CN113462728B - 一种利用土星轮头酵母制备(r)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法 - Google Patents

一种利用土星轮头酵母制备(r)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明为一种利用土星轮头酵母制备(R)‑1‑(4‑溴苯基)‑2,2,2‑三氟乙醇的方法，以土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807菌株经发酵培养获得的湿菌体为酶源细胞，以4'‑溴‑2‑2‑2‑三氟苯乙酮为底物，以pH值6.0～8.0的0.1M缓冲液为反应介质构成转化体系，在30℃、200rpm条件下转化6～48h，反应结束后，获得含式(Ⅰ)所示(R)‑1‑(4‑溴苯基)‑2,2,2‑三氟乙醇的转化液。本发明利用土星轮头酵母ZJPH1807菌株静息细胞为催化剂，生物催化4'‑溴‑2‑2‑2‑三氟苯乙酮不对称还原获得相应的(R)‑1‑(4‑溴苯基)‑2,2,2‑三氟乙醇，该方法具有立体选择性高，反应条件温和等优点。当底物浓度为1.25g/L时，产率达74.52％，e.e.值为94.08％。

Description

一种利用土星轮头酵母制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟 乙醇的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的制备方法，特别涉及利用土星轮头酵母(Gyberlindnera saturnus)ZJPH1807全细胞催化4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮不对称还原制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法。
(二)背景技术
式(Ⅰ)所示的(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇是合成药物组织蛋白酶K抑制剂奥当卡替(Odanacatib，MK-0822)和色氨酸羟化酶抑制剂LX1031的重要手性中间体。
式(Ⅱ)所示的奥当卡替(化学名：(2S)-N-(1-氰基环丙基)-4-氟-4-甲基-2-(((S)-2,2,2-三氟-1-(4'-(甲基磺酰基)-[1,1'-联苯基]-4-基)乙基)氨基)戊酰胺，CAS号：603139-19-1)是默沙东公司开发的一种组织蛋白酶K抑制剂，用于治疗妇女绝经后的骨质疏松症。组织蛋白酶K由破骨细胞分泌并累积在酸化的吸收腔中，并在吸收腔降解基质蛋白，从而导致骨质流失。奥当卡替能造成破骨细胞失活，从而使组织蛋白酶K的分泌受阻，但不影响破骨细胞与成骨细胞之间双向信号的转导，从而维持成骨细胞的骨形成作用，是一种有效的骨质疏松症治疗药物。
式(Ⅲ)所示的LX-1031(化学名：(2S)-2-氨基-3-[4-[2-氨基-6-[(1R)-2,2,2-三氟-1-[4-(3-甲氧基联苯)苯基]乙氧基]嘧啶-4-基]苯基]丙酸，CAS号：945976-76-1)主要用于治疗肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)。IBS的发生与胃肠道中5-羟色胺(5-HT)的过表达有关。色氨酸羟化酶(TPH)是5-HT生物合成中的限速酶，存在TPH1和TPH2两个亚型。LX-1031可以选择性抑制主要表达于胃肠道中的TPH1，减少外周5-HT的合成，潜在地提供IBS的有效治疗，而不会影响大脑中5-HT的水平，从而最大程度地减少CNS副作用。
目前制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法主要包括化学法和生物法。化学法制备大多需使用价格昂贵的金属催化剂，易造成环境污染，且反应条件较苛刻，影响了其工业化应用。生物法制备是以全细胞或酶作为催化剂，进行底物4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮的不对称还原，具有反应选择性高、反应条件温和、环境友好等优点。Hussain利用从红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)中分离纯化的醇脱氢酶(ADH RE)进行4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮不对称还原制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇，采用酶偶联法实现辅酶再生，所用的偶联酶为葡萄糖脱氢酶103(GDH 103)，在此条件下产物对映体过量值大于99％。Lopes等采用含过表达ADH-A(20mg)的大肠杆菌冻干细胞为催化剂制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇，底物浓度为50mM(12.6mg/L)，以异丙醇为辅助底物，反应在30℃，700rpm进行2h后，转化率≥99％，对映体过量值为98％。
酶法转化工艺中使用的纯化酶需经过繁琐和高成本的分离纯化过程得到，增加了生产成本，同时底物还原过程中还需额外添加昂贵的辅因子。而利用微生物全细胞催化还原无需进行酶的分离纯化，并且可以实现辅酶的原位再生，不需要添加昂贵的辅因子。Lopes等在连续流还原氟化苯乙酮的研究中采用了全细胞的催化方式，他们使用浓度为7.2mM的底物考察了8种不同微生物(6株酵母菌和2株丝状真菌)对4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮的不对称还原反应。结果显示采用深红酵母(Rhodotorula rubra)进行全细胞催化的转化率＞99％，(R)-构型醇的ee值为35％，用海藻酸钙固定化后结果无明显变化，转化率为98％，ee值为42％。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种利用土星轮头酵母(Gyberlindnera saturnus)ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法。该方法具有立体选择性高，成本低，反应条件温和，环境友好等优点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用土星轮头酵母(Gyberlindnera saturnus)ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法，所述土星轮头酵母ZJPH1807的保藏编号为CCTCC NO:M2019215，所述方法为：以土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807菌株经发酵培养获得的湿菌体为酶源细胞，以4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮为底物，以pH值6.0～8.0的0.1M缓冲液为反应介质构成转化体系，在30℃、200rpm条件下转化6～48h(优选24h)，反应结束后，获得含式(Ⅰ)所示(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇产物的转化液。
进一步，转化反应结束后，反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，离心收集乙酸乙酯萃取相，将乙酸乙酯相经旋转蒸发器浓缩去除溶剂乙酸乙酯，即得到产物的粗提液；将用石油醚浸泡过的硅胶装于层析柱中制备得到硅胶层析柱，再以石油醚：乙酸乙酯＝8:1(v/v)的洗脱剂平衡硅胶柱，将所述产物粗提液上样于硅胶柱，然后以石油醚：乙酸乙酯＝8:1(v/v)为洗脱剂进行洗脱，收集合并含有目标产物的洗脱液，经旋转蒸发浓缩后，即得(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇产物。
进一步，所述缓冲液为K2HPO4-KH2PO4、柠檬酸-柠檬酸钠或甘氨酸-氢氧化钠，优选K2HPO4-KH2PO4(优选浓度为0.1M，pH 7.0)。
进一步，所述底物的用量以所述缓冲液的体积计为1.25～8.75g/L(优选1.25g/L)，所述湿菌体的用量以所述缓冲液的体积计为50～400g/L(优选300g/L)。
进一步，为促进生物还原反应中的辅酶再生，提高反应产率，所述反应体系中还添加有辅助底物，所述辅助底物为下列之一：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甲醇、异丙醇、甘油、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酰胺；所述辅助底物为葡萄糖、麦芽糖或蔗糖时，添加量以所述缓冲液的体积计为100g/L；所述辅助底物为甘油时，添加量以所述缓冲液的体积计为60g/L；所述辅助底物为甲醇或异丙醇时，添加量为所述缓冲液的体积的5～25％，优选10％；所述辅助底物为L-谷氨酰胺、L-赖氨酸或L-酪氨酸时，添加量以所述缓冲液的体积计为50g/L。
优选所述辅助底物为甲醇，添加量为所述缓冲液体积的10％。
进一步，所述酶源细胞按如下方法制备：(1)斜面培养：将土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807接种至斜面培养基，30℃培养1-2天，获得斜面菌种；斜面培养基中各组分终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉15～20g/L(优选20g/L)，溶剂为水，pH 6.5；
(2)种子培养：从步骤(1)中所得斜面菌种挑一环菌体接入100mL种子培养基中，30℃、200rpm培养12h，获得种子液；所述种子培养基中各组分终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量转接到发酵培养基中，30℃、200rpm培养24h，发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1M、pH 6.5缓冲液洗涤，再次离心收集湿菌体，即为所述酶源细胞；所述发酵培养基中各组分终浓度组成为：葡萄糖20g/L，NH4Cl 15g/L，CaCl2 8g/L，溶剂为水，pH 8.0。
本发明所述土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807已在申请人先前专利申请CN110283733A中公开，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2019215，保藏日期：2019年3月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：利用土星轮头酵母ZJPH1807菌株静息细胞为催化剂，生物催化4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮不对称还原获得相应的(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇，该方法具有立体选择性高，反应温和等优点。当底物浓度为1.25g/L时，产率达74.52％，e.e.值为94.08％。
(四)附图说明
图1为A：4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮；B：十四烷；C：(S)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇；D：(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇标准品的气相色谱图。
图2为实施例2土星轮头酵母(Gyberlindnera saturnus)ZJPH1807菌株生物还原反应萃取液的气相色谱图。A：4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮；B：十四烷；C：(S)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇；D：(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：生物催化剂的制备
1)斜面培养：挑取土星轮头酵母(Gyberlindnera saturnus)ZJPH1807单菌落接种至斜面培养基，30℃培养1～2天，获得斜面菌体，4℃冰箱保存。斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 6.5。
2)种子培养：从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养12h，获得种子液。种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5。
3)发酵培养：以体积浓度10％的接种量将种子液转接到装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养24h，获得发酵培养液，将发酵液9000rpm，4℃，离心10min，所得沉淀用0.1M、pH 6.5缓冲液洗涤，即获得湿菌体；发酵培养基组成：葡萄糖20g/L，NH4Cl15g/L，CaCl2 8g/L，溶剂为水，pH 8.0。
实施例2：生物转化反应
将1g按实施例1方法所得的湿菌体重悬于10mL，0.1M，pH 7.0的磷酸缓冲液中；加入0.0125g 4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮作为底物，再加入1000μL甲醇作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。转化结束后，转化液用10mL乙酸乙酯萃取，获得含有(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的乙酸乙酯萃取液，采用气相色谱法分析目的产物和残留底物的含量以及产物的光学纯度，产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值94.08％，产率为74.52％。
实施例3：转化产物的气相色谱检测方法
转化反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用气相色谱法分析，用内标法定量。气相色谱检测方法如下：气相色谱仪为Agilent7820A，色谱柱为Varian CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm，df＝0.25)。以十四烷(3.862mM)为内标物进行底物和产物的定量分析，载气为氮气，使用氢火焰离子化检测器(FID)。
气相检测条件：载气流量2mL/min，进样量1μL，分流比15:1，进样口温度250℃，检测器温度250℃，色谱柱温度142～152℃，升温速度1℃/min。各物质保留时间为4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮1.6min，内标物十四烷3.1min，(S)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇8.6min，(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇9.1min。
产物产率的计算公式：
公式(1)中Ci、C0分别是反应结束时产物的摩尔浓度以及反应起始时底物的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess，e.e.)表征：
公式(2)中CR和CS分别为(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇和(S)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的摩尔浓度。
实施例4：辅助底物种类对催化结果的影响
将1g按实施例1方法获得的土星轮头酵母(Gyberlindnera saturnus)ZJPH1807湿菌体，悬浮于10ml，0.1M、pH 7.0的磷酸缓冲液中，加入0.025g 4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮为底物，分别加入1g葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，0.6g甘油，600μL甲醇和异丙醇，0.5g L-谷氨酰胺、L-赖氨酸和L-酪氨酸作为辅助底物，30℃、200rpm振荡反应24h，反应结束后，在转化液中加入10mL乙酸乙酯萃取，反应萃取液中的产物和未反应的底物浓度采用实施例3的气相色谱法进行分析检测，计算目的产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的对映体过量值(e.e.值)及产率，结果见表1。
表1添加不同辅助底物对产物e.e.值及产率的影响
从表1可知，选择甲醇为较佳的辅助底物，在此条件下，(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为86.28％，产率为89.68％。
实施例5：甲醇添加量对催化结果的影响
将1g按实施例1方法获得的土星轮头酵母(Gyberlindnera saturnus)ZJPH1807湿菌体重悬于10mL，0.1M、pH 7.0的磷酸缓冲液中，加入0.025g 4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮为底物，分别加入500、800、1000、1500、2000、2500μL甲醇作为辅助底物，30℃，200rpm振荡反应24h，反应结束后，在转化液中加入10mL乙酸乙酯萃取，反应萃取液中的产物和未反应的底物浓度采用实施例3的气相色谱法进行分析检测，计算目的产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的对映体过量值(e.e.值)及产率，结果如表2所示。
表2甲醇添加量对产物e.e.值及产率的影响
从表2可知，优选甲醇添加量为10％(v/v)，在此条件下，(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为88.04％，产率为94.85％。
实施例6：缓冲液种类与pH对催化结果的影响
将1g按实施例1方法获得的土星轮头酵母(Gyberlindnera saturnus)ZJPH1807湿菌体分别重悬于10mL的0.1M、pH 4.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.1M、pH 5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.1M、pH 6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.1M、pH 6.0K2HPO4-KH2PO4缓冲液，0.1M、pH 7.0K2HPO4-KH2PO4缓冲液，0.1M、pH 8.0K2HPO4-KH2PO4缓冲液，0.1M、pH 9.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，加入0.025g 4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮为底物，加入1000μL甲醇作为辅助底物，于30℃，200rpm振荡反应24h，反应结束后，在转化液中加入10mL乙酸乙酯萃取，反应萃取液中的产物和未反应的底物浓度采用实施例3的气相色谱法进行分析检测，计算目的产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的对映体过量值(e.e.值)及产率，结果如表3所示。
表3甲醇添加量对产物e.e.值及产率的影响
由表3可知，优选pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4作为反应体系的缓冲液，在此条件下，(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为89.20％，产率为86.98％。
实施例7：底物浓度对催化结果的影响
将1g按实施例1方法获得的土星轮头酵母(Gyberlindnera saturnus)ZJPH1807湿菌体重悬于10mL，0.1M、pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，分别加入0.0125g、0.025g、0.0375g、0.05g、0.0625g、0.075g、0.0875g 4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮为底物，加入1000μL甲醇作为辅助底物，于30℃，200rpm振荡反应24h，反应结束后，在转化液中加入10mL乙酸乙酯萃取，反应萃取液中的产物和未反应的底物浓度采用实施例3的气相色谱法进行分析检测，计算目的产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的对映体过量值(e.e.值)及产率，结果见表4所示。
表4底物浓度对产物e.e.值及产率的影响
由表4可知，优选底物浓度为1.25g/L，在此条件下，(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为90.53％，产率为74.23％。
实施例8：菌体浓度对催化结果的影响
将按实施例1方法获得的土星轮头酵母(Gyberlindnera saturnus)ZJPH1807湿菌体重悬于10mL，0.1M、pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，湿菌体加量分别为0.5g、1g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g，加入0.025g 4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮为底物，加入1000μL甲醇作为辅助底物，于30℃，200rpm振荡反应24h，反应结束后，在转化液中加入10mL乙酸乙酯萃取，反应萃取液中的产物和未反应的底物浓度采用实施例3的气相色谱法进行分析检测，计算目的产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的对映体过量值(e.e.值)及产率，结果见表5所示。
表5菌体浓度对产物e.e.值及产率的影响
由表5可知，优选菌体浓度为300g/L，在此条件下，(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为91.90％，产率为82.10％。
实施例9：底物浓度、菌体浓度和缓冲液pH对催化结果的影响
将按实施例1方法获得的土星轮头酵母(Gyberlindnera saturnus)ZJPH1807湿菌体重悬于10mL，0.1M、不同pH的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，湿菌体加量为2.5g、3g、3.5g，加入0.0125g、0.025g、0.0375g 4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮为底物，加入1000μL甲醇作为辅助底物，于30℃，200rpm振荡反应24h，反应结束后，在转化液中加入10mL乙酸乙酯萃取，反应萃取液中的产物和未反应的底物浓度采用实施例3的气相色谱法进行分析检测，计算目的产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的对映体过量值(e.e.值)及产率，结果见表6所示。
表6底物浓度、菌体浓度和缓冲液pH对催化结果的影响
由表6经过极差分析和方差分析可得，优选转化体系为底物浓度1.25g/L，菌体浓度为350g/L，磷酸缓冲液pH 7.0，在此体系条件下，(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为94.08％，产率为74.52％。
实施例10：林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJPH1811生物催化制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的转化能力考察
(1)林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJPH1811，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；保藏编号：CCTCC NO：M 2020281，保藏日期：2020年7月6日。该菌株已在先前的专利申请(公开号：CN 112063532A，公开日：2020年12月11日)中公开。
(2)将1g林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJPH1811发酵培养获得的湿菌体重悬于10ml，0.1M，pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，加入0.025g 4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮作为底物，再加入1g葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。反应结束后，在转化液中加入10mL乙酸乙酯萃取，采用实施例3的气相色谱法分析检测反应萃取液中的产物和未反应的底物浓度。结果表明，所得产物的构型为(S)-构型，产物(S)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为99.9％，产率>99％。
结论：林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJPH1811不能转化4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇。
实施例11：半乳糖地霉(Galactomyces geotrichu)ZJPH1810生物催化制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的转化能力考察
(1)半乳糖地霉(Galactomyces geotrichu)ZJPH1810，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；保藏编号：CCTCC NO：M 2019822，保藏日期：2019年10月14日。该菌株已在先前的专利申请(公开号：CN 110760449 A，公开日：2020年2月7日)中公开。
(2)将1g半乳糖地霉(Galactomyces geotrichu)ZJPH1810发酵培养获得的湿菌体重悬于10ml，0.1M，pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，加入0.025g 4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮作为底物，再加入1g的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。反应结束后，在转化液中加入10mL乙酸乙酯萃取，采用实施例3的气相色谱法分析检测反应萃取液中的产物和未反应的底物浓度。结果表明，所得产物的构型为(S)-构型，产物(S)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为99.9％，产率>99％。
结论：半乳糖地霉(Galactomyces geotrichu)ZJPH1810不能转化4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇。
实施例12：土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807生物催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮能力考察
(1)2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮及其对应醇的检测方法
气相色谱仪为Agilent7820A，色谱柱为Varian CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25um，df＝0.25)。以十二烷为内标物进行底物和产物的定量分析，载气为氮气，使用氢火焰离子化检测器(FID)。气相(GC)检测条件：载气流量2mL/min，进样量1μL，分流比15:1，进样口温度260℃，检测器温度280℃，色谱柱温度120～165℃；升温速度：5℃/min，165℃保持1min。各物质的保留时间分别为：内标物十二烷2.7min；底物5.1min；S-构型产物7.9min；R-构型产物8.4min。
(2)生物转化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮
10mL PBS缓冲液(0.1M，pH 7.0)中加入1g土星轮头酵母(Cyberlindnerasaturnus)ZJPH1807湿菌体，底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮加量为9.53mg，加入1g葡萄糖作为辅助底物，30℃，200rpm转化24h，反应结束后在转化液中加入10mL乙酸乙酯萃取，采用本实施例中(1)方法检测产物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率和e.e.值。
结论：土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807生物催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮制备(R)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产率为73.1％，e.e.值为56.6％。

Claims (10)

1.一种利用土星轮头酵母ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法，所述土星轮头酵母ZJPH1807的保藏编号为CCTCC NO:M2019215，所述方法为：以土星轮头酵母ZJPH1807菌株经发酵培养获得的湿菌体为酶源细胞，以4'-溴-2-2-2-三氟苯乙酮为底物，以pH值6.0～8.0的0.1M缓冲液为反应介质构成转化体系，在30℃、200rpm条件下转化6～48h，反应结束后，获得含(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的转化液。
2.如权利要求1所述的利用土星轮头酵母ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法，其特征在于：所述缓冲液为K2HPO4-KH2PO4、柠檬酸-柠檬酸钠或甘氨酸-氢氧化钠。
3.如权利要求2所述的利用土星轮头酵母ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法，其特征在于：所述缓冲液为K2HPO4-KH2PO4。
4.如权利要求3所述的利用土星轮头酵母ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法，其特征在于：所述缓冲液浓度为0.1M，pH 7.0。
5.如权利要求1所述的利用土星轮头酵母ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法，其特征在于：所述底物的用量以所述缓冲液的体积计为1.25～8.75g/L。
6.如权利要求5所述的利用土星轮头酵母ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法，其特征在于：所述底物的用量以所述缓冲液的体积计为1.25g/L。
7.如权利要求1所述的利用土星轮头酵母ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法，其特征在于：所述湿菌体用量以缓冲液体积计为50～400g/L。
8.如权利要求1所述的利用土星轮头酵母ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法，其特征在于：反应体系中还添加辅助底物，所述辅助底物为下列之一：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甲醇、异丙醇、甘油、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酰胺；所述辅助底物为葡萄糖、麦芽糖或蔗糖时，添加量以所述缓冲液的体积计为100g/L；所述辅助底物为甘油时，添加量以所述缓冲液的体积计为60g/L；所述辅助底物为甲醇或异丙醇时，添加量为所述缓冲液的体积的5～25％；所述辅助底物为L-谷氨酰胺、L-赖氨酸或L-酪氨酸时，添加量以所述缓冲液的体积计为50g/L。
9.如权利要求8所述的利用土星轮头酵母ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法，其特征在于：所述辅助底物为甲醇，添加量为所述缓冲液体积的10％。
10.如权利要求1所述的利用土星轮头酵母ZJPH1807制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法，其特征在于所述酶源细胞按如下方法制备：
(1)斜面培养：将土星轮头酵母ZJPH1807接种至斜面培养基，30℃培养1-2天，获得斜面菌种；斜面培养基中各组分终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉15～20g/L，溶剂为水，pH 6.5；
(2)种子培养：从步骤(1)中所得斜面菌种挑一环菌体接入100mL种子培养基中，30℃、200rpm培养12h，获得种子液；种子培养基中各组分终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量转接到100mL发酵培养基中，30℃、200rpm培养24h，发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1M、pH 6.5缓冲液洗涤，再次离心收集湿菌体，即为所述酶源细胞；所述发酵培养基中各组分终浓度组成为：葡萄糖20g/L，NH4Cl 15g/L，CaCl2 8g/L，溶剂为水，pH 8.0。
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