CN116004409A - 一种合成植物精油关键组分的重组菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种合成植物精油关键组分的重组菌及其构建方法与应用，该重组菌中含有外源基因；外源基因包括萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因；植物精油关键组分包括百里香酚和香芹酚。本发明通过导入萜类合成酶，细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因，成功地构建出一种可以合成百里香酚和香芹酚的重组菌，实现了百里香酚衍生物的异源合成。而且利用本发明的重组菌转化生产百里香酚和香芹酚，生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种合成植物精油关键组分的重组菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种合成植物精油关键组分的重组菌及其构建方法和应用。

背景技术

百里香酚又名麝香草酚，它主要来源于百里香属植物中，是百里香挥发油的主要组成成分，在香料领域,百里香酚具有特殊的香气,常用于配制各种香精,如柑桔、蘑菇香等。百里香酚不但广泛的应用在香料领域，又因为它具有防腐性，所以还可作为医疗药品，常出现在一些具有药用价值的卫生品中，如:牙膏、香皂等。同时百里香酚也可用来处理伤口,贮存解剖标本。此外，百里香酚还可作为抗氧剂、检定氮化钛用的特殊试剂，百里酚蓝指示剂的对比基准以及合成许多化学品的初级原料。百里香属包含300～400种芳香草本植物，其中大部分百里香属常用来治疗干咳、支气管炎、喉炎、消化不良。研究表明百里香属的生物活性作用主要来源于其酚羟基的结构，尤其是百里香和香芹酚这两种。百里香中的精油含量比香芹酚中的精油含量高很多，这类化合物比苯酚的抗菌活性高30倍，并且毒性比苯酚小4倍。

近年来百里香酚和香芹酚多用于制作香料，防腐剂，医疗用品和驱虫剂，研究表明百里香酚具有杀螨抑菌等多种生物活性，百里香酚对刺足根螨的杀毒作用，发现百里香酚对芽孢杆菌的生长具有明显的抑制作用。近年来，百里香酚衍生物得到了国内外研究学者的广泛关注，合成的百里香酚衍生物也越来越多。

目前市面上百里香酚及其衍生物的主要合成方式是化学合成，在生物合成方面仍有较大的发展空间，利用微生物合成百里香酚及其衍生物能有效的减少企业生产成本。因此，创建一条效率较高的百里香酚和香芹酚制备方法迫在眉睫。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种合成植物精油关键组分的重组菌及其构建方法和应用，通过该重组菌能够生产获得较高产量的百里香酚和香芹酚。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种合成植物精油关键组分的重组菌，该重组菌中含有外源基因；该外源基因包括萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因；

上述植物精油关键组分包括百里香酚和香芹酚。

第二方面，本发明提供了上述合成植物精油关键组分的重组菌的构建方法，其包括以下步骤：将经过密码子优化后的萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌中，即获得重组菌。

第三方面，本发明提供了上述重组菌应用，该应用包括利用上述重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过导入萜类合成酶，细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因，成功地构建出一种可以合成百里香酚和香芹酚的重组菌，实现了百里香酚衍生物的异源合成。而且利用本发明的重组菌转化生产百里香酚和香芹酚，生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明中百里香酚和香芹酚的合成途径；

图2为本发明中重组质粒构建示意图，其中图2-A为TvTPS2-PrTEFin-TvSDR1-T-pcfb4586，图2-B为TvTPS2-PrTEFin-TvCYP71D507-T-pcfb5791；

图3为实验例1的重组酵母干重数据对比；

图4为实验例2的重组酵母不同发酵时间产物分析；

图5为实验例2的发酵后重组酵母的产物含量对比；

图6为实验例3中不同的细胞色素p450基因构建的重组菌的产物含量对比。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种合成植物精油关键组分的重组菌，该重组菌中含有外源基因；该外源基因包括萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因；上述植物精油关键组分包括百里香酚和香芹酚。

在本发明中，发明人首次将百里香中的萜类合成酶，细胞色素P450以及短链脱氢酶基因导入出发菌中，使香叶基二磷酸在萜烯合成酶(TvTPS2)的作用下环化为γ-松油烯。细胞色素P450(TvCYP71D507-T)使γ-松油烯在C-3或C-6上羟基化，二烯醇中间体被短链脱氢酶(SDR)转化为相应的酮，合成途径如图1所示。

根据上述反应原理，发明人将编码萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因导入出发菌中，获得一种重组菌，再通过该重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚。

在一些实施方式中，萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因来源于百里香。

在一些实施方式中，重组菌的出发菌为酵母菌；较为优选地，该酵母菌为解脂耶氏酵母，具体地，该解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母pO1f菌株。

在本发明中，出发菌选择解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是由于其相比其他酵母具有更加高效的戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway)和乙酰-CoA代谢能力，能为细胞提供大量NADPH和底物用于合成脂肪酸，解脂耶氏酵母细胞含油量高，能达到干重的30％以上。并且，解脂耶氏酵母是能够工业生产的安全菌株，得到了美国FDA的GRAS认证，有成熟的发酵生产技术，是生产萜类物质的理想底盘生物。

为了获得上述重组菌，本发明还提供了该重组菌的构建方法，其包括将经过密码子优化后的萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌中，即获得重组菌。

在一些实施方式中，萜类合成酶包括TvTPS2，密码子优化后的TvTPS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一些实施方式中，细胞色素P450包括TvCYP71D507-T，密码子优化后的TvCYP71D507-T的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在研究过程中，发明人在多个细胞色素P450基因中筛选获得了能够与萜类合成酶及短链脱氢酶形成如图1的合成途径的基因TvCYP71D507-T，该包含有该基因的合成途径，不仅能合成百里香酚，还能同时合成香芹酚。

在一些实施方式中，短链脱氢酶包括TvSDR1-T，密码子优化后的TvSDR1-T的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明中，TvTPS2_、TvCYP71D507-T和TvSDR1-T均来源于百里香。由于原始的序列在构建重组菌中的会出现基因无法表达或表达效率极低的情况，发明人在获得TvTPS2_、TvCYP71D507-T和TvSDR1-T的氨基酸序列后，依据出发菌偏好性进行密码子优化，合成了三条优化后的核苷酸序列。

在一些实施方式中，表达载体包括pCfB4586质粒、pCfB4778质粒和pCfB5791质粒。

本发明中，将上述萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因进行三种基因组合共表达。对于导入携带上述酶的编码基因的质粒的方式，可以是其中任意两个编码基因存在于同一质粒上，还可以是三种基因分别存在于不同的质粒上，也可以是其他导入方式，对此本发明不做限定。

由于pCfB4586质粒、pCfB4778质粒和pCfB5791质粒中有特殊的启动子和终止子的原件，两两基因组合能达到效率最高并能将构建好的表达盒整体插入到特定的酵母基因组中。因此，较为优选地，将上述三种基因中的任意两种基因作为一组共同构建一个表达质粒。比如，将编码萜类合成酶和细胞色素P450的基因组合构建一个重组质粒，或是将编码萜类合成酶和短链脱氢酶的基因组合构建一个重组质粒，其构建示意图如图2所示。构建的重组质粒可以分别表示为TvTPS2-PrTEFin-TvSDR1-T-pcfb4586(图2-A)和TvTPS2-PrTEFin-TvCYP71D507-T-pcfb5791(图2-B)。

本发明还提供了上述重组菌的应用，该重组菌可通过发酵生产百里香酚和香芹酚。

在一些实施方式中，重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚的步骤包括：活化重组菌，然后将其接入液体培养基中，培养后将获取的菌液经过真空冷冻干燥、研磨，获得含有百里香酚和香芹酚的菌粉。

具体地，其步骤包括：将上述重组菌株在28℃过夜活化培养，之后测各自的OD600，将它们的OD600调整一致后取相同的菌液接入100mLYPD(即酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)液体培养基中，于25-30℃、200-220rpm培养36-72h，之后收取细胞菌液置于-80℃冰箱保存1天，然后置于真空冷冻干燥器中完全抽干，最终研磨获取各菌株的菌粉。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种合成植物精油关键组分的重组菌的构建方法，其步骤包括：

1.目的基因的获取

本实施例所需要的外源基因包括TvTPS2、TvCYP71D507-T和TvSDR1-T，均来源于百里香，经过密码子优化后的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

2.重组载体的构建

本实施例中采用的质粒为pCfB4586质粒和pCfB5791质粒。

将TvTPS2和TvCYP71D507-T的基因组合构建一个重组质粒，TvTPS2和TvSDR1-T的基因组合构建一个重组质粒。构建的重组质粒可以分别表示为TvTPS2-PrTEFin-TvSDR1-T-pcfb4586和TvTPS2-PrTEFin-TvCYP71D507-T-pcfb5791，其中TvTPS2-PrTEFin-TvSDR1-T-pcfb4586的构建方法如下：

(1)通过高保真酶Phusion U Hot Start DNA Polymerase进行PCR扩增出目的基因和启动子片段，引物见下表，体系如下：

反应程序为：98℃，1min→(98℃，10s→54℃，30s→72℃，1min)×35→72℃，5min→10℃，反应后的PCR液体经琼脂糖凝胶电泳，将各正确的目的片段回收，获取TvTPS2，PrTEFin，PrGPD，TvSDR1-T基因片段。

(2)酶切pCfB4586质粒，先用AsiSI酶切，体系如下表：

37℃反应2h后进行凝胶回收，再用Nb.BsmI酶切，酶切体系如下：

65℃反应1h，之后进行凝胶回收得到末端修饰的线性化质粒。

(3)用USER克隆方法将各基因片段组装到pCfB4586载体上，体系如下：

反应程序为：37℃，25min→25℃，10min→4℃，保温。将上述反应液转化到DH5α中，具体步骤参照。

(4)DH5α转化子的筛选与检测

挑取单克隆，用PR-14617/PR-14619引物进行菌落PCR检测，反应体系如下：

反应程序为：98℃，3min→(98℃，15s→56℃，15s→72℃，1min)×35→72℃，5min→12℃，保温。然后经DNA凝胶电泳检测，测序确认。

TvTPS2-PrTEFin-TvCYP71D507-T-pcfb5791的构建方法同TvTPS2-PrTEFin-TvSDR1-T-pcfb4586。上述构建过程中使用的引物如表1所示：

表1引物序列表

3.酵母转化和筛选

本实施例采用的酵母菌为解脂耶氏酵母pO1f菌株。

(1)提前一天将转化菌株划线于YPD平板上培养。

(2)取90μL PEG6000和5μL乙酸锂于1.5mL灭菌的EP管中，再向其中加入5μL于100℃处理5min的鲑鱼精。

(3)然后挑取绿豆大小的菌体于EP管中，震荡10-15s，之后再加入500ng的线性化表达质粒；震荡10-15s后30℃反应10min，再震荡10-15s，此过程重复3次，然后于39℃反应10min，最后向其中加入100μL灭菌的ddH2O，混匀后取100μL涂布与SC-ura平板上。

(4)放置于28℃培养箱培养2-4天长出单菌落。挑取转化后的酵母单菌划线于SC-ura平板的同时接入SC-ura培养基中，过夜培养后提取其基因组，作为模板，进行PCR检测相应基因是否整合到酵母基因组目的位点。

为了下一个质粒的顺利转化与单克隆的筛选，必须先去除步骤(4)中筛选得到的阳性克隆中的URA标签，由于构建的载体上URA的两端带有LoxP位点，因此使用cre-loxp系统去除URA标签。具体做法是：

向步骤(4)获得的阳性克隆中转入Cre质粒，转化后涂布于SC-leu平板上。放置于28℃培养箱培养2-4天长出单菌落。之后将长出的单克隆先划线于YPD固体平板上传代两轮，然后再将第二轮的克隆划线于YPD，SC-leu和SC-ura平板上，大约持续传代5-6轮就会有单克隆仅在YPD上生长，即去除标签的转化酵母。

经过多次转化的筛选，最终得到目的重组菌。

实施例2

本实施例提供的是实施例1获得重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚的方法，具体步骤如下：

将实施例1获得重组菌在28℃过夜活化培养，之后测各自的OD600，将它们的OD600调整一致后取相同的菌液接入100mLYPD液体培养基中，于28℃220rpm培养36h，之后收取细胞菌液置于-80℃冰箱保存1天，然后置于真空冷冻干燥器中完全抽干，最终研磨获取各菌株的菌粉。

实施例3

本实施例提供的是实施例1获得重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚的方法，具体步骤如下：

将实施例1获得重组菌在28℃过夜活化培养，之后测各自的OD600，将它们的OD600调整一致后取相同的菌液接入100mLYPD液体培养基中，于28℃220rpm培养48h，之后收取细胞菌液置于-80℃冰箱保存1天，然后置于真空冷冻干燥器中完全抽干，最终研磨获取各菌株的菌粉。

实施例4

本实施例提供的是实施例1获得重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚的方法，具体步骤如下：

将实施例1获得重组菌在28℃过夜活化培养，之后测各自的OD600，将它们的OD600调整一致后取相同的菌液接入100mLYPD液体培养基中，于28℃220rpm培养54h，之后收取细胞菌液置于-80℃冰箱保存1天，然后置于真空冷冻干燥器中完全抽干，最终研磨获取各菌株的菌粉。

实施例5

本实施例提供的是实施例1获得重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚的方法，具体步骤如下：

将实施例1获得重组菌在28℃过夜活化培养，之后测各自的OD600，将它们的OD600调整一致后取相同的菌液接入100mLYPD液体培养基中，于28℃220rpm培养60h，之后收取细胞菌液置于-80℃冰箱保存1天，然后置于真空冷冻干燥器中完全抽干，最终研磨获取各菌株的菌粉。

实施例6

本实施例提供的是实施例1获得重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚的方法，具体步骤如下：

将实施例1获得重组菌在28℃过夜活化培养，之后测各自的OD600，将它们的OD600调整一致后取相同的菌液接入100mLYPD液体培养基中，于28℃220rpm培养72h，之后收取细胞菌液置于-80℃冰箱保存1天，然后置于真空冷冻干燥器中完全抽干，最终研磨获取各菌株的菌粉。

实施例7

本实施例提供的是实施例1获得重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚的方法，具体步骤如下：

将实施例1获得重组菌在28℃过夜活化培养，之后测各自的OD600，将它们的OD600调整一致后取相同的菌液接入100mL YPD液体培养基中，于28℃220rpm培养84h，之后收取细胞菌液置于-80℃冰箱保存1天，然后置于真空冷冻干燥器中完全抽干，最终研磨获取各菌株的菌粉。

实验例1

检测实施例2-7与中发酵培养获得的酵母干重，结果如图3所示。

从图3中可以看出，在发酵60h后酵母的干重可达20g/L以上。

实验例2

将实施例3-6与获得的菌粉经气相色谱检测相应菌株的产物，具体方法如下：

1.将冻干后的样品称取5mg至5ml玻璃瓶中；

2.向玻璃瓶中加入2ml乙酸乙酯，超声提取90min(温度不超过30℃)；

3.将超声后的样品4000rpm离心10min中取上清液；

4.上清液使用0.22μm的有机相滤膜过滤后转移至气象瓶中。

气相色谱检测条件：

色谱柱:毛细管色谱柱(5％二苯基/95％二甲基聚硅氧烷)，30.0mX0.25mm×0.25μm，或性能相当者；

升温程序:80℃保持1min，以10℃/min升至120℃，再以5℃/min升至145℃，最后以35℃/min升至250℃，保持2min；

载气流速:1.0mL/min(恒流模式)；

进样体积:1μL(不分流进样)；

进样口温度:250℃；

检测器温度:300℃；

氢气流量:30mL/min；

空气流量:300mL/min；

尾吹气流量:30mL/min。

检测结果如图4和图5所示。从中可以看出，通过导入TvTPS2，TvCYP71D507-T，TvSDR1-T构建萜类合成途径，成功在解脂耶氏酵母中产出百里香酚和香芹酚，百里香酚和香芹酚总产量可达到2mg/kg。

实验例3

本实验例将细胞色素p450基因CYP71D179、TvCYP71D180v1T分别与TvTPS2和TvSDR1-T组合构建重组菌，CYP71D179、TvCYP71D180v1T基因来源于百里香，经过密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。所选择的质粒均为pCfB5791，构建的重组质粒分别为TvTPS2-PrTEFin-CYP71D179–pcfb5791和TvTPS2-PrTEFin-TvCYP71D180v1T–pcfb5791其构建方法同实施例1。构建过程中涉及的引物的序列如表2所示：

表2CYP71D179和TvCYP71D180v1T的引物序列

然后将构建的重组菌按照实施例2的发酵方法生产百里香酚和香芹酚。其结果与实施例1构建的重组菌的生产结果作对比，结果如图6所示。其中，TvCYP71D507-T简写为507-T；CYP71D179简写为179；TvCYP71D180v1T简写为180v1t。

从图6中可以看出，不同的细胞色素p450基因构建的重组菌对产物有重要影响。当导入的基因是CYP71D179时，只能生产较少的香芹酚；当导入的基因是TvCYP71D180v1T时，只能生产较少的百里香酚；而当导入的基因是TvCYP71D507-T时，生产的百里香酚及香芹酚含量最高，并且能实现同时获得两种产物。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种合成植物精油关键组分的重组菌，其特征在于，所述重组菌中含有外源基因；所述外源基因包括萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因；

所述植物精油关键组分包括百里香酚和香芹酚。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因来源于百里香。

3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的出发菌为酵母菌；

优选地，所述酵母菌包括解脂耶氏酵母pO1f。

4.如权利要求1-3任一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将经过密码子优化后的萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌中，即获得所述重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述萜类合成酶包括TvTPS2，密码子优化后的TvTPS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述细胞色素P450包括TvCYP71D507-T，密码子优化后的TvCYP71D507-T的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求6所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述短链脱氢酶包括TvSDR1-T，密码子优化后的TvSDR1-T的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.根据权利要求4所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述表达载体包括pCfB4586质粒、pCfB4778质粒和pCfB5791质粒；

优选地，所述萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因中任意两个基因连接在同一表达载体上。

9.如权利要求1-3任一项所述的重组菌或权利要求4-8任一项所述的重组菌的构建方法获得的重组菌的应用，其特征在于，所述重组菌通过发酵生产百里香酚和香芹酚。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚的步骤包括：活化重组菌，然后将其接入液体培养基中，培养后将获取的菌液经过真空冷冻干燥、研磨，获得含有百里香酚和香芹酚的菌粉；

优选地，所述液体培养基包括酵母浸出粉胨葡萄糖培养基；

优选地，所述重组菌培养条件为：在25-30℃，180-400rpm下培养24-96h。

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