CN104745509B - 不解糖假苍白杆菌wzz003及其应用 - Google Patents

不解糖假苍白杆菌wzz003及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种不解糖假苍白杆菌WZZ003及应用，所述的应用为：以不解糖假苍白杆菌WZZ003经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以外消旋(R,S)‑2‑(2,6‑二甲基苯基氨基)丙酸甲酯为底物，以pH值5.0～7.2的磷酸缓冲液为反应介质，在20～50℃、200rpm条件下进行拆分制备(R)‑2‑(2,6‑二甲基苯基氨基)丙酸；本发明提供的产酶微生物菌株‑‑不解糖假苍白杆菌WZZ003的区域选择性强，制备的产物对映体过量值≧99.5％，反应转化率高，通过副产物回收利用转化率达到99％以上，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。

Description

不解糖假苍白杆菌WZZ003及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种新菌株--不解糖假苍白杆菌WZZ003及其在立体拆分(R,S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯反应生成光学纯(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸中的应用，转化产物(S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯通过化学消旋法重新生成R,S-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯作为反应底物回收利用。
(二)背景技术
酰胺类农药如甲霜灵是一种高效、低毒、广谱的内吸性杀菌剂，对由霜霉病菌、疫霉病菌、腐霉病菌等引起的植物病害具有较强的治疗效果，并且有较长的药效，是当今广泛使用的杀菌剂品种之一。甲霜灵(Metalaxyl)是由一对光学异构体组成的外消旋化合物，其中R-异构体(精甲霜灵)的杀菌活性比S-异构体高20-30倍，某些方面甚至高100倍以上，而且S-异构体对R-异构体的活性还有一定的抑制作用。在获得同等效果的情况下，精甲霜灵的用量仅为甲霜灵的一半或几分之一。另外，R-异构体在环境中的降解速度要比外消旋化合物快得多，具有更好的环境相容性。因此，精甲霜灵的工业化生产具有良好的经济效益和社会效益。
(R)-DMPM是合成酰胺类农药的关键中间体，可用于生产N-酰基丙酸类杀菌剂。目前，文献报道的合成(R)-DMPM主要是用具有旋光性的起始原料，控制适当的反应条件获得。
根据反应原料(L)-X-CH(CH3)COOCH3的不同，分为以下几种不同的制备方法。
(1)右旋的α-(三氟甲基磺酸酯基)丙酸甲酯和与之对应的胺类反应生成(R)-DMPM。反应式如下：
(2)以右旋的α-氯代丙酸甲酯为起始原料，与2,6-二甲苯胺，在甲苯溶液中反应72个小时控制反应温度在115℃，可以得到79％的(R)-(-)-DMPM，反应式如下：
(3)以甲苯作溶剂，(L)-α-磺酸酯基丙酸甲酯与2,6-二甲苯胺反应54个小时控制温度，在(90-130)℃之间，可得93％的R-DMPM。
浙江禾本农药化学有限公司利用L-乳酸为原料制备精甲霜灵，R体含量低，对映体过量值大多为92％，总收率为58％。综合以上几个化学合成方法可以看到化学拆分工艺途径存在着收率低、成本高、步骤繁多、产物纯度较低、污染严重等问题，因此采用微生物酶法拆分(R,S)-DMPM制备(R)-DMPM，具有选择性好，收率高，成本低的优势。
目前酶法拆分(R,S)-DMPM方法主要是用商品脂肪酶来制备，吉林大学的王岩等用PSL脂肪酶来拆分DMPM，底物浓度为5mmol，产物e.e.p％＝99％，总产率92.8％，化学纯度98％。但是由于底物浓度低，商品脂肪酶价格昂贵，成本很高，效率很低，不宜用于工业生产。本发明的微生物酶法拆分工艺底物浓度大大提高，最高可达100g/L(500mmol)以上，自制的微生物脂肪酶成本低，R体含量高，对映体过量值≧99.5％，收率为95％以上，另外通过对未反应的另一个产物(S)-DMPM重新消旋回用，可达到100％全利用效果，完全达到工业化生产的要求。
(三)发明内容
本发明目的是为了解决上述方法的不足，通过筛选产脂肪酶微生物，提供了一种廉价高效的产酶微生物，以外消旋(R,S)-DMPM(Ⅰ)为反应底物，立体选择性水解右旋甲霜灵中间体制备(R)-MPA-acid(Ⅲ)。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--不解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrumasaccharolyticum)WZZ003，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014209，保藏日期2014年5月18日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还提供所述不解糖假苍白杆菌WZZ003在拆分外消旋(R,S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯中的应用，具体所述的应用为：以不解糖假苍白杆菌WZZ003经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以外消旋(R,S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯为底物，以pH值5.0～7.2的磷酸缓冲液(优选pH值6.5～7.2)为反应介质，在20～50℃(优选40℃)、200rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸。所述底物终浓度为5～100g/L缓冲液(优选10～20g/L)，湿菌体加入量为10～50g/L缓冲液(优选20～30g/L)，干菌体加入量为2～10g/L缓冲液。
本发明所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将不解糖假苍白杆菌WZZ003接种至斜面培养基，在30℃培养2天，获得斜面菌体；斜面培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，质量浓度2％琼脂，溶剂为去离子水，pH 7.0；
(2)种子培养：取斜面菌体接种于种子培养基，在30℃、150r/min条件下培养24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0；
(3)发酵培养：在无菌条件下，取种子液以体积浓度2％的接种量接种于产酶培养基中，在30℃、150r/min条件下培养24h，获得发酵液，取发酵液在9000rpm离心10min，弃上清液，收集湿菌体；产酶培养基组成为：酵母膏11g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO41mmol/L，pH 7.0，溶剂为去离子水；
(4)干菌体的制备：取湿菌体在-40℃条件下，冻干2天，得到干菌体。
本发明所述分离纯化的方法为：转化反应结束后，将反应液的pH值用盐酸(优选4M的盐酸)调节至2.0后，加入乙酸乙酯进行萃取，充分振荡，9000rpm离心10min，取上层有机相减压蒸馏至无液体流出，取浓缩物用甲苯溶解，再加入无水硫酸钠干燥，过滤，获得滤液和滤饼，取滤液蒸干溶剂后得到产品(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸；取滤饼(含另一个未反应的产物(S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯)通过消旋化回收利用，所述消旋化方法为：以S-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯:正丁醛＝1:1(理论摩尔比)进行投料，用冰醋酸为溶剂加热100℃反应，大约10h完成消旋化，反应液用柱层析纯化，乙酸乙酯：石油醚＝1﹕5(体积比)作为流动相洗脱，洗脱液经蒸发浓缩得到相应的(R,S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯，然后再重复利用。
本发明反应流程见下式所示：
本发明有益效果主要体现在：本发明提供的产酶微生物菌株--不解糖假苍白杆菌WZZ003的区域选择性强，制备的产物对映体过量值≧99.5％，反应转化率高，通过副产物回收利用转化率达到99％以上，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。
(四)附图说明
图1为外消旋体DMPM和MPA-acid液相色谱图；
图2为S-DMPM和R-MPA-acid标准品的液相色谱图；
图3为微生物催化外消旋底物DMPM制备R-MPA-acid的液相色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1、菌株的分离纯化
称取湿土样1g(从浙江省杭州市浙江大学华家池校区试验田土壤中取得)混悬于10mL无菌生理盐水中，振荡混匀；接3mL混悬液于50mL液体富集培养基中，在30℃、200r/min下培养5～7d后，无菌操作转接1mL浑浊的菌液到新鲜的液体富集培养基，连续富集3～4次。富集培养基中，以外消旋DMPM为唯一碳源，富集培养基配方如下：NaNO3 3.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，外消旋DMPM 10mmol/L，pH 7.0，溶剂为去离子水。将富集后菌液经梯度稀释，涂布分离平板培养基，多次分离，获取单菌落。分离平板培养基组成为：富集培养基加入琼脂20g/L，pH 7.0。
挑取分离得到的单菌落接种于斜面培养基，30℃培养2天，获得斜面菌体。挑取斜面菌体接种至50mL种子培养基，在30℃、150r/min培养24h，在无菌条件下，取1mL种子液接种于50mL的产酶培养基中，30℃、150r/min培养24h，获得发酵液。种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，溶剂为去离子水；斜面培养基组成为在种子培养基中添加质量浓度2％琼脂。产酶培养基组成为：酵母膏11g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4 1mmol/L，pH 7.0，溶剂为去离子水，115℃灭菌30min。
取20mL发酵液于50mL离心管中，9000rpm离心10min，弃上清液，将0.1g湿菌体加入2mL、0.2mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液，振荡混匀，再加入终浓度10.06g/L外消旋DMPM作为底物，在30℃、200r/min下，转化200min。取出离心管，向反应液中加入200μL 4M的盐酸酸化至pH值2.0后，加入3mL乙酸乙酯，充分振荡，9000rpm离心10min。取上层有机相50μL，用旋转蒸发仪蒸干溶剂，然后加入1mL的流动相溶解，用无水硫酸钠除去微量水，用HPLC检测底物DMPM和产物的对映体过量值(e.e.)，筛选得到底物DMPM和产物的对映体过量值分别达到95％和98.5％的微生物菌株，记为菌株WZZ003。
液相色谱分析条件：采用液相色谱仪Waters 1525型液相色谱仪；手性液相色谱柱Cellud-Y(250×4.6m)；正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝98:2:0.1(体积比)，流速0.5ml/min，柱压212psi，柱温30℃；进样量10μL。(R)-DMPM和S-DMPM分别在9.9min和10.4min出峰，水解产物(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸和(S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸分别在24.2min和32.1min出峰(如图1所示)。
2、菌株的鉴定
生理生化特征：菌株WZZ003为革兰氏阴性菌，专性好氧，生长对pH不敏感，最适pH为7.0左右。利用无机氮源的能力较差。生长和产酶受到Cu2+的抑制，受到Mg2+、Mn2+等的促进。
经测序鉴定，菌株WZZ003的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示：GGGGCTTTACACATGCAAGTCGAACGGTCTCTTCGGAGGCAGTGGCAGACGGGTGAGTAATGCATGGGAATCTACCGTTCTCTACGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATACGCCCTTTTGGGGAAAGATTTATCGGAGAATGATGAGCCCATGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACTTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGGTGTTTACACTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCTCTTGACATGCCTATGAATGTTAGTGGAGACACTTTCAGCCTTTCGGGGCGTAGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAAGGGACTGCCAGTGATAAGCTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGATCGCGAGGTCGAGCTAATCTCCAAAAACCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGCGCTGTGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCGACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACA
根据生理生化特性和分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为不解糖假苍白杆菌，命名为不解糖假苍白杆菌WZZ003(Pseudochrobactrum asaccharolyticum WZZ003)。该菌种现保藏于中国典型培养物保藏中心(地址中国，武汉，武汉大学，430072)，保藏编号CCTCC M2014209，保藏日期2014年5月18日。
实施例2：
不解糖假苍白杆菌WZZ003接种至斜面培养基，在30℃培养2天，获得斜面菌体。斜面培养基组成同实施例1。
取斜面菌体接种于50mL的种子培养基，在30℃、150r/min培养24h，获得种子液。种子培养基组成同实施例1。
在无菌条件下，取1mL种子液接种于50mL的产酶培养基中，30℃、150r/min培养24h，获得发酵液。取20mL发酵液9000rpm离心10min，弃上清液，得到解糖假苍白杆菌WZZ003湿菌体，经酶活测定，该湿菌体比酶活力为30.25U/L。将湿菌体在-40℃条件下，冻干2天，得到干菌体。
U为1个酶活力单位，所述的1个酶活力单位是在规定的条件下测定的每分钟催化水解1μmol外消旋DMPM所需脂肪酶的量，所述的规定条件为：取0.5g湿菌体，向湿菌体中加入外消旋DMPM浓度为10g/L的磷酸缓冲溶液10ml，30℃条件下，搅拌转速200rpm，反应200min后，加入200μL 4M的盐酸酸化后，加入3mL乙酸乙酯，充分振荡，9000rpm离心10min。取上层有机相50μL，用旋转蒸发仪蒸干溶剂，然后加入1mL的流动相溶解，用无水硫酸钠除去微量水，用HPLC检测底物DMPM和产物的对映体过量值(e.e.)。
实施例3：
取实施例2方法制备的不解糖假苍白杆菌WZZ003干菌体0.1g，加入到含有外消旋DMPM终浓度为5g/L的20mL pH7.0磷酸缓冲液中，30℃、200rpm条件下，反应3h后，转化反应结束后，将反应液的pH值用4M的盐酸调节至2.0后，加入乙酸乙酯进行萃取，充分振荡，9000rpm离心10min，取上层有机相减压蒸馏至无液体流出，浓缩物用甲苯溶解，再加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干溶剂后得到产品(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸。采用实施例1方法检测(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸的对映体过量值e.e.p 99.5％，产率50.3％(如图3所示)。滤饼(含另一个未反应的产物(S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯)通过消旋化回收利用：S-酯:正丁醛＝1:1(理论摩尔比)进行投料，用冰醋酸为溶剂加热100℃反应，大约10h完成消旋化，反应液用柱层析纯化，乙酸乙酯：石油醚＝1﹕5(体积比)作为流动相洗脱，洗脱液经蒸发浓缩得到相应的酯，回收率在99％以上，然后再重复利用。
实施例4：
取实施例2方法制备的不解糖假苍白杆菌干菌体0.1g，加入到含有外消旋DMPM(实施例3中(S)-DMPM消旋制备得到)终浓度为5g/L的20mLpH7.0磷酸缓冲液中，30℃、200rpm条件下，反应3h后，反应转化后的反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸。采用实施例1方法检测(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸的对映体过量值e.e.p 99.6％，产率49.2％，通过两次酶催化反应，最终底物转化率达到了99.5％。
实施例5：
取实施例2方法制备的不解糖假苍白杆菌干菌体0.2g，加入到含有外消旋DMPM终浓度为50g/L的20mLpH7.0磷酸缓冲液中，30℃、200rpm条件下，反应3h后，反应转化后的反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸。采用实施例1方法检测(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸的对映体过量值e.e.p 99.5％，产率48.0％。另一个产物通过实例4的回收利用方法，最终总回收率达到95％以上。
实施例6：
取实施例2方法制备的不解糖假苍白杆菌湿菌体0.5g，加入到含有外消旋DMPM终浓度为5g/L的20mLpH7.0磷酸缓冲液中，30℃、200rpm条件下，反应6h后，反应转化后的反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸。采用实施例1方法检测(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸的对映体过量值e.e.p 99.9％，产率50.8％。另一个产物通过实例4的回收利用方法，最终总回收率达到95％以上。
实施例7：
取实施例2方法制备的不解糖假苍白杆菌湿菌体1g，加入到含有外消旋DMPM浓度为5g/L的20mLpH5.0磷酸缓冲液中，30℃、200rpm条件下，反应3h后，反应转化后的反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸。采用实施例1方法检测(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸的对映体过量值e.e.p 99.5％，产率48.6％。另一个产物通过实例4的回收利用方法，最终总回收率达到95％以上。
实施例8：
取实施例2方法制备的不解糖假苍白杆菌湿菌体1g，加入到含有外消旋DMPM终浓度为50g/L的20mLpH7.2磷酸缓冲液中，30℃、200rpm条件下，反应3h后，反应转化后的反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸。采用实施例1方法检测(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸的对映体过量值e.e.p 98.5％，产率50.8％。另一个产物通过实例4的回收利用方法，最终总回收率达到95％以上。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.不解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrum asaccharolyticum)WZZ003，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2014209，保藏日期2014年5月18日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述不解糖假苍白杆菌WZZ003在拆分外消旋(R,S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以不解糖假苍白杆菌WZZ003经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以外消旋(R,S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯为底物，以pH值5.0～7.2的磷酸缓冲液为反应介质，在20～50℃、200rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物终浓度为5～100g/L缓冲液，湿菌体加入量为10～50g/L缓冲液，干菌体加入量为2～10g/L缓冲液。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将不解糖假苍白杆菌WZZ003接种至斜面培养基，在30℃培养2天，获得斜面菌体；斜面培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，质量浓度2％琼脂，溶剂为去离子水，pH 7.0；
(2)种子培养：取斜面菌体接种于种子培养基，在30℃、150rpm条件下培养24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；
(3)发酵培养：在无菌条件下，取种子液以体积浓度2％的接种量接种于产酶培养基中，在30℃、150rpm条件下培养24h，获得发酵液，取发酵液在9000rpm离心10min，弃上清液，收集湿菌体；产酶培养基组成为：酵母膏11g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4 1mmol/L，pH7.0，溶剂为去离子水；
(4)干菌体的制备：取湿菌体在-40℃条件下冻干2天，得到干菌体。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述分离纯化的方法为：拆分反应结束后，将反应液的pH值用盐酸调节至2.0后，加入乙酸乙酯进行萃取，9000rpm离心10min，取上层有机相减压蒸馏至无液体流出，取浓缩物用甲苯溶解，再加入无水硫酸钠干燥，过滤，获得滤液和滤饼；取滤液蒸干溶剂后得到产品(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸；取滤饼通过消旋化回收利用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105779409B (zh) * 2016-03-31 2019-11-29 浙江工业大学 一种立体选择性酯酶、编码基因、载体、工程菌及其应用
CN109504634B (zh) * 2018-12-21 2021-10-15 浙江工业大学 芽孢杆菌wzz006及其应用
CN112195170B (zh) * 2020-07-15 2023-01-10 浙江工业大学 一种固定化重组酯酶及其制备r-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的应用
CN113667704A (zh) * 2021-08-24 2021-11-19 浙江工业大学 一种两步酶法制备(r)-n-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的方法
CN115895980B (zh) * 2022-12-30 2024-03-29 华熙生物科技股份有限公司 一种产l-肌肽的苍白杆菌及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4919709A (en) * 1983-01-25 1990-04-24 Ciba-Geigy Corporation N-(1'-methyl-2'-methoxyethyl)-N-chloroacetyl-2,6-dimethylaniline as herbicide
KR100507559B1 (ko) * 2003-06-10 2005-08-09 주식회사 엘지생명과학 신규한 슈도모나스 속 균주들, 그로부터 생산되는 입체선택적 기질 특이성을 가진 리파아제, 및 그러한 리파아제를 이용한 광학이성질체의 분할 방법
CN103787909A (zh) * 2012-10-30 2014-05-14 江苏汉邦科技有限公司 一种甲霜灵外消旋体的高效液相色谱拆分方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4919709A (en) * 1983-01-25 1990-04-24 Ciba-Geigy Corporation N-(1'-methyl-2'-methoxyethyl)-N-chloroacetyl-2,6-dimethylaniline as herbicide
KR100507559B1 (ko) * 2003-06-10 2005-08-09 주식회사 엘지생명과학 신규한 슈도모나스 속 균주들, 그로부터 생산되는 입체선택적 기질 특이성을 가진 리파아제, 및 그러한 리파아제를 이용한 광학이성질체의 분할 방법
CN103787909A (zh) * 2012-10-30 2014-05-14 江苏汉邦科技有限公司 一种甲霜灵外消旋体的高效液相色谱拆分方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Description of Pseudochrobactrum gen. nov., with the two species Pseudochrobactrum asaccharolyticum sp. nov. and Pseudochrobactrum saccharolyticum sp. nov.;P Kampfer 等;《International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology》;20060831;第56卷(第8期);第1823-1829页 *
Enzyme-catalyzed preparation of methyl (R)-N-(2,6-dimethylphenyl)alaninate: a key intermediate for (R)-metalaxyl;OJ Park 等;《Tetrahedron Asymmetry》;20050321;第16卷(第6期);第1221-1225页 *
Stereoselective lipases from Burkholderia sp., cloning and their application to preparation of methyl (R)-N-(2,6-dimethylphenyl)alaninate, a key intermediate for (R)-Metalaxyl;OJ Park 等;《Journal of Biotechnology》;20051104;第120卷(第2期);第174-182页 *
精甲霜灵的合成研究;王岩;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（工程科技Ⅰ辑）》;20081115(第11期);内容提要，第45-49页 *

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