CN112048538B - 一种利用土星轮头酵母制备(s)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用土星轮头酵母制备(S)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，以土星轮头酵母ZJPH1807经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以3,5‑双三氟甲基苯乙酮为底物，于pH值6.0～8.0的缓冲液中构成转化体系，在25～45℃、100‑200rpm条件下进行转化反应，反应结束后将转化反应液进行分离纯化，获得(S)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇；本发明在pH 7.5的磷酸缓冲液体系中，菌体加量为150g/L，加入128.07g/L(500mM)的底物，转化24h，产物的产率为80.97％。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的制备方法，特别涉及利用土星轮头酵母不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮为(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法。
(二)背景技术
(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，分子式C10H8F6O，是用于制备NK-1受体拮抗剂-阿瑞匹坦的关键手性中间体。阿瑞匹坦(Aprepitant)是美国FDA于2003年批准上市的第一个神经激肽-1(NK-1)受体阻滞剂，也是目前应用广泛的NK-1受体拮抗剂，通过与NK-1受体(主要存在于中枢神经系统及其外围)结合，来阻滞P物质的作用，抑制恶心呕吐反应，具有高选择性、强亲和力和长半衰期等优点。其全新的止吐作用靶点为预防术后恶心呕吐提供了一种新的选择，并对疼痛、焦虑、抑郁症、偏头痛等有潜在的治疗作用。
目前制备(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法主要包括化学法和生物法。化学法制备多使用金属催化剂，价格昂贵，易造成环境污染，且合成步骤冗长。生物催化是以全细胞或酶作为催化剂，实现底物3,5-双三氟甲基苯乙酮的不对称还原，具有选择性高、反应条件温和等优点。Pollard等采用来自原核微生物红串红球菌的醇脱氢酶合成(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，底物浓度为580mM(148.57g/L)，产率97％，e.e.值>99.9％。Broussy等分别利用马肝醇脱氢酶(HLADH)和近平滑假丝酵母醇脱氢酶(CPADH)进行3,5-双三氟甲基苯乙酮的不对称还原反应合成(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，两种酶的转化率均达99％，e.e.值为98％。但酶法转化所用的纯酶需经过繁琐、高成本的分离纯化过程制备得到，增加了成本，同时底物还原过程中还需额外添加昂贵的辅因子。而利用微生物全细胞催化还原，可实现辅酶的原位再生，不需要添加昂贵的辅因子。张芳等人在水-辛烷双相体系中，利用红酵母催化3,5-双三氟甲基苯乙酮不对称还原为(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，底物浓度为11mM时，产率为81.7％，但产物的e.e.值不理想，最高为89.5％。王普等人以热带假丝酵母104催化合成(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，加入麦芽糖为辅助底物，当底物浓度为50mM时，产率为70.3％；利用红串红球菌XS1012催化制备(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇时，以葡萄糖和异丙醇为双辅助底物，当底物浓度为20mM时，产率为92％，e.e.值>99.9％。
目前报道的全细胞催化3,5-双三氟甲基苯乙酮不对称还原制备(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法主要存在可催化的底物浓度偏低，产物的产率不高等问题。
本发明提出利用土星轮头酵母ZJPH1807菌株，通过生物催化还原制备(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的新方法，该方法利用微生物全细胞为催化剂，可高选择性生物还原3,5-双三氟甲基苯乙酮制备(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，微生物酶源细胞可经发酵自行制备，质量稳定，成本低廉，并且在生物还原过程中，通过添加廉价的辅助底物即可实现辅酶的原位再生。土星轮头酵母ZJPH1807细胞可在中性偏碱性的较宽泛的pH范围内保持较高的催化性能。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种利用土星轮头酵母制备(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，以土星轮头酵母ZJPH1807静息细胞为催化剂转化制备(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，不仅可消除培养基成分对生物转化过程的影响，有效控制转化液的组成，提高转化率，而且更利于转化产物的后续分离与提纯，菌种易培养，含酶源细胞的制备成本低，催化转化3,5-双三氟甲基苯乙酮的底物浓度高，转化产率高。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用土星轮头酵母制备(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，所述的方法为：以土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，于pH值6.0～8.0的缓冲液中构成转化体系，在25～45℃、100-200rpm条件下(优选30℃、200rpm)进行转化反应，反应结束后将转化反应液进行分离纯化，获得(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇；所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为10-300g/L，所述底物的初始加量以缓冲液体积计为10-160g/L。
进一步，所述缓冲液种类优选K2HPO4-KH2PO4，Na2HPO4-NaH2PO4，Tris-HCl，Na2HPO4-KH2PO4，最优选Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.0)。
进一步，为促进辅酶再生，提高反应效率，所述转化体系中添加有辅助底物，所述辅助底物为下列之一：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘油、异丙醇、乙醇、甲醇、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸；所述辅助底物为葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖或甘油时，添加量以缓冲液体积计为10～100g/L，优选50g/L；所述辅助底物为异丙醇、乙醇或甲醇时，体积加量以缓冲液体积计为10％；所述辅助底物为半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸时，添加量以缓冲液体积计为10g/L。优选地，所述辅助底物为葡萄糖，添加量以缓冲液体积计为50g/L。
为了进一步提高还原产率，所述转化体系由酶源、底物、辅助底物和天然低共熔溶剂组成，所述天然低共熔溶剂质量加量以缓冲液体积计为5～20g/L，优选10g/L。所述天然低共熔溶剂的种类及摩尔比为下列之一：甜菜碱:葡萄糖:甘油(摩尔比1:1:1)、甜菜碱:赖氨酸(摩尔比1:2)、L-肉碱:赖氨酸(摩尔比1:2)、L-肉碱:赖氨酸(摩尔比1:1)、L-脯氨酸:赖氨酸(摩尔比1:1)、甜菜碱:谷氨酸(摩尔比1:1)、L-脯氨酸:赖氨酸(摩尔比1:1)、L-脯氨酸:异丙醇(摩尔比1:1)、甜菜碱:异丙醇(摩尔比1:1)、甜菜碱:丙氨酸(摩尔比1:1)。优选L-肉碱:赖氨酸，特别地，当转化体系中加入L-肉碱:赖氨酸(摩尔比为1:2)，底物浓度为76.84g/L时，产率可提高至84.82％。
此外，本发明所述转化体系由酶源、底物、辅助底物、天然低共熔溶剂和表面活性剂组成，所述表面活性剂为吐温-80，吐温-60，吐温-20，司盘-80(Span-80)或司盘-20(Span-20)，优选吐温-80；所述表面活性剂的添加量以缓冲液体积计为1～15g/L，最优选5g/L。
本发明最优选转化体系由酶源、底物、辅助底物、天然低共熔溶剂和表面活性剂组成，底物加量以缓冲液体积计为128.07g/L，所述酶源加量以缓冲液体积计为150g/L；所述辅助底物为葡萄糖，其中葡萄糖添加量以缓冲液体积计为50g/L；所述天然低共熔溶剂为L-肉碱:赖氨酸(摩尔比为1:2)，加量以缓冲液体积计为10g/L；所述表面活性剂为Tween-80，添加量以缓冲液体积计为5g/L；该转化体系的产率提高至80.97％。
进一步，本发明所述酶源按如下方法制备：(1)斜面培养：将土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO41.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉15～20g/L(优选20g/L)，溶剂为水，pH6.5；
(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，25～30℃、150～250rpm培养10～24h(优选30℃、200rpm培养12h)，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度8％的接种量接种至发酵培养基中，初始pH值7.5，摇瓶装液量为90mL/250mL锥形瓶，培养温度30℃、摇床转速200rpm，培养时间32h，发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1M、pH 7.5磷酸缓冲液洗涤，收集湿菌体，即为酶源；发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖34.36g/L，酵母膏14.89g/L，NH4Cl 30.34g/L，KH2PO41.01g/L，CaCl2 0.11g/L，溶剂为水，pH 7.5。
本发明技术路线如下：
本发明土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807已在申请人先前专利申请CN110283733A中公开，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2019215，保藏日期2019年3月29日。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明利用土星轮头酵母ZJPH1807菌株静息细胞为催化剂，生物不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮获得相应的(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。利用该菌株制备所得产物的光学纯度高，e.e.值>99.9％。在pH 7.5的磷酸缓冲液体系中，菌体加量为150g/L，加入128.07g/L(500mM)的底物，转化24h，产物的产率为80.97％。
(四)附图说明
图1为3,5-双三氟甲基苯乙酮(A)、正十二烷(B)、(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇(C)、(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇(D)标准品的气相色谱图。
图2为土星轮头酵母ZJPH1807生物还原反应萃取液的气相色谱图；A:3,5-双三氟甲基苯乙酮；B:正十二烷；C:(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：湿菌体的获得
斜面培养基组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH值6.5。
种子培养基组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH值6.5。
发酵培养基组成：葡萄糖34.36g/L，酵母膏14.89g/L，NH4Cl 30.34g/L，CaCl20.11g/L，KH2PO4 1.01g/L，溶剂为水，pH值7.5。
将土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌体。
从培养成熟的斜面挑取一环菌体接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养12h，得种子液，再以体积浓度8％的接种量将种子液转接到装有90mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养32h。培养结束后发酵液经离心分离沉淀，并用pH7.0的磷酸缓冲液洗涤，收集得到湿菌体细胞，备用。
实施例2：产物的气相检测方法
反应结束后，在转化液中加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取液中的产物和未反应的底物浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。气相色谱检测方法如下：气相色谱仪为Agilent7820A，色谱柱为Varian CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm，df＝0.25)。以十二烷(4.4mM)为内标物进行底物和产物的定量分析，载气为氮气，使用氢火焰离子化检测器(FID)。
气相(GC)检测条件：载气流量2ml/min，进样量1μL，分流比15:1，进样口温度250℃，检测器温度250℃，色谱柱温度80℃保持2min，再以5℃/min升温到180℃。各物质的保留时间分别为：3,5-双三氟甲基苯乙酮4.1min，十二烷8.8min，(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇10.1min，以及(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇10.6min，气相检测色谱图见图1。
公式(1)中Ci、C0分别为反应结束时产物的摩尔浓度和反应起始时底物的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess，e.e.)表征。
公式(2)中：CS和CR分别为产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇、(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的摩尔浓度。
实施例3：辅助底物种类对催化结果的影响
将实施例1方法所得的湿菌体1g重悬于10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH7.0)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮和辅助底物，30℃，200rpm转化24h，反应结束后，在转化液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，反应萃取液中的产物和未反应的底物浓度采用实施例2的气相色谱法进行分析检测，气相检测色谱图见图2，通过计算得出目的产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率及对应体过量值(e.e.值)，结果见表1所示。湿菌体质量添加量以缓冲液体积计为100g/L，底物加量以缓冲液体积计为51.23g/L，辅助底物(葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖和甘油)以缓冲液体积计均为50g/L，辅助底物(甲醇、乙醇和异丙醇)以缓冲液体积计均为10％(v/v)，辅助底物(L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-丙氨酸)以缓冲液体积计均为10g/L。
表1添加不同辅助底物对产物产率及e.e.值的影响
从表1可知，选择葡萄糖为较佳的辅助底物，在此条件下，(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇产率为61.49％，e.e.值>99.9％。
实施例4：葡萄糖浓度对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的湿菌体1g重悬于10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮和不同浓度的葡萄糖作为辅助底物，30℃、200rpm转化24h，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率、e.e.值，结果见表2。湿菌体加量以缓冲液体积计为100g/L，底物加量以缓冲液体积计为51.23g/L，葡萄糖加量以缓冲液体积计分别为：10g/L、50g/L、70g/L、100g/L、120g/L。
表2葡萄糖浓度对产率和e.e.值的影响
从表2可知，较佳的葡萄糖添加量为50g/L，在此条件下，产率为62.69％，e.e.值>99.9％。
实施例5：转化反应温度对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的湿菌体1g重悬于10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮和辅助底物葡萄糖，于不同温度(25～45℃)下，200rpm转化24h，反应结束后采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表3。湿菌体加量以缓冲液体积计为100g/L，底物加量以缓冲液体积计为51.23g/L，葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L。
表3不同转化温度下的产物产率及e.e.值
优选转化反应温度为30℃，在此条件下，产率为62.51％、e.e.值>99.9％。
实施例6：缓冲液种类对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的湿菌体分别重悬于10mL的0.1M，pH 7.0K2HPO4-KH2PO4缓冲液、0.1M，pH 7.0Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、0.1M，pH 7.0Tris-HCl缓冲液、0.1M，pH7.0Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液和纯净水中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮和辅助底物葡萄糖，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表4。湿菌体加量以缓冲液体积计为100g/L，底物加量以缓冲液体积计为51.23g/L，葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L。
表4缓冲液种类对产物的产率和e.e.值的影响
优选缓冲液种类为Na2HPO4-NaH2PO4，在此条件下，产物的产率为63.15％，e.e.值>99.9％。
实施例7：缓冲液pH值对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的湿菌体分别重悬于10mL pH范围为6.0～8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮和辅助底物葡萄糖，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表5。湿菌体加量以缓冲液体积计为100g/L，底物加量以缓冲液体积计为51.23g/L，葡萄糖加量以缓冲液体积计50g/L。
表5缓冲液pH值对产率及e.e.值的影响
优选Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的pH为7.0，在此条件下，产物的产率为63.73％，e.e.值>99.9％。
实施例8:湿菌体加量对催化结果的影响
将不同量的按照实施例1方法所得的湿菌体分别重悬于10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮和辅助底物葡萄糖，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表6。湿菌体加量以缓冲液体积计为10～300g/L，底物加量以缓冲液体积计为76.84g/L(300mM)，葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L。
表6湿菌体加量对产率和e.e.值的影响
优选湿菌体加量为50g/L，在此条件下，产率为60.67％、e.e.值>99.9％。
实施例9：底物浓度对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的湿菌体0.5g重悬于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，加入不同量的底物3,5-双三氟甲基苯乙酮和辅助底物葡萄糖，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表7。湿菌体加量以缓冲液体积计为50g/L，底物加量以缓冲液体积计为25.61～153.69g/L，葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L。
表7底物浓度对产率和e.e.值的影响
优选底物浓度为51.23g/L，在此条件下，产率为69.73％、e.e.值>99.9％。
实施例10：转化时间对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的0.5g湿菌体重悬于10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮和辅助底物葡萄糖，于30℃，200rpm条件下转化6～42h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表8。湿菌体加量以缓冲液体积计为50g/L，底物加量以缓冲液体积计为51.23g/L，葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L。
表8转化时间对产率和e.e.值的影响
优选转化时间为30h，在此条件下，产率为76.42％，e.e.值>99.9％。
实施例11:加入不同种类天然低共熔溶剂对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的0.5g湿菌体重悬于10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮、辅助底物葡萄糖和天然低共熔溶剂，于30℃，200rpm条件下转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表9。湿菌体加量以缓冲液体积计为50g/L，天然低共熔溶剂加量以缓冲液体积计10g/L，底物加量以缓冲液体积计为76.84g/L，葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L。
表9加入不同种类天然低共熔溶剂对产率和e.e.值的影响
最优天然低共熔溶剂为L-肉碱:赖氨酸(摩尔比为1:2)，在此条件下，产率为73.10％、e.e.值>99.9％。
实施例12:天然低共熔溶剂(NADES)加量对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的0.5g湿菌体重悬于10mLNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮、辅助底物葡萄糖和天然低共熔溶剂，于30℃，200rpm条件下转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表10。湿菌体用量以缓冲液体积计为50g/L；底物加量以缓冲液体积计为76.84g/L；葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L；天然低共熔溶剂为L-肉碱:赖氨酸(摩尔比为1:2)，加入量以缓冲液体积计为10-25g/L。
表10 NADES加量对产物产率和e.e.值的影响
表10的结果表明，在反应体系中加入10g/L的L-肉碱:赖氨酸(C:Lys)(摩尔比1:2)，产率为75.99％，e.e.值>99.9％。
实施例13:含天然低共熔溶剂的转化体系中湿菌体加量对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的湿菌体重悬于10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH7.0)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮、辅助底物葡萄糖和天然低共熔溶剂，于30℃，200rpm条件下转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表11。湿菌体用量以缓冲液体积计为50-300g/L；底物加量以缓冲液体积计为76.84g/L；葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L；天然低共熔溶剂为L-肉碱:赖氨酸(摩尔比为1:2)，加入量以缓冲液体积计为10g/L。
表11含天然低共熔溶剂的转化体系中湿菌体加量对产率和e.e.值的影响
表11的结果表明，在含天然低共熔溶剂的转化体系中最适的湿菌体加量为150g/L，产率为81.22％，e.e.值>99.9％。
实施例14:含天然低共熔溶剂的转化体系中缓冲液种类和pH值对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的1.5g湿菌体重悬于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1M，pH 4～6)、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M,pH 6～8)、Tris-HCl(0.1M,pH 8～9)、甘氨酸-氢氧化钠(0.1M,pH 9～9.6)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮、辅助底物葡萄糖和天然低共熔溶剂，于30℃，200rpm条件下转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表12。湿菌体用量以缓冲液体积计为150g/L；底物加量以缓冲液体积计为76.84g/L；葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L；天然低共熔溶剂为L-肉碱:赖氨酸(摩尔比为1:2)，加入量以缓冲液体积计为10g/L。
表12含天然低共熔溶剂的转化体系中缓冲液种类和pH值对产率和e.e.值的影响
表12的结果表明，在含天然低共熔溶剂的转化体系中较佳的缓冲液种类为Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M pH 7.5)，产率为84.45％，e.e.值>99.9％。
实施例15:不同表面活性剂对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的1.5g湿菌体重悬于10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.5)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮，辅助底物葡萄糖，天然低共熔溶剂L-肉碱:赖氨酸(1:2)和不同种类的表面活性剂，于30℃，200rpm条件下转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表13所示。湿菌体用量以缓冲液体积计为150g/L，底物加量以缓冲液体积计为102.47g/L，葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L，L-肉碱:赖氨酸(摩尔比1:2)加量以缓冲液体积计为10g/L，表面活性剂加量以缓冲液体积计为5g/L。
表13不同种类的表面活性剂对产物产率和e.e.值的影响
表13结果表明，Tween-80为最优的表面活性剂，产物产率为88.78％，e.e.值>99.9％。
实施例16:表面活性剂加量对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的1.5g湿菌体重悬于10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.5)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮、辅助底物葡萄糖、天然低共熔溶剂L-肉碱:赖氨酸(1:2)和Tween-80，于30℃，200rpm条件下转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表14所示。湿菌体用量以缓冲液体积计为150g/L，底物加量以缓冲液体积计为102.47g/L，葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L，L-肉碱:赖氨酸(摩尔比为1:2)加量以缓冲液体积计为10g/L，Tween-80加量以缓冲液体积计为1-15g/L。
表14表面活性剂加量对产物产率和e.e.值的影响
表14结果显示，Tween-80最优添加量为5g/L，产率为88.76％，e.e.值>99.9％。
实施例17：含天然低共熔溶剂和表面活性剂体系中不同转化时间对催化结果的影响
将按照实施例1方法所得的1.5g湿菌体重悬于10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.5)中，加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮、辅助底物葡萄糖、L-肉碱:赖氨酸(摩尔比1:2)和Tween-80，于30℃，200rpm条件下转化6～36h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值，结果见表15所示。湿菌体用量以缓冲液体积计为150g/L，底物加量以缓冲液体积计为128.07g/L(500mM)，葡萄糖加量以缓冲液体积计为50g/L，L-肉碱:赖氨酸(摩尔比为1:2)加量以缓冲液体积计为10g/L，Tween-80加量以缓冲液体积计为5g/L。
表15转化时间对产物的产率和e.e.值的影响
优选转化时间为24h，在此条件下，产率为80.97％，e.e.值>99.9％。
实施例18:阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJPH1903生物催化制备阿瑞匹坦关键手性中间体的转化能力考察
(1)阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJPH1903，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2019年10月14日，保藏编号：CCTCC NO：M2019821。该菌种已在先前的专利申请(公开号：CN110982757A，公开日：2020年4月10日)中公开。菌种的培养方法和酶源细胞制备过程依据先前的专利申请(公开号：CN110982757A，公开日：2020年4月10日)。
(2)生物催化制备阿瑞匹坦关键手性中间体
10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.0)中加入1g阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)ZJPH1903湿菌体，底物3,5-双三氟甲基苯乙酮加量以缓冲液体积计为12.81g/L，加入以缓冲液体积计为100g/L的葡萄糖作为辅助底物，30℃，200rpm转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值。
结论：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJPH1903不能转化3,5-BTAP制备阿瑞匹坦关键手性中间体(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。
实施案例19:Galactomyces geotrichum ZJPH1810生物制备阿瑞匹坦关键手性中间体的转化能力考察
(1)半乳糖地霉(Galactomyces geotrichum)ZJPH1810，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2019年10月14日，保藏编号：CCTCC NO：M2019822。该菌种已在先前的专利申请(公开号：CN 110760449 A，公开日：2020.02.07)中公开。菌种的培养方法和酶源细胞制备过程依据先前的专利申请(公开号：CN 110760449 A，公开日：2020.02.07)。
(2)生物催化制备阿瑞匹坦关键手性中间体
10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1M，pH 7.0)中加入1g半乳糖地霉(Galactomycesgeotrichum)ZJPH1810湿菌体，底物3,5-双三氟甲基苯乙酮加量以缓冲液体积计为12.81g/L，加入以缓冲液体积计为100g/L的葡萄糖作为辅助底物，30℃，200rpm转化24h，反应结束后，采用实施例2方法检测产物(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值。
结论：半乳糖地霉(Galactomyces geotrichum)ZJPH1810具有转化3,5-BTAP制备阿瑞匹坦关键手性中间体(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的能力，但产率仅为21.40％，e.e.值为62.06％。
Claims (6)
1.一种利用土星轮头酵母制备(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述的方法为：以土星轮头酵母（Cyberlindnera saturnus）CCTCC NO: M2019215经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，以葡萄糖为辅助底物，于0.1 M，pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中构成转化体系，在25~45℃、100-200rpm条件下进行转化反应30-36h，反应结束后将转化反应液进行分离纯化，获得(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇；所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为50 g/L，所述底物的初始加量以缓冲液体积计为25.61-51.23 g/L；所述葡萄糖添加量为50 g/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述转化体系由酶源、底物、辅助底物和天然低共熔溶剂组成；所述天然低共熔溶剂的种类及摩尔比为下列之一：甜菜碱:葡萄糖:甘油=1:1:1、甜菜碱:赖氨酸=1:2、L-肉碱:赖氨酸=1:2、L-脯氨酸:赖氨酸=1:1、甜菜碱:谷氨酸=1:1、L-脯氨酸:赖氨酸=1:1、L-脯氨酸:异丙醇=1:1、甜菜碱:异丙醇=1:1、甜菜碱:丙氨酸=1:1。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述天然低共熔溶剂质量加量以缓冲液体积计为5～20 g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述转化体系由酶源、底物、辅助底物、天然低共熔溶剂和表面活性剂组成，所述表面活性剂为吐温-80，吐温-60，吐温-20，司盘-80或司盘-20。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述表面活性剂的添加量以缓冲液体积计为1～15g/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酶源按如下方法制备：（1）斜面培养：将土星轮头酵母（Cyberlindnera saturnus）CCTCC NO: M2019215接种至斜面培养基，30℃培养24 h，获得斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15 g/L，蛋白胨7.5 g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，NaCl 0.75 g/L，MgSO4·7H2O 0.75 g/L，琼脂粉15~20 g/L，溶剂为水，pH 6.5；
（2）种子培养：将步骤（1）制备得到的斜面菌种接种至种子培养基中，25~30℃、150~250rpm培养10~24 h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，KH2PO4 2 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，溶剂为水，pH 6.5；
（3）发酵培养：将步骤（2）制备得到的种子液以体积浓度8%的接种量接种至发酵培养基中，初始pH值7.5，摇瓶装液量为90 mL/250 mL锥形瓶，培养温度30℃、摇床转速200 rpm，培养时间32 h，发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1 M、pH 7.5磷酸缓冲液洗涤，收集湿菌体，即为酶源；发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖34.36 g/L，酵母膏14.89 g/L，NH4Cl30.34 g/L，KH2PO4 1.01 g/L，CaCl2 0.11 g/L，溶剂为水，pH 7.5。
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