CN107746861B - 一种(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的生物制备方法 - Google Patents
一种(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的生物制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种(R)‑1‑(2‑三氟甲基苯基)乙醇的生物催化制备方法，所述方法为：以白地霉ZJPH1704经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以2‑三氟甲基苯乙酮为底物，在pH 5.8～8.0的磷酸缓冲液中，于25～40℃、200rpm条件下进行生物还原反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(R)‑1‑(2‑三氟甲基苯基)乙醇；本发明方法底物浓度为10mmol/L时，产物(R)‑1‑(2‑三氟甲基苯基)乙醇的产率为92.31％，e.e.值>99％，表现出更优的催化效率。与已报道的转化菌株相比，本菌株催化转化底物2‑三氟甲基苯乙酮转化为产物的立体选择性和产率均较高。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的生物制备方法。
(二)背景技术
GSK461364(Ⅲ)的化学结构式为：
5-[6-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-1H-苯并咪唑-1-基]-3-[(1R)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙氧基]-2-噻吩甲酰胺(GSK461364，Ⅲ)是一种Plk1激酶抑制剂。Plk1激酶抑制剂是一类新型的具有良好应用前景的癌症治疗药物，其与传统微管蛋白抑制剂类抗癌药物(紫杉醇、长春新碱)相比具有更好的选择性、耐受性和临床应用优势。
式(IV)为2-三氟甲基苯乙酮，式(V-a)为(S)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇，式(V-b)为(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇。
(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇(V-b)是合成GSK461364的重要手性中间体。目前(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的合成方法有化学法和生物法两种。化学法制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇时大多使用化学催化剂，这些催化剂中含有不易降解的金属化合物，易对环境造成污染。如Du等(Organometallics,2014,33:974-982)采用金属钌作为催化剂，40℃反应24h，可将2.0mmol/L的2-三氟甲基苯乙酮底物转化为(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇，主产物为R型，转化率93％，e.e.值仅为53％。秉承绿色化学的理念，采用微生物全细胞作为生物催化剂，通过生物催化法制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇成为更好的选择。许建和等(专利CN201210423006.0)利用基因挖掘技术，对来源于耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)的羰基还原酶基因构建重组工程菌E.coli BL21(DE3)/Pet-KtCR，用于催化还原2-三氟甲基苯乙酮制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇，产率为2％。何军邀等以恶臭假单胞菌为生物催化剂，将10mmol/L的2-三氟甲基苯乙酮转化为(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇，产率为64％，e.e.值>99％。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的生物催化制备方法，利用白地霉ZJPH1704静息细胞作为生物催化剂，生物催化还原2-三氟甲基苯乙酮制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇。该方法与化学法相比具有立体选择性强、环境友好等特点。当底物浓度为10mmol/L时，产物(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的产率为92.31％，e.e.值>99％，表现出更优的催化效率。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的生物催化制备方法，所述方法为：以白地霉(Geotrichum candidum)ZJPH1704菌株经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以2-三氟甲基苯乙酮为底物，在pH 5.8～8.0的0.2M磷酸缓冲液中，于25～40℃(优选30℃)、200rpm条件下进行生物还原反应，反应结束后对反应液进行处理，获得(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇；所述白地霉(Geotrichum candidum)ZJPH1704保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO：M 2017380，保藏日期为2017年6月26日。
进一步，所述底物用量以缓冲液体积计为5～25mmol/L(优选10mmol/L)，湿菌体用量以缓冲液体积计为100～500g/L(优选300g/L)。
进一步，所述转化反应液的处理方式为：转化反应结束后，加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，然后于8000rpm、4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用气相色谱法分析检测。
进一步，所述生物催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将白地霉ZJPH1704接种至斜面培养基，置25-30℃(优选30℃)培养1～2天后取出，获得斜面菌种；斜面培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 1g/L，(NH4)2SO4 1g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0，121℃灭菌20min；
(2)种子培养：从斜面上挑取一环菌体转接至种子培养基中，25～30℃、150～250rpm培养10～24h(优选30℃，200rpm摇床中培养12h)，获得种子液；种子培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 1g/L，(NH4)2SO4 1g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度为4～10％(优选9％)的接种量转接至发酵培养基中，装液量为100mL/250mL摇瓶，25～30℃、150～250rpm培养24～28h(优选30℃，200rpm摇床中培养24h)，发酵结束后将发酵液离心，收集湿菌体，即得含酶细胞的生物催化剂；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，KH2PO4 0.5g/L，(NH4)2SO4 1g/L，K2HPO4 0.5g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明利用白地霉ZJPH1704静息细胞作为生物催化剂，生物催化还原2-三氟甲基苯乙酮制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇。本发明采用生物转化方法制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的过程，具有产物立体选择性高，工艺简单，环境友好，转化率高等优点，并且在生物还原过程中通过添加辅助底物，可实现辅酶的原位再生。许建和等(专利CN201210423006.0)利用基因挖掘技术，对来源于耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)的羰基还原酶基因构建重组工程菌E.coli BL21(DE3)/Pet-KtCR，催化还原2-三氟甲基苯乙酮制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的产率为2％。何军邀等以恶臭假单胞菌为生物催化剂，将10mmol/L的2-三氟甲基苯乙酮转化为(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇，产率为64％，e.e.值>99％。本发明提出了利用白地霉(Geotrichum candidum)ZJPH1704菌株生物转化2-三氟甲基苯乙酮制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的新方法，当底物浓度为10mmol/L时，产物(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的产率为92.31％，e.e.值>99％，表现出更优的催化效率。与已报道的转化菌株相比，本菌株催化底物2-三氟甲基苯乙酮转化为产物的立体选择性和产率均较高。
(四)附图说明
图1为实施例1白地霉ZJPH1704的平板菌落形态。
图2为实施例1白地霉ZJPH1704的细胞扫描电镜照片，500倍。
图3为实施例1白地霉ZJPH1704的细胞扫描电镜照片，10000倍。
图4为实施例1产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇(Ⅰ-a)的GC色谱检测图谱(含内标正十二烷)。
图5为实施例1底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮(Ⅱ)的GC色谱检测图谱(含内标正十二烷)。
图6为实施例1产物消旋体即(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇(Ⅰ-a)和(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇(Ⅰ-b)之混合物(1:1)的GC色谱检测图谱(含内标正十二烷)。
图7为实施例1白地霉ZJPH1704菌株生物还原2,6-二氯-3-氟苯乙酮的转化样品(即萃取液)的GC色谱检测图谱(含内标正十二烷)。
图8为实施例3底物2-三氟甲基苯乙酮(IV)的GC色谱检测图谱(含内标正十二烷)。
图9为实施例3产物1-(2-三氟甲基苯基)乙醇消旋体(V-a)和(V-b)的1:1混合物标准品的GC色谱检测图谱(含内标正十二烷)。
图10为实施例3白地霉ZJPH1704菌株生物不对称还原2-三氟甲基苯乙酮反应萃取液的GC色谱检测图谱(含内标正十二烷)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：用于催化还原2,6-二氯-3-氟苯乙醇的微生物菌种筛选
1、菌株筛选
富集培养：将1g新鲜土样(浙江工业大学(浙江杭州)校园内采集的土样)加入到装有50mL富集培养基的250mL摇瓶中，30℃、200rpm，培养5d，取1mL培养液转接至新鲜的富集培养基中，继续培养5d，如此重复富集2次。富集培养基组成为：(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，式(Ⅱ)化合物(2g/L)为唯一碳源，溶剂为蒸馏水，pH6.5。
平板初筛：富集培养液用生理盐水稀释104-106倍后涂布于平板筛选培养基，30℃培养2d。挑取单菌落再次进行平板划线，并置30℃培养2d。经2次划线分离培养后获得纯化菌株ZJPH1704，并保藏于固体斜面培养基。平板筛选培养基终浓度组成为：(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，20g/L琼脂粉，溶剂为蒸馏水，pH 6.5。斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO41.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为蒸馏水，pH 6.5。
微生物菌体培养和收集：挑取纯化种子接种至种子培养基，30℃，200rpm培养10～24h，以10％(v/v)的接种量转接至初始发酵培养基中，30℃，200rpm培养24～48h。将发酵液于4℃，9000rpm条件下离心10min，弃去上清，并用pH 6.5磷酸缓冲液洗涤菌体两次，再次离心分离获得静息细胞。种子培养基及初始发酵培养基终浓度组成均为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH 6.5。
菌种复筛：以微生物静息细胞为酶源催化底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮(Ⅱ)立体选择性还原制备(S)-型产物(Ⅰ-a)，反应体系为：2g静息细胞(以湿重计)重悬于10mL磷酸缓冲液(0.1M、pH 6.5)中，加入1g/L底物，100g/L甘油作辅助底物，40℃，200rpm反应24h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯萃取，并经气相色谱(GC)分析检测转化产物，对照外消旋体还原产物(Ⅰ-a)，观察生物催化样品中是否出现式(Ⅰ-a)还原产物出峰。菌株ZJPH1704可将底物还原为式(I-a)化合物。采用手性GC法检测该菌株还原产物的对映体过量值(e.e.值)，经检测，e.e.值>99.9％。
气相色谱法定性及定量分析：检测转化反应后产物及残留底物的含量，并计算相关物质浓度、产率(Yield)和e.e.值。
公式(1)中Ci、C0分别为反应结束时产物的摩尔浓度和反应起始时底物的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,e.e.)表征。
公式(2)中：CS和CR分别为(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的摩尔浓度。
气相色谱法条件：反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物为十二烷。取1mL萃取液加入1μL十二烷进行分析。气相色谱条件：日本岛津GC-2014气相色谱仪，浙大N2000色谱工作站；美国瓦里安CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm)。载气为高纯氮气，流量为2mL/min；进样量1μL，分流比为15:1；检测器和进样口温度均为250℃；色谱柱温度120～170℃；升温速度：5℃/min；检测器为FID。式(Ⅰ-a)产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇、式(Ⅱ)底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮、式(I-a)(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)和式(Ⅰ-b)(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇混合物即产物消旋体、菌株ZJPH1704生物还原2,6-二氯-3-氟苯乙酮的转化样品(即萃取液)气相色谱图见图4～7。
2、菌株鉴定
菌株ZJPH1704菌株的形态特征、生理生化特性和ITS序列：
①形态学观察在营养琼脂平板上，观察菌株ZJPH1704的菌落外观形态、质地、色泽、生长速度等特征，并对菌体细胞进行扫描电镜观察细胞形态。30℃，培养36h，营养琼脂平板上菌落呈平面扩散，生长快，扁平，乳白色，短绒状或近于粉状，有同心圈可放射线，有的呈中心突起。在液体培养时生白醭，毛绒状或粉状。粗糙的较大菌落，见图1；扫描电镜下可观察到菌株ZJPH1704细胞呈分散、直的杆状，见图2和图3。
②生理生化特性可以利用的碳源有：葡萄糖、D-木糖、半乳糖，不能利用蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、乳糖、阿拉伯糖、纤维二糖、蜜二糖。可耐受0.01％和0.1％的放线菌酮，不能同化硝酸盐和尿素。
③特征ITS序列利用PCR扩增真菌核糖体ITS(Internal TranscribedSpacer)基因区段可快速，准确，简便的鉴定真菌。采用通用引物ITS1和ITS4，对ZJPH1704菌株rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小为349bp的DNA片段，对上述PCR扩增产物进行了序列测定。经测定，所述ZJPH1704菌株的真菌核糖体ITS(Internal Transcribed Spacer)基因序列(SEQID NO.1)如下：
CCTGCGGAAGGATCATTAAGAATTATAAATATTTGTGAAATTTACACAGCAAACAATAATTTTATAGTCAAAACAAAAATAATCAAAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGTATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTTCTTGTGAATTGCAGAAGTGAATCATCAGTTTTTGAACGCACATTGCACTTTGGGGTATCCCCCAAAGTATACTTGTTTGAGCGTTGTTTCTCTCTTGGAATTGCATTGCTTTTCTAAAATTTCGAATCAAATTCGTTTGAAAAACAACACTATTCAACCTCAGATCAAGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA
该序列已提交GenBank(GenBank登录号为No.MG214158)，将菌株ZJPH1704的ITS序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对(BLAST)，结果表明：菌株ZJPH1704与地霉属(Geotrichum sp.)的部分菌株序列同源性较高，且与菌株Geotrichumcandidum CBS:11628(GenBank登录号为No.KY103456.1)的序列同源性达到100％。因此将菌株ZJPH1704命名为白地霉(Geotrichum candidum)ZJPH1704，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2017380，保藏日期为：2017年6月26日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
实施例2：摇瓶培养条件下用于制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的静息细胞酶源的获得
(1)斜面保藏：用接种环挑取白地霉ZJPH1704接种至斜面培养基上，30℃培养1～2天后，取出置4℃冰箱保藏备用。斜面培养基组成(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨5，酵母膏5，K2HPO40.5，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1，(NH4)2SO4 1，琼脂20，溶剂为蒸馏水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
(2)平板保藏：从培养成熟的斜面上挑取一环菌体至平板培养基，30℃培养1～2天后，取出置4℃冰箱保藏备用。平板培养基组成(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨5，酵母膏5，K2HPO40.5，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1，(NH4)2SO4 1，琼脂20，溶剂为蒸馏水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
(3)种子培养：从步骤(2)平板菌体中挑取一环菌体转接至装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm摇床中培养12h。种子培养基组成(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨5，酵母膏5，K2HPO4 0.5，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1，(NH4)2SO4 1，溶剂为蒸馏水，pH7.0，121℃灭菌20min。
(4)发酵培养：从种子培养液(按步骤(3)制备)中转接至装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，体积接种量为9％，30℃，200rpm摇床中培养24h，发酵结束后将发酵液离心，弃去上清液，收集湿菌体用于后续生物还原反应。发酵培养基组成(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨5，酵母膏5，K2HPO4 0.5，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1，(NH4)2SO4 1，溶剂为蒸馏水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
实施例3 辅助底物种类对白地霉ZJPH1704生物还原制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的影响
采用实施例2方法获得的白地霉ZJPH1704湿菌体为生物催化剂，取50mL的锥形瓶，加入2g湿菌体悬浮于10mL、pH 7.0的0.2M磷酸缓冲液中，加入终浓度10mmol/L底物2-三氟甲基苯乙酮，分别加入终浓度100g/L的辅助底物：麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘油、葡萄糖、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇(如表1所示)，于30℃，200rpm摇床中反应48h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，8000rpm、4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，进行气相检测(图10)，同时检测2-三氟甲基苯乙酮(图8)和1-(2-三氟甲基苯基)乙醇外消旋体标准品(图9)的气相色谱图，计算产率，结果见表1。
气相色谱(GC)检测条件：日本岛津GC-2014气相色谱仪，浙大N2000色谱工作站，美国瓦里安Stabilwax(Crossbond Carbowax-PEG)极性毛细管气相色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)。载气为氮气，流量为2.0mL/min，进样量为1μL，分流比为15:1；进样口、检测器的温度为250℃；色谱柱温度100℃，保留3min，以8℃/min速度升温至150℃；采用内标法定量，内标物为十二烷。检测器为FID氢离子火焰检测器。
用相对校正因子分别计算出反应液中的底物和产物的浓度。进而求出反应的产率(Yield)。计算式为:
产率＝Ci/C0×100％
式中C0、Ci分别为反应起始底物的摩尔浓度和反应结束时产物的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess，e.e.)来表示。
e.e.＝(CR-CS)/(CR+CS)×100％
式中CR和CS分别为R型和S型1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的摩尔浓度。
表1 不同辅助底物对(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇产率的影响
结论：从表1可知，最佳辅助底物为甘油，在此条件下产率为56.19％。
实施例4 反应温度对白地霉ZJPH1704生物还原制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的影响
采用实施例2方法获得的白地霉ZJPH1704湿菌体为生物催化剂，取50mL的锥形瓶，加入2g湿菌体悬浮于10mL、pH 7.0的0.2M磷酸缓冲液中，加入终浓度100g/L甘油作为辅助底物，终浓度10mmol/L底物2-三氟甲基苯乙酮，于25℃～40℃(如表2所示)，200rpm摇床中反应48h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，然后8000rpm、4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用实施例3的方法进行气相检测，计算产率，结果见表2。
表2 不同反应温度对(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇产率的影响
| 序号 | 反应温度/℃ | 产率/％ | e.e.值/％ |
| 1 | 25 | 48.24 | 99 |
| 2 | 30 | 56.19 | 99 |
| 3 | 35 | 49.11 | 99 |
| 4 | 37 | 48.83 | 99 |
| 5 | 40 | 47.75 | 99 |
结论：从表2可知，最佳反应温度为30℃，在此条件下产率为56.19％。
实施例5 菌体浓度对白地霉ZJPH1704生物还原制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的影响
采用实施例2方法获得的白地霉ZJPH1704湿菌体为生物催化剂，取50mL的锥形瓶，加入10mL、pH 7.0的0.2M磷酸缓冲液，湿菌体终浓度加量分别为100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L、350g/L、400g/L、450g/L、500g/L(如表3所示)，添加100g/L甘油作为辅助底物，10mmol/L底物2-三氟甲基苯乙酮，于30℃，200rpm摇床中反应48h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，8000rpm、4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用实施例3的方法进行气相检测，计算产率，结果见表3。
表3 不同菌体浓度对(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇产率的影响
结论：从表3可知，最佳菌体浓度为300g/L，在此条件下产率为77.23％。
实施例6缓冲液pH值对白地霉ZJPH1704生物还原制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的影响
采用实施例2方法获得的白地霉ZJPH1704湿菌体为生物催化剂，取50mL的锥形瓶，加入3g湿菌体(终浓度300g/L)悬浮于10mL pH分别为5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、8.0的磷酸缓冲液中，加入终浓度100g/L甘油作为辅助底物，终浓度10mmol/L底物2-三氟甲基苯乙酮，于30℃，200rpm摇床中反应48h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，然后于8000rpm、4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用实施例3的方法进行气相检测，计算产率，结果见表4。
表4 不同pH值对(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇产率的影响
| 序号 | 缓冲液pH值 | 产率/％ | e.e.值/％ |
| 1 | 5.8 | 67.57 | 99 |
| 2 | 6.2 | 72.96 | 99 |
| 3 | 6.6 | 79.84 | 99 |
| 4 | 7.0 | 77.23 | 99 |
| 5 | 7.4 | 66.1 | 99 |
| 6 | 8.0 | 58.24 | 99 |
结论：从表4可知，最佳pH值为6.6，在此条件下产率为79.84％。
实施例7转化时间对白地霉ZJPH1704生物还原制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的影响
采用实施例2方法获得的白地霉ZJPH1704湿菌体为生物催化剂，取50mL的锥形瓶，加入3g湿菌体(终浓度30 0g/L)悬浮于10mL、pH 6.6的0.2M磷酸缓冲液中，加入终浓度100g/L甘油作为辅助底物，终浓度10mmol/L底物2-三氟甲基苯乙酮，于30℃，200rpm摇床中分别反应12h、18h、24h、36h、42h、48h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，8000rpm、4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用实施例3的方法进行气相检测，计算产率，结果见表5。
表5 不同转化时间对(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇产率的影响
| 序号 | 转化时间/h | 产率/％ | e.e.值/％ |
| 1 | 12 | 67.57 | 99 |
| 2 | 18 | 79.84 | 99 |
| 3 | 24 | 92.31 | 99 |
| 4 | 36 | 79.64 | 99 |
| 5 | 42 | 78.95 | 99 |
| 6 | 48 | 76.29 | 99 |
结论：从表5可知，最佳转化时间为24h，在此条件下产率为92.31％。
实施例8 辅助底物添加量对白地霉ZJPH1704生物还原制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的影响
采用实施例2方法获得的白地霉ZJPH1704湿菌体为生物催化剂，取50mL的锥形瓶，加入3g湿菌体(终浓度300g/L)悬浮于10mL、pH 6.6的0.2M磷酸缓冲液中，分别加入终浓度20g/L、40g/L、70g/L、100g/L、150g/L、200g/L甘油作为辅助底物，终浓度10mmol/L底物2-三氟甲基苯乙酮，于30℃，200rpm摇床中分别反应24h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，8000rpm、4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用实施例3的方法进行气相检测，计算产率，结果见表6。
表6 不同甘油添加量对(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇产率的影响
| 序号 | 辅助底物添加量/(g/L) | 产率/％ | e.e.值/％ |
| 1 | 20 | 53.77 | 99 |
| 2 | 40 | 64.82 | 99 |
| 3 | 70 | 76.27 | 99 |
| 4 | 100 | 92.31 | 99 |
| 5 | 150 | 90.57 | 99 |
| 6 | 200 | 88.53 | 99 |
结论：从表6可知，最佳辅助底物甘油添加量为100g/L，在此条件下产率为92.31％。
实施例9底物浓度对白地霉ZJPH1704生物还原制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的影响
采用实施例2方法获得的白地霉ZJPH1704湿菌体为生物催化剂，取50mL的锥形瓶，加入3g湿菌体(终浓度300g/L)悬浮于10mL、pH 6.6的0.2M磷酸缓冲液中，加入终浓度100g/L甘油作为辅助底物，分别加入终浓度5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L的底物2-三氟甲基苯乙酮，于30℃，200rpm摇床中反应24h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，8000rpm、4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用实施例3的方法进行气相检测，计算产率，结果见表7。
表7 不同底物浓度对(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇产率的影响
| 序号 | 底物浓度/(mmol/L) | 产率/％ | e.e.值/％ |
| 1 | 5 | 95.34 | 99 |
| 2 | 10 | 92.31 | 99 |
| 3 | 15 | 69.38 | 99 |
| 4 | 20 | 34.45 | 99 |
| 5 | 25 | 25.98 | 99 |
结论：从表7可知，最佳底物浓度为10mmol/L，在此条件下产率为92.31％。
实施例10：小孢根霉须状变种(Rhizopus microspors)ZJPH1308催化2-三氟甲基苯乙酮的生物还原
(1)菌种来源：小孢根霉须状变种(Rhizopus microspors)ZJPH1308菌株，由本课题组从土壤中分离筛选获得，并保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCC NO.M 2014645，已在专利申请(申请号201510289729.X，申请日2015.05.29)中公开。
(2)斜面培养：将少孢根霉须状变种ZJPH1308接种至斜面培养基，30℃恒温培养2～3天，获得斜面菌体；斜面培养基为PDA培养基，每升PDA培养基中添加琼脂20g，pH自然。
(3)种子培养：取斜面菌体接种至装有100mL种子液的250mL锥形瓶中，30℃培养24h，获得种子液；种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖25，蛋白胨27.5，(NH4)2SO4 3，KH2PO4 1，NaCl 0.3，琼脂20g/L，pH 6.0，溶剂为蒸馏水。
(4)发酵培养：取种子液，以7％的接种量接种至装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃培养24h，获得湿菌体；发酵培养基组成为(g/L)：糊精25，牛肉膏29.84，(NH4)2SO45.05，氯化钙0.4，NaCl 0.3，氯化钴0.05，pH 6.0，溶剂为蒸馏水。
(5)2-三氟甲基苯乙酮的生物转化
实验组：小孢根须状变种ZJPH1308经种子液培养后转接发酵液，离心收集湿菌体。将湿菌体悬浮于20mL蒸馏水中，湿菌体加入终浓度300g/L，底物终浓度10mmol/L。
设置对照组1(不添加湿菌体)：将10mmol/L 2-三氟甲基苯乙酮加至10mL，pH 6.0的0.2M磷酸盐缓冲液中。
设置对照组2(不添加底物)：将湿菌体悬浮于10mL，pH 6.0的0.2M磷酸盐缓冲液中，湿菌体加量300g/L。
处理：转化反应温度30℃，摇床转速为200rpm，反应时间48h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，8000rpm，4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用实施例3气相色谱法分析检测目的产物和残留底物的含量，以及产物的光学纯度。
结论：小孢根霉须状变种(Rhizopus microspors)ZJPH1308不能转化2-三氟甲基苯乙酮制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇。
实施例11：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJPH1504催化2-三氟甲基苯乙酮的生物还原
(1)菌种来源：铜绿假单胞菌ZJPH1504菌株，由本课题组从土壤中分离筛选获得，并保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCC NO.M 2016188，已在专利申请(申请号201610369158.5，申请日2016.05.27)中公开。
(2)斜面培养：将铜绿假单胞菌ZJPH1308接种至斜面培养基，30℃培养36h，获得培养成熟的斜面菌种。斜面培养基终浓度组成为(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨7.5，酵母膏6，(NH4)2SO4 3，KH2PO4 1.5，NaCl 0.75，MgSO4﹒7H2O 0.75，琼脂粉20，溶剂为水，pH 6.5。
(3)种子培养：将斜面菌体接种至装有100mL种子液的250mL锥形瓶中，30℃培养12h，获得种子液。种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨7.5，酵母膏6，(NH4)2SO4 3，KH2PO4 1.5，NaCl 0.75，MgSO4﹒7H2O 0.75，溶剂为蒸馏水，pH 6.5。
(4)发酵培养：取种子液，以8％的接种量接种至装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃培养28h，获得湿菌体；发酵培养基组成为(g/L)：麦芽糖30.45，蛋白胨17.31，NaCl 0.98，溶剂为蒸馏水，pH 7.5。
(5)2-三氟甲基苯乙酮的生物转化
实验组：铜绿假单胞菌ZJPH1504菌株经种子液培养后转接发酵液，离心收集湿菌体。将湿菌体悬浮于10mL蒸馏水中，湿菌体加入终浓度300g/L，底物终浓度10mmol/L。
设置对照组1(不添加湿菌体)：将10mmol/L 2-三氟甲基苯乙酮加至10mL，pH 6.0的0.2M磷酸盐缓冲液中。
设置对照组2(不添加底物)：将湿菌体悬浮于10mL，pH 6.0的0.2M磷酸盐缓冲液中，湿菌体加量300g/L。
处理：转化反应温度30℃，摇床转速为200rpm，反应时间48h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，8000rpm，4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用实施例3气相色谱法分析检测目的产物和残留底物的含量，以及产物的光学纯度。
结论：铜绿假单胞菌ZJPH1504不能转化2-三氟甲基苯乙酮制备(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇。
实施例12：近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)ZJPH1305催化2-三氟甲基苯乙酮的生物还原
(1)菌种来源：近平滑假丝酵母ZJPH1305菌株，由本课题组从土壤中分离筛选获得，并保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCC NO.M 2013559，已在专利申请(申请号201410040143.5，申请日2014.01.27)中公开。
(2)斜面培养：将近平滑假丝酵母ZJPH1305接种至斜面培养基，30℃培养2～3天，获得斜面菌种。斜面培养基终浓度组成为(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨7.5，酵母膏6，(NH4)2SO43，KH2PO4 1.5，NaCl 0.75，MgSO4﹒7H2O 0.75，琼脂粉20，溶剂为蒸馏水，pH 6.5。
(3)种子培养：将斜面菌体接种至装有100mL种子液的250mL锥形瓶中，30℃培养24h，获得种子液。种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨20，酵母膏10，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 2，NaCl 1，MgSO4﹒7H2O 0.5，溶剂为蒸馏水，pH6.5。
(4)发酵培养：取种子液，以10％的接种量接种至装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃培养48h，获得湿菌体；发酵培养基组成同种子培养基。
(5)2-三氟甲基苯乙酮的生物转化
实验组：近平滑假丝酵母ZJPH1305经种子液培养后转接发酵液，离心收集湿菌体。将湿菌体悬浮于10mL蒸馏水中，湿菌体加入终浓度300g/L，底物终浓度10mmol/L。
设置对照组1(不添加湿菌体)：将10mmol/L 2-三氟甲基苯乙酮加至10mL，pH 6.0的0.2M磷酸盐缓冲液中。
设置对照组2(不添加底物)：将湿菌体悬浮于10mL，pH 6.0的0.2M磷酸盐缓冲液中，湿菌体加量300g/L。
处理：转化反应温度30℃，摇床转速为200rpm，反应时间48h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取30min，8000rpm，4℃离心10min，取有机相经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用实施例3气相色谱法分析检测目的产物和残留底物的含量，以及产物的光学纯度。
结论：近平滑假丝酵母ZJPH1305催化10mmol/L的2-三氟甲基苯乙酮合成(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的产率为5％。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的生物制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 349
<212> DNA
<213> 白地酶(Geotrichum candidum)
<400> 1
cctgcggaag gatcattaag aattataaat atttgtgaaa tttacacagc aaacaataat 60
tttatagtca aaacaaaaat aatcaaaact tttaacaatg gatctcttgg ttctcgtatc 120
gatgaagaac gcagcgaaac gcgatatttc ttgtgaattg cagaagtgaa tcatcagttt 180
ttgaacgcac attgcacttt ggggtatccc ccaaagtata cttgtttgag cgttgtttct 240
ctcttggaat tgcattgctt ttctaaaatt tcgaatcaaa ttcgtttgaa aaacaacact 300
attcaacctc agatcaagta ggattacccg ctgaacttaa gcatatcaa 349
Claims (3)
1.一种(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的生物催化制备方法，其特征在于所述方法为：以白地霉(Geotrichum candidum)ZJPH1704经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以2-三氟甲基苯乙酮为底物，以甘油为辅助底物，在pH 5.8～8.0的磷酸缓冲液中，于25～40℃、200rpm条件下进行生物还原反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇；所述白地霉(Geotrichum candidum)ZJPH1704，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2017380，保藏日期为：2017年6月26日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
2.如权利要求1所述(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的生物催化制备方法，其特征在于所述底物用量以缓冲液体积计为5～25mmol/L，湿菌体用量以缓冲液体积计为100～500g/L；辅助底物用量以缓冲液体积计分别为20g/L、40g/L、70g/L、100g/L、150g/L或200g/L。
3.如权利要求1所述(R)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的生物催化制备方法，其特征在于所述生物催化剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将白地霉ZJPH1704接种至斜面培养基，25～30℃培养1-2天，获得斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 1g/L，(NH4)2SO4 1g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0；
(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，25～30℃、150～250rpm培养10～24h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 1g/L，(NH4)2SO4 1g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度为4～10％的接种量接种至发酵培养基中，装液量为100mL/250mL摇瓶，25～30℃、150～250rpm培养24～28h，发酵结束后，将发酵液离心，收集湿菌体，即为生物催化剂；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，KH2PO4 0.5g/L，(NH4)2SO4 1g/L，K2HPO4 0.5g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
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