CN110760449A - 半乳糖地霉zjph1810及制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇应用 - Google Patents

半乳糖地霉zjph1810及制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110760449A
CN110760449A CN201911116285.4A CN201911116285A CN110760449A CN 110760449 A CN110760449 A CN 110760449A CN 201911116285 A CN201911116285 A CN 201911116285A CN 110760449 A CN110760449 A CN 110760449A
Authority
CN
China
Prior art keywords
volume
substrate
dichloro
glucose
buffer solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911116285.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110760449B (zh
Inventor
王普
夏娜娜
毕顺德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN201911116285.4A priority Critical patent/CN110760449B/zh
Publication of CN110760449A publication Critical patent/CN110760449A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110760449B publication Critical patent/CN110760449B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种半乳糖地霉ZJPH1810及其在制备(S)‑1‑(2,6‑二氯‑3‑氟苯基)乙醇中的应用，本发明采用该新菌种催化制备光学纯(S)‑1‑2,6‑二氯‑3‑氟苯基乙醇的立体选择性好，产物光学纯度高，e.e.值>99.9％。在pH 7.0的磷酸缓冲液体系中，加入5g/L的底物，反应24h，S构型还原产物的产率为64.44％。当反应体系中添加天然低共熔溶剂、表面活性剂时可有效改善催化效率，提高反应产率，产率可提高至86.64％，e.e.值大于99.9％。

Description

半乳糖地霉ZJPH1810及制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙 醇应用
(一)技术领域
本发明涉及一种(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的制备方法，特别涉及一株新的菌种—半乳糖地霉(Galactomyces geotrichum)ZJPH1810，及其在生物催化制备克唑替尼和爱莎替尼药物关键手性中间体(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇中的应用。
(二)背景技术
(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的化学结构式为：
Figure BDA0002274141270000011
(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇是制备克唑替尼和爱莎替尼药物的关键手性中间体。克唑替尼(crizotinib)的化学名为：3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-胺，它是一种小分子激酶抑制剂，用于治疗间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性的局部晚期和转移性非小细胞肺癌(NSCLC)。2011年，克唑替尼经美国FDA批准，并在美国上市，成为世界上第一个EML4-ALK融合基因的口服抑制剂，促进了个体化治疗的分子靶向药物的开发。艾莎替尼(Ensartinib)做为新一代ALK抑制剂，有望超过克唑替尼成为非小细胞癌的首选药物。
(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇是合成克唑替尼和爱莎替尼药物的关键手性中间体，根据其合成方法不同分为化学法和生物法两种制备路线。采用化学法制备的反应步骤较多，并且使用昂贵的化学催化剂如Ru等，对环境造成污染，生物催化法具有对映选择性高，反应条件温和，减少有机溶剂的使用，生物催化剂可重复使用、易于降解等优点，更符合绿色化学的要求。王安明等人对醛酮还原酶和乙醇脱氢酶双酶进行固定化，在磷酸钙-酶晶体(磷酸钙与醛酮还原酶以及乙醇脱氢酶协同制备的酶晶体)和辅酶NADPH的协同催化下，制得光学纯(S)-1-(2,6-二氯-3-氟-苯基)乙醇产物，产物收率为95％，e.e.为100％。洪浩等人使用酮还原酶酶液，添加NAD+，催化得到(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，反应收率85～95％，e.e.值大于98％。邵雷等人利用重组大肠杆菌E.coli BL21-ADH和E.coli BL21-GDH共表达乙醇脱氢酶(ADH)和葡萄糖脱氢酶(GDH)对底物进行还原反应。在反应温度为30℃，pH值为7的条件下潜手性酮底物加量为7％，(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇产率为90.35％。
申请人在先专利申请201711155979.X(公开号CN107794282A)提供了一株新菌种白地霉ZJPH1704以及利用该菌种催化不对称还原2,6-二氯-3-氟苯乙酮制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的方法。本发明提出了利用半乳糖地霉(Galactomyces geotrichum)ZJPH1810菌株生物转化制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的新方法，利用该全细胞催化的底物浓度和目标产物的产率更高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株新的菌种—半乳糖地霉(Galactomyces geotrichum)ZJPH1810，及其在生物催化制备克唑替尼和爱莎替尼药物关键手性中间体(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇中的应用，利用微生物全细胞生物还原2,6-二氯-3-氟苯乙酮制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，微生物细胞制备的成本低廉，且在生物还原过程中，通过添加廉价的辅助底物可实现辅酶的原位再生，进一步提高反应的底物浓度和产物收率。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--半乳糖地霉(Galactomyces geotrichum)ZJPH1810，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M 2019822，保藏日期：2019年10月14日，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
本发明提供一种半乳糖地霉ZJPH1810在制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇中的应用，所述应用的方法为：以半乳糖地霉ZJPH1810经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以2,6-二氯-3-氟苯乙酮为底物，以pH值2.96～10.6的缓冲液(优选pH值6～7)为反应介质构成转化体系，在25～50℃、150～250rpm(优选30℃、200rpm)条件下进行反应，反应结束后，将转化反应液分离纯化，获得(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
进一步，所述底物用量以缓冲液体积计为0.1～10g/L(优选2～6g/L)，湿菌体用量以缓冲液体积计为50～550g/L(优选100～350g/L)。
进一步，为促进辅酶再生，提高反应效率，所述转化体系中添加有辅助底物，所述辅助底物为下列一种或任意几种的混合：葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、甘油、异丙醇、半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸；所述辅助底物添加量以缓冲液体积计为20～200g/L，优选50-150g/L。优选地，所述反应以葡萄糖和甘油作为双辅助底物，最优选甘油添加量以缓冲液体积计为100g/L，葡萄糖添加量以缓冲液体积计为80g/L。不添加辅助底物的对照在相同条件下反应24h，生物催化产率为54.23％(水相转化，具体参见实施例3表1序号1)，添加100g/L甘油与80g/L作辅助底物时，底物浓度为2g/L，生物催化产率为66.88％(水相转化，具体参见实施例3表1序号16)。
进一步，所述缓冲液种类选用磷酸盐缓冲液，优选磷酸钾缓冲液，磷酸钠缓冲液，磷酸钠-柠檬酸缓冲液，最优选磷酸钠缓冲液。
为了进一步提高还原产率，所述转化体系由酶源、底物、辅助底物和天然低共熔溶剂组成，所述天然低共熔溶剂质量添加量以缓冲液体积计为2～10g/L，优选5g/L。所述天然低共熔溶剂为下列之一：甜菜碱：赖氨酸、氯化胆碱：赖氨酸、L-肉碱：赖氨酸、L-脯氨酸：赖氨酸、甜菜碱：甘氨酸、氯化胆碱：甘氨酸、L-肉碱：甘氨酸、L-脯氨酸：甘氨酸、甜菜碱：海藻糖、L-脯氨酸：海藻糖。优选L-肉碱:赖氨酸或L-脯氨酸:海藻糖，特别地，当加入L-肉碱：赖氨酸，底物浓度为5g/L时的生物催化产率可由水相转化的64.44％(具体见实施例11表4序号1)提高至74.41％(具体见实施例12)。
本发明所述天然低共熔溶剂L-肉碱：赖氨酸的制备方法如下：将0.1mol的L-肉碱与0.1mol赖氨酸加入至500ml圆底烧瓶中，加入200ml无水甲醇，50℃搅拌24h，75℃真空旋转干燥24-48h，得到固体产物L-肉碱：赖氨酸。其他天然低共熔溶剂的制备方法相同。
此外，本发明所述转化体系由酶源、底物、辅助底物、天然低共熔溶剂和表面活性剂组成，所述表面活性剂为吐温-80，吐温-60，吐温-20，司盘-80(Span-80)或司盘-20(Span-20)，优选司盘-80；所述表面活性剂的添加量以缓冲液体积计为2～20g/L，优选2-14g/L，最优选5g/L。
本发明最优选转化体系由酶源、底物、辅助底物、天然低共熔溶剂和表面活性剂组成，底物加入量以缓冲液体积计为5g/L，所述酶源加入量以缓冲液体积计为350g/L；所述辅助底物为葡萄糖和甘油，其中甘油添加量以缓冲液体积计为100g/L，葡萄糖添加量以缓冲液体积计为80g/L；所述天然低共熔溶剂为L-肉碱：赖氨酸，加入量以缓冲液体积计为5g/L；所述表面活性剂为Span-80，添加量以缓冲液体积计为5g/L；该转化体系的产率提高至86.64％(具体见实施例16)。
本发明所述酶源制备方法：
(1)斜面培养：将半乳糖地霉ZJPH1810接种至斜面培养基，25～30℃培养48h，获得斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂粉15～20g/L，溶剂为水，pH值6.5；
(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，25～30℃、150～250rpm培养10～24h(优选30℃，200rpm培养12h)，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH值6.5；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度为4～10％(优选6％)的接种量接种至发酵培养基中，装液量为80mL/250mL摇瓶，25～30℃、150～250rpm培养24～28h，优选30℃、200rpm培养24h。发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1M、pH 6.5磷酸缓冲液洗涤，收集湿菌体，即为酶源；发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖24.45g/L，蛋白胨15.75g/L，(NH4)2SO421.39g/L，CaCl2 0.111g/L，溶剂为水，pH值6.5。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株可用于高选择性不对称还原潜手性酮底物制备(S)-1-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的微生物菌株--半乳糖地霉(Galactomyces geotrichum)ZJPH1810，采用该新菌种催化制备光学纯(S)-1-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的立体选择性好，产物光学纯度高(e.e.值>99.9％)。在pH 7.0的磷酸缓冲液体系中，加入5g/L的底物，反应24h，S构型还原产物的产率为64.44％。当反应体系中加入天然低共熔溶剂、表面活性剂时可有效改善催化效率，提高反应产率，反应产率提高至86.64％，e.e.值大于99.9％。
(四)附图说明
图1为(S)-1-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇对照品色谱图；
图2为生物转化所得高光学纯度产物的色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：本发明实施例中底物、辅助底物、天然低共熔溶剂和表面活性剂的添加量均以缓冲液体积计。
实施例1：菌株的分离、鉴定，生物转化过程，以及转化产物的分析检测方法
(1)初筛：取采自河南省信阳市息县东岳镇的1g果园土样加入至无菌生理盐水中，摇匀，吸取2mL土样混悬液接种至装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养1-2d，待培养液变混浊后，取2mL培养液转接至含100mL富集培养基的250mL摇瓶中，继续培养4～5d。富集培养基的配方如下：2,6-二氯-3-氟苯乙酮2g/L，(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO4 2g/L，KH2PO4 1g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH值6.5。
(2)复筛：将步骤(1)获得的富集培养液经生理盐水梯度稀释后，涂布到分离平板上，挑取分离平板上生长的菌落划线接种于含全营养培养基的平板，经多次划线分离后获得纯化的单菌落。将挑取的单菌落接种于种子培养基，30℃，200rpm培养24h后制得种子液，将种子液转接至发酵培养基中30℃，200rpm培养24h。发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1M、pH 6.5磷酸缓冲液洗涤，收集湿菌体，即为酶源细胞。
生物转化反应过程：将离心所得酶源细胞以100g/L的量重悬于10ml磷酸盐缓冲液(pH值为7.0)中，加入2g/L的底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮，以及100g/L的辅助底物葡萄糖，置30℃摇床反应24h后得到转化反应产物。
种子培养基组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH值6.5。
发酵培养基组成：葡萄糖24.45g/L，蛋白胨15.75g/L，(NH4)2SO4 21.39g/L，CaCl20.111g/L，溶剂为水，pH值6.5。
分离平板培养基组成同富集培养基，另外再加入20g/L的琼脂。
全营养培养基组成同种子培养基，另外再加入20g/L的琼脂。
转化结束后，转化液用等体积乙酸乙酯萃取，反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用气相色谱分析检测，并计算得出目的产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率及对应体过量值(e.e.值)，从中筛选得到可高选择性还原底物制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的菌株，e.e.值大于99.9％，产率为25.42％，记为菌株ZJPH1810。底物和产物标准品的气相检测图谱，以及生物转化反应液的气相检测图谱见图1，图2。
用内标法定量。内标物为十二烷。取1mL萃取液加入1μL十二烷进行分析。气相色谱条件：日本岛津GC-2014气相色谱仪，浙大N2000色谱工作站；CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm)。载气为高纯氮气，流量为2mL/min；进样量1μL，分流比为15:1；检测器和进样口温度均为250℃；色谱柱温度120～170℃；升温速度：5℃/min；检测器为FID。
气相色谱法定性及定量分析：检测转化反应后产物及残留底物的含量，并计算相关物质浓度、产率和e.e.值。
产率＝C产物/C底物×100％公式(1)
式中，C产物为转化所得产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的摩尔浓度，C底物为反应初始时底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess，e.e.)来表示。
e.e.＝(CS-CR)/(CR+CS)×100％公式(2)
式中CR和CS分别为R型和S型2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的摩尔浓度。
(3)筛选所得菌株ZJPH1810的形态特征和26S rDNA序列
菌株ZJPH1810的形态特征：
形态学观察：在营养琼脂平板上，观察菌株ZJPH1810的菌落外观形态、质地、色泽、生长速度等特征，通过光学显微镜观察细胞形态。营养琼脂平板上菌落呈平面扩散，生长快，扁平，中心突起，白色，短绒状，液体培养浑浊，繁殖方式为裂殖，形成的节孢子单个或连接成链。
分子生物学鉴定：委托上海生工生物工程有限公司进行菌株ZJPH1810的26S rDNA测序。以提取到的细胞总DNA为模板，利用通用引物NL1与NL4扩增菌株的26S rDNA，再将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。经测序确认所述菌株ZJPH1810的26S rDNA基因序列如SEQID NO.1所示。
将ZJPH1810菌株的26S rDNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对分析，该菌株与Galactomyces geotrichum HN12-2同源性为100％。该菌株鉴定为半乳糖地霉(Galactomyces geotrichum)，命名为半乳糖地霉(Galactomycesgeotrichum)ZJPH1810，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2019822，保藏日期：2019年10月14日，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
实施例2：湿菌体的获得
斜面培养基组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH值6.5。
种子培养基组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH值6.5。
发酵培养基组成：葡萄糖24.45g/L，蛋白胨15.75g/L，(NH4)2SO4 21.39g/L，CaCl20.111g/L，溶剂为水，pH值6.5。
从培养成熟的斜面挑取一环菌体接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养12h，得种子液，再以体积浓度6％的接种量将种子液转接到装有80mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养24h。培养结束后发酵液经离心分离沉淀，并用磷酸缓冲液洗涤，收集得到湿菌体细胞，备用。
实施例3：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计浓度为100g/L，加入2g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入表1所示不同种类的辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1气相检测方法检测产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率及光学纯度e.e.值，结果见表1，可见选择葡萄糖添加量(80g/L)与甘油添加量(100/L)作为双辅助底物时，产率为66.88％，e.e.值大于99.9％。
表1不同种类的辅助底物对生物转化的影响合并表
Figure BDA0002274141270000071
实施例4：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 3.9)中，湿菌体加量以缓冲液体积计浓度为100g/L，加入2g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为46.92％，e.e.值大于99.9％。
实施例5：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计浓度为100g/L，加入2g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为67.20％，e.e.值大于99.9％。
实施例6：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中，湿菌体加量以缓冲液体积计浓度为100g/L，加入2g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，在温度为30℃下产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为62.90％，e.e.值大于99.9％。
实施例7：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 10.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计浓度为100g/L，加入2g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为61.19％，e.e.值大于99.9％。
实施例8：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计浓度为100g/L，加入2g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，置于表2所示不同温度条件下，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，在温度为30℃下产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为66.54％，e.e.值大于99.9％。
表2温度对生物转化的影响
Figure BDA0002274141270000081
实施例9：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计浓度为50-550g/L(表3)，加入5g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，在菌体湿重为350g/L的条件下，产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率65.49％，e.e.值大于99.9％。
表3湿菌体浓度对生物转化的影响
实施例10：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计为350g/L，加入6.3g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，在菌体湿重为350g/L的条件下，产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为51.44％，e.e.值大于99.9％。
实施例11：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计为350g/L，加入5g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，加入10g/L表4中不同种类的天然低共熔溶剂中，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，在菌体湿重为350g/L的条件下，最优选L-肉碱：赖氨酸，产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为69.58％，e.e.值大于99.9％。
表4不同种类的天然低共熔溶剂对生物转化的影响
Figure BDA0002274141270000092
Figure BDA0002274141270000101
实施例12：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计为350g/L，加入5g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，加入5g/L的L-肉碱：赖氨酸的天然低共熔溶剂，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，在菌体湿重为350g/L的条件下，产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为74.21％，e.e.值大于99.9％。
实施例13：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计为350g/L，加入5g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，加入5g/L的L-肉碱：赖氨酸的天然低共熔溶剂，5g/L的吐温-20，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，在菌体湿重为350g/L的条件下，产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为82.68％，e.e.值大于99.9％。
实施例14：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计为350g/L，加入5g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油，加入5g/L的L-肉碱：赖氨酸的天然低共熔溶剂，5g/L的吐温-80，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用气相检测方法，在菌体湿重为350g/L的条件下，产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为84.87％，e.e.值大于99.9％。
实施例15：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计为350g/L，加入5g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，加入5g/L的L-肉碱：赖氨酸的天然低共熔溶剂，5g/L的Span-20，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，在菌体湿重为350g/L的条件下，产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为66.88％，e.e.值大于99.9％。
实施例16：
将实施例2方法获得的湿菌体悬浮于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以缓冲液体积计为350g/L，加入5g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入80g/L的葡萄糖与100g/L的甘油为辅助底物，加入5g/L的L-肉碱：赖氨酸的天然低共熔溶剂，5g/L的Span-80，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1气相检测方法，在菌体湿重为350g/L的条件下，产物(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率为86.64％，e.e.值大于99.9％。
实施例17：
选取小孢根霉须状变种(Rhizopus microsporus var.Rhizopodiformis)ZJPH1308，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M 2014645，保藏日期为2014年12月14日。该菌种已在先前的专利申请(公开号：CN104893989A，公开日：2015年9月9日)中公开。菌种的培养方法和酶源细胞制备过程依据先前的专利申请(公开号：CN104893989A，公开日：2015年9月9日)。
按先前所述培养，获得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计浓度为100g/L，加入5g/L的2,6-二氯-3-氟苯乙酮作为底物，再加入100g/L的葡萄糖为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用气相色谱检测的方法，实验结果表明，小孢根霉须状变种(Rhizopus microsporus var.Rhizopodiformis)ZJPH1308不能转化2,6-二氯-3-氟苯乙酮制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 半乳糖地霉ZJPH1810及制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 562
<212> DNA
<213> 半乳糖地霉(Galactomyces geotrichum)
<400> 1
cggaggaaaa gaaaccaaca gggattgcct tagtaacggc gagtgaagcg gcaaaagctc 60
aaatttgaaa tcggccacca ggtcgagttg taatttgtag attgtatctt gagagcggat 120
taaagtctgt tggaacacag cgccttagag ggtgacagcc ccgtaaaatc tattctcatt 180
gtaagatact ttcgaagagt cgagttgttt gggaatgcag ctctaagtgg gaggtaaatt 240
ccttctaaag ctaaatattg acgagagacc gatagcgaac aagtactgtg aaggaaagat 300
gaaaagcact ttgaaaagag agtgaaaaag tacgtgaaat tgttaaaagg gaagggtatt 360
gaatcagact tggtgctgtt gttcaactgt gtttcggcat agtgtactca gcagtactag 420
gccaaggtgg ggtgtttggg agtgaaaaag aagttggaag gtaactcttc ggagtgttat 480
agcctacttt catagctcct caggcgcctc aggactgcgc ttcggcaagg accttggcat 540
aatgattcta taccgcccgt ct 562

Claims (10)

1.半乳糖地霉(Galactomyces geotrichum)ZJPH1810，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2019822，保藏日期：2019年10月14日，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述半乳糖地霉ZJPH1810在制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以半乳糖地霉ZJPH1810经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以2,6-二氯-3-氟苯乙酮为底物，以pH 2.96～10.6的磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～50℃、150～250rpm条件下进行反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物用量以缓冲液体积计为0.1～10g/L，湿菌体用量以缓冲液体积计为50～550g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中添加有辅助底物，所述辅助底物为下列一种或任意几种的混合：葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、甘油、异丙醇、半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸；所述辅助底物添加量以缓冲液体积计为20～200g/L。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述辅助底物为甘油和葡萄糖，所述甘油添加量以缓冲液体积计为100g/L，葡萄糖添加量以缓冲液体积计为80g/L。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系由酶源、底物、辅助底物和天然低共熔溶剂组成，所述天然低共熔溶剂质量添加量以缓冲液体积计为2～10g/L；所述天然低共熔溶剂为下列之一：甜菜碱:赖氨酸、氯化胆碱:赖氨酸、L-肉碱:赖氨酸、L-脯氨酸:赖氨酸、甜菜碱:甘氨酸、氯化胆碱:甘氨酸、L-肉碱:甘氨酸、L-脯氨酸:甘氨酸、甜菜碱:海藻糖、L-脯氨酸:海藻糖。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述转化体系由酶源、底物、辅助底物、天然低共熔溶剂和表面活性剂组成，所述表面活性剂为吐温-80，吐温-60，吐温-20，司盘-80或司盘-20；所述表面活性剂的添加量以缓冲液体积计为2～20g/L。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述底物加入量以缓冲液体积计为5g/L，酶源加入量以缓冲液体积计为350g/L；所述辅助底物为葡萄糖和甘油，其中甘油添加量以缓冲液体积计为100g/L，葡萄糖添加量以缓冲液体积计为80g/L；所述天然低共熔溶剂为L-肉碱:赖氨酸，加入量以缓冲液体积计为5g/L；所述表面活性剂为司盘-80，添加量以缓冲液体积计为5g/L。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备：
(1)斜面培养：将半乳糖地霉ZJPH1810接种至斜面培养基，25～30℃培养48h，获得斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂粉15～20g/L，溶剂为水，pH值6.5；
(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，25～30℃、150～250rpm培养10～24h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH值6.5；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度为4～10％的接种量接种至发酵培养基中，装液量为80mL/250mL摇瓶，25～30℃、150～250rpm培养24～28h，发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1M、pH 6.5磷酸缓冲液洗涤，收集湿菌体，即为酶源；发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖24.45g/L，蛋白胨15.75g/L，(NH4)2SO4 21.39g/L，CaCl2 0.111g/L，溶剂为水，pH值6.5。
CN201911116285.4A 2019-11-15 2019-11-15 半乳糖地霉zjph1810及制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇应用 Active CN110760449B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911116285.4A CN110760449B (zh) 2019-11-15 2019-11-15 半乳糖地霉zjph1810及制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911116285.4A CN110760449B (zh) 2019-11-15 2019-11-15 半乳糖地霉zjph1810及制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110760449A true CN110760449A (zh) 2020-02-07
CN110760449B CN110760449B (zh) 2021-04-06

Family

ID=69338379

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911116285.4A Active CN110760449B (zh) 2019-11-15 2019-11-15 半乳糖地霉zjph1810及制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110760449B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112063531A (zh) * 2020-08-11 2020-12-11 浙江工业大学 白地霉zjph1907及制备(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的应用
CN112063532A (zh) * 2020-08-11 2020-12-11 浙江工业大学 林生地霉及其制备(s)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003096029A (ja) * 2001-09-21 2003-04-03 Mitsubishi Rayon Co Ltd 光学活性アルコール及びその製造方法
CN102676407A (zh) * 2012-03-14 2012-09-19 南阳师范学院 一种降解发酵药渣中残余林可霉素的酵母菌及其应用
CN103361277A (zh) * 2013-06-17 2013-10-23 湖南省微生物研究所 一株溶磷白地霉p14及其应用方法和制备的菌剂
TW201443231A (zh) * 2013-05-13 2014-11-16 Univ Tunghai 應用於分解有機酸的白地霉分離株
CN104673683A (zh) * 2015-02-27 2015-06-03 台州职业技术学院 一株耐盐多环芳烃降解菌Tzyjm及其在海洋污染环境中的应用
CN106085977A (zh) * 2016-06-08 2016-11-09 西北工业大学 谷氨酸脱氢酶的重组基因及其获取方法与应用
CN107746861A (zh) * 2017-11-20 2018-03-02 浙江工业大学 一种(r)‑1‑(2‑三氟甲基苯基)乙醇的生物制备方法
CN107794282A (zh) * 2017-11-20 2018-03-13 浙江工业大学 一种克唑替尼手性中间体的制备方法及菌株

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003096029A (ja) * 2001-09-21 2003-04-03 Mitsubishi Rayon Co Ltd 光学活性アルコール及びその製造方法
CN102676407A (zh) * 2012-03-14 2012-09-19 南阳师范学院 一种降解发酵药渣中残余林可霉素的酵母菌及其应用
TW201443231A (zh) * 2013-05-13 2014-11-16 Univ Tunghai 應用於分解有機酸的白地霉分離株
CN103361277A (zh) * 2013-06-17 2013-10-23 湖南省微生物研究所 一株溶磷白地霉p14及其应用方法和制备的菌剂
CN104673683A (zh) * 2015-02-27 2015-06-03 台州职业技术学院 一株耐盐多环芳烃降解菌Tzyjm及其在海洋污染环境中的应用
CN106085977A (zh) * 2016-06-08 2016-11-09 西北工业大学 谷氨酸脱氢酶的重组基因及其获取方法与应用
CN107746861A (zh) * 2017-11-20 2018-03-02 浙江工业大学 一种(r)‑1‑(2‑三氟甲基苯基)乙醇的生物制备方法
CN107794282A (zh) * 2017-11-20 2018-03-13 浙江工业大学 一种克唑替尼手性中间体的制备方法及菌株

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TATOBA R. WAGHMODE ET AL.: "Biodegradation of Rubine GFL by Galactomyces geotrichum MTCC 1360 and subsequent toxicological analysis by using cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress studies", 《MICROBIOLOGY》 *
吴迎奔等: "溶磷白地霉P14（Galactomyces geotrichum P14）的分离鉴定及其溶磷特性研究", 《浙江农业学报》 *
田慧: "光学选择性酰胺酶产生菌的筛选及其底物特异性的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112063531A (zh) * 2020-08-11 2020-12-11 浙江工业大学 白地霉zjph1907及制备(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的应用
CN112063532A (zh) * 2020-08-11 2020-12-11 浙江工业大学 林生地霉及其制备(s)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的应用
CN112063532B (zh) * 2020-08-11 2022-05-24 浙江工业大学 林生地霉及其制备(s)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110760449B (zh) 2021-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103497911B (zh) 一株金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产
US11085059B2 (en) Methylopila sp. and use thereof in selective resolution preparation of (S)-α-ethyl-2-oxo-1-pyrrolidineacetate
CN110760449B (zh) 半乳糖地霉zjph1810及制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇应用
CN101857887B (zh) 一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法
CN113462602B (zh) 促根生科萨克氏菌zjph202011及其应用
CN112063532B (zh) 林生地霉及其制备(s)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的应用
CN112063531B (zh) 白地霉zjph1907及制备(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的应用
CN107881202B (zh) 一种左炔诺孕酮关键手性中间体的生物制备方法
CN106086090B (zh) 一种两步微生物转化法制备r-扁桃酸的方法
CN110982757B (zh) 阴沟肠杆菌zjph1903及应用
CN104830744A (zh) 利用sd-as序列偶联(r)-羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶制备(r)-苯乙二醇的方法
CN108998430B (zh) 一种界面自组装羰基还原酶及在(r)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯合成中的应用
CN107794282B (zh) 一种克唑替尼手性中间体的制备方法及菌株
CN110016444B (zh) 不动杆菌zjph1806及其制备咪康唑手性中间体的应用
CN107118986B (zh) 一种恶臭假单胞菌及在制备(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇中的应用
CN111925949B (zh) 新月弯孢霉b-36及其在合成手性醇中的应用
CN112176019B (zh) 一种生物催化制备(r)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的方法
CN111778198B (zh) 一种藤黄细球菌hmc01及其在不对称还原制备手性醇中的应用
CN115058400B (zh) 来自于玫瑰的糖基转移酶RrUGT3在生物合成天麻素中的应用
CN117247848B (zh) 一株产腈水解酶的菌株、发酵方法及应用
CN108441433B (zh) 胶红酵母nq1及在制备手性醇中的应用
CN113462728B (zh) 一种利用土星轮头酵母制备(r)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法
CN113481175B (zh) 一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用
CN102643879B (zh) 一种微生物转化制备度洛西汀手性中间体的方法
CN107586750B (zh) 一株产腈水合酶的菌株及用于生产对羟基苯乙酰胺的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant