CN112063531B - 白地霉zjph1907及制备(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白地霉ZJPH1907及制备(S)‑2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙醇的应用，白地霉ZJPH1907在偏酸性环境下高选择性催化制备替格瑞洛关键手性中间体，具有立体选择性高、催化剂制备成本低，且转化过程环境友好等特点。当底物浓度为7.6g/L时，30℃，200rpm，转化2h，产物(S)‑2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙醇的产率为83.8％，e.e.值为97.1％，表现出更好的催化效率。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株具有可在偏酸性环境下高选择性生物催化不对称还原制备替格瑞洛关键手性中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的新菌株—白地霉ZJPH1907及其应用。
(二)背景技术
(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的化学结构式为：
(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇是合成替格瑞洛的关键手性中间体，可由2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮为原料经不对称还原制得。目前该手性中间体的制备主要采用化学合成法，也有报道以酶催化制得，而采用全细胞催化法则报道较少。化学法制备带来的环境问题，以及酶法制备需额外添加辅因子等问题使其工业化存在着一定的不足。全细胞生物催化具有环境友好、反应专一、操作简便等优点，可省去复杂的胞内酶分离和纯化步骤。此外，细胞自身具有辅酶再生系统，其反应过程中无需额外添加昂贵的辅因子，且酶在细胞内环境中具有较好的稳定性。
徐建国等使用(S)-2-甲基-CBS-噁唑硼烷与BH3·THF等试剂将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原为(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇，纯度为96.5％，e.e.值为98.9％。CN104744266A报道了一种使用N,N-二乙基苯胺盐酸盐与氯仿组成的溶液和硼氢化钠与乙二醇二甲醚组成的悬浮液反应，随后加入S-二苯基脯氨醇及二氯甲烷形成的体系合成(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇，产物产率为98.5％，e.e.值为98％，该路线涉及化学反应试剂较多、成本偏高。Wu等利用易错PCR技术和单点饱和突变技术对源于金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)CA49的羰基还原酶ChKRED20进行分子改造，获得活性提高的羰基还原酶ChKRED20突变体，在20h内完全转化200g/L的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮底物，e.e.值>99％，产率为95％，但反应中需添加昂贵的辅因子，成本较高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株新的菌种—白地霉(Geotrichum candidum)ZJPH1907，及其在偏酸性环境下高选择性催化制备替格瑞洛关键手性中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇中的应用，该方法与化学合成法相比具有立体选择性高、催化剂制备成本低，且转化过程环境友好等特点。当底物浓度为7.6g/L时，30℃，200rpm，转化2h，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为83.8％，e.e.值为97.1％，表现出更好的催化效率。并通过构建含低共熔溶剂的双相反应介质体系以有效解决底物难溶性等问题，进一步提高了催化产率。此外，本发明还丰富了可用于该药物中间体制备的生物催化剂种类，并且生物转化过程中由于维持偏酸性环境而不易受到杂菌的污染。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--白地霉(Geotrichum candidum)ZJPH1907，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M 2020282，保藏日期：2020年7月6日，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
本发明提供一种白地霉ZJPH1907在制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇中的应用，所述应用的方法为：以白地霉ZJPH1907经发酵培养后获得的湿菌体为酶源，以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮为底物，以pH值3.5～8.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20～40℃、150～250rpm条件下进行反应，反应结束后，将转化液经分离纯化后，获得(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇产物。
进一步，所述底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮用量以转化体系总体积计为1g/L～10g/L(优选3.8g/L～7.6g/L)，湿菌体用量以转化体系总体积计为50～500g/L(优选100～300g/L)。
进一步，为促进辅酶再生，提高反应效率，本发明转化体系中还添加有辅助底物；所述辅助底物为下列一种或任意几种的混合：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘油、异丙醇、谷氨酸或赖氨酸，优选葡萄糖。所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘油、谷氨酸或赖氨酸时，加量以转化体系总体积计为10～150g/L(优选60g/L)；所述辅助底物为异丙醇时，其体积加入量以转化体系总体积计为10％。不添加辅助底物的对照在相同条件下反应24h，底物浓度为3.8g/L时，产率仅为34.3％。
进一步，本发明所述转化体系中除了添加辅助底物外，还添加了助溶剂，所述助溶剂为吐温-60或吐温-80；所述助溶剂加入量以转化体系总体积计为1～10g/L(优选4～6g/L)。
进一步，所述缓冲液种类选用Tris-HCl缓冲液、磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，最优选pH 4.2、0.025mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
进一步，本发明还在缓冲液中引入疏水性天然低共熔溶剂作为第二相构建两相反应介质，所述疏水性天然低共熔溶剂为薄荷醇：辛烷(摩尔比1:1)，薄荷醇：百里酚(摩尔比1:1)，香豆素：百里酚(摩尔比1:1)，优选香豆素：百里酚(摩尔比1:1)，所述疏水性天然低共熔溶剂的体积加入浓度为10～50％(优选10～30％)。
进一步，所述酶源按如下方法制备：1)斜面培养：将白地霉ZJPH1907从甘油管中接种至斜面培养基中，30℃培养2d，重复接种活化2d，获得斜面菌体。所述斜面培养基组成为：葡萄糖15.0g/L，酵母膏10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，无水MgSO4 0.244g/L，NaCl 1.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为水，pH 6.5；
2)种子培养：从斜面挑取一环菌体接入装液量为100mL种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃、200rpm条件下培养12h，获得种子液；所述种子培养基组成为：麦芽糖20.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母膏8.0g/L，牛肉膏11.9g/L，KH2PO4 0.98g/L，CaCl2 0.095g/L，溶剂为水，pH 7.5；
3)发酵培养：以体积浓度5～10％(优选8％)的接种量，将种子液移种至装有100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，20～40℃、200rpm条件下培养18～28h(优选30℃、200rpm，培养22h)，将发酵液离心，收集湿菌体，即为酶源；所述发酵培养基组成为：麦芽糖15～35g/L，葡萄糖1～5g/L，酵母膏4～12g/L，牛肉膏5～20g/L，KH2PO4 0.5～3.0g/L，CaCl2 0.05～0.3g/L，溶剂为水，pH 4.0～9.0，优选pH 7.5。
采用Box-Behnken旋转中心组合实验设计法对牛肉膏、KH2PO4、CaCl2三个显著影响因子的浓度进行优化设计，得到白地霉ZJPH1907较佳发酵培养基配方，所述发酵培养基组成为：麦芽糖20.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母膏8.0g/L，牛肉膏11.9g/L，KH2PO4 0.98g/L，CaCl2 0.095g/L，溶剂为水，pH 6.5。
本发明所述转化反应液的分析检测方法为：反应结束后，将转化液用等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，然后于8000rpm、4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用手性气相色谱法分析目的产物和残留底物含量及产物的光学纯度。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株可用于微生物催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮不对称还原制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的新菌株，且该菌株可在pH 4.2偏酸性环境下进行高效生物转化，当底物浓度为7.6g/L时，产物的产率为83.8％，e.e.值为97.1％。
(四)附图说明
图1为底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮标准品的气相检测色谱图。
图2为产物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇标准品的气相检测色谱图。
图3为生物转化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇反应液的气相检测色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例中底物、辅助底物、表面活性剂的添加量均以转化体系总体积计。
实施例1：菌株的筛选及鉴定、生物转化过程及转化产物的分析检测方法
(1)菌种初筛：取采自安徽岳西县果园土样1g加入至灭菌后的生理盐水中，充分摇匀，吸取2mL土样混悬液接种至装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养1～2d，待培养液变混浊后，取2mL培养液转接至含100mL富集培养基的250mL摇瓶中，继续培养4～5d。富集培养基的组成如下：2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮0.95g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，K2HPO4 2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，无水MgSO4 0.244g/L，溶剂为水，pH 6.5。
(2)菌种复筛：将步骤(1)获得的富集培养液用生理盐水稀释至10-4、10-5和10-6，分别取0.2mL涂布到分离平板上，30℃培养3～5d；挑取分离平板上生长的菌落划线接种于全营养培养基平板中，30℃培养2～3d，获得单菌落。挑取单菌落接种于种子培养基中，30℃，200rpm培养24h，制得种子液。将种子液以体积浓度10％的接种量转接至发酵培养基中，30℃，200rpm培养24h。发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1M、pH 7.0磷酸缓冲液洗涤，收集湿菌体，即为酶源细胞。
种子培养基组成：葡萄糖15.0g/L，酵母膏10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，无水MgSO4 0.244g/L，NaCl 1.0g/L，溶剂为水，pH 6.5。发酵培养基组成同种子培养基；
分离平板培养基组成是在富集培养基中加有20g/L琼脂。
全营养培养基组成是在种子培养基中加有20g/L琼脂。
(3)生物转化反应过程：将离心所得酶源细胞100g/L重悬于10mL磷酸盐缓冲液(pH值为7.0)中，加入底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮0.95g/L，以及100g/L的辅助底物葡萄糖，置30℃、200rpm摇床中反应24h，得到转化液。
转化液用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液中的产物和未反应的残留底物浓度采用气相色谱法分析检测，并计算得出目的产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率及对映体过量值(e.e.值)，从中筛选得到可高选择性还原底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的菌株，e.e.值为89.6％，产率为87.2％，记为菌株ZJPH1907。底物和产物标准品的气相检测图谱，以及生物转化反应液的气相检测图谱见图1、图2和图3。
采用内标法定量。内标物为十二烷。取1mL萃取液加入3mM十二烷进行分析。气相色谱检测条件：安捷伦气相色谱仪，浙大N2000色谱工作站；CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm)。载气为高纯氮气，流量为2mL/min；进样量1μL，分流比为15:1；进样口和检测器温度分别为260℃和280℃；色谱柱温度120～165℃；升温速度：5℃/min，165℃保持1min；检测器为FID。用以上条件对样品进行检测，底物的保留时间为5.1min，如图1；产物标准品的保留时间，R型产物为8.4min，S型产物为7.9min，如图2；ZJPH1907菌株转化所得产物的保留时间为7.9min，如图3。内标物十二烷的保留时间为2.7min。
气相色谱法定性及定量分析：检测转化反应结束后产物及残留底物的含量，并计算相关物质浓度、产率和e.e.值。
产率＝C产物/C底物×100％公式(1)
式中，C产物为转化所得产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的摩尔浓度，C底物为反应初始时底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess，e.e.)来表示。
e.e.＝(CS-CR)/(CR+CS)×100％公式(2)
式中CR和CS分别为R型和S型2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的摩尔浓度。
(4)菌株ZJPH1907的形态特征和ITS序列
菌株ZJPH1907的形态特征：
形态学观察：在全营养培养基琼脂平板上，观察菌株ZJPH1907的菌落外观形态、质地、色泽、生长速度等特征，通过光学显微镜观察细胞形态。菌落呈中心突起，短绒状，菌丝从中心放射性扩散，乳白色，生长速度快。在液体培养中生长时呈白醭，粉状。
分子生物学鉴定：委托上海生工生物工程有限公司进行菌株ZJPH1907的ITS测序。以提取到的细胞总DNA为模板，利用通用引物ITS1(序列：TCCGTAGGTGAACCTGCGG)与ITS4(序列：TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增菌株的内转录间隔区1和2序列，再将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。经测序确认所述菌株ZJPH1907的内转录间隔区1和2序列如SEQ ID NO.1所示。
将菌株ZJPH1907的内转录间隔区1和2序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对分析，该菌株与Geotrichum candidumMH153556同源性为97％。该菌株鉴定为白地霉(Geotrichum candidum)，命名为白地霉(Geotrichum candidum)ZJPH1907，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2020282，保藏日期：2020年7月6日，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
实施例2：Box-Bhenken响应面设计优化发酵培养基组成
使用Design Expert 12.0软件设计PB试验，得到显著性影响因素：牛肉膏、CaCl2及KH2PO4。并对该三因素进行最陡爬坡试验，得到中心点：牛肉膏12g/L，CaCl2 0.11g/L，KH2PO41.4 g/L，用于进行Box-Bhenken旋转中心组合法设计，分析得到三因素的最优组合方案为：牛肉膏11.9g/L，CaCl2 0.095g/L，KH2PO4 0.98g/L，在3.8g/L底物浓度下该组合方案的理论产率为35.9％。
以麦芽糖20.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母膏8.0g/L，牛肉膏11.9g/L，KH2PO4 0.98g/L，CaCl2 0.095g/L，溶剂为水，作为种子及发酵培养基的组成，种子培养基及发酵培养基的初始pH值均为6.5。从培养成熟的斜面挑取一环菌体接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养12h，得种子液，再以体积浓度10％的接种量将种子液转接到装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养24h。培养结束后发酵液经离心分离沉淀，并用0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)进行洗涤，收集得到湿菌体细胞。将湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0，0.1M)中，加入100g/L葡萄糖作为辅助底物，3.8g/L 2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮为转化底物构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系总体积计为100g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为37.2％。
实施例3：湿菌体的获得
斜面培养基组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 6.5。
种子培养基组成：麦芽糖20.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母膏8.0g/L，牛肉膏11.9g/L，KH2PO4 0.98g/L，CaCl2 0.095g/L，溶剂为水，pH 7.5。
发酵培养基组成：麦芽糖20.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母膏8.0g/L，牛肉膏11.9g/L，KH2PO4 0.98g/L，CaCl2 0.095g/L，溶剂为水，pH7.5。
将白地霉ZJPH1907接种至斜面培养基，30℃培养2d后，重复接种活化2d，获得斜面菌体。
从培养成熟的斜面挑取一环菌体接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养12h，得种子液，再以体积浓度8％的接种量将种子液转接到装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养22h。培养结束后发酵液经离心分离沉淀，并用与转化介质相同的缓冲液洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞，备用。
实施例4：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0，0.1M)中，不添加任何辅助底物，加入3.8g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为100g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为34.3％，e.e.值94.6％。
实施例5：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0，0.1M)中，100g/L葡萄糖作为辅助底物，3.8g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为100g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为50.8％，e.e.值为94.3％。
实施例6：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0，0.1M)中，100g/L谷氨酸作为辅助底物，3.8g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为100g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为45.2％，e.e.值为93.7％。
实施例7：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于9mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0，0.1M)，1mL异丙醇作为辅助底物，3.8g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为100g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为15.1％，e.e.值为23.7％。
实施例8：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0，0.1M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，3.8g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为100g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为54.2％，e.e.值为94.4％。
实施例9：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.6，0.1M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，3.8g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为100g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为62.1％，e.e.值为96.1％。
实施例10：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，0.1M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，3.8g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为100g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为65.1％，e.e.值为95.9％。
实施例11：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，0.025M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，3.8g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为100g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为67.8％，e.e.值为95.7％。
实施例12：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，0.025M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，3.8g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为150g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为71.5％，e.e.值为95.3％。
实施例13：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，0.025M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，3.8g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为280g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为94.2％，e.e.值为95.5％。
实施例14：
将实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，0.025M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，7.6g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为280g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化5h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为77.9％，e.e.值为96.2％。
实施例15：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，0.025M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，9.5g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为280g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化5h。采用实施例1气相检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为66.1％，e.e.值为95.5％。
实施例16：
将实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，0.025M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，4g/L吐温-80作为助溶剂，9.5g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为280g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化5h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为71.7％，e.e.值为96.0％。
实施例17：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，0.025M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，4g/L吐温-60作为助溶剂，9.5g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为280g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化5h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为69.4％，e.e.值为95.7％。
实施例18：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，0.025M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，6g/L吐温-80作为助溶剂，9.5g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为280g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化2h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为71.4％，e.e.值为96.6％。
实施例19：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，0.025M)中，60g/L葡萄糖作为辅助底物，6g/L吐温-80作为助溶剂，7.6g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为280g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化2h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为83.8％，e.e.值为97.1％。
实施例20：
将按照实施例3方法获得的湿菌体重悬于9mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，0.025M)中，添加1mL的疏水性天然低共熔溶剂(香豆素：百里酚(摩尔比1:1))构建两相体系作为反应介质，60g/L葡萄糖作为辅助底物，6g/L吐温-80作为助溶剂，7.6g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为280g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化2h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为86.2％，e.e.值为96.8％。
实施例21：近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)ZJPH1305生物催化制备替格瑞洛关键手性中间体的转化能力考察
(1)近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)ZJPH1305，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2013年11月8日，保藏编号：CCTCC NO:M2013559。该菌种已在先前的专利申请(公开号：CN103849574A公开日：2014年6月11日)中公开。菌种的培养方法和酶源细胞制备过程依据先前的专利申请(公开号：CN103849574A，公开日：2014年6月11日)。
(2)生物催化制备替格瑞洛关键手性中间体
将经发酵制备得到的近平滑假丝酵母湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0，0.1M)中，100g/L葡萄糖作为辅助底物，3.8g/L底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮构成转化体系10mL，其中湿菌体加量以转化体系体积计为100g/L，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1中的气相色谱检测方法检测。
结论：近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)ZJPH1305不能转化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮制备替格瑞洛关键手性中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 白地霉ZJPH1907及制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 325
<212> DNA
<213> 白地霉(Geotrichum candidum)
<400> 1
atcgcatcta cttgatctga ggttgaatag tgttgttttt caaacgaatt tgattcgaaa 60
ttttagaaaa gcaatgcaat tccaagagag aaacaacgct caaacaagta tactttgggg 120
gataccccaa agtgcaatgt gcgttcaaaa actgatgatt cacttctgca attcacaaga 180
aatatcgcgt ttcgctgcgt tcttcatcga tacgagaacc aagagatcca ttgttaaaag 240
ttttaatttt tttgttttga ctataaaatt attgtttgct gtgtaaattt cacaaatatt 300
tataattctt aatgatcctt ccgca 325
Claims (10)
1.白地霉(Geotrichum candidum) ZJPH1907，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2020282，保藏日期：2020年7月6日，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述白地霉ZJPH1907在制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以白地霉ZJPH1907经发酵培养后获得的湿菌体为酶源，以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮为底物，以pH值3.5～8.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20～40℃、150～250rpm条件下进行反应，反应结束后，将转化液经分离纯化后，获得(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇产物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物用量以转化体系总体积计为1g/L～10g/L，湿菌体用量以转化体系总体积计为50～500g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中还添加有辅助底物；所述辅助底物为下列一种或任意几种的混合：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘油、谷氨酸或赖氨酸。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述辅助底物加入量以转化体系总体积计为10～150g/L。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述转化体系中除了添加辅助底物外，还添加了助溶剂，所述助溶剂为吐温-60或吐温-80；所述助溶剂加入量以转化体系总体积计为1～10g/L。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH 4.2、0.025mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述缓冲液中加有疏水性天然低共熔溶剂构建两相反应介质，所述疏水性天然低共熔溶剂选自摩尔比均为1:1的下列之一：薄荷醇：辛烷，薄荷醇：百里酚或香豆素：百里酚；所述疏水性天然低共熔溶剂的体积加入浓度为10～50％。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备：1)斜面培养：将白地霉ZJPH1907从甘油管中接种至斜面培养基中，30℃培养2d，重复接种活化2d，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成为：葡萄糖15.0g/L，酵母膏10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，无水MgSO4 0.244g/L，NaCl 1.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为水，pH 6.5；
2)种子培养：从斜面挑取一环菌体接入装液量为100mL种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃、200rpm条件下培养12h，获得种子液；所述种子培养基组成为：麦芽糖20.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母膏8.0g/L，牛肉膏11.9g/L，KH2PO4 0.98g/L，CaCl2 0.095g/L，溶剂为水，pH7.5；
3)发酵培养：以体积浓度5～10％的接种量，将种子液移种至装有100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，20～40℃、200rpm条件下培养18～28h，将发酵液离心，收集湿菌体，即为酶源；所述发酵培养基组成为：麦芽糖15～35g/L，葡萄糖1～5g/L，酵母膏4～12g/L，牛肉膏5～20g/L，KH2PO4 0.5～3.0g/L，CaCl2 0.05～0.3g/L，溶剂为水，pH 4.0～9.0。
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