg aaacggaaga aacacgagaa gggaagcacc 960
gcgggcacag gccgccacac cccgacggga agggacccac cagaacccag cgcacccaga 1020
aaccgacccg aaagccgcgc ggcgaccgcg cggggacgac cgggaccgca aagaagaaca 1080
ggaacgggga ccggccgcgc agcgcagaaa gaaaaaccga ccgaagaaga agccgccgac 1140
cggaagaaac aaaggcgggc ggaccgaacg ggaacggaca acaaaaaccg ccgcgcacac 1200
aaaggccgaa caggccggcc cagggacaaa cacgaccagg acaccacccc ggacaacacg 1260
gacgccgcca cccagaa 1277

Claims (9)

1.一种快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌共表达甲羟戊酸途径的基因，所述共表达甲羟戊酸途径的基因包括：
乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、脱羧酶基因ERG19、异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和香叶醇合成酶基因GES共九个基因，这九个基因都进行了大肠杆菌偏好密码子优化，并且每个基因都具有独立的强启动子T7和终止子，其中，这九个基因密码子优化后的序列分别为SEQ.No1、SEQ.No2、SEQ.No3、SEQ.No4、SEQ.No5、SEQ.No6、SEQ.No7、SEQ.No8和SEQ.No9。
2.根据权利要求1所述的快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌以大肠埃希式菌BL21 DE3作为受体菌。
3.根据权利要求1所述的快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌采用三个表达载体共表达所述九个基因，其中：
所述乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1引入至第一表达载体；
所述甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8和脱羧酶基因ERG19引入至第二表达载体；
所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和香叶醇合成酶基因GES引入至第三表达载体。
4.根据权利要求3所述的快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述第一表达载体为pCOLADuet-1-T7pro-ERG10-T7ter-T7pro-ERG13-T7ter-T7pro-tHMG1-T7ter；所述第二表达载体为pTrcHis2B-T7pro-ERG19-T7ter-T7pro-ERG8-T7ter-T7pro-ERG12-T7ter；所述第三表达载体为pACYCDuet-1-T7pro-IDI1-T7ter-T7pro-GPPS2-T7ter-T7pro-GES-T7ter。
5.构建权利要求1至4任意一项所述的快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1引入至第一表达载体；
步骤2：将甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8和脱羧酶基因ERG19引入至第二表达载体；
步骤3：将异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和香叶醇合成酶基因GES引入至第三表达载体；
步骤4：将所述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体共同转化到受体菌中获得工程菌。
6.权利要求1至4任意一项所述的快速产香叶醇的大肠杆菌工程菌在产香叶醇中的应用，其特征在于，以葡萄糖为原料，在有氧条件诱导下，利用权利要求1至4任意一项所述的大肠杆菌工程菌生物合成香叶醇。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用权利要求1至4任意一项所述的大肠杆菌工程菌生物合成香叶醇的方法具体包括以下步骤：
步骤1：将权利要求1至4任意一项所述的大肠杆菌工程菌置于LB液体培养基中，30-37℃震荡培养，获得新鲜的种子液；
步骤2：按1%接种量将上述种子液接种到新鲜的发酵培养基中，25-30℃震荡培养，直至菌液OD600达到0.8；
步骤3：向上述菌液中加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG，25-30℃震荡诱导培养24h；
步骤4：将发酵液离心，取上清液，用乙酸乙酯对上清液中的香叶醇进行萃取，取上层有机相进行氮吹浓缩。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤2中，所述发酵培养基的配方如下：
酵母浸粉6g/L、磷酸氢二钾3.5g/L、一水合柠檬酸1.4g/L、柠檬酸铁铵0.13g/L、硫酸镁17.6mmol/L，用去离子水定容至1L，pH调至7.0，灭菌后每100mL发酵培养基中再加10mL浓度为8g/L的无菌葡萄糖和1.67mL微量元素。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微量元素的种类和含量具体如下：
七水硫酸锌2.9g/L、钼酸铵3.7g/L、硼酸24.7g/L、五水硫酸铜2.5g/L、氯化锰15.8g/L。
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