CN103849574B - 近平滑假丝酵母zjph1305及在手性醇制备中的应用 - Google Patents

近平滑假丝酵母zjph1305及在手性醇制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株新菌种--近平滑假丝酵母(Candida？parapsilosis)ZJPH1305及在微生物催化不对称还原5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸制备高光学纯度(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸中的应用，本发明通过采用近平滑假丝酵母（Candida？parapsilosis）ZJPH1305细胞为催化剂的手性生物催化，当底物浓度为47.62mmol/L，辅助底物葡萄糖终浓度为100g/L时，目的产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的e.e值达到99.9%，产率达到95.37%。

Description

近平滑假丝酵母ZJPH1305及在手性醇制备中的应用
（一）技术领域
本发明涉及一株近平滑假丝酵母及应用，特别涉及一株新菌株-近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)ZJPH1305，以及在微生物催化不对称还原5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸制备高光学纯度(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸中的应用。
（二）背景技术
式（Ⅰ）所示的(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸是合成药物依替米贝(Ezetimibe，商品名为）的重要手性中间体。依替米贝化学名为1-(4-氟苯基)-(3R)-[3-(4-氟苯基)-(3S)-羟基丙基]-(4S)-(4-羟基苯基)-2-氮杂环丁烷酮。2002年美国食品药品监督管理局(FDA)批准依替米贝用于治疗高脂血症。依替米贝是默克和先灵葆雅研发的一类新型的选择性胆固醇吸收抑制剂，其被吸收后在肝脏中与葡萄糖醛酸结合，经肝肠循环，几乎特异地定位于小肠黏膜细胞，然后结合小肠刷状缘膜小囊泡上膜蛋白，抑制胆固醇的吸收，从而降低胆固醇含量。2002年11月在德国首先上市，同期在美国、英国、瑞士、瑞典上市。研究证实，依替米贝是有效的胆固醇吸收抑制剂，与他汀类降脂药物联用效果更好。美国FDA于2004年8月23日正式批准默克和先灵葆雅共同研发的二合一降胆固醇新药依替米贝/辛伐他汀()上市。是一种复方药，其可以通过两个途径来降低胆固醇：一种途径是阻止来源于食物的肠内胆固醇的吸收，另一种途径是抑制肝脏胆固醇的合成。2010年依替米贝()的销售额为16.66亿美元，依替米贝/辛伐他汀复方药()的销售额为15.52亿美元。
化学法制备(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的工艺条件较为苛刻，反应步骤较多，反应过程中需使用对环境有毒害作用的溶剂；所用的手性催化剂制备较为困难，价格昂贵，反应后存在重金属残留问题，且催化剂循环使用效率不理想。采用微生物全细胞催化的生物不对称还原方法制备(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点。
目前，文献报道的(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸制备方法主要涉及以下几种：
Kunmar等以5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸甲酯为底物，经手性催化剂(-)-B-氯二异蒎茨硼烷的催化还原，水解和酸化等步骤制得(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸，产率为78.99%，e.e.值98.36%。该路线的反应条件苛刻，需要在-35℃～-25℃低温下进行反应，对厂房和设备的要求较高。所用催化剂(-)-B-氯二异蒎茨硼烷价格昂贵，且遇水和空气极易氧化。反应介质为四氢呋喃。具体反应式如下：
Homann等以5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸为底物，从土壤中筛选得到可将5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸不对称还原为(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的菌株--拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)ATCCNO.38924，该菌株在30℃条件下转化24h，产率为15%，e.e.值达99.8%。反应式如下：
（三）发明内容
本发明目的是提供一株可用于微生物催化不对称还原5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸制备高光学纯度(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的新菌种--近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)ZJPH1305，以及该菌种在催化不对称还原制备(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)ZJPH1305，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年11月8日，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M2013559。
本发明所述新菌株按如下方法筛选得到：
（1）菌株筛选
1）富集培养：将从浙江兰溪、义乌、温州、安徽安庆、湖北孝感、山西大同等地采集的土样接种到富集培养基中，置30℃，200rpm的摇床培养5天，待培养液变浑浊后，取1mL培养液转接至新鲜的富集培养基中，继续培养5天，如此重复3个循环。富集培养基配方如下：5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸50mmol/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO42g/L，NaCl1g/L，MgSO4.7H2O0.5g/L，溶剂为水，pH6.5。
2）平板培养：将最后一次富集培养液稀释1000倍后涂布平板培养基，30℃培养5天。平板培养基终浓度组成为富集培养基中加入15-20g/L的琼脂。
3）近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)ZJPH1305菌株筛选
菌种来源：近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)ZJPH1305菌株系从采自浙江兰溪的土样中分离筛选获得。具体筛选方法如下：将从浙江兰溪采集的土样加入到装有50ml富集培养基的250ml摇瓶中，30℃，200rpm，培养4～5天，待培养液变浑浊后，取1ml培养液转接至新鲜的富集培养基中，继续培养4～5天，如此重复富集培养3～4次。富集培养基中以5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸为唯一碳源，所述富集培养基终浓度组成为：5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸50mmol/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO42g/L，NaCl1g/L，MgSO4.7H2O0.5g/L，溶剂为水，pH6.5。
将最后一次富集培养液稀释1000倍后涂布平板培养基，30℃培养5天，经多次分离培养后获得单菌落菌株。平板培养基终浓度组成为富集培养基中加入15-20g/L的琼脂。挑取单菌落菌株接种到种子培养基，30℃培养20小时，再转接至产酶培养基中30℃培养44小时，9000rpm，4℃，离心10分钟获得湿菌体。以5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸为底物，离心获得的湿菌体为催化剂，在磷酸缓冲液中30℃转化24小时后，采用液相色谱法检测转化液中目的产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的对映体过量值（e.e.值），从中筛选得到具有高立体选择性（e.e.值＞99%）的微生物新菌株，记为菌株ZJPH1305。
（2）菌株ZJPH1305的生理生化特征
菌落形态：30℃平板培养48h，菌落呈圆形，表面湿润，光滑，略微隆起。菌落呈白色，不透明，有光泽。
细胞形态：细胞呈椭圆形，可单个、成对排列或聚集成丛。
生理生化特性：采用麦芽汁琼脂斜面培养时菌落呈白色到奶油色，无光泽或稍有光泽，软而平滑或部分有皱纹。培养3～5天菌落渐硬并呈菌丝状。细胞呈卵形4～8微米×5～11微米，或球形3微米～6微米。糖发酵葡萄糖阳性，D-半乳糖阳性，麦芽糖阳性，蔗糖阳性，海藻糖阳性，蜜二糖阴性，乳糖阴性，纤维二糖阴性，松三糖阳性，棉子糖阴性，菊糖阴性，淀粉阴性，D-木糖阴性；碳源同化葡萄糖阳性，半乳糖阳性，D-山梨醇阳性，D-核糖阳性，D-木糖阳性，L-阿拉伯糖阳性，L-鼠李糖阴性，蔗糖阳性，麦芽糖阳性，海藻糖阳性，蜜二糖阴性，乳糖阴性，棉子糖阴性，松三糖阳性，菊糖阴性，淀粉阴性，甘油阳性。氮源利用硝酸钾阴性，类淀粉化合物的形成阴性，分解脂肪产酸实验阴性，尿素阴性，抗放线菌酮阳性。
（3）菌株ZJPH1305的26srDNAD1/D2区序列特性
用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取细胞总DNA，并以其为模板，通过引物NL1（GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG）和NL4（GGTCCGTGTTTCAAGACGG）扩增菌株的26srDNAD1/D2区的基因，再将PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，所得结果见图4所示，其中泳道A和B均为菌株ZJPH1305的26srDNA扩增产物，两者均在600bp处出现单一条带。
PCR反应体系：
试剂 体积（μl）
Template（基因组DNA20-50ng/μl） 0.5
5×Buffer（with Mg2+） 2.5
dNTP（各2.5mM） 1
F（10uM） 0.5
R（10uM） 0,5
加双蒸H2O至 25
PCR循环条件：
经上海生工测序确认所述菌株ZJPH1305的26srDNAD1/D2区序列如SEQIDNO：1所示：
AAAGAACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACTTTCAGTGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGTCCCAGACCTATGTAAAGTTCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGTATGTTACTCTCTCGGGGGTGGCCTCTACAGTTTACCGGGCCAGCATCAGTTTGAGCGGTAGGATAAGTGCAAAGAAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTATAGTCTTTGTCGATACTGCCAGCTTAGACTGAGGACTGCGGCTTCGGCCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGCCCGT
SEQIDNO：1所示核苷酸序列已提交GenBank（GenBank登录号为No.KF811029），将菌株ZJPH1305的26srDNAD1/D2区序列在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行同源性对比（BLAST），结果表明：菌株ZJPH1305与假丝酵母属（Candidasp.）的部分菌株序列同源性较高。ZJPH1305菌株与CandidaparapsilosiscloneMROJIY04菌株（GenBank登录号为No.JX441605.1）的序列同源性达到100%。
根据生理生化特性并结合分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为近平滑假丝酵母，命名为近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)ZJPH1305。
采用Box-Behnken旋转中心组合实验设计法对葡萄糖浓度，酵母膏浓度和KH2PO4浓度三个因素对产酶影响显著的因素进行优化，得到近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)ZJPH1305菌株的优化培养基组成为：麦芽糖20～50g/L，酵母膏20～50g/L，(NH4)2SO41.0～2.5g/L，KH2PO41.0～2.5g/L，MgSO4·7H2O0.3～0.6g/L，NaCl0.5～1.5g/L，溶剂为水，pH6.0～7.5。
近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis）ZJPH1305菌株的培养条件为：初始pH6.0～7.5，摇瓶装液量80～120mL/250mL锥形瓶，培养温度30℃，摇床转速180～220rpm，接种量4～10%（体积浓度），培养时间36～48h。
本发明还涉及所述近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis）ZJPH1305在微生物催化不对称还原制备依替米贝中间体(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸中的应用，所述应用为：以5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸为底物，以近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis）ZJPH1305经发酵培养获得的湿菌体为酶源，在25℃～35℃下，于pH为6.0～8.5的缓冲液（优选磷酸盐缓冲液，更优选pH为6.0的磷酸盐缓冲液）构成的反应体系（所述反应体系是由底物、酶源和缓冲液构成）中进行转化反应，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，获得含(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的乙酸乙酯溶液，再用饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂，即得到依替米贝中间体(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸，(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸1HNMR(DMSO，400MHz):11.97(s,1H),7.34(m,2H),7.14(m,2H),5.21(s,1H),4.52(t,1H),2.19(t,2H),1.57(m,3H),1.43(m,1H)。
所述反应体系中，底物5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸的初始浓度为4.76～119.05mmol/L，优选23.81～71.43mmol/L，更优选47.62mmol/L，近平滑假丝酵母ZJPH1305菌体的添加量以菌体干重计为30.4～91.2g/L，优选30.4～76.0g/L，更优选60.8g/L。
进一步，优选所述反应是在25℃～35℃条件下反应12～60小时，更优选在30℃、200rpm条件下反应24～48小时。
为促进辅酶再生，提高反应效率，所述反应体系中还添加有辅助底物构成转化体系（所述转化体系是由底物、酶源、辅助底物和缓冲液构成），所述辅助底物为下列之一：①葡萄糖、②蔗糖、③麦芽糖、④异丙醇、⑤甲醇或⑥乙醇；所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖时，辅助底物终浓度为20～200g/L转化体系，辅助底物为异丙醇、甲醇或乙醇时，辅助底物体积终浓度为10%～30%。
更优选的，所述辅助底物为葡萄糖，转化体系中，葡萄糖终浓度为75～125g/L，底物初始浓度为4.76～71.43mmol/L，近平滑假丝酵母ZJPH1305菌体的添加量以菌体干重计为30.4～76.0g/L。
本发明所述湿菌体（即酶源）可按照常规方法由菌株发酵离心后获得，优选的，所述湿菌体由如下方法获得：
1）斜面培养：将近平滑假丝酵母ZJPH1305单菌落接种至斜面培养基，30℃培养2～3天，4℃冰箱保存，获得斜面菌体；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO41.5g/L，NaCl0.75g/L，MgSO4·7H2O0.75g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH6.5；
2）种子培养：从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养24小时，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO42g/L，NaCl1.0g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，溶剂为水，pH6.5；
3）发酵培养：以体积浓度10%的接种量将种子液转接到装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养48小时，获得发酵培养液，将发酵培养液离心（9000rpm，4℃，离心10分钟），所得沉淀用pH6.0的磷酸缓冲液洗涤，弃去洗涤液，收集湿菌体即为酶源；发酵培养基配方同种子培养基。
更进一步，本发明最优选所述近平滑假丝酵母ZJPH1305在制备(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸中的应用为：将近平滑假丝酵母ZJPH1305经发酵培养获得的湿菌体加入至0.2M、pH为6.0的磷酸缓冲液中，再加入5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸和葡萄糖构成转化体系，30℃、200rpm摇床振荡反应24～48小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取层即有机相，得到含(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的乙酸乙酯溶液；所述菌体加入量以菌体干重计为30.4～60.8g/L，所述底物初始浓度为4.76～47.62mmol/L，葡萄糖终浓度为100g/L。
液相色谱法测定目标产物的光学纯度和产率：转化反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用液相色谱分析，采用面积归一法。取1mL萃取液蒸干，重溶于乙醇，进行液相分析。液相色谱条件：日本岛津SPD-10A高效液相色谱仪，浙大N2000色谱工作站，日本大赛璐CHIRALPAKAD-H正相多糖衍生物手性柱(4.6mm×250mm×5μm)；检测波长：210nm；流动相V(正己烷)/V(乙醇)=86/14；流速：0.6ml/min；柱温：25℃；进样量：5μl。
用面积归一化法分别计算出反应液中的底物和产物的浓度。进而求出反应的产率（Yield）。计算式为：
产率=Ci/C0×100%公式（1）
公式（1）中C0、Ci分别为反应起始时底物的摩尔浓度和反应结束时产物的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值（enantiomericexcess，e.e.）来表示。
e.e.=(CS-CR)/(CS+CR)×100%公式（2）
公式（2）中CS和CR分别为S型和R型5-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的摩尔浓度。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株可用于微生物催化不对称还原5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸制备依替米贝药物关键手性中间体(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的微生物新菌种--近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis）ZJPH1305，采用该新菌种催化制备光学纯(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸具有底物浓度高，立体选择性好，产物光学纯度高等优点；本发明通过采用近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis）ZJPH1305细胞为催化剂的手性生物催化，当底物浓度为47.62mmol/L，辅助底物葡萄糖终浓度为100g/L时，目的产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的e.e值达到99.9%，产率达到95.37%。
（四）附图说明
图1为底物标准品液相色谱图；
图2为产物标准品液相色谱图；
图3为近平滑假丝酵母ZJPH1305菌株生物还原反应萃取液液相色谱图；
图4为菌株ZJPH1305的26srDNA扩增产物电泳图，其中泳道A和B均为菌株ZJPH1305的26srDNA扩增产物，M为Marker。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1）斜面培养：挑取近平滑假丝酵母ZJPH1305的单菌落接种至斜面培养基，30℃培养2～3天，获得斜面菌体4℃冰箱保存。斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO41.5g/L，NaCl0.75g/L，MgSO4·7H2O0.75g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH6.5。
2）种子培养：从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养24小时，获得种子液。种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO42g/L，NaCl1.0g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，溶剂为水，pH6.5。
3）发酵培养：以体积浓度10%的接种量将种子液转接到装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养48小时，获得发酵培养液，将发酵培养液9000rpm，4℃，离心10分钟，弃去上清，收集沉淀用pH为6.0的磷酸缓冲液洗涤一次，即获得湿菌体；发酵培养基配方同种子培养基。
实施例2：
1）转化反应
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH7.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入终浓度4.76mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度10g/L的蔗糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。转化结束后，转化液用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并萃取相，获得含有(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的乙酸乙酯溶液，采用液相色谱法分析目的产物和残留底物的含量，以及产物的光学纯度。
5）分析检测：
转化反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用液相色谱分析，采用面积归一法。取1mL离心后的上清液蒸干，重溶于乙醇，进行液相分析。液相色谱条件：日本岛津SPD-10A高效液相色谱仪，浙大N2000色谱工作站，日本大赛璐CHIRALPAKAD-H正相多糖衍生物手性柱(4.6mm×250mm×5μm)；检测波长：210nm；流动相V(正己烷)/V(乙醇)=86/14；流速：0.6ml/min；柱温：25℃；进样量：5μl。液相色谱图见图1～图3。产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为1.02mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率21.42%。
实施例3：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH7.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入终浓度4.76mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，不加辅助底物（对照），置于30℃，200rpm的摇床中反应24h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为0.89mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率18.70%。
实施例4：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH7.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入4.76mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入1mL甲醇（10%，v/v）的乙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为1.02mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率18.35%。
实施例5：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH7.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入4.76mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入1mL异丙醇（10%，v/v）的乙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为1.02mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率20.43%。
实施例6：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH7.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入终浓度4.76mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度10g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为1.10mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率23.10%。
实施例7：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH7.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入终浓度4.76mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度50g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为1.93mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率40.55%。
实施例8
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH7.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入终浓度4.76mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为2.85mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率59.88%。
实施例9：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH6.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入终浓度4.76mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为4.68mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率98.32%。
实施例10：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH8.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入终浓度4.76mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为2.92mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率61.34%。
实施例11：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH6.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入终浓度23.81mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为19.36mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率81.31%。
实施例12：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH6.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入终浓度23.81mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应48h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为23.00mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率96.6%。
实施例13：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH6.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入终浓度47.62mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应48h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为29.82mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率62.62%。
实施例14：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH6.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为30.4g/L；加入终浓度71.43mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应48h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为30.39mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率42.55%。
实施例15：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH6.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为60.8g/L；加入终浓度47.62mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应48h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为45.41mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率95.37%。
实施例16：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH6.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为76.0g/L；加入终浓度95.24mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应48h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为34.84mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率36.58%。
实施例17：
将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸缓冲液（0.2M，pH6.0）中，湿菌体以菌体干重计浓度为91.2g/L；加入终浓度119.05mmol/L的5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸作为底物，再加入终浓度100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应48h，采用实施例2的检测方法，产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的浓度为29.87mmol/L，光学纯度ee值99.9%，产率25.09%。

Claims (10)

1.近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)ZJPH1305，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年11月8日，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M2013559。
2.一种权利要求1所述近平滑假丝酵母ZJPH1305在制备(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸中的应用，其特征在于所述的应用为：以5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸为底物，以近平滑假丝酵母ZJPH1305经发酵培养获得的湿菌体为酶源，在25℃～35℃条件下，于pH为6.0～8.5的缓冲液构成的反应体系中进行转化反应，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取层，得到含(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的乙酸乙酯溶液。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述反应体系中，底物的初始浓度为4.76～119.05mmol/L，近平滑假丝酵母ZJPH1305湿菌体的添加量以菌体干重计为30.4～91.2g/L。
4.如权利要求2所述应用，其特征在于所述反应是在25℃～35℃条件下反应12～60小时。
5.如权利要求2所述应用，其特征在于所述反应体系中还添加有辅助底物构成转化体系，所述辅助底物为下列之一：①葡萄糖、②蔗糖、③麦芽糖、④异丙醇、⑤甲醇或⑥乙醇。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖，辅助底物终浓度为20～200g/L转化体系。
7.如权利要求5所述应用，其特征在于所述辅助底物为异丙醇、甲醇或乙醇，辅助底物体积终浓度为10%～30%。
8.如权利要求5所述应用，其特征在于所述辅助底物为葡萄糖，所述葡萄糖的终浓度为75～125g/L反应体系。
9.如权利要求2所述应用，其特征在于所述酶源按如下步骤制备：
1）斜面培养：将近平滑假丝酵母ZJPH1305单菌落接种至斜面培养基，30℃培养2～3天，4℃冰箱保存，获得斜面菌体；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO41.5g/L，NaCl0.75g/L，MgSO4·7H2O0.75g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH6.5；
2）种子培养：从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养24小时，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO42g/L，NaCl1.0g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，溶剂为水，pH6.5；
3）发酵培养：将种子液以体积浓度10%的接种量接种至发酵培养基，30℃、200rpm摇床培养48h，将发酵液离心，所得沉淀用pH6.0的磷酸缓冲液洗涤，弃去洗涤液，收集湿菌体即为酶源；所述发酵培养基终浓度组成同种子培养基。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于所述应用为：将近平滑假丝酵母ZJPH1305经发酵培养获得的湿菌体加入至0.2M、pH6.0的磷酸缓冲液中，再加入5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸和葡萄糖构成转化体系，30℃，200rpm摇床振荡反应24～48小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取层，得到含(5S)-(4氟苯)-5-羟基戊酸的乙酸乙酯溶液；所述湿菌体加入量以菌体干重计为30.4～60.8g/L，所述底物初始浓度为4.76～47.62mmol/L，葡萄糖终浓度为100g/L。
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