CN112481178A - 氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法 - Google Patents

氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法。本发明公开了一株以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌株，属于合成生物学或者代谢工程领域。本发明将4‑香豆酰辅酶A连接酶基因4cl、二聚酮合酶基因dcs、姜黄素合成酶基因curs3以及乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1组成合成途径转入大肠杆菌MG1655(DE3)中，并对合成途径进行模块划分及优化，得到了产量最优的一株工程菌。通过对发酵条件的优化，最终使得该菌株在以对氨基肉桂酸为底物发酵48h后，氨基双去甲氧基姜黄素的产量达到33mg/L。本发明为高活性氨基双去甲氧基姜黄素的工业化生产和应用奠定了基础。

Description

氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法
技术领域
本发明属于代谢工程领域，涉及一种氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法；尤其涉及一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的高产菌株构建方法以及发酵条件优化。
背景技术
姜黄素类化合物是中药姜黄中具有药理作用的主要活性成分，根据其结构的不同，主要分为三种：姜黄素(curcumin，C21H20O6)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin，C20H18O5)以及双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin，C19H16O4)。姜黄素类化合物具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗氧化以及抗心脑血管活性，另一方面姜黄素在食品工业中也被广泛用作于食品添加色素。因此该类化合物具有广阔的应用前景。
根据前期课题组的研究，一种氨基双去甲氧基姜黄素(NH2-bisdemethoxycurcumin，NBMC)具有更高于天然双去甲氧基姜黄素的抗炎能力。该化合物在此之前没有相关报道，因此不能使用天然的植物提取方法来获得。目前关于姜黄素类化合物的微生物发酵方法已逐渐成为该类化合物获取的主要研究对象，具有一定的研究基础。而氨基双去甲氧基姜黄素的获取，在一定程度上也为后续获得氨基姜黄素等其他衍生产物提供了可能。
本发明是以对氨基肉桂酸为底物，通过对合成途径进行模块划分及优化，使其获得较高的氨基双去甲氧基姜黄素的产量，并通过发酵条件的优化进一步提升了最终的产量，为后续的的大规模工业化生产提供了研究基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法；本发明提供了一株高产氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，并通过发酵条件的优化进一步提高菌株的产量，为其工业化生产奠定了基础。
本发明的目的是通过以下技术手段实现的。
第一方面，本发明提供一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，在大肠杆菌MG1655(DE3)中表达了合成途径中所需的关键酶：4-香豆酰辅酶A连接酶4CL、二聚酮合酶DCS、姜黄素合成酶CURS3以及乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1。
编码所述4-香豆酰辅酶A连接酶4CL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述二聚酮合酶DCS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述姜黄素合成酶CURS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
作为本发明的一个实施方案，通过同时使用3个载体对所述5条基因进行共表达。所述载体在以下4个拷贝数不同、抗性不同的载体中随机组合：pRSFDuet-1(拷贝数>100，Kan)、pETDuet-1(拷贝数～40，Amp)、pCDFDuet-1(拷贝数20-40，Spe)和pACYCDuet(拷贝数10-12，Chl)。
作为本发明的一个实施方案，4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl单独在一个质粒上；二聚酮合酶基因dcs和姜黄素合成酶基因curs3在同一个质粒上；乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1在同一个质粒上。
作为本发明的一个实施方案，4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl单独在pCDFDuet-1质粒或pACYCDuet质粒上。
第二方面，本发明提供了一种所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)对所述关键酶的5条基因进行大肠杆菌密码子优化并全合成；
(2)通过酶切酶连方法构建4CL表达质粒：pCDF-4CL和pACYC-4CL；
(3)通过酶切酶连方法构建DCS和CURS3表达质粒：pRSF-DCS-CURS3、pET-DCS-CURS3、pCDF-DCS-CURS3和pACYC-DCS-CURS3；
(4)通过酶切酶连方法构建AccBC和DtsR1表达质粒：pRSF-AccBC-DtsR1、pET-AccBC-DtsR1、pCDF-AccBC-DtsR1和pACYC-AccBC-DtsR1；
(5)分别取步骤(2)、(3)、(4)中的表达质粒，按不同抗性进行组合，各组合分别电转化入MG1655(DE3)感受态细胞中；
(6)对应重组质粒的抗性，对长出的菌落进行筛选，并进一步利用PCR验证重组菌株的正确性。
作为本发明的一个实施方案，步骤(5)中，所述组合包括：pACYC-4CL、pET-DCS-CURS3和pCDF-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pET-DCS-CURS3和pRSF-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pET-DCS-CURS3和pACYC-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pET-DCS-CURS3和pRSF-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pACYC-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pACYC-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pCDF-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pCDF-DCS-CURS3和pRSF-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pCDF-AccBC-DtsR1的组合，以及pACYC-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合。
作为本发明的一个实施方案，取pACYC-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pCDF-AccBC-DtsR1的组合电转化入MG1655(DE3)感受态细胞中，获得重组菌株。
作为本发明的一个实施方案，所述方法还包括对构建得到的重组菌进行氨基双去甲氧基姜黄素的检测，筛选出产量最优的工程菌。
第三方面，本发明提供一种利用所述大肠杆菌工程菌发酵生产氨基双去甲氧基姜黄素的方法，将所述大肠杆菌工程菌接种到100mL LB培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至OD600≈0.6时，加入终浓度0.5mM的IPTG和0.5mM的对氨基肉桂酸，在25℃、220rpm条件下继续培养36h。
第五方面，本发明对构建得到的12株重组菌进行氨基双去甲氧基姜黄素的检测，筛选出产量最优的工程菌。该菌株为大肠埃希氏菌Escherichia coli HXJE109，保藏编号为CGMCC NO.20984。
第六方面，利用所述的产量最优工程菌，对其进行发酵条件优化，发酵生产氨基双去甲氧基姜黄素；具体步骤为：将上述工程菌接种到1L LB培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至OD600≈0.6时，加入终浓度0.5mM的IPTG，在25℃、220rpm条件下诱导5h。将菌液在5000rpm离心15min后，弃上清，将得到的菌体重悬至100mL含有0.5mM对氨基肉桂酸的新鲜LB培养基中，25℃继续培养48h。
本发明中的大肠埃希氏菌Escherichia coli HXJE109，已经于2020年11月2日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.20984。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明以大肠杆菌MG1655为出发菌株，利用合成生物学手段将利用对氨基肉桂酸表达氨基双去甲氧基姜黄素的异源途径构建在MG1655(DE3)菌株体内，并对途径进行了模块划分，通过调控各个模块的拷贝数并进行随机组合优化，最终筛出产量较高的组合；
2)本发明再通过发酵条件的优化，使得获得的菌株在以对氨基肉桂酸为底物发酵48h时，氨基双去甲氧基姜黄素的产量达到33mg/L。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1：氨基双去甲氧基姜黄素合成路径的构建及模块划分示意图；
图2：模块化优化氨基双去甲氧基姜黄素产量；
图3：重组质粒示意图；
图4：重组菌株HXJE109 PCR验证琼脂糖凝胶电泳图；
图5：优化发酵条件前后氨基双去甲氧基姜黄素产量比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1、氨基双去甲氧基姜黄素合成路径的构建及模块划分
在姜黄素的生物合成途径中，二聚酮合酶DCS和姜黄素合成酶CURS可以利用两分子的香豆酰辅酶A和一分子的丙二酰辅酶A为底物合成一分子的双去甲氧基姜黄素。本发明拟采用对氨基肉桂酸作为喂养底物，以期获得氨基双去甲氧基姜黄素。因此，本发明将整个生物合成路径规划成三个模块(图1)。模块Ⅰ包含了来自拟南芥的4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl，该基因编码的4CL蛋白可将底物对氨基肉桂酸转化为氨基肉桂酰辅酶A。模块Ⅱ包含来自姜黄的二聚酮合酶基因dcs和姜黄素合成酶基因curs3，该模块是姜黄素合成的核心模块。模块Ⅲ包含了来自谷氨酸棒状杆菌的乙酰辅酶A羧化酶基因(包含两个基因，分别为accBC和dtsR1)，该酶可以将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A，以期提高胞内丙二酰辅酶A的含量。
在本发明的模块优化体系中，共选择了四个拷贝数不同的质粒，包括pRSFDuet(拷贝数>100，Kan)、pETDuet(拷贝数～40，Amp)、pCDFDuet(拷贝数20-40，Spe)和pACYCDuet(拷贝数10-12，Chl)。每个质粒上分别包含两个多克隆位点，每个多克隆位点前均含有一个T7启动子。最终本发明通过改变各模块的质粒拷贝数来调节各模块之间的代谢平衡，并通过对目的产物的检测筛选出产量最高的组合模式。
本发明总共涉及11种组合方式，详见图2。通过对所产生的工程菌进行发酵验证及氨基双去甲氧基姜黄素产量检测，各菌株的产量见图2。最终得到了产量最高的模块组合：模块Ⅰ在质粒pACYCDuet上，模块Ⅱ在pRSFDuet上，模块Ⅲ在pCDFDuet上。
实施例2、模块工程菌的构建
将以上五条基因进行大肠杆菌密码子优化并全合成。模块Ⅰ的构建：将4cl与经NdeI和XhoI酶切处理过的pACYCDuet载体进行连接，构成质粒4CL-PACYC。模块Ⅱ的构建：将dcs和curs3连接到经BamHI和HindIII，NdeI和XhoI酶切处理过的pRSFDuet载体进行连接，得到质粒DCS-CURS3-pRSF。模块Ⅲ的构建：参照模块Ⅱ的构建，构建质粒AccBC-DtsR1-pCDF。各质粒示意图详见图3。将这三个重组质粒共同电转入MG1655(DE3)感受态中，并在含有50μg/mL壮观霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB固体平板上进行筛选。将长出的单克隆进行PCR验证，以确保阳性克隆的正确性(图4)。将最终筛选得到的重组菌株命名为HXJE109。
其中，LB固体培养基配方为：10g/L tryptone，5g/L yeast extract，5g/L NaCl，15g/L agar。
大肠杆菌MG1655(DE3)的获得方法参照文献Nielsen DR,Yoon SH,Yuan CJ,Prather KL.Metabolic engineering of acetoin and meso-2,3-butanediolbiosynthesis in E.coli.Biotechnol J.2010Mar；5(3):274-84.
实施例3、发酵产生氨基双去甲氧基姜黄素的方法
将实施例2中获得的重组菌株HXJE109接种于LB液体培养基中，在37℃下过夜培养后，以1:100的接种比例接种于100mL新鲜LB液体培养基中。于37℃、220rpm条件下培养至OD600≈0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG和0.5mM的对氨基肉桂酸，转至25℃、220rpm继续培养48h。取500μL发酵液，加入500μL甲醇，混合均匀后对菌体进行超声破碎。12000rpm离心5min，取上清进行HPLC检测。使用4.6μm×250mm的Agilent TC C18反相柱，以0.1％甲酸水为A相，纯甲醇为B相，流速1mL/min，按以下条件进行洗脱：0min，10％B；9min，100％B；15min，100％B。检测波长为450nm。最终计算得出重组菌HXJE109中氨基双去甲氧基姜黄素的产量为3.07mg/L。
其中，LB液体培养基配方为：10g/L tryptone，5g/L yeast extract，5g/L NaCl。
实施例4、发酵条件优化的方法
将实施例2中获得的重组菌株HXJE109接种于LB液体培养基中，在37℃下过夜培养后，以1:100的接种比例接种于1L新鲜LB液体培养基中。于37℃、220rpm条件下培养至OD600≈0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，转至25℃、220rpm继续培养5h。5000rpm离心15min后，弃上清，将得到的菌体重悬至100mL新鲜LB液体培养基中，并加入终浓度为0.5mM的对氨基肉桂酸。在25℃、220rpm条件下继续培养48h后，取500μL发酵液，加入500μL甲醇，混合均匀后对菌体进行超声破碎。并按照实施例3中的检测方法对发酵液中氨基双去甲氧基姜黄素的含量进行测定，发现使用该种发酵方式，最终可以得到33.58mg/L的产量，相比优化前提升了10倍(图5)。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法
<130> KAG45583
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1686
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopisis thaliana)
<400> 1
atggctcctc aggaacaggc tgtgagccag gttatggaaa aacagagcaa taataataac 60
agcgatgtta ttttccgcag taaactgccg gatatctata ttccgaatca tctgagcctg 120
catgattata tttttcagaa tatcagcgag ttcgccacca aaccgtgcct gattaatggc 180
ccgaccggtc atgtgtatac ctatagcgat gttcatgtta ttagccgtca gattgcagca 240
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attattaccg aagcacgcta tgtggataaa attaagccgc tgcagaatga tgatggtgtt 480
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gtgagtaaac aggttgtttt ctataagcgc attaataagg ttttcttcac cgaaagtatc 1620
ccgaaagccc cgagcggtaa aattctgcgt aaagatctgc gcgcaaaact ggccaatggt 1680
ctgtaa 1686
<210> 2
<211> 1170
<212> DNA
<213> 姜黄(Curcuma longa)
<400> 2
atggaagcta acggttaccg tatcacccac tctgctgacg gtccagctac catcctggct 60
atcggtaccg ctaacccgac caacgttgtt gaccagaacg cttacccgga cttctacttc 120
cgtgttacca actctgaata cctgcaggaa ctgaaagcta aattccgtcg tatctgcgaa 180
aaagctgcta tccgtaaacg tcacctgtac ctgaccgaag aaatcctgcg tgaaaacccg 240
tctctgctgg ctccgatggc tccgtctttc gacgctcgtc aggctatcgt tgttgaagct 300
gttccgaaac tggctaaaga agctgctgaa aaagctatca aagaatgggg tcgtccgaaa 360
tctgacatca cccacctggt tttctgctct gcttctggta tcgacatgcc gggttctgac 420
ctgcagctgc tgaaactgct gggtctgccg ccgtctgtta accgtgttat gctgtacaac 480
gttggttgcc acgctggtgg taccgctctg cgtgttgcta aagacctggc tgaaaacaac 540
cgtggtgctc gtgttctggc tgtttgctct gaagttaccg ttctgtctta ccgtggtccg 600
cacccggctc acatcgaatc tctgttcgtt caggctctgt tcggtgacgg tgctgctgct 660
ctggttgttg gttctgaccc ggttgacggt gttgaacgtc cgatcttcga aatcgcttct 720
gcttctcagg ttatgctgcc ggaatctgct gaagctgttg gtggtcacct gcgtgaaatc 780
ggtctgacct tccacctgaa atctcagctg ccgtctatca tcgcttctaa catcgaacag 840
tctctgacca ccgcttgctc tccgctgggt ctgtctgact ggaaccagct gttctgggct 900
gttcacccgg gtggtcgtgc tatcctggac caggttgaag ctcgtctggg tctggaaaaa 960
gaccgtctgg ctgctacccg tcacgttctg tctgaatacg gtaacatgca gtctgctacc 1020
gttctgttca tcctggacga aatgcgtaac cgttctgctg ctgaaggtca cgctaccacc 1080
ggcgaaggtc tggactgggg tgttctgctg ggtttcggtc caggtctgtc tatcgaaacc 1140
gttgttctgc actcttgccg tctgaactaa 1170
<210> 3
<211> 1173
<212> DNA
<213> 姜黄(Curcuma longa)
<400> 3
atgggcagtc tccaagccat gcgtcgtgcg caacgtgcgc aaggcccagc gaccatcatg 60
gcggttggca cgagcaatcc accaaatctg tacgagcaga ccagctaccc ggatttctac 120
ttccgcgtta cgaacagcga ccataagcat gagctgaaaa ataaattccg tgttatctgt 180
gaaaagacga aggtgaaacg ccgctatctg catctgaccg aagagatcct caaacagcgc 240
ccgaaactgt gcagctacat ggagccgagt ttcgacgacc gtcaagatat cgtggtggag 300
gagattccga aactggcgaa agaagcggcc gaaaaagcga ttaaggagtg gggtcgccca 360
aaaagcgaga tcacccacct cgtgttctgc agcatcagcg gtatcgacat gccgggcgcc 420
gattatcgtc tggccacgct gctcggtctg ccactgagcg ttaaccgtct gatgctgtac 480
agccaagcgt gccacatggg tgcccaaatg ctgcgcatcg ccaaggatct ggccgaaaat 540
aatcgcggtg cccgcgttct ggccgttagc tgcgaaatca ccgttctgag cttccgtggc 600
ccagatgccg gcgattttga agcgctggcg tgccaagcgg gttttggtga cggtgcggcg 660
gcggttgttg ttggtgccga cccactgccg ggtgtggaac gtccaatcta tgagattgcc 720
gccgcgatgc aagaaaccgt tccggagagt gaacgcgccg ttggcggcca tctccgtgag 780
atcggctgga ccttccactt cttcaatcag ctgccgaaac tgatcgcgga gaacatcgaa 840
ggcagtctgg cccgtgcgtt caagccactg ggtatcagtg agtggaacga cgtgttctgg 900
gttgcccacc cgggtaattg gggcatcatg gatgcgatcg agacgaaact gggtctggaa 960
caaggcaaac tggcgacggc gcgtcacgtt ttcagcgagt acggcaatat gcagagcgcc 1020
accgtgtact tcgtgatgga tgaggtgcgt aagcgcagtg ccgccgaagg tcgtgcgacg 1080
acgggtgaag gtctcgaatg gggcgtgctg tttggttttg gtccgggcct caccatcgaa 1140
accgttgtgc tgcgcagtgt gccactgccg taa 1173
<210> 4
<211> 1776
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌( Corynebacterium glutamicum)
<400> 4
gtgtcagtcg agactaggaa gatcaccaag gttcttgtcg ctaaccgtgg tgagattgca 60
atccgcgtgt tccgtgcagc tcgagatgaa ggcatcggat ctgtcgccgt ctacgcagag 120
ccagatgcag atgcaccatt cgtgtcatat gcagacgagg cttttgccct cggtggccaa 180
acatccgctg agtcctacct tgtcattgac aagatcatcg atgcggcccg caagtccggc 240
gccgacgcca tccaccccgg ctacggcttc ctcgcagaaa acgctgactt cgcagaagca 300
gtcatcaacg aaggcctgat ctggattgga ccttcacctg agtccatccg ctccctcggc 360
gacaaggtca ccgctcgcca catcgcagat accgccaagg ctccaatggc tcctggcacc 420
aaggaaccag taaaagacgc agcagaagtt gtggctttcg ctgaagaatt cggtctccca 480
atcgccatca aggcagcttt cggtggcggc ggacgtggca tgaaggttgc ctacaagatg 540
gaagaagtcg ctgacctctt cgagtccgca acccgtgaag caaccgcagc gttcggccgc 600
ggcgagtgct tcgtggagcg ctacctggac aaggcacgcc acgttgaggc tcaggtcatc 660
gccgataagc acggcaacgt tgttgtcgcc ggaacccgtg actgctccct gcagcgccgt 720
ttccagaagc tcgtcgaaga agcaccagca ccattcctca ccgatgacca gcgcgagcgt 780
ctccactcct ccgcgaaggc tatctgtaag gaagctggct actacggtgc aggcaccgtt 840
gagtacctcg ttggctccga cggcctgatc tccttcctcg aggtcaacac ccgcctccag 900
gtggaacacc cagtcaccga agagaccacc ggcatcgacc tggtccgcga aatgttccgc 960
atcgcagaag gccacgagct ctccatcaag gaagatccag ctccacgcgg ccacgcattc 1020
gagttccgca tcaacggcga agacgctggc tccaacttca tgcctgcacc aggcaagatc 1080
accagctacc gcgagccaca gggcccaggc gtccgcatgg actccggtgt cgttgaaggt 1140
tccgaaatct ccggacagtt cgactccatg ctggcaaagc tgatcgtttg gggcgacacc 1200
cgcgagcagg ctctccagcg ctcccgccgt gcacttgcag agtacgttgt cgagggcatg 1260
ccaaccgtta tcccattcca ccagcacatc gtggaaaacc cagcattcgt gggcaacgac 1320
gaaggcttcg agatctacac caagtggatc gaagaggttt gggataaccc aatcgcacct 1380
tacgttgacg cttccgagct cgacgaagat gaggacaaga ccccagcaca gaaggttgtt 1440
gtggagatca acggccgtcg cgttgaggtt gcactcccag gcgatctggc actcggtggc 1500
accgctggtc ctaagaagaa ggccaagaag cgtcgcgcag gtggtgcaaa ggctggcgta 1560
tccggcgatg cagtggcagc tccaatgcag ggcactgtca tcaaggtcaa cgtcgaagaa 1620
ggcgctgaag tcaacgaagg cgacaccgtt gttgtcctcg aggctatgaa gatggaaaac 1680
cctgtgaagg ctcataagtc cggaaccgta accggcctta ctgtcgctgc aggcgagggt 1740
gtcaacaagg gcgttgttct cctcgagatc aagtaa 1776
<210> 5
<211> 1635
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌( Corynebacterium glutamicum)
<400> 5
atgatgacca tttcctcacc tttgattgac gtcgccaacc ttccagacat caacaccact 60
gccggcaaga tcgccgacct taaggctcgc cgcgcggaag cccatttccc catgggtgaa 120
aaggcagtag agaaggtcca cgctgctgga cgcctcactg cccgtgagcg cttggattac 180
ttactcgatg agggctcctt catcgagacc gatcagctgg ctcgccaccg caccaccgct 240
ttcggcctgg gcgctaagcg tcctgcaacc gacggcatcg tgaccggctg gggcaccatt 300
gatggacgcg aagtctgcat cttctcgcag gacggcaccg tattcggtgg cgcgcttggt 360
gaggtgtacg gcgaaaagat gatcaagatc atggagctgg caatcgacac cggccgccca 420
ttgatcggtc tttacgaagg cgctggcgct cgtattcagg acggcgctgt ctccctggac 480
ttcatttccc agaccttcta ccaaaacatt caggcttctg gcgttatccc acagatctcc 540
gtcatcatgg gcgcatgtgc aggtggcaac gcttacggcc cagctctgac cgacttcgtg 600
gtcatggtgg acaagacctc caagatgttc gttaccggcc cagacgtgat caagaccgtc 660
accggcgagg aaatcaccca ggaagagctt ggcggagcaa ccacccacat ggtgaccgct 720
ggtaactccc actacaccgc tgcgaccgat gaggaagcac tggattgggt acaggacctg 780
gtgtccttcc tcccatccaa caatcgctcc tacgcaccga tggaagactt cgacgaggaa 840
gaaggcggcg ttgaagaaaa catcaccgct gacgatctga agctcgacga gatcatccca 900
gattccgcga ccgttcctta cgacgtccgc gatgtcatcg aatgcctcac cgacgatggc 960
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gaaggccagt ccgttggctt tgttgccaac cagccaaccc agttcgctgg ctgcctggac 1080
atcgactcct ctgagaaggc agctcgcttc gtccgcacct gcgacgcgtt caacatccca 1140
atcgtcatgc ttgtcgacgt ccccggcttc ctcccaggcg caggccagga gtacggtggc 1200
attctgcgtc gtggcgcaaa gctgctctac gcatacggcg aagcaaccgt tccaaagatc 1260
accgtcacca tgcgtaaggc ttacggcgga gcgtactgcg tgatgggttc caagggcttg 1320
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gcagttggat tcatctaccg caaggagctc atggcagctg atgccaaggg cctcgatacc 1440
gtagctctgg ctaagtcctt cgagcgcgag tatgaagacc acatgctcaa cccgtaccac 1500
gctgcagaac gtggcctgat cgacgccgtg atcctgccaa gcgaaacccg cggacagatt 1560
tcccgcaacc ttcgcctgct caagcacaag aacgtcactc gccctgctcg caagcacggc 1620
aacatgccac tgtaa 1635

Claims (10)

1.一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，其特征在于，在大肠杆菌MG1655(DE3)中表达了合成途径中所需的关键酶：4-香豆酰辅酶A连接酶4CL、二聚酮合酶DCS、姜黄素合成酶CURS3以及乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，编码所述4-香豆酰辅酶A连接酶4CL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述二聚酮合酶DCS的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，编码所述姜黄素合成酶CURS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求1和2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，同时使用3个载体对所述5条基因进行共表达；所述载体在以下4个拷贝数不同、抗性不同的载体中随机组合：pRSFDuet-1(拷贝数>100，Kan)、pETDuet-1(拷贝数～40，Amp)、pCDFDuet-1(拷贝数20-40，Spe)和pACYCDuet(拷贝数10-12，Chl)。
4.根据权利要求3所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl单独在一个质粒上；二聚酮合酶基因dcs和姜黄素合成酶基因curs3在同一个质粒上；乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1在同一个质粒上。
5.根据权利要求4所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl单独在pCDFDuet-1质粒或pACYCDuet质粒上。
6.一种如权利要求1-5中任一项所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)对所述关键酶的5条基因进行大肠杆菌密码子优化并全合成；
(2)通过酶切酶连方法构建4CL表达质粒：pCDF-4CL和pACYC-4CL；
(3)通过酶切酶连方法构建DCS和CURS3表达质粒：pRSF-DCS-CURS3、pET-DCS-CURS3、pCDF-DCS-CURS3和pACYC-DCS-CURS3；
(4)通过酶切酶连方法构建AccBC和DtsR1表达质粒：pRSF-AccBC-DtsR1、pET-AccBC-DtsR1、pCDF-AccBC-DtsR1和pACYC-AccBC-DtsR1；
(5)分别取步骤(2)、(3)、(4)中的表达质粒，按不同抗性进行组合，各组合分别电转化入MG1655(DE3)感受态细胞中；
(6)对应重组质粒的抗性，对长出的菌落进行筛选，并进一步利用PCR验证重组菌株的正确性。
7.根据权利要求6所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述组合包括：pACYC-4CL、pET-DCS-CURS3和pCDF-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pET-DCS-CURS3和pRSF-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pET-DCS-CURS3和pACYC-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pET-DCS-CURS3和pRSF-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pACYC-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pACYC-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pCDF-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pCDF-DCS-CURS3和pRSF-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pCDF-AccBC-DtsR1的组合，以及pACYC-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合。
8.一种利用如权利要求1-5中任一项所述的大肠杆菌工程菌发酵生产氨基双去甲氧基姜黄素的方法，其特征在于，将所述大肠杆菌工程菌接种到含有100mL LB培养基的500mL平底三角摇瓶中，在37℃、220rpm条件下培养至OD600≈0.6时，加入终浓度0.5mM的IPTG和0.5mM的对氨基肉桂酸，在25℃、220rpm条件下继续培养36h。
9.一株大肠埃希氏菌Escherichia coli HXJE109，保藏编号为CGMCC NO.20984。
10.一种利用如权利要求9所述的大肠杆菌工程菌发酵生产氨基双去甲氧基姜黄素的方法，其特征在于，将所述大肠杆菌工程菌接种到1L LB培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至OD600≈0.6时，加入终浓度0.5mM的IPTG，在25℃、220rpm条件下诱导5h；将菌液在5000rpm离心15min后，弃上清，将得到的菌体重悬至100mL含有0.5mM对氨基肉桂酸的新鲜LB培养基中，25℃继续培养48h。
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