CN105331550B - 一种产青蒿二烯的重组真核菌株及利用该重组真核菌株制备青蒿二烯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种产青蒿二烯的重组真核菌株及利用该重组真核菌株制备青蒿二烯的方法。本发明提供的产青蒿二烯的重组真核菌株，在真核菌株的基因组中整合表达3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因、表达FPP合酶的基因、和表达青蒿二烯合酶的基因；该整合为整合在真核菌株的基因组的多拷贝位点。本发明提供的产青蒿二烯的重组真核菌株属于整合型重组菌株，该重组菌株显著提高了青蒿二烯的产量，更有利于青蒿二烯的生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种产青蒿二烯的重组真核菌株及利用该重组真核菌株制备青蒿二烯的方法。
背景技术
天然化合物主要从以下几个途径得到：(1)从植物中提取；(2)利用化学合成的方法合成；(3)利用合成生物学手段合成。合成生物学是生产大规模且性能稳定的天然化合物的新学科，为直接从植物中提取和化学全合成的一个重要替代方式，这种方式主要是通过基因工程手段将天然化合物合成途径的相关酶基因导入到酵母、大肠杆菌或者植物等一些常用的模式底盘细胞中，在底盘细胞中重新构建可以生产天然化合物的途径，进而表达天然化合物。
青蒿素及其相关衍生物已被世界卫生组织认定为目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物。青蒿二烯(Amorphadiene)是青蒿素的重要前体化合物之一，其分子式为C15H24，是典型的倍半萜类化合物。青蒿二烯经过开环过氧化，可形成倍半萜类过氧化内酯化合物青蒿素。合成生物学手段是获得青蒿二烯的重要途径之一。
研究发现，青蒿植物中青蒿二烯的积累分两个步骤：(1)生成法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate,FPP)；(2)青蒿二烯合成酶(amorpha-4,11-diene synthase,ADS)催化FPP经过两步环化反应形成青蒿素的中间体紫穗槐-4,11-二烯。其中，FPP作为倍萜类化合物的共同前体，它的合成主要通过两条独立的生物途径：存在于真核生物、古生菌和一些原核生物内的甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径以及细菌和光合真核生物的2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径。所以，这两个途径，以及途径中关键的酶是利用合成生物学技术合成青蒿二烯的关键。
目前，用于青蒿二烯合成生物学研究的底盘细胞主要有大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)、植物细胞和其他微生物。其中，应用最广泛的是大肠杆菌和酿酒酵母。大肠杆菌中存在唯一的萜类合成途径MEP途径，而且已经有研究表明，MEP途径在萜类合成方面具有更大的潜力，适合合成萜类化合物碳骨架，大肠杆菌是较早被广泛应用于青蒿素半合成的微生物底盘细胞。2003年，Keasling课题组将重构的MVA途径导入E.coli体内，得到可以生产青蒿二烯的人工细胞。随后，Keasling课题组又经过一系列底盘改造和发酵优化，最终得到青蒿二烯产量为27.4g/L的人工大肠杆菌细胞。2014年，汪建峰等通过引入外源MEP途径基因改造大肠杆菌底盘细胞，同时优化发酵过程，得到可以生产青蒿二烯6.1g/L的人工大肠杆菌细胞。但是由于大肠杆菌体系缺少糖基化和翻译后修饰等功能，不利于青蒿二烯后续生产中的修饰，限定了其应用。
所以，更多研究者选择生长繁殖速度快，基因操作简单，可以进行大规模发酵生产的酵母作为研究底盘。根据重组菌株的构建方式，在利用酵母作为合成生物学中的底盘细胞时，将外源基因导入底盘细胞后得到两种重组工程菌：附加体型重组菌株和整合体型重组菌株。针对表达青蒿二烯的重组菌株，2009年孔建强等在药学学报《酵母工程菌制备紫穗槐-4,11-二烯的研究》中报道了附加体型酵母工程菌产青蒿二烯的产量要高于整合体型酵母工程菌。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种产青蒿二烯的重组真核菌株及利用该重组真核菌株制备青蒿二烯的方法。本发明提供的产青蒿二烯的重组真核菌株属于整合型重组菌株，该产青蒿二烯的重组真核菌株的青蒿二烯产量高，且其底盘细胞为真核菌，更有利于青蒿二烯的后续生产。
为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种产青蒿二烯的重组真核菌株，在该真核菌株的基因组中整合表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因、表达FPP合酶的基因、和表达青蒿二烯合酶的基因；
该整合为整合在该真核菌株的基因组的多拷贝位点。
在本发明中，所述表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因是指该基因的表达产物具有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，其催化甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径中的中间产物HMG-CoA(hydroxyl-methyl-glutaryl-CoA)生成甲羟戊酸(mevalonate)。
在本发明中，所述表达FPP合酶的基因是指该基因的表达产物具有FPP合酶的活性，其催化IPP和DMAPP通过缩合形成GPP，GPP再与IPP缩合形成半萜类物质的共同前体FPP。
在本发明中，所述表达青蒿二烯合酶的基因是指该基因的表达产物具有青蒿二烯合酶的活性，其催化FPP经过两步环化反应形成青蒿二烯。
在本发明中，所述表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因、所述表达FPP合酶的基因、所述表达青蒿二烯合酶的基因既可以是野生型的也可以是变异的，只要其表达产物保留该酶的活性即可。
优选地，本发明提供的重组真核菌株中，该真核菌株为酵母菌。在本发明的一些实施例中，该真核菌株为酿酒酵母。在本发明的另外一些实施例中，为酿酒酵母CEN.PK2-1C。
优选地，本发明提供的重组真核菌株中，该多拷贝位点为Delta位点。
优选地，本发明提供的重组真核菌株中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因、表达FPP合酶的基因和表达青蒿二烯合酶的基因中至少一种是外源基因。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中，表达青蒿二烯合酶的基因为外源基因，是参考GeneBank ID.AF-138959报道的序列信息，经过密码子优化获得。在本发明的另外一些实施例中，该表达青蒿二烯合酶的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，标记为ADS基因。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中，表达截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因来自于酿酒酵母基因组。在本发明的另外一些实施例中，该表达截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因来自于酿酒酵母BY4741基因组，标记为tHMGR基因。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中，表达FPP合酶的基因来自于酿酒酵母基因组。在本发明的另外一些实施例中，该表达FPP合酶的基因来自于酿酒酵母BY4741基因组，标记为ERG20基因。
优选地，本发明提供的重组真核菌株中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因、表达FPP合酶的基因和表达青蒿二烯合酶的基因中至少一种以表达盒的形式整合到真核菌株的基因组中。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因以表达盒的形式整合到真核菌株的基因组中，并且该表达盒包含启动子、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因、终止子。
优选地，本发明提供的重组真核菌株中，当表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因以表达盒的形式整合到真核菌株的基因组中时，其中的启动子为真菌菌株内源组成型强启动子。更为优选地，该启动子为TEF1、TPI1或GPM1。在本发明的一些实施例中，具体为TEF1。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中，当表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因以表达盒的形式整合到真核菌株的基因组中时，其中的终止子为TEF1、TPI1或GPM1。在本发明的另外一些实施例中，具体为TEF1。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中，表达FPP合酶的基因以表达盒的形式整合到该真核菌株的基因组中时，并且该表达盒包括启动子、表达FPP合酶的基因、终止子。
优选地，本发明提供的重组真核菌株中，当表达FPP合酶的基因以表达盒的形式整合到所述真核菌株的基因组中时，其中的启动子为真核菌株内源中强型启动子。更为优选地，该启动子为GPM1、TPI1、FBA1或GPD1。在本发明的一些实施例中，具体为GPM1。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中，当表达FPP合酶的基因以表达盒的形式整合到所述真核菌株的基因组中时，其中的终止子为TPI1、TEF1、GPM1、FBA1或GPD1。在本发明的一些实施例中，具体为TPI1。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中，表达青蒿二烯合酶的基因以表达盒的形式整合到真核菌株的基因组中，且该表达盒包括启动子、表达青蒿二烯的基因、终止子。
优选地，本发明提供的重组真核菌株中，当表达青蒿二烯合酶的基因以表达盒的形式整合到真核菌株的基因组中时，其中的启动子为真核菌株内源性启动子。更为优选地，该启动子为ENO2、PGK1、TEF2或PDC1。在本发明的一些实施例中，具体为PDC1。
优选地，本发明提供的重组真核菌株中，当表达青蒿二烯合酶的基因以表达盒的形式整合到真核菌株的基因组中时，其中的终止子为真核菌株内源性终止子。更为优选地，该类型的终止子为GPM1、ENO2、TPI1、TEF1、FBA1或GPD1。在本发明的一些实施例中，具体为GPM1。
优选地，本发明提供的重组真核菌株中，当表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒和表达青蒿二烯合酶的基因表达盒以基因功能模块的形式整合到所述多拷贝位点。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒和表达青蒿二烯合酶的基因表达盒以基因功能模块的形式整合到所述多拷贝位点时，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒和表达青蒿二烯合酶的基因表达盒在基因功能模块中的排列顺序不固定。各个基因表达盒之间可以通过一段短的核苷酸序列连接，例如终止子，也可以直接相连。在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中，三个基因表达盒在基因功能模块中的排列顺序为：表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒、表达青蒿二烯合酶的基因表达盒的前后顺序排列。
优选地，本发明提供的重组真核菌株中的整合到多拷贝位点的上述基因功能模块中还可以包括筛选标记基因，以便于重组菌株的筛选，筛选标记可以为Lue、His、Trp或Ura。在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中的基因功能模块中的筛选标记为URA3基因。本发明提供的重组真核菌株中的基因功能模块中表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒、表达青蒿二烯合酶的基因表达盒、筛选标记基因在基因功能模块中的排列顺序不固定。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株中，整合到多拷贝位点的基因功能模块包括以下基因：筛选标记基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒、表达青蒿二烯合酶的基因表达盒，在重组菌株基因组中的排列顺序(5’-3’)如下所示：
DNA分子1—DNA分子2—DNA分子3—DNA分子4
其中，DNA分子1代表筛选基因；DNA分子2代表表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒；DNA分子3代表表达FPP合酶活性的基因表达盒；DNA分子4代表表达青蒿二烯合酶的基因表达盒。其中，DNA分子1、DNA分子2直接相连；DNA分子2、DNA分子3直接相连；DNA分子3、DNA分子4之间通过终止子连接。在本发明的一些实施例中，连接DNA分子3、DNA分子4的终止子为ENO2。
本发明还提供了一种本发明提供的重组真核菌株的构建方法，包括：
步骤1：获得表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒、表达青蒿二烯合酶的基因表达盒；
步骤2：取步骤1所得的表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒、表达青蒿二烯合酶的基因表达盒，导入真核菌株底盘细胞中，经同源重组，即得。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株的构建方法，包括：
步骤1：获得筛选基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒、表达青蒿二烯合酶的基因表达盒；
步骤2：取步骤1所得的筛选基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒、表达青蒿二烯合酶的基因表达盒，导入真核菌底盘细胞中，经同源重组，即得。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株的构建方法中，步骤1中的筛选基因的5’端连接有真核菌底盘细胞整合位点第一同源臂序列，在其3’端连接有一个终止子。该终止子的作用是为筛选基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒在真核菌株底盘细胞中发生同源重组时提供同源臂。在本发明的一些实施例中，该终止子具体为CYC1。该真核菌底盘细胞整合位点第一同源臂序列的作用是为真核菌底盘细胞基因组、重组DNA分子发生同源重组时提供同源臂。在本发明的另外一些实施例中，该第一同源臂序列为能与Delta位点发生同源重组的序列，标记为Delta1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株的构建方法中，步骤1中的表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒的5’端连接有一个终止子，该终止子的作用是为筛选基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒在真核菌株底盘细胞中发生同源重组时提供同源臂，该终止子与筛选基因3’端连接的终止子相同，使得筛选基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒在真核菌株底盘细胞中发生同源重组，前后依次相连。在本发明的一些实施例中，该终止子具体为CYC1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株的构建方法中，步骤1中的表达FPP合酶活性的基因表达盒的5’端连接有一个终止子，该终止子的作用是为表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒在真核菌底盘细胞中发生同源重组时提供同源臂，该终止子与表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒中的终止子相同，使得表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒在真核菌株底盘细胞中发生同源重组，前后依次相连。在本发明的一些实施例中，该终止子具体为TEF1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组真核菌株的构建方法中，为了在步骤2中的同源重组时，为连接表达FPP合酶活性的基因表达盒与表达青蒿二烯合酶的基因表达盒提供同源臂，步骤2中的导入步骤中，还包括导入一段DNA分子；在步骤2的同源重组过程中该DNA分子的5’端与表达FPP合酶活性的基因表达盒的3’端发生同源重组，相连接；该DNA分子的3’端与表达青蒿二烯合酶的基因表达盒的5’端发生同源重组，相连接，最终实现了将表达FPP合酶活性的基因表达盒与表达青蒿二烯合酶的基因表达盒连接起来。在本发明的另外一些实施例中，该DNA分子由两个终止子组成，位于该DNA分子的5’端的终止子与表达FPP合酶活性的基因表达盒中的3’端的终止子相同。在本发明的另外一些实施例中，该DNA分子的5’端的终止子为TPI1。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的DNA分子由终止子TPI1和终止子ENO2组成，其中，终止子TPI1位于该DNA分子的5’端。
在本发明的另外一些实施例中，步骤1中的表达青蒿二烯合酶的基因表达盒的5’端连接有一个终止子，3’端连接有一个真核菌株底盘细胞整合位点第二同源臂序列。该终止子的作用是为表达FPP合酶活性的基因表达盒、表达青蒿二烯合酶的基因表达盒在真核菌底盘细胞中发生同源重组时提供同源臂。在本发明的另外一些实施例中，该终止子与为连接表达FPP合酶活性的基因表达盒、表达青蒿二烯合酶的基因表达盒提供同源臂的DNA分子的3’端的终止子相同。在本发明的另外一些实施例中，该终止子具体为ENO2。该真核菌底盘细胞整合位点第二同源臂序列的作用是为真核菌底盘细胞基因组、重组DNA分子发生同源重组时提供同源臂。在本发明的另外一些实施例中，该第二同源臂序列为能与基因组Delta位点发生同源重组的序列，标记为Delta2。
在本发明的另外一些实施例中，按照本发明提供的重组真核菌株的构建方法，筛选基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒、为连接表达FPP合酶活性的基因表达盒与表达青蒿二烯合酶的基因表达盒提供同源臂的DNA分子、表达青蒿二烯合酶的基因表达盒提供同源臂的DNA分子整合到真核菌株底盘细胞的基因组多拷贝位点之后所得的重组真核菌株中，整合到真核菌底盘细胞的基因组多拷贝位点的基因功能模块包括：筛选标记基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒、表达FPP合酶活性的基因表达盒和表达青蒿二烯合酶的基因表达盒，其在重组菌株基因组中的排列顺序(5’-3’)如下所示：
DNA分子1—DNA分子2—DNA分子3—DNA分子4
其中，DNA分子1代表筛选基因；DNA分子2代表表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒；DNA分子3代表表达FPP合酶活性的基因表达盒；DNA分子4代表表达青蒿二烯合酶的基因表达盒。其中，DNA分子1、DNA分子2直接相连；DNA分子2、DNA分子3直接相连；DNA分子3、DNA分子4之间通过一个终止子连接，整合到真核菌株底盘细胞的基因组多拷贝位点为Delta位点。
本发明还提供了一种利用本发明提供的重组真核菌株制备青蒿二烯的方法，该重组真核菌株为在其真核菌株的基因组中整合表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因、表达FPP合酶的基因、和表达青蒿二烯合酶的基因；该整合为整合在上述真核菌株基因组的多拷贝位点；
该制备青蒿二烯的方法包括：
取所述重组真核菌株，接种到发酵培养基中，经发酵培养、分离、收集青蒿二烯，即得。
优选地，本发明提供的制备青蒿二烯的方法中，当真核菌株为亮氨酸、组氨酸和色氨酸缺陷型酿酒酵母时，发酵培养基为尿嘧啶缺陷SC培养基；
其包括：葡萄糖、YNB培养基、氨基酸混合物、亮氨酸、组氨酸、色氨酸；亮氨酸的浓度为0.8g/L～1.2g/L；组氨酸的浓度为0.16g/L～0.24g/L；色氨酸的浓度为0.16g/L～0.24g/L。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，当真核菌株为亮氨酸、组氨酸和色氨酸缺陷型酿酒酵母时，发酵培养基中亮氨酸的浓度为1g/L。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，当真核菌株为亮氨酸、组氨酸和色氨酸缺陷型酿酒酵母时，发酵培养基中组氨酸的浓度为0.2g/L。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，当真核菌株为亮氨酸、组氨酸和色氨酸缺陷型酿酒酵母时，发酵培养基中色氨酸的浓度为0.2g/L。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备青蒿二烯的方法中，当真核菌株为亮氨酸、组氨酸和色氨酸缺陷型酿酒酵母时，该酿酒酵母具体为CEN.PK2-1C。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备青蒿二烯的方法中，当真核菌株为酿酒酵母CEN.PK2-1C时，该方法包括：
取重组真核菌株，接种到发酵培养基中，在28℃～32℃、pH5.5～pH6.0的条件下，发酵8h～12h之后，加入十二烷后，经两相培养、分离、收集青蒿二烯，即得；
其中发酵培养基为尿嘧啶缺陷SC培养基，其包括：葡萄糖、YNB培养基、氨基酸混合物、亮氨酸、组氨酸、色氨酸；
其中，亮氨酸的浓度为0.8g/L～1.2g/L；组氨酸的浓度为0.16g/L～0.24g/L；色氨酸的浓度为0.16g/L～0.24g/L。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，当真核菌株为CEN.PK2-1C时，发酵的温度为30℃。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，当真核菌株为CEN.PK2-1C时，发酵的pH值为5.8。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，当真核菌株为CEN.PK2-1C时，发酵的时间为10h。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，当真核菌株为CEN.PK2-1C时，在发酵过程中，当发酵液中葡萄糖的浓度为1g/L～3g/L时，向所述发酵液中葡萄糖；当菌液生长进入平台期后，加入无菌YNB溶液亮氨酸、组氨酸和色氨酸。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，当真核菌株为CEN.PK2-1C时，两相培养的温度为28℃～32℃。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，两相培养的温度为30℃。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，当真核菌株为CEN.PK2-1C时，两相培养的pH值为pH5.5～pH6.0。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，两相培养的pH值为5.8。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，当真核菌株为CEN.PK2-1C时，两相培养的时间为150h～170h。在本发明的另外一些实施例中，两相培养的时间为169h。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，当真核菌株为CEN.PK2-1C时，当发酵液中葡萄糖的浓度为1g/L～3g/L时，向所述发酵液中加入葡萄糖，至葡萄糖的浓度为初始发酵培养基中葡萄糖的浓度；当菌液生长进入平台期时，向发酵液中加入无菌YNB溶液、亮氨酸、组氨酸和色氨酸，亮氨酸的浓度为初始发酵培养基中亮氨酸的浓度、组氨酸的浓度为初始发酵培养基中组氨酸的浓度，色氨酸的浓度为初始发酵培养基中色氨酸的浓度。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，加入葡萄糖的方式为批式补料。
本发明提供了一种产青蒿二烯的重组真核菌株及利用该重组菌株制备青蒿二烯的方法。本发明提供的产青蒿二烯的重组真核菌株，在真核菌株的基因组中整合表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因、表达FPP合酶的基因、和表达青蒿二烯合酶的基因；该整合为整合在该真核菌株的基因组的多拷贝位点。本发明提供的产青蒿二烯的重组真核菌株属于整合型重组菌株，实验结果证实，该重组菌株的青蒿二烯的产量高，当采用本发明提供的发酵罐培养方法生产青蒿二烯时，青蒿二烯的产量进一步提高，其产量高达1.05g/L，显著提高了青蒿二烯的产量，更有利于青蒿二烯的生产。
附图说明
图1示实施例1中的各个重组载体的质粒图谱；其中图1-A为重组表达载体pRS425K:TCYC1-PTEF1-tHMGR-TTEF1图谱；图1-B为重组表达载体pRS425K：TTEF1-PGPM1-ERG20-TTPI1的图谱；图1-C为重组表达载体pRS425K:TENO2-PPDC1-ADS-TGPM1-Delta2的图谱；
图2示实施例1中，PCR验证重组菌株正确性的验证结果，其中泳道1-3为转化子1的扩增产物；泳道4-6为转化子2的扩增产物；泳道7-9为转化子3的扩增产物；泳道10-12为转化子4的扩增产物；泳道13-15为转化子5的扩增产物；
图3示实施例1中，重组菌株构建过程中发生的同源重组；其中图3-A为各个DNA分子片段之间在底盘细胞中发生同源重组的方式；图3-B为各个DNA分子片段整合到底盘细胞基因组中的整合位点以及同源重组方式；
图4示实施例2中，摇瓶发酵过程中重组酿酒酵母菌的生长曲线；
图5示实施例2中，摇瓶发酵过程中提取获得的产物的GC-TOF/MS检测结果；其中图5-A为该产物的气相色谱图，其中出峰时间为10.33min所对应的峰为目标产物峰；图5-B为该产物的质谱谱图；
图6示实施例2中，发酵罐培养中，各个组别各个发酵时间点产青蒿二烯的情况，其中曲线1为实验组；曲线2为对照组；
图7示实施例2中，发酵罐培养中，各个组别的生长曲线见图7，其中曲线1为对照组的生长曲线；曲线2为实验组的生长曲线；
图8示实施例2中，发酵罐培养过程中，实验组发酵过程中葡萄糖的补料过程与菌液生长曲线的对应情况，其中曲线1为实验组的生长曲线，曲线2为实验组发酵罐中葡萄糖浓度变化曲线；
图9示实施例2中，发酵罐培养过程中，实验组菌液生长曲线与青蒿二烯的产量的对应情况，其中曲线1代表实验组各个取样点青蒿二烯的产量；曲线2代表实验组菌株生长曲线；
图10示实施例2中，发酵罐培养过程中，对照组发酵过程中葡萄糖的补料过程与菌液生长曲线的对应情况，其中曲线1为对照组的生长曲线，曲线2为对照组发酵罐中葡萄糖浓度变化曲线；
图11示实施例2中，发酵罐培养过程中，对照组菌液生长曲线与青蒿二烯的产量的对应情况，其中曲线1代表对照组各个取样点青蒿二烯的产量；曲线2代表对照组菌株生长曲线；
图12示实施例3中，提取获得的产物的GC-TOF/MS检测结果；其中，图12-A为该产物的气相色谱图，其中出峰时间为10.34min所对应的峰为目标产物峰；图12-B为该产物的质谱谱图；
图13示实施例4中，提取获得的产物的GC-TOF/MS检测结果；其中，图13-A为该产物的气相色谱图，其中出峰时间为10.34min所对应的峰为目标产物峰；图13-B为该产物的质谱谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种产青蒿二烯的重组真核菌株及利用该重组菌株制备青蒿二烯的方法。本领域技术人员可以参考本文内容，获得该重组菌株，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种产青蒿二烯的重组真核菌株及利用该重组菌株制备青蒿二烯的方法中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 重组真核菌株的构建
(1)基因表达模块的构建
步骤一：pRS425K-启动子-终止子模块的构建：
以酿酒酵母BY4741基因组DNA为引物利用特异性引物克隆得到启动子和终止子单元，以及Delta同源臂区域；以Kan抗性基因序列替换原有的pRS425质粒中Amp抗性基因序列，所得质粒成为pRS425K，用限制性内切酶NotI线性化，作为后续构建的载体。
同源臂单元模块LDL的构建：Delta上游序列Delta1，URA3基因序列以及不同终止子单元序列以overlap PCR方式扩增，用限制性内切酶NotI消化，与线性化的载体pRS425K经T4连接酶连接，按照此方法获得重组载体pRS425K:Delta1-URA3-TCYC1。基因表达盒模块LD构建(带有Delta下游序列)：终止子1，启动子，终止子2，Delta下游序列Delta2经overlapPCR方法扩增得到，终止子1序列上游含有NotI和PstI位点，终止子2序列下游有BamHI位点，Delta2序列下游含有NotI位点。用限制性内切酶NotI消化，与线性化载体pRS425K经T4连接酶连接。其中终止子1和2不同，终止子1作为同源臂，与同源臂单元模块中对应的终止子相连，启动子和终止子2之间加入BsaI酶切位点，用于后续功能基因的插入；按照此方法获得pRS425K-TCYC1-PTEF1-TTEF1-Delta2,pRS425K-TENO2-PPDC1-TGPM1-Delta2,pRS425K-TTEF1-PGPM1-TTPI1-Delta2模块。基因表达盒模块LD构建：用限制性内切酶PstI和BamHI消化pRS425K-TENO2-PPDC1-TGPM1-Delta2,pRS425K-TTEF1-PGPM1-TTPI1-Delta2模块，得到pRS425K-TCYC1-PTEF1-TTEF1模块、pRS425K-TTEF1-PGPM1-TTPI1模块。同源连接模块的构建：overlap PCR的方法得到TTPI1-TENO2的扩增片段，以BamHI和PstI消化，与线性化载体pRS425K连接。得到：重组质粒pRS425K：TTPI1-TENO2。
步骤二：tHMGR基因的获得与重组子的构建：
以酿酒酵母BY4741基因组DNA为模板(来源于实验室保存)，用含BsaI酶切位点的特异性引物通过PCR扩增得到tHMGR基因扩增产物，用限制性内切酶BsaI对PCR后纯化产物进行酶切，得到tHMGR基因片段；
取所得tHMGR基因片段，通过T4连接酶与经BsaI酶切的本实验室构建的pRS425K-启动子-终止子模块(pRS425K-TCYC1-PTEF1-TTEF1模块)连接，得到重组子，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，得重组菌株，保存菌种。将所得菌株进行测序，测序正确，说明本实施例成功获得了tHMGR基因重组表达载体，该载体中含有以下基因片段：CYC1终止子、TEF1启动子、tHMGR基因、TEF1终止子，各个片段依次连接，所得载体标记为重组表达载体pRS425K:TCYC1-PTEF1-tHMGR-TTEF1，其图谱见图1-A，该重组表达载体中含有的重组基因具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列(即CYC1终止子、TEF1启动子、tHMGR基因、TEF1终止子依次相连所得核苷酸序列)。
步骤三：ERG20基因的获得与重组子的构建：
以酿酒酵母BY4741基因组DNA为模板，用含BsaI酶切位点的特异性引物通过PCR扩增得到ERG20基因扩增产物，用限制性内切酶BsaI对PCR后纯化产物进行酶切，得到ERG20基因片段；
将所得ERG20基因片段，通过T4连接酶与经BsaI酶切的本实验室构建的pRS425K-启动子-终止子模块(pRS425K-TTEF1-PGPM1-TTPI1模块)连接，得到重组子，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，得重组菌株，保存菌种。将所得菌株进行测序，测序正确，说明本实施例成功获得了ERG20基因重组表达载体，该载体中含有以下基因片段：TEF1终止子、GPM1启动子、ERG20基因、TPI1终止子，各个片段依次连接，所得重组载体标记为重组表达载体pRS425K：TTEF1-PGPM1-ERG20-TTPI1，其图谱见图1-B，该重组表达载体中含有的重组基因具有如SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列(TEF1终止子、GPM1启动子、ERG20基因、TPI1终止子依次相连所得核苷酸序列)。
步骤四：TTPI1-TENO2片段的获得与重组子的构建：
以BY4741基因组DNA为模板，用特异性引物通过PCR扩增得到终止子TPI1基因片段，标记为TTPI1。用特异性引物通过PCR扩增得到终止子ENO2基因片段，标记为TENO2。用overlap PCR的方法得到TTPI1-TENO2的扩增片段，以BamHI和PstI对分别所得扩增片段和载体pRS425K分别进行酶切，分别纯化回收酶切片段，之后以T4连接酶连接，得到重组子，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，得重组菌株，保存菌种。将所得菌株进行测序，测序正确，说明本实施例成功获得了TTPI1-TENO2重组表达载体，该载体中含有以下基因片段：TPI1终止子、ENO2终止子，各个片段依次连接，所得重组质粒标记为：重组质粒pRS425K：TTPI1-TENO2，该重组质粒中含有的重组基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列(TPI1终止子、ENO2终止子依次相连所得核苷酸序列)。
步骤五：ADS基因的获得与重组子的构建：
外源基因ADS基因是参考GeneBank ID.AF-138959报道的序列信息，经过密码子优化获得，所得ADS基因具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。利用Genewiz公司合成的60bpOligo，使用overlap PCR方法合成得到。利用BsaI限制性内切酶分别对ADS基因和pRS425K-启动子-终止子元件(pRS425K-TENO2-PPDC1-TGPM1-Delta2)进行酶切，纯化回收酶切产物，经T4连接酶连接得到重组子，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，得重组菌株，保存菌种。将所得菌株进行测序，测序正确，说明本实施例成功获得了ADS基因重组表达载体，该载体中含有如下基因片段：ENO2终止子、PDC1启动子、ADS基因、GPM1终止子、Delta2片段，各个片段依次连接，所得重组载体标记为重组表达载体pRS425K:TENO2-PPDC1-ADS-TGPM1-Delta2，该重组表达载体的图谱见图1-C，该重组表达载体中含有的重组基因具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列(ENO2终止子、PDC1启动子、ADS基因、GPM1终止子、Delta2片段依次相连所得核苷酸序列)。
重组载体pRS425K:Delta1-URA3-TCYC1，该载体中含有如下基因片段：Delta1片段、URA3基因、CYC1终止子，各个片段依次连接，该重组载体中含有的重组基因具有如SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列(即Delta1片段、URA3基因、CYC1终止子，各个片段依次连接所得的DNA分子序列)。
(2)产青蒿二烯的重组真核菌株的获得：
各个基因片段的获得：
取步骤(1)所得的各个重组载体：重组表达载体pRS425K:TCYC1-PTEF1-tHMGR-TTEF1、重组表达载体pRS425K:TTEF1-PGPM1-ERG20-TTPI1、重组质粒pRS425K:TTPI1-TENO2、重组表达载体pRS425K:TENO2-PPDC1-ADS-TGPM1-Delta2表达载体，分别用BamHI和PstI进行双酶切，即可得到片段TCYC1-PTEF1-tHMGR-TTEF1、TTEF1-PGPM1-ERG20-TTPI1、TTPI1-TENO2、TENO2-PPDC1-ADS-TGPM1-Delta2四个片段。用NotI限制性内切酶对重组载体pRS425K:Delta1-URA3-TCYC1进行酶切，得到Delta1-URA3-TCYC1片段。
转化、同源重组和重组菌株的获得：
采用醋酸锂转化法用上述5个片段：TCYC1-PTEF1-tHMGR-TTEF1、TTEF1-PGPM1-ERG20-TTPI1、TTPI1-TENO2、TENO2-PPDC1-ADS-TGPM1-Delta2、Delta1-URA3-TCYC1转入宿主菌株CEN.PK2-1C中，进行酵母转化，得到重组菌株。用SC-ura培养基进行筛选，30℃恒温倒置培养3天，得到重组克隆，每个不同转化挑取8个单菌落在SC-ura固体培养基上划线分纯，30℃恒温倒置培养至长出大小合适的单菌落，挑取单菌落接种到SC-ura液体培养基，30℃、200rpm培养至OD600约为4，取1.5mL菌液12000rpm离心1min，弃上清培养基收集菌体，提取基因组。采用基因组PCR验证表达模块和异源表达模块，如果能够出现正确大小的目标条带，则证明筛选到了正确的阳性克隆。
PCR验证方法：取转化子，分别以tHMGR基因、ERG20基因、ADS基因所对应的特异性引物进行扩增，如果该转化子能同时扩增得到tHMGR基因(1506bp)、ERG20基因(1050bp)、ADS基因(1641bp)，则证明该转化子为阳性克隆，否则为阴性克隆。PCR验证结果见图2，其中，泳道1-3为转化子1的扩增产物；泳道1代表tHMGR特异性引物所得扩增产物、泳道2代表ERG20特异性引物所得扩增产物、泳道3代表ADS特异性引物所得扩增产物；泳道4-6为转化子2的扩增产物，泳道4代表tHMGR特异性引物所得扩增产物、泳道5代表ERG20特异性引物所得扩增产物、泳道6代表ADS特异性引物所得扩增产物；泳道7-9为转化子3的扩增产物，泳道7代表tHMGR特异性引物所得扩增产物、泳道8代表ERG20特异性引物所得扩增产物、泳道9代表ADS特异性引物所得扩增产物；泳道10-12代表转化子4的扩增产物，泳道10代表tHMGR特异性引物所得扩增产物、泳道11代表ERG20特异性引物所得扩增产物、泳道12代表ADS特异性引物所得扩增产物；泳道13-15为转化子5的扩增产物，泳道13代表tHMGR特异性引物所得扩增产物、泳道14代表ERG20特异性引物所得扩增产物、泳道15代表ADS特异性引物所得扩增产物。从图2可知，转化子5同时扩增得到了三个核苷酸片段，且3个扩增片段与理论大小相一致，为阳性菌株，说明本发明成功获得了重组菌株，该重组菌株标记为SyBE_000111001重组菌株。在该重组菌株构建过程中，各个DNA分子片段之间在底盘细胞中发生同源重组的方式见图3-A，该图片呈现了Delta1-URA3-TCYC1、TCYC1-PTEF1-tHMGR-TTEF1、TTEF1-PGPM1-ERG20-TTPI1、TTPI1-TENO2、TENO2-PPDC1-ADS-TGPM1-Delta2五个片段之间在底盘细胞中发生基因重组的方式：其中TCYC1为Delta1-URA3-TCYC1、TCYC1-PTEF1-tHMGR-TTEF1之间的同源重组提供了同源臂；TTEF1为TCYC1-PTEF1-tHMGR-TTEF1、TTEF1-PGPM1-ERG20-TTPI1之间的同源重组提供了同源臂；TTPI1为TTEF1-PGPM1-ERG20-TTPI1、TTPI1-TENO2之间的同源重组提供了同源臂；TENO2为TTPI1-TENO2、TENO2-PPDC1-ADS-TGPM1-Delta2之间的同源重组提供了同源臂，五个片段在底盘细胞重组之后得到重组DNA分子片段。各个DNA分子片段整合到底盘细胞基因组中的整合位点以及同源重组方式见图3-B，图中呈现了Delta1、Delta2为重组DNA分子片段与底盘细胞基因组之间的同源重组提供同源臂。
实施例2 利用重组菌株发酵生产青蒿二烯
实验材料：
重组菌株：实施例1提供的构建方法构建获得的重组菌株，SyBE_000111001重组菌株。
培养基：SC-ura液体培养基，该培养基中葡萄糖的浓度为40g/L，YNB的浓度为6.7g/L，氨基酸混合物的浓度为2.0g/L，亮氨酸的浓度为0.1g/L，组氨酸的浓度为0.02g/L，色氨酸的浓度为0.02g/L。
(1)摇瓶发酵
将筛选得到的正确阳性克隆SyBE_000111001重组菌株接种到5mL SC-ura液体培养基中，30℃、200rpm培养至OD600值约为5.0；取所得菌液，以初始OD600值为0.1转接至SC-ura液体培养基中，30℃、200rpm培养12小时后，按初始OD600值为0.05转接到50mL葡萄糖浓度为40g/L的SC-ura液体培养基中，30℃、200rpm培养，10小时后在摇瓶中加入2.5mL正十二烷进行两相培养，以此条件继续培养至72小时，结束发酵，提取青蒿二烯、检测青蒿二烯的产量，初步考察SyBE_000111001重组菌株的产青蒿二烯的能力。在两相培养过程中，分别于以下时间点取样：6，9，15，18，24，28，31，34，39，44，50，55，62，66，73小时，检测菌液OD600吸收值，绘制重组酿酒酵母菌的生长曲线。
青蒿二烯的提取与检测方法：
发酵结束后，将发酵液5000rpm离心10min，吸取上层十二烷相，用无水硫酸钠干燥48小时，用一次性0.22μm有机相滤膜过滤，用正己烷稀释30倍，用GC-TOF/MS检测产物。
摇瓶发酵过程中重组酿酒酵母菌的生长曲线见图4。摇瓶发酵结束后提取获得的产物的GC-TOF/MS检测结果见图5中的图5-A和图5-B；其中图5-A为该产物的气相色谱图，其中出峰时间为10.33min所对应的峰为目标产物峰；图5-B为该产物的质谱谱图，证明所得产物为青蒿二烯。通过以下公式计算青蒿二烯的含量：
青蒿二烯的浓度＝(峰面积-标准曲线截距)×样品稀释倍数×十二烷体积÷(发酵培养基体积×标准曲线斜率)
通过计算可知青蒿二烯的产量为225.3mg/L(即每升培养基中含有225.3mg青蒿二烯)，说明本发明构建获得的重组菌株能够可以用于生产青蒿二烯，且青蒿二烯的产量高达225.3mg/L。
(2)发酵罐培养：
培养基:
对照组SC-ura发酵培养基：培养基中葡萄糖的浓度为25g/L,YNB的浓度为6.7g/L，氨基酸混合物的浓度为2.0g/L，亮氨酸的浓度为0.1g/L，组氨酸的浓度为0.02g/L，色氨酸的浓度为0.02g/L。
实验组SC-ura发酵培养基：培养基中葡萄糖的浓度为25g/L，YNB的浓度为6.7g/L，氨基酸混合物的浓度为2.0g/L，亮氨酸的浓度为1g/L，组氨酸的浓度为0.2g/L，色氨酸的浓度为0.2g/L。
发酵方法：
将筛选得到的正确阳性克隆SyBE_000111001重组菌株接种到5mL SC-ura液体培养基中，30℃、200rpm培养至OD600值约为5.0；取所得菌液，以初始OD600值为0.05分别转接至对照组SC-ura发酵培养基和实验组SC-ura发酵培养基中，初始培养基体积均为2L，温度为30℃，pH维持在5.8，转速保持500rpm，空气流量4LPM，发酵培养10小时后加入400mL十二烷继续两相培养。两相培养过程中，温度为30℃，pH维持在5.8，两相培养时间为169h。
发酵培养过程中，检测发酵培养基中葡萄糖的浓度，当培养基中葡萄糖浓度为2g/L时，用fed-batch补料的方式补加浓度为700g/L的葡萄糖母液使培养基中葡萄糖浓度达到25g/L。当菌体生长进入平台时，按初始培养基浓度，补加YNB和氨基酸母液。实验组，补加YNB至发酵液YNB的浓度为6.7g/L；亮氨酸的浓度为1g/L，组氨酸的浓度为0.2g/L，色氨酸的浓度为0.2g/L。对照组，补加YNB至发酵液中葡萄糖的浓度为25g/L；亮氨酸的浓度为0.1g/L，组氨酸的浓度为0.02g/L，色氨酸的浓度为0.02g/L。
分别在以下发酵时间取样：8，15，22，29，37，44，52，59，67，75，83，91，99，109，119，131，155，179小时，测定各个组别的菌液的OD600吸收值，绘制重组酿酒酵母在不同的培养基中的生长曲线；同时，对各个时间点所取样品提取青蒿二烯，检测其浓度。
实验结果：
发酵罐培养中，各个组别各个发酵时间点产青蒿二烯的情况见图6，其中曲线1为实验组各个时间点的青蒿二烯产量；曲线2为对照组各个时间点的青蒿二烯产量。发酵罐培养中，各个组别的重组酿酒酵母的生长曲线见图7，其中曲线1为对照组的生长曲线；曲线2为实验组的生长曲线。发酵罐培养过程中，实验组发酵过程中葡萄糖的补料过程与菌液生长曲线的对应情况见图8，其中曲线1代表实验组生长曲线；曲线2代表实验组发酵罐中葡萄糖浓度变化曲线；实验组菌液生长曲线与青蒿二烯的产量的对应情况见图9，其中曲线1代表实验组各个取样点青蒿二烯的产量；曲线2代表实验组菌株生长曲线。在发酵培养过程中，对照组发酵过程中葡萄糖的补料过程与菌液生长曲线的对应情况见图10，其中曲线1代表对照组生长曲线；曲线2代表对照组发酵罐组中葡萄糖浓度变化曲线；对照组菌液生长曲线与青蒿二烯的产量的对应情况见图11，其中曲线1代表对照组各个取样点青蒿二烯的产量；曲线2代表对照组菌株生长曲线。
底盘细胞CEN.PK2-1C是部分氨基酸基因缺陷型的，经过外源基因整合之后仍然不能自身合成部分必需氨基酸，如亮氨酸(Leu)、组氨酸(His)和色氨酸(Trp)。而由于这些基因的缺陷，需要在培养基中添加这些必须氨基酸，但是培养基中这三种氨基酸的添加量是否会影响菌体的生长情况和产量的积累是未知的。
从实验结果图6可知，在发酵培养155小时后，以实验组SC-ura发酵培养基作为培养基的发酵罐中青蒿二烯浓度为1.05g/L；以对照组SC-ura发酵培养基作为培养基的发酵罐中青蒿二烯浓度为562.81mg/L，说明本发明提供的重组真核菌株生产青蒿二烯的过程确实受到发酵液中氨基酸浓度的影响。
从实验结果图7至图11可知，针对对照组，在发酵进行到35小时后，发明提供的重组菌株在对照组SC-ura发酵培养基中生长进入平台期，OD600值维持在10左右，在40小时时，以培养基中初始浓度计算补加YNB和亮氨酸(Leu)、组氨酸(His)和色氨酸(Trp)的氨基酸母液；YNB加入至其浓度为6.7g/L，亮氨酸加入至亮氨酸的浓度为0.1g/L，组氨酸加入至组氨酸的浓度为0.02g/L，色氨酸加入至色氨酸的浓度为0.02g/L；在补加之后，菌体出现二次生长情况，并且最终OD600值高于实验组(图7)，说明在本发明提供的重组真核菌株的生长情况确实受到氮源浓度以及氨基酸浓度的限制。但是如果菌株生长速度过快，由于空气通量保持不变，这就使得每OD600的菌体实际摄入的氧气量降低，在一定程度上加快了单位浓度菌体消耗葡萄糖的速率，但由于氮源的快速消耗，使得人工菌株体内相关代谢失衡，所以青蒿二烯的积累速率并没有相应增加(图11)，这可能是和碳源在体内的代谢流平衡有关。
从实验结果图9、图11可知，本发明提供的重组真核菌株在实验组提供的发酵培养条件下进行培养时，能够进一步提高青蒿二烯的产量，相比对照组(普通培养方法)，差异显著(P＜0.05)。
实施例3 利用本发明提供的重组真核菌株制备青蒿二烯
发酵培养基：SC-ura液体培养基，该培养基中葡萄糖的浓度为25g/L，YNB的浓度为6.7g/L，氨基酸混合物的浓度为2.0g/L，亮氨酸的浓度为0.8g/L，组氨酸的浓度为0.16g/L，色氨酸的浓度为0.16g/L。
发酵方法：
将筛选得到的正确阳性克隆SyBE_000111001重组菌株接种到5mL SC-ura液体培养基中，30℃、200rpm培养至OD600值约为5.0；取所得菌液，以初始OD600值为0.05分别转接至发酵培养基中，初始培养基体积为2L，温度为28℃，pH维持在6.0，转速保持500rpm，空气流量4LPM，发酵培养12小时后加入400mL十二烷继续两相培养。两相培养过程中，温度为28℃，pH维持在6.0，两相培养时间为150h。
发酵培养过程中，检测发酵培养基中葡萄糖的浓度，当培养基中葡萄糖浓度为3g/L时，用fed-batch补料的方式补加浓度为700g/L的葡萄糖母液使培养基中葡萄糖浓度达到25g/L，当菌体生长进入平台时，按初始培养基浓度，补加YNB和氨基酸母液。补加YNB至发酵液中YNB的浓度为6.7g/L；亮氨酸的浓度为0.8g/L，组氨酸的浓度为0.16g/L，色氨酸的浓度为0.16g/L。
发酵结束后，将发酵液5000rpm离心10min，吸取上层十二烷相，用无水硫酸钠干燥48小时，用一次性0.22μm有机相滤膜过滤，用正己烷稀释30倍，用GC-TOF/MS检测产物。所得产物的检测结果见图12，其中，图12-A为该产物的气相色谱图，其中出峰时间为10.34min所对应的峰为目标产物峰；图12-B为该产物的质谱谱图。证明所得产物为青蒿二烯。通过以下公式计算青蒿二烯的含量：
青蒿二烯的浓度＝(峰面积-标准曲线截距)×样品稀释倍数×十二烷体积÷(发酵培养基体积×标准曲线斜率)
通过计算可知青蒿二烯产量为987.53mg/L。
实施例4 利用本发明提供的重组真核菌株制备青蒿二烯
发酵培养基：SC-ura液体培养基，该培养基中葡萄糖的浓度为25g/L，YNB的浓度为6.7g/L，氨基酸混合物的浓度为2.0g/L，亮氨酸的浓度为1.2g/L，组氨酸的浓度为0.24g/L，色氨酸的浓度为0.24g/L。
发酵方法：
将筛选得到的正确阳性克隆SyBE_000111001重组菌株接种到5mL SC-ura液体培养基中，30℃、200rpm培养至OD600值约为5.0；取所得菌液，以初始OD600值为0.05分别转接至发酵培养基中，初始培养基体积为2L，温度为32℃，pH维持在5.5，转速保持500rpm，空气流量4LPM，发酵培养8小时后加入400mL十二烷继续两相培养。两相培养过程中，温度为32℃，pH维持在5.5，两相培养时间为170h。
发酵培养过程中，检测发酵培养基中葡萄糖的浓度，当培养基中葡萄糖浓度为1g/L时，用fed-batch补料的方式补加浓度为700g/L的葡萄糖母液使培养基中葡萄糖浓度达到25g/L，当菌体生长进入平台时，按初始培养基浓度，补加YNB和氨基酸母液。补加YNB至发酵液中YNB的浓度为6.7g/L；亮氨酸的浓度为1.2g/L，组氨酸的浓度为0.24g/L，色氨酸的浓度为0.24g/L。
发酵结束后，将发酵液5000rpm离心10min，吸取上层十二烷相，用无水硫酸钠干燥48小时，用一次性0.22μm有机相滤膜过滤，用正己烷稀释30倍，用GC-TOF/MS检测产物。所得产物的检测结果见图13，其中，图13-A为该产物的气相色谱图，其中出峰时间为10.34min所对应的峰为目标产物峰；图13-B为该产物的质谱谱图。证明所得产物为青蒿二烯，通过以下公式计算青蒿二烯的含量：
青蒿二烯的浓度＝(峰面积-标准曲线截距)×样品稀释倍数×十二烷体积÷(发酵培养基体积×标准曲线斜率)
通过计算可知青蒿二烯产量为958.64mg/L。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种产青蒿二烯的重组真核菌株，其特征在于，在所述真核菌株的基因组中整合表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因、表达FPP合酶的基因、和表达青蒿二烯合酶的基因；
上述三种基因以表达盒的形式整合到基因组中，表达盒包括基因、启动子和终止子；
所述整合为整合在所述基因组的多拷贝位点；
所述真核菌株为酿酒酵母CEN.PK2-1C；
所述多拷贝位点为Delta位点；
所述表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因来自于酿酒酵母BY4741基因组，为tHMGR基因；启动子为TEF1、TPI1或GPM1；终止子为TEF1、TPI1或GPM1；
所述表达FPP合酶的基因来自于酿酒酵母BY4741基因组，为ERG20基因；启动子为GPM1、TPI1、FBA1或GPD1；终止子为TPI1、TEF1、GPM1、FBA1或GPD1；
所述表达青蒿二烯合酶的基因为ADS基因；启动子为ENO2、PGK1、TEF2或PDC1，终止子为GPM1、ENO2、TPI1、TEF1、FBA1或GPD1。
2.利用权利要求1所述的重组真核菌株制备青蒿二烯的方法，其特征在于，包括：
取所述重组真核菌株，接种到发酵培养基中，经发酵培养、分离、收集青蒿二烯，即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述真核菌株为亮氨酸、组氨酸和色氨酸缺陷型酿酒酵母时，所述发酵培养基为尿嘧啶缺陷SC培养基；
其包括：葡萄糖、YNB培养基、氨基酸混合物、亮氨酸、组氨酸、色氨酸；所述亮氨酸的浓度为0.8g/L～1.2g/L；所述组氨酸的浓度为0.16g/L～0.24g/L；所述色氨酸的浓度为0.16g/L～0.24g/L。
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