CN114591929A

CN114591929A - 一种温郁金来源的姜黄素合成酶、基因、载体、工程菌及应用

Info

Publication number: CN114591929A
Application number: CN202210405041.3A
Authority: CN
Inventors: 谢恬; 谌容; 殷晓浦; 胡添源; 王铭; 陈姝; 胡雨涵
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2022-04-18
Filing date: 2022-04-18
Publication date: 2022-06-07
Also published as: WO2023202122A1

Abstract

本发明公开一种温郁金来源的姜黄素合成酶、基因、载体、工程菌及应用。姜黄素合成酶的氨基酸序列为SEQ.IDNO.2所示。其基因序列为SEQ.IDNO.1所示。构建的重组载体为pYES2::CwPKS。重组基因工程菌为SaccharomycescerevisiaeBY4741/pESC‑LEU::At4CL‑ClDCS/pYES2::CwPKS。本发明携带温郁金来源的姜黄素合成酶工程菌具有利用阿魏酸生成的姜黄素、利用阿魏酸和香豆酸生成单去甲氧基姜黄素，利用二氢香豆酸生成四氢双去甲氧基姜黄素的能力；能在酵母细胞中快速，大量地制备所述的催化剂，用于姜黄素类化合物的大量合成。

Description

一种温郁金来源的姜黄素合成酶、基因、载体、工程菌及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种温郁金来源的姜黄素合成酶、基因、载体、工程菌及应用，特别涉及一种温郁金来源的姜黄素合成酶、基因、载体、工程菌及其制备姜黄素及其衍生物的应用。

背景技术

姜黄素(Curcumin)是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种二酮类化合物，化学式为C₂₁H₂₀O₆。在药品领域，姜黄素对II型糖尿病具有较好的治疗作用。姜黄素还可以抑制人类免疫缺陷病毒的病毒活性，具有抗艾滋病功效。姜黄素对治疗癌症、风湿、炎性眼病、肠道疾病以及口腔癌和黏膜白斑病方面均有效果，且安全性高，药效明显，在天然姜黄素类化合物中，姜黄素比去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素在抗氧化及修复DNA等方面具有更高的活性，是发挥药效的最主要成分。同时因其为橙黄色结晶粉末，味稍苦，不溶于水的特性常在食品生产中用作着色剂。温郁金(Curcuma wenyujin Y.H.Chen&C.Ling)是姜科姜黄属郁金的栽培品种，温郁金的新鲜根茎切片称“片姜黄”，能行气破瘀，通经络。用于风湿痹痛，心腹积痛、胸肋疼痛，经闭腹痛，跌打损伤等血瘀气滞的症候。温郁金中含有的化学成分种类繁多，主要有倍半萜、单萜类、二萜类、姜黄素类、多糖类等。目前，姜黄素的生产方法主要为植物提取法，但从天然植物温郁金中提取分离姜黄素仍存在许多技术难点：第一，温郁金植株仅在叶片和块根中含有极少量姜黄素，其中叶片中的姜黄素含量更低；同时姜黄素的含量易受品种、叶片和根茎质量、种植环境等诸多因素影响。第二，姜黄素与许多结构相似的姜黄素类化合物混杂在一起，必须通过精密分馏、分子蒸馏进行初分，再通过薄层色谱和柱层析，经过多次分离才能得到纯品，因此姜黄素的提取工艺要求高难度大。总之，这种方法获得的姜黄素产量有限，后续分离过程昂贵、耗时。

采用酶催化方法进行姜黄素的生物合成具有一定优势，例如反应条件温和、选择性高、产物专一性高。而进行酶催化的首要条件是优质的生物催化剂的获得。姜黄素合成酶(Curcumin Synthase,CURS)能催化肉桂酰二酮基乙酰半胱胺(一种辅酶A酯的模拟物) 和阿魏酰-CoA体外生成类姜黄素。在阿魏酰-CoA和丙二酰-CoA存在下，二酮基-CoA 合成酶(DCS)和CURS共孵育得到姜黄素。在阿魏酰-CoA、香豆酰-CoA和丙二酰-CoA 存在下，二酮基-CoA合成酶(DCS)和CURS共孵育得到单去甲氧基姜黄素。在二氢香豆酰-CoA和丙二酰-CoA存在下，二酮基-CoA合成酶(DCS)和CURS共孵育得到四氢双去甲氧基姜黄素。但是已报道的CURS的活性不高，因此，研究优质的姜黄素合成酶基因的克隆、表达，有助于姜黄素的生物合成，同时也能进一步利用代谢工程或者生物合成相关技术进行姜黄素的细胞工厂生产，本发明具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有姜黄素合成酶CURS的活性不高，公开了一种温郁金来源的姜黄素合成酶，该姜黄素合成酶属于III型聚酮合酶(PKSs)，具有很好的催化底物羧酸生成姜黄素、单去甲氧基姜黄素及四氢双去甲氧基姜黄素的活性。所述酶的氨基酸序列为SEQ.ID NO.2所示。

本发明的第二个目的在于公开了一种温郁金来源的姜黄素合成酶编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ.ID NO.1所示。

本发明的第三个目的在于公开了温郁金来源的姜黄素合成酶编码基因构建的重组载体。所述重组载体为pYES2::CwPKS，是由SEQ.ID NO.1所示的姜黄素合成酶编码基因与pEASY-Blunt Zero载体连接得到。

本发明第四个目的在于公开了上述重组载体转化制备的重组基因工程菌。所述重组基因工程菌为Saccharomyces cerevisiae BY4741/pESC-LEU::At4CL-ClDCS/ pYES2::CwPKS，是由重组载体pESC-LEU::At4CL-ClDCS及pYES2::CwPKS转化至 Saccharomycescerevisiae BY4741中得到。重组载体pESC-LEU::At4CL-ClDCS在酵母细胞中的表达可将阿魏酸生成阿魏酰二酮基辅酶A，为姜黄素和单去甲氧基姜黄素合成提供前体；重组载体pESC-LEU::At4CL-ClDCS在酵母细胞中的表达可将二氢香豆酸生成二氢香豆酰二酮基辅酶A，为四氢双去甲氧基姜黄素提供前体。

本发明第五个目的在于公开了温郁金来源的姜黄素合成酶在制备姜黄素及其衍生物中的应用，具体是催化阿魏酸生成姜黄素、单去甲氧基姜黄素及四氢双去甲氧基姜黄素生物。

其中，所述的应用为：将重组基因工程菌Saccharomyces cerevisiae BY4741/pESC-LEU::At4CL-ClDCS/pYES2::CwPKS，以菌液∶培养基＝1∶100的比例向3mL Leu-Ura双缺葡萄糖液体培养基中加入30μL的菌液，与30℃、220rpm黑暗环境下摇瓶培养24小时；活化后进入发酵的第一阶段，即葡萄糖生长阶段，以菌液∶培养基＝1∶100 的比例向20mL Leu-Ura双缺葡萄糖液体培养基中加入200μL活化后的菌液，与30℃、 220rpm黑暗环境下摇瓶培养48小时；葡萄糖生长阶段结束后进入发酵的第二阶段，即半乳糖诱导阶段，将第一阶段的发酵液以3000×g的转速于4℃离心2min，弃上清液，加入20mL Leu-Ura双缺半乳糖液体培养基，重悬菌体，并加入20μL阿魏酸溶液(200mM), 与30℃、220rpm黑暗环境下摇瓶培养48小时。

本发明提供的氨基酸序列为SEQ.ID NO.2所示的一种温郁金来源的姜黄素合成酶(即CwPKS)，经实验证明，上述结构的蛋白质属于聚酮合酶，在阿魏酰-CoA和丙二酰-CoA存在下，二酮基-CoA合成酶(DCS)和姜黄素合成酶CwPKS共孵育得到姜黄素。在阿魏酰-CoA、香豆酰-CoA和丙二酰-CoA存在下，二酮基-CoA合成酶(DCS)和CwPKS 共孵育得到单去甲氧基姜黄素。在二氢香豆酰-CoA和丙二酰-CoA存在下，二酮基-CoA 合成酶(DCS)和CwPKS共孵育得到四氢双去甲氧基姜黄素。不难想到的是，在不改变蛋白质特性的情况，适当改变氨基酸序列，仍具有本发明姜黄素合成酶的特性。比如，氨基酸序列SEQ ID NO.2的保守性变异多肽，或其活性片段、或其衍生物。

本发明提供一种温郁金来源的姜黄素合成酶编码基因(即CwPKS基因)，所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明提供一种含有所述温郁金姜黄素合成酶编码基因的重组载体。进一步，所述重组载体按如下方法制备：将姜黄素合成酶编码基因与pYES2载体连接，获得连接产物pYES2::CwPKS，即为含有温郁金姜黄素合成酶编码基因的重组载体。将重组载体 pYES2::CwPKS转化Saccharomyces cerevisiae BY4741细胞中，在含有URA3缺陷的葡萄糖液体培养基中，并在30℃、220rpm黑暗环境下摇瓶培养24小时，即获得含有温郁金姜黄素合成酶编码基因的重组载体。

本发明还提供一种含有所述温郁金姜黄素合成酶编码基因或重组载体的重组基因工程菌。所述重组基因工程菌按如下方法制备：pYES2::CwPKS、pESC-LEU::At4CL-ClDCS质粒的共转化，即2～3μL质粒加入酵母感受态细胞中，加入500μL EZ-Solution3试剂混匀，30℃水浴45min，每隔15min上下颠倒混匀一次，取100μL在Leu-Ura双缺葡萄糖固体培养基上，涂布均匀，于30℃培养箱中培养2～3天。

本发明提供一种所述温郁金来源的姜黄素合成酶在制备姜黄素类化合物中的应用，所述的应用为：以上述含温郁金来源的姜黄素合成酶编码基因工程菌菌体于3mL Leu-Ura 双缺葡萄糖液体培养基中，并在30℃、220rpm黑暗环境下摇瓶培养24小时；稀释至总体积为5mL计算加入菌液的体积，并加入Leu-Ura双缺葡萄糖液体培养基至总体积达到 5mL，并在30℃、220rpm黑暗环境下摇瓶培养48小时；加入Leu-Ura双缺葡萄糖液体培养基至总体积达到20mL，并在30℃、220rpm黑暗环境下摇瓶培养48小时；葡萄糖生长阶段结束后，进入半乳糖诱导阶段，将前一阶段的发酵液以3000×g的转速于4℃离心2min，弃上清液，加入20mL Leu-Ura双缺半乳糖液体培养基，重悬菌体，并分别加入前体20μL阿魏酸溶液(200mM),阿魏酸溶液(200mM)和香豆酸(200mM)组合，二氢香豆酸(200mM)，共三组，三个重复，于30℃、220rpm黑暗环境下摇瓶培养48 小时。

本发明具有以下有益效果：

本发明对温郁金来源的姜黄素合成酶在酿酒酵母中进行姜黄素、单去甲氧基姜黄素、四氢双去甲氧基姜黄素合成方法的发明与应用。发现温郁金来源的姜黄素合成酶可在酵母表达体系中催化前体羧酸生成大量的姜黄素化合物，从而在酵母中快速，大量地制备所述的化合物，应用于姜黄素的合成，具有重要的意义。

附图说明

图1CwPKS催化反应产物的LC-MS图，即LC-MS分析不同前体饲喂的工程酵母菌的发酵产物。

具体实施方式

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明一种温郁金来源的姜黄素合成酶、基因、载体、工程菌及应用作进一步的说明。

1、工程菌的设计

通过现有技术构建了pESC-LEU::At4CL-ClDCS重组质粒，含有CoA连接酶(4CL，(Arabidopsis thaliana p-coumaroyl:CoA ligase；ID:AY376729))和二酮-CoA合成酶(Curcuma longa diketide-CoA synthase；ID:AB495006.1)。At4CL和ClDCS的核苷酸序列来源于NCBI 数据库，经过酿酒酵母密码子偏好性优化后由南京擎科生物技术公司合成，并通过基因组装构建到pESC-Leu载体上。

将本实验室筛选到的一条TypeⅢPKS基因(见SEQ.ID NO.1)进行酿酒酵母宿主优化后，由南京擎科生物技术公司进行序列全合成，继而构建到pYES2表达载体上，获得pYES2::CwPKS重组质粒。

酿酒酵母菌通过使用ZYMO RESEARCH的Frozen-EZ Yeast Transfromation II试剂盒对酵母细胞进行化学转化。并对转化后的酵母感受态细胞进行梯度冻存。

pESC-LEU::At4CL-ClDCS、pYES2::CwPKS质粒的共转化：取2～3μL质粒加入酵母感受态细胞中，加入500μL EZ-Solution3试剂混匀，30℃水浴45min，每隔15min上下颠倒混匀一次，取100μL在Leu-Ura双缺葡萄糖固体培养基上，涂布均匀，于30℃培养箱中培养2～3天。

2、定性发酵：对上述所设计的工程菌是否有合成姜黄素的功能进行确定，采取阿魏酸饲喂的定性发酵的方法，以发酵后发酵液是否变为黄色为判断依据，初步确定是否有功能。

首先对酵母工程菌进行活化，以菌液∶培养基＝1∶100的比例向3mL Lea-Ura双缺葡萄糖液体培养基中加入30μL的菌液，于30℃、220rpm黑暗环境下摇瓶培养24小时；活化后进入发酵的第一阶段，即葡萄糖生长阶段，以菌液∶培养基＝1∶100的比例向20 mL Leu-Ura双缺葡萄糖液体培养基中加入200μL活化后的菌液，于30℃、220rpm黑暗环境下摇瓶培养48小时；葡萄糖生长阶段结束后进入发酵的第二阶段，即半乳糖诱导阶段，将第一阶段的发酵液以3000×g的转速于4℃离心2min，弃上清液，加入20mL Leu-Ura 双缺半乳糖液体培养基，重悬菌体，并加入20μL阿魏酸溶液(200mM),与30℃、220rpm 黑暗环境下摇瓶培养48小时。

为探索CwPKS的底物选择性，如上所述，添加阿魏酸和香豆酸的组合，以及二氢阿魏酸和阿魏酸，二氢香豆酸和香豆酸的组合，分析其产物特性。

3、姜黄素类化合物的提取

首先对发酵菌液进行菌体破碎(JN-02C低温高压连续流细胞破碎机，4℃，1800bar), 已破碎的发酵液与等体积的乙酸乙酯混匀，超声提取30min，提取液以3000×g的转速离心5min，产生明显分层，将上层乙酸乙酯相移入新管中，水相管中再加入等体积的乙酸乙酯混匀，重复上述操作直至下层水相没有颜色，所得的乙酸乙酯相旋蒸至干燥，用1mL 乙腈复溶，用0.22μm尼龙滤膜过滤复溶液体，滤液保存于进样瓶中。

5、姜黄素类化合物的检测

采用液相质谱联用(液相色谱-单四极杆质谱仪，安捷伦1260Infinity II/6125)的检测方法检测复溶液体中姜黄素的含量。C18反相色谱柱，流动相A为0.1％的甲酸，流动相B为乙腈(加了0.1％的甲酸)，流量为0.4mL/min，B相梯度洗脱(0-6min 44％-44％， 6-15min 44％-45％，15-20min 45％-46％，20-26min 46％-44％)，柱温30℃，430nm紫外波长及MS图(m/z＝367)对姜黄素进行定性，430nm紫外波长及MS图(m/z＝337)对姜黄素进行定性360nm波长及MS图(m/z＝369)对二氢姜黄素进行定性，280nm波长及MS图(m/z＝371)对四氢姜黄素进行定性，280nm波长及MS图(m/z＝311)对四氢双去甲氧基姜黄素进行定性，进样量为10μL。

图1结果表明：携带CwPKS表达的酵母工程菌可利用底物阿魏酸，生成姜黄素；利用底物阿魏酸和香豆酸，生成双去甲氧基姜黄素；利用底物二氢香豆酸，生成四氢双去甲氧基姜黄素。单独添加香豆酸没有产物生成。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种温郁金来源的姜黄素合成酶、基因、载体、工程菌及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列(CwCUS3-DN46085)

<400> 2

atggcctcca actacgtcga tgcattcccc aagccccaaa gggctcaagg cccagccacc 60

gtcatggcca tcggcaccgc caaccctccc aacctctacg aacagagcgc ttacccagac 120

ttctatttcc gcgtcaccgg tgccgaccac aagccggagc tcaagcagaa gttccgccgt 180

ctctgtgaca ggagcatgat caagaagcgt tatatgcacc tgacggagga gctgctgaag 240

gagaaaccag ggatgtgctc gtacatggac acttccttcg acgagcggca ggatgtcgtg 300

gtggaggagg tgcctcgcct ggccaaggag gccgccgtca aggccatcaa ggagtgggga 360

cggcccttgt cggagatcac ccacttggtt ttctgctcca ccagcggcgt cgatatgcct 420

ggagctgatt accgcctcgc caaacttctc ggtctctcct tctccgtcaa ccgcatcatg 480

ctctacaacc aggcctgcca catcggcgcg cagacgctcc gcatcgccaa ggacatcgcc 540

gagaacaacc ggagcgcccg cgtcctcgtc gtcgcctgcg aggtcaacac gctcatcttc 600

cgcggtcccg aagagcgcga cttccagagc ctcgcggccc aggtcgcgtt cggcgacgga 660

gcggcggcgc tcgtcgtcgg ggccgacccc gtccagggcg tcgagaagcc gatcttcgag 720

atcatggcgg cgtttccgtt cacggtgccg gagacccaga tggcggtcgg cgggcagctg 780

aagcagatcg ggctgacctt ccatttcgcg caccagctgc cggggctgat agccaacaac 840

ttggagacgt gcctcggcga ggcgttaaag ccgctgggga tctccgactg gaacgacgtg 900

ttctgggtgg cccacccggg gaactggggc atcatggacg ccgtcgaggc caagctgggc 960

ctggaacagg ggaagctgca gtcgtcaagg cacgtcttca gcgagttcgg gaacatgatg 1020

agcgccaccg ttctgttcgt gatggacgac gtgaggaagc gggcggtggc ggaaggcgcg 1080

gcgaccaccg gcgacggcct gaagtggggc gtgctctgcg cgttcggccc agggctgtcc 1140

atcgagacgc tggtgcttcg cagcgtccct ctg 1173

<210> 2

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列(CwPKS)

<400> 2

Met Ala Ser Asn Tyr Val Asp Ala Phe Pro Lys Pro Gln Arg Ala Gln

1 5 10 15

Gly Pro Ala Thr Val Met Ala Ile Gly Thr Ala Asn Pro Pro Asn Leu

20 25 30

Tyr Glu Gln Ser Ala Tyr Pro Asp Phe Tyr Phe Arg Val Thr Gly Ala

35 40 45

Asp His Lys Pro Glu Leu Lys Gln Lys Phe Arg Arg Leu Cys Asp Arg

50 55 60

Ser Met Ile Lys Lys Arg Tyr Met His Leu Thr Glu Glu Leu Leu Lys

65 70 75 80

Glu Lys Pro Gly Met Cys Ser Tyr Met Asp Thr Ser Phe Asp Glu Arg

85 90 95

Gln Asp Val Val Val Glu Glu Val Pro Arg Leu Ala Lys Glu Ala Ala

100 105 110

Val Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Arg Pro Leu Ser Glu Ile Thr His

115 120 125

Leu Val Phe Cys Ser Thr Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr

130 135 140

Arg Leu Ala Lys Leu Leu Gly Leu Ser Phe Ser Val Asn Arg Ile Met

145 150 155 160

Leu Tyr Asn Gln Ala Cys His Ile Gly Ala Gln Thr Leu Arg Ile Ala

165 170 175

Lys Asp Ile Ala Glu Asn Asn Arg Ser Ala Arg Val Leu Val Val Ala

180 185 190

Cys Glu Val Asn Thr Leu Ile Phe Arg Gly Pro Glu Glu Arg Asp Phe

195 200 205

Gln Ser Leu Ala Ala Gln Val Ala Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Leu

210 215 220

Val Val Gly Ala Asp Pro Val Gln Gly Val Glu Lys Pro Ile Phe Glu

225 230 235 240

Ile Met Ala Ala Phe Pro Phe Thr Val Pro Glu Thr Gln Met Ala Val

245 250 255

Gly Gly Gln Leu Lys Gln Ile Gly Leu Thr Phe His Phe Ala His Gln

260 265 270

Leu Pro Gly Leu Ile Ala Asn Asn Leu Glu Thr Cys Leu Gly Glu Ala

275 280 285

Leu Lys Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Asp Val Phe Trp Val Ala

290 295 300

His Pro Gly Asn Trp Gly Ile Met Asp Ala Val Glu Ala Lys Leu Gly

305 310 315 320

Leu Glu Gln Gly Lys Leu Gln Ser Ser Arg His Val Phe Ser Glu Phe

325 330 335

Gly Asn Met Met Ser Ala Thr Val Leu Phe Val Met Asp Asp Val Arg

340 345 350

Lys Arg Ala Val Ala Glu Gly Ala Ala Thr Thr Gly Asp Gly Leu Lys

355 360 365

Trp Gly Val Leu Cys Ala Phe Gly Pro Gly Leu Ser Ile Glu Thr Leu

370 375 380

Val Leu Arg Ser Val Pro Leu

385 390

Claims

1.一种温郁金来源的姜黄素合成酶，其特征在于，所述酶的氨基酸序列为SEQ.ID NO.2所示。

2.一种权利要求1所述温郁金来源的姜黄素合成酶编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ.ID NO.1所示。

3.一种权利要求2所述温郁金来源的姜黄素合成酶编码基因构建的重组载体，其特征在于：所述重组载体为pYES2::CwPKS，是由SEQ.ID NO.1所示的姜黄素合成酶编码基因与pYES2载体连接得到。

4.一种由权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组基因工程菌为Saccharomyces cerevisiae BY4741/pESC-LEU::At4CL-ClDCS/pYES2::CwPKS，是由重组载体pYES2::CwPKS及pESC-LEU::At4CL-ClDCS转化至Saccharomycescerevisiae BY4741中得到。

5.如权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于，重组载体pESC-LEU::At4CL-ClDCS在酵母细胞中的表达可将阿魏酸生成阿魏酰二酮基辅酶A，为姜黄素和单去甲氧基姜黄素合成提供前体；重组载体pESC-LEU::At4CL-ClDCS在酵母细胞中的表达将二氢香豆酸生成二氢香豆酰二酮基辅酶A，为四氢双去甲氧基姜黄素提供前体。

6.一种权利要求1所述温郁金来源的姜黄素合成酶在制备姜黄素及其衍生物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含温郁金来源的姜黄素合成酶编码基因工程菌经诱导培养一段时间，在半乳糖诱导阶段加入底物阿魏酸诱导培养一段时间后生成姜黄素。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含温郁金来源的姜黄素合成酶编码基因工程菌经诱导培养一段时间，在半乳糖诱导阶段加入底物阿魏酸和香豆酸诱导培养一段时间后生成双去甲氧基姜黄素。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含温郁金来源的姜黄素合成酶编码基因工程菌经诱导培养一段时间，在半乳糖诱导阶段加入底物二氢香豆酸诱导培养一段时间后生成四氢双去甲氧基姜黄素。

10.如权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，诱导培养的条件为30℃、220rpm黑暗环境。