CN110283733B - 土星轮头酵母zjph1807及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土星轮头酵母ZJPH1807及其应用，所述的应用为：以二酮类化合物(Ⅰ)为底物，以土星轮头酵母ZJPH1807经发酵培养获得的湿菌体为酶源，加入助溶剂和辅助底物，于pH 6.0～8.0的缓冲液中构成转化体系，在25℃～50℃、150rpm～250rpm条件下进行反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(13R,17S)‑乙基开环醇(Ⅱ)；本发明土星轮头酵母ZJPH1807制备所得产物的光学纯度高，e.e.值>99.9％。在pH 7.0的磷酸缓冲液体系中，加入7g/L的底物，反应12h，产物的产率为63.96％，时空产率为0.373g/L·h。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种可用于二酮类化合物(Ⅰ)生物还原制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的新菌株—土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807及其应用。
(二)背景技术
(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)(化学名：2-乙基-3-羟基-2-[2-(6-甲氧基-3,4-二氢-1(2H)-萘亚基)乙基]环戊酮，分子式C20H24O3，CAS号：51773-49-0)是制备左炔诺孕酮的关键手性中间体。左炔诺孕酮(levonorgestrel，LNG)是目前应用广泛的第二代口服避孕药，主要作用于下丘脑和垂体，具有很好的孕激素活性和较强的与雄激素受体结合的能力，与雌激素合并使用，可用作短效和长效口服避孕药。它也可用于治疗月经不调，子宫功能性出血及子宫内膜异位症等。使用1.5mg的左炔诺孕酮就能紧急避孕，量小且服用次数少，胃肠反应轻微，对月经影响小，因此在妇科领域有着极其重要地位。
A为底物二酮类化合物(Ⅰ)，B为产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)，C为左炔诺孕酮。
目前左炔诺孕酮制备主要采用化学法。Ananchenko等(Anne-Sophie Chapelon,Delphine Moral eda,Rapha€el Rodriguez,et al.Tetrahedron,2007,63(47):11511-11616.)采用硼氢化钠还原二酮类化合物(Ⅰ)制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)，反应后产生4种异构体。Wong等人(Wong F.F.,Chuang S.H.,Yang S.C.,et al.,Tetrahedron,2010,66(23):4068-4072.)利用一锅法合成工艺，以44.6mmol/L底物3-甲氧基-18-甲基雄甾-2,5-10-二烯-17-酮与Me3SiC≡CLi反应1h后，加入当量的四丁基氟化铵进行脱甲硅烷基，最终制得40.3mmol/L左炔诺孕酮，产率为90％。化学全合成法的工艺路线较复杂、反应条件较为苛刻、环境污染大。与化学法相比，微生物转化法具有更高的反应特异性，且符合“绿色化学”原则。
近年来有研究者报道了利用生物法催化还原二酮类化合物(Ⅰ)制备左炔诺孕酮关键手性中间体(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)。Federica等人(Dall'Oglio Federica,LetiziaContente Martina,Conti Paola.Catalysis Communications,2017,(93):29-32.)利用混合床反应体系进行不同酮类底物的还原，以KRED1-Pglu和BmGDH作为催化剂，加入3mmol/L二酮类化合物(Ⅰ)，反应6h后，(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率为65％。Martina等人(Letizia Contente Martina,Molinari Francesco,Serra Immacolata.EuropeanJournal of Organic Chemistry,2016:1260-1263.)筛选了不同种类酵母菌作为催化剂进行生物还原，利用酿酒酵母(S.cerevisiae)CEN.PK113-7D催化时，加入10mmol/L的二酮类化合物(Ⅰ)，转化24h后产率达95％，对映体过量值(e.e.值)>98％。但采用P.glucozyma CBS5766和R.glutinis NRRL-Y1587为催化剂生物还原二酮类化合物(Ⅰ)，则生成了异构体(13S,17S)-乙基开环醇。
利用微生物全细胞为催化剂，通过生物还原制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)，微生物酶源细胞可经发酵自行制备，质量稳定，成本低廉。并且在生物还原过程中，通过添加辅助底物可实现辅酶的原位再生。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种产羰基还原酶的微生物新菌株--土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807，以及利用该菌株通过全细胞催化二酮类化合物(Ⅰ)生物还原制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)。与化学还原法相比，该方法的立体选择性高，催化剂制备成本低，且转化过程环境友好。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2019215，保藏日期：2019年3月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。
本发明还提供一种所述土星轮头酵母ZJPH1807在催化二酮类化合物(Ⅰ)生物还原制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)中的应用，所述的应用为：以二酮类化合物(Ⅰ)为底物，以土星轮头酵母ZJPH1807经发酵培养获得的湿菌体为酶源，加入助溶剂和辅助底物，于pH6.0～8.0(优选pH 7.0)的缓冲液中构成转化体系，在25℃～50℃(优选30℃)、150rpm～250rpm(优选200rpm)条件下进行反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)；所述辅助底物为下列一种或两种：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘油、甲醇、乙醇、异丙醇、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸或L-丙氨酸；所述助溶剂为下列之一：甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或丙酮。
进一步，所述辅助底物为葡萄糖、麦芽糖和乳糖时，加入量以缓冲液体积计均为100g/L；所述辅助底物为甘油时加入量以缓冲液体积计为20～200g/L(优选140g/L)；所述辅助底物为甲醇、乙醇和异丙醇时，体积加入量以缓冲液体积计均为10-30％；所述辅助底物为L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸或L-丙氨酸时，加入量以缓冲液体积计为5～25g/L(优选10g/L)；更优选所述辅助底物为甘油和L-酪氨酸的混合，其中甘油加入量以缓冲液体积计为20g/L～200g/L，优选140g/L，L-酪氨酸加入量以缓冲液体积计为5g/L～25g/L，优选10g/L。
进一步，所述底物用量以缓冲液体积计为4.0～7.5g/L(优选4.5～7.5g/L，最优选7g/L)，湿菌体用量以缓冲液体积计为150～400g/L(优选250～400g/L，最优选350g/L)。
进一步，所述缓冲液为下列之一：K2HPO4-KH2PO4缓冲液、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液和蒸馏水。优选地，所述反应以K2HPO4-KH2PO4缓冲液、Na2HPO4-NaH2PO4的一种构成缓冲液体系，最优选K2HPO4-KH2PO4(优选pH 6～8，最优选pH7.0)。
进一步，所述助溶剂体积加入量以缓冲液体积计为3～11％，最优选所述助溶剂为45℃热乙醇，体积添加量为5％。
进一步，本发明所述酶源按如下方法制备：(1)斜面培养：将土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO41.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉15～20g/L(优选20g/L)，溶剂为水，pH6.5；
(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，25～30℃、150～250rpm培养10～24h(优选30℃、200rpm培养12h)，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度4～12％(优选10％)的接种量接种至发酵培养基中，初始pH值5.0～8.0(优选7.5)，摇瓶装液量50～110mL/250mL锥形瓶(优选90mL/250mL摇瓶)，培养温度25～40℃(优选30℃)、摇床转速200rpm，培养时间12～36h(优选32h)，发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1M、pH 6.5磷酸缓冲液洗涤，收集湿菌体，即为酶源；发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖34.36g/L，酵母膏14.89g/L，NH4Cl 30.34g/L，KH2PO41.01g/L，CaCl2 0.11g/L，溶剂为水，pH 7.5。
本发明技术路线如下：
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株可用于高立体选择性生物还原底物二酮类化合物(Ⅰ)制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的微生物菌株--土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807，利用该菌株制备所得产物的光学纯度高，e.e.值>99.9％。在pH 7.0的磷酸缓冲液体系中，加入7g/L的底物，反应12h，产物的产率为63.96％，时空产率为0.373g/L·h。
(四)附图说明
图1为土星轮头酵母ZJPH1807的菌落形态。
图2为底物二酮类化合物(Ⅰ)的HPLC检测谱图。
图3为产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的HPLC检测谱图。
图4为实施例1菌株ZJPH1807生物还原反应萃取液的HPLC检测谱图。
图5为土星轮头酵母ZJPH1807系统发育树。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：用于催化还原二酮类化合物(Ⅰ)的微生物菌种筛选
1、菌种筛选
在装有50mL生理盐水的250mL摇瓶中，加入1g采自浙江省台州仙居的土样，置于旋转式摇床，30℃，200rpm条件下充分振荡1h，吸取1mL混悬液至全营养筛选培养基中，30℃培养1d，获得种子液。全营养筛选培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5。吸取1mL种子液转接至富集培养基中，30℃培养3～5d后得到富集培养液。富集培养基组成：NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 2g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，二酮类化合物(Ⅰ)1g/L，溶剂为水，pH 6.5。
随后用无菌生理盐水将富集培养液稀释至10-4、10-5、10-6，分别吸取200μL，用涂布棒涂布于筛选平板上，30℃恒温培养箱中培养2～3d。筛选平板组成：NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 2g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，二酮类化合物(Ⅰ)1g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH 6.5。待培养成熟后挑取不同形态、颜色的菌落，于全营养平板培养基上划线分离，30℃培养2～3d。全营养平板培养基组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH 6.5。挑取单菌落接种到种子培养基中，30℃，200rpm培养24h，再转接至发酵培养基中，30℃，200rpm培养24h，发酵液经离心后，收集菌体沉淀。以终浓度5g/L的二酮类化合物(Ⅰ)为底物，筛选得到的菌体沉淀以150g/L加入量作为催化剂，在pH 6.5的磷酸缓冲液中，30℃生物转化24h后，采用高效液相色谱法检测转化液中目的产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率和e.e.值，从中筛选得到e.e.值>99.9％，产率为45.44％的菌株，记为菌株ZJPH1807。种子培养基组成与全营养筛选培养基组成相同，发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖34.36g/L，酵母膏14.89g/L，NH4Cl 30.34g/L，KH2PO4 1.01g/L，CaCl2 0.11g/L，溶剂为水，pH 7.5。
液相色谱法分析检测：检测转化反应后产物及残留底物的含量，并计算相关物质浓度、产率(Yield)和e.e.值。
公式(1)中Ci、C0分别为反应结束时产物的摩尔浓度和反应起始时底物的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess，e.e.)表征。
公式(2)中：CS和CR分别为产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)和另外3种异构体(即(13S,17S)-乙基开环醇、(13R,17R)-乙基开环醇、(13S,17R)-乙基开环醇)的摩尔浓度。
HPLC法测定目标产物产率：所有样品进样检测前采用0.45μm微孔滤膜过滤。液相色谱条件：色谱柱型号，Lux 5μm Cellulose-2(4.6×250mm，Phenomenex)，流动相，正己烷/异丙醇(85:15，v/v)，流速0.5mL/min，进样量20μL，柱温30℃，检测波长220nm。
2、菌种鉴定
1)菌落形态：菌落大且厚，质地均一，颜色偏乳白色，正、反面及中央与边缘的颜色一致，无褶皱且接种时较易挑起，表面粗糙湿润，中间微隆起，边缘圆整。
2)生理生化特征：可利用11种碳源，分别是亮氨酸芳胺酶，甘油，D-葡萄糖，D-甘露糖，尿素酶，七叶苷水解，乙酸盐，L-脯氨酸，DL-乳酸，2-酮基-D-葡萄糖酸盐。
3)菌种的26S rDNA序列特性：以提取到的细胞总DNA为模板，利用通用引物NL1和NL4扩增菌株的26S rDNA基因，再将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。经测序确认所述菌株ZJPH1807的26S rDNA基因序列(SEQ ID NO.1)如下：
CGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGAAGATAGTTTTCTGGTGCTGGCCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGGCGGGGTGTCCAGTGCTTTGTAGATTTCTATCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTAGATCAGACTTGGTGTTTTGTGATTATCTTCCCTTCTTGGGTTGTGCACTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCGGTTCGGGTGGTAAGATAATGACATTGGAACGTGGCACTGCCTTCGGGTGGTGTGTTATAGCCCTTGTTGATGTTGCCTACCTGGACCGAGGACTGCGGCTTTTGCCTAGGATGCTGGCGTAATGATCTAACACCGCCCGTCTT。
将菌株ZJPH1807的26S rDNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对(BLAST)，发现其与Cyberlindnera saturnus序列相似度最高。选择序列相似性高的菌株进行序列比对和分析，并构建系统发育树(如图5)。结果表明：菌株ZJPH1807与Cyberlindnera saturnus序列的同源性最高，为72％。
根据生理生化特性并结合分子生物学鉴定，该菌株ZJPH1807被鉴定为土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)，命名为土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2019215，保藏日期：2019年3月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。
实施例2：摇瓶培养条件下静息细胞酶源的获得
(1)斜面培养：将土星轮头酵母ZJPH1807接种至斜面培养基中，30℃培养24h，获得培养成熟的斜面菌种。斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH 6.5。
(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养12h后获得种子液。种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5。
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种至发酵培养基中，摇瓶装液量为90mL/250mL摇瓶，30℃、200rpm培养32h。发酵结束后，将发酵液离心，所得菌体沉淀用磷酸缓冲液(0.1M、pH 6.5)洗涤2次。发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖34.36g/L，酵母膏14.89g/L，NH4Cl 30.34g/L，KH2PO4 1.01g/L，CaCl2 0.11g/L，溶剂为水，pH 7.5。
实施例3：辅助底物种类对催化结果的影响
反应体系为10mL，将按照实施例2方法所得的湿菌体1.5g悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M，pH 6.5)中，湿菌体质量添加量以缓冲液体积计为150g/L。加入预先用700μL 45℃热乙醇溶解的二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇加入量以缓冲液体积计为7％，底物加入量以缓冲液体积计为5g/L，再分别加入以缓冲液体积计均为100g/L的辅助底物(葡萄糖、麦芽糖、乳糖和甘油)，以缓冲液体积计均为10％(v/v)的辅助底物(甲醇、乙醇和异丙醇)，以缓冲液体积计均为10g/L的辅助底物(L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸和L-丙氨酸)，30℃，200rpm转化24h。反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表1。
表1添加不同辅助底物对产物产率、时空产率及e.e.值的影响
从表1可知，选择甘油和酪氨酸为较佳的辅助底物，在此条件下，甘油和酪氨酸产率、时空产率分别为55.11％、0.115g/L·h和47.73％、0.099g/L·h。
实施例4：甘油浓度对催化结果的影响
反应体系为10mL，将按照实施例2方法所得的湿菌体1.5g悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M，pH 6.5)中，湿菌体加入量以缓冲液体积计为150g/L。加入预先用700μL45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇加入量以缓冲液体积计为7％，底物加入量以缓冲液体积计为5g/L。在L-酪氨酸质量浓度为10g/L的基础上，分别选取甘油添加量以缓冲液体积计为：20g/L、60g/L、100g/L、140g/L、200g/L进行优化。在优选甘油添加量以缓冲液体积计为140g/L下，分别选取L-酪氨酸添加量以缓冲液体积计为：5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L进行优化。30℃、200rpm转化24h。反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表2、表3。
表2甘油浓度对产率、时空产率和e.e.值的影响
从表2可知，较佳的甘油添加量为140g/L，在此条件下，产率和时空产率分别为62.69％和0.131g/L·h。
表3 L-酪氨酸浓度对产物产率、时空产率和e.e.值的影响
从表3可知，较佳的L-酪氨酸添加量为10g/L，在此条件下，产率、时空产率分别为62.77％、0.131g/L·h。由此可见，甘油和L-酪氨酸作为双辅助底物可有效提高产率。
实施例5：转化反应温度对催化结果的影响
反应体系为10mL，将按照实施例2方法所得的湿菌体1.5g悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M，pH 6.5)中，湿菌体加入量以缓冲液体积计为150g/L。加入预先用700μL45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇加入量以缓冲液体积计为7％，底物加入量以缓冲液体积计为5g/L，再加入以缓冲液体积计140g/L的甘油和10g/L的L-酪氨酸作为双辅助底物，于不同温度(25～50℃)下，200rpm转化24h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表4。
表4不同转化温度下的产物产率、时空产率及e.e值
优选转化反应温度为30℃，在此条件下，产率、时空产率分别为62.50％、0.130g/L·h，e.e.值>99.9％。
实施例6：缓冲液种类对催化结果的影响
反应体系为10mL，将按照实施例2方法所得的湿菌体分别悬浮于10mL、0.1M、pH6.5的K2HPO4-KH2PO4缓冲液，Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液和蒸馏水中，湿菌体加入量以缓冲液体积计为150g/L。加入用700μL45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇加入量以缓冲液体积计为7％，底物加入量以缓冲液体积计为5g/L。再加入以缓冲液体积计140g/L的甘油和10g/L的L-酪氨酸作为双辅助底物，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表5。
表5缓冲液种类对产物的产率、时空产率和e.e.值的影响
优选缓冲液种类为K2HPO4-KH2PO4，在此条件下，产物的产率和时空产率分别为62.22％、0.130g/L·h，e.e.值>99.9％。
实施例7：缓冲液pH值对催化结果的影响
反应体系为10mL，将按照实施例2方法所得的湿菌体分别悬浮于10mL pH范围为6.0～8.0的K2HPO4-KH2PO缓冲液(0.1M)中，湿菌体加入量以缓冲液体积计为150g/L。加入预先用700μL45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇加入量以缓冲液体积计为7％，底物加入量以缓冲液体积计为5g/L。再加入以缓冲液体积计140g/L的甘油和10g/L的L-酪氨酸作为双辅助底物，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表6。
表6 pH值对产率、时空产率及e.e值的影响
优选K2HPO4-KH2PO4缓冲液的pH为7.0，在此条件下，产物产率、时空产率为65.55％、0.137g/L·h，e.e.值>99.9％。
实施例8：助溶剂种类对催化效果影响
反应体系为10mL，将按照实施例2方法所得的湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，湿菌体加入量以缓冲液体积计为150g/L。分别加入用700μL45℃的不同助溶剂(甲醇、乙醇、DMF、DMSO、丙酮)溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，助溶剂加入量以缓冲液体积计为7％，底物加入量以缓冲液体积计为5g/L。再加入以缓冲液体积计140g/L的甘油和10g/L的L-酪氨酸作为双辅助底物，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表7。
表7助溶剂种类对产率、时空产率和e.e.值的影响
优选乙醇为助溶剂，在此条件下，产率、时空产率分别为65.35％、0.136g/L·h，e.e.值>99.9％。
实施例9：助溶剂乙醇加量对催化结果的影响
反应体系为10mL，将按照实施例2方法所得的湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，湿菌体加入量以缓冲液体积计为150g/L。分别加入预先用300～1100μL的45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇加入量以缓冲液体积计为3-11％，底物加入量以缓冲液体积计为5g/L。再加入以缓冲液体积计140g/L的甘油和10g/L的L-酪氨酸作为双辅助底物，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表8。
表8乙醇加量对产率、时空产率和e.e.值的影响
优选乙醇添加量为500μL，在此条件下，产率、时空产率分别为69.14％、0.144g/L·h，e.e.值>99.9％。
实施例10：菌体浓度对催化结果的影响
反应体系为10mL，按照实施例2方法所得的湿菌体分别悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，湿菌体加入量以缓冲液体积计为150～400g/L，加入预先用500μL45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇用量以缓冲液体积计为5％，底物加入量以缓冲液体积计为5g/L。再加入以缓冲液体积计分别为140g/L的甘油和10g/L的L-酪氨酸作为双辅助底物，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表9。
表9细胞浓度对产率、时空产率和e.e.值的影响
优选湿菌体浓度为350g/L，在此条件下，产率、时空产率分别为73.60％、0.153g/L·h，e.e.值>99.9％。
实施例11：底物浓度对催化结果的影响
反应体系为10mL，按照实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，湿菌体加入量以缓冲液体积计为350g/L。分别加入预先用500μL 45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇加入量以缓冲液体积计为5％，底物加入量以缓冲液体积计为4.0～7.5g/L。再加入以缓冲液体积记为分别为140g/L的甘油和10g/L的L-酪氨酸作为双辅助底物，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表10。
表10底物浓度对产率、时空产率和e.e.值的影响
优选底物浓度为7.0g/L，在此条件下，产率、时空产率分别为54.26％、0.158g/L·h，e.e.值>99.9％。
实施例12：转化时间对催化结果的影响
反应体系为10mL，按照实施例2方法所得的湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，湿菌体加入量以缓冲液体积计为350g/L。加入预先用500μL 45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇加入量以缓冲液体积计为5％，底物加量以缓冲液体积计为7g/L。再加入以缓冲液体积计为140g/L的甘油和10g/L的L-酪氨酸作为双辅助底物，于30℃，200rpm条件下转化6～48h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表11。
表11转化时间对产率、时空产率和e.e.值的影响
优选转化时间为12h，在此条件下，产率、时空产率为60.24％、0.351g/L·h，e.e.值>99.9％。
实施例13菌体量与底物浓度之比对催化结果的影响
反应体系为15mL，按照实施例2方法所得的湿菌体悬浮于15mL K2HPO4-KH2PO缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，分别加入以缓冲液体积计不同质量浓度的湿菌体，预先用500μL 45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇体积加入量以缓冲液体积计为5％，底物加入量以缓冲液体积计为7g/L。再加入以缓冲液体积计为140g/L的甘油和10g/L的L-酪氨酸作为双辅助底物，于30℃，200rpm条件下转化12h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表12。
表12改变湿菌体/底物比例对产率、时空产率和e.e.值的影响
优选湿菌体/底物之比为450：7(g:g)，在此条件下，产率、时空产率为63.96％、0.373g/L·h，e.e.值>99.9％。
实施例14离子液体种类对催化结果的影响
ChCl/Gly、ChCl/Cys、ChCl/GSH、ChCl/Glu、[N1,1,1,1][Glu]、[N1,1,1,1][Cys]、[BMIm]PF6、[HMIm]PF6、[OMIm]BF4、[OMIm]PF6的制备分别参照专利申请201310754765.X和201310754767.9方法。
以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIm]PF6为例：室温条件下，烧杯中加入100ml水和17.4g氯化1-丁基-3-甲基咪唑，搅拌溶解，加入250ml六氟磷酸钾水溶液(含六氟磷酸钾20g)，室温搅拌12h，分液，取下层，去离子水洗涤，直至硝酸银滴定无沉淀，70℃真空干燥24h后制得。
反应体系15mL，按照实施例2方法所得的湿菌体别悬浮于15mL K2HPO4-KH2PO缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，湿菌体用量以缓冲液体积计浓度为450g/L。加入预先经用500μL 45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇加入量以缓冲液体积计为5％，底物加入量以缓冲液体积计终浓度为7g/L。再加入以缓冲液体积计为终浓度140g/L的甘油和10g/L的L-酪氨酸作为双辅助底物，分别加入体积用量以缓冲液体积计终浓度为1％的ChCl/Gly、ChCl/Cys、ChCl/GSH、ChCl/Glu、[BMIm]PF6、[HMIm]PF6、[OMIm]BF4、[OMIm]PF6、[N1,1,1,1][Glu]、[N1,1,1,1][Cys]，于30℃，200rpm条件下转化12h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后按实施例1中的HPLC法检测，产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率、时空产率和e.e.值见表13。
表13离子液体对产物产率、时空产率和e.e.值的影响
表13的结果表明，在反应体系中添加离子液体并没有对催化反应起到促进作用。
实施例15铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJPH1504生物催化制备左炔诺孕酮关键手性中间体的转化能力考察
(1)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJPH1504保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2016188，保藏日期为2016年4月11日。该菌种已在先前的专利申请(公开号：CN105925506A，公开日：2016年9月7日)中公开。菌种的培养方法和酶源细胞制备过程依据先前的专利申请(公开号：CN105925506A，公开日：2016年9月7日)。
(2)生物催化制备左炔诺孕酮关键手性中间体
10mL K2HPO4-KH2PO缓冲液(0.1M，pH 6.5)体系中加入1.5g铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJPH1504湿菌体，加入预先用700μL 45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇体积加入量以缓冲液体积计为7％，底物加入量以质量浓度计为5g/L，加入以缓冲液体积计为100g/L的葡萄糖作为辅助底物，30℃，200rpm转化24h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后用实施例1中的HPLC法检测产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率和e.e.值。
结论：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJPH1504不能转化二酮类化合物(Ⅰ)制备左炔诺孕酮关键手性中间体(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)。
实施例16近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)ZJPH1305生物催化制备左炔诺孕酮关键手性中间体的转化能力考察
(1)近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)ZJPH1305，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2013年11月8日，保藏编号：CCTCC NO：M2013559。该菌种已在先前的专利申请(公开号：CN103849574A，公开日：2014年6月11日)中公开。菌种的培养方法和酶源细胞制备过程依据先前的专利申请(公开号：CN103849574A，公开日：2014年6月11日)
(2)生物催化制备左炔诺孕酮关键手性中间体
10mL K2HPO4-KH2PO缓冲液(0.1M，pH 6.5)体系中加入1.5g近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)ZJPH1305湿菌体，加入预先用700μL 45℃热乙醇溶解的底物二酮类化合物(Ⅰ)，乙醇体积加入量以缓冲液体积计7％，底物加入量以缓冲液体积计为5g/L，加入以缓冲液体积计为100g/L的葡萄糖作为辅助底物，30℃，200rpm转化24h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸除溶剂。所得浓缩液用无水甲醇进行溶解后用实施例1中的HPLC法检测产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率和e.e.值。
结论：近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)ZJPH1305不能转化二酮类化合物(Ⅰ)制备左炔诺孕酮关键手性中间体(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 土星轮头酵母ZJPH1807及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 592
<212> DNA
<213> 土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)
<400> 1
cggaggaaaa gaaaccaaca gggattgcct cagtaacggc gagtgaagcg gcaaaagctc 60
aaatttgaaa tctggtacct tcggtgcccg agttgtaatt tgaagatagt tttctggtgc 120
tggcccttgt ctatgttcct tggaacagga cgtcacagag ggtgagaatc ccgtctggcg 180
gggtgtccag tgctttgtag atttctatcg acgagtcgag ttgtttggga atgcagctct 240
aagtgggtgg taaattccat ctaaagctaa atattggcga gagaccgata gcgaacaagt 300
acagtgatgg aaagatgaaa agaactttga aaagagagtg aaaaagtacg tgaaattgtt 360
gaaagggaag ggtattagat cagacttggt gttttgtgat tatcttccct tcttgggttg 420
tgcactcgca tttcactggg ccagcatcgg ttcgggtggt aagataatga cattggaacg 480
tggcactgcc ttcgggtggt gtgttatagc ccttgttgat gttgcctacc tggaccgagg 540
actgcggctt ttgcctagga tgctggcgta atgatctaac accgcccgtc tt 592
Claims (10)
1.土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2019215，保藏日期：2019年3月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。
2.一种权利要求1所述土星轮头酵母ZJPH1807在催化二酮类化合物(Ⅰ)不对称还原制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)中的应用；
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用方法为：以二酮类化合物(Ⅰ)为底物，以土星轮头酵母ZJPH1807经发酵培养获得的湿菌体为酶源，加入助溶剂和辅助底物，于pH 6.0～8.0的缓冲液中构成转化体系，在25℃～50℃、150rpm～250rpm条件下进行转化，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)；所述辅助底物为下列一种或两种：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘油、甲醇、乙醇、异丙醇、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸或L-丙氨酸；所述助溶剂为下列之一：甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或丙酮。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述辅助底物为葡萄糖、麦芽糖或乳糖时，加入量以缓冲液体积计均为100g/L；所述辅助底物为甘油时加入量以缓冲液体积计为20-200g/L；所述辅助底物为甲醇、乙醇或异丙醇时，体积加入量以缓冲液体积计均为10-30％；所述辅助底物为L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸或L-丙氨酸时，加入量以缓冲液体积计为5-25g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述辅助底物为甘油和L-酪氨酸的混合，其中甘油加入量以缓冲液体积计为140g/L，L-酪氨酸加入量以缓冲液体积计为10g/L。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物用量以缓冲液体积计为4.0～7.0g/L，湿菌体用量以缓冲液体积计为150～400g/L。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液为下列之一：K2HPO4-KH2PO4缓冲液、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述助溶剂体积加量以缓冲液体积计为3～11％。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述助溶剂为45℃热乙醇。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备：(1)斜面培养：将土星轮头酵母ZJPH1807接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO41.5g/L，NaCl0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉15～20g/L，溶剂为水，pH 6.5；(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，25～30℃、150～250rpm培养10～24h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度4～10％的接种量接种至发酵培养基中，初始pH 5.0～8.0，摇瓶装液量50～110mL/250mL锥形瓶，培养温度25～40℃、摇床转速220rpm，培养时间12～36h，发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1M、pH 6.5缓冲液洗涤，收集湿菌体，即为酶源；发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖34.36g/L，酵母膏14.89g/L，NH4Cl 30.34g/L，KH2PO4 1.01g/L，CaCl2 0.11g/L，溶剂为水，pH 7.5。
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