CN104531565B - 反硝化无色杆菌zjut1104及其应用 - Google Patents

反硝化无色杆菌zjut1104及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株新菌株‑‑反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)zjut1104及其在拆分2，6‑二甲基苯基氨基丙酸甲酯中的应用，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月19日，保藏编号CCTCC NO：M 2014495，保藏地址为中国武汉武汉大学；本发明菌株对农药中间体(2，6‑二甲基苯基氨基丙酸甲酯)催化12h，底物转化率达到了29.5％，eep达到了92.5％，主要产物为(R)‑2，6‑二甲基苯基氨基丙酸。

Description

反硝化无色杆菌zjut1104及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一株反硝化无色杆菌zjut1104(Achromobacter denitrificanszjut1104)及在生物催化领域的应用，该菌株具有很好的手性选择性拆分农药中间体的作用。
(二)背景技术
N取代苯基α氨基丙酸是一类重要的手性合成中间体，特别是在农药领域，是很多手性农药的关键中间体，由该类中间体合成的农药已经形成了一类重要的农药体系--酰胺类农药，其中甲霜灵、氯霜灵、呋霜灵、异霜灵和苯霜灵为杀菌剂，异丙甲草胺、新燕灵和麦草伏为除草剂。这些农药不同光学异构体的生物活性是不同的，是典型的旋光活性农药。
甲霜灵是酰胺类杀菌剂中最为普遍的成员，在世界防治卵菌亚纲病害(霜霉病和晚疫病)市场上甲霜灵产品占15％。甲霜灵同RNA聚合-I模板复杂作用，抑制核糖核苷酸三磷酸酯结合为核蛋白体RNA。甲霜灵因其烷基部分有一个不对称碳且无限制构形异构物(atropoisomer)不对称苯环取代基而具有手性。因此，甲霜灵由一对具有R和S构型的对映异构体组织。外对phyflaophtora infextants和Pythium ultimmn生活活性测试表明R异构体大约比S异构体高1000倍。体内测试显示活性具有较小差异，R体比S体高3倍。因此，甲霜灵立体异构体具有相同的作用模式，但到达或者与受体结合的有效性方面具有显著的差异。R体相对于其对映体具有更高的生物活性，因此甲霜灵的杀菌活性主要来源于R体。外消旋甲霜灵目前在一些国家正在被主要由具有较高生物活性的R体组成的精甲霜灵所代替，典型的精甲霜灵产品由97.5％的R体以及2.5％的s体构成。光学纯或异构体产品替代外消旋(或异构体混合物)产品不仅提高了 使用药效而且还能减少释放到环境中的农药总量，减少非活性异构体在生物圈内的扩展，从而减小对非靶标生物的潜在副作用。而且，光学纯产品的使用还有利于产品的生产、运输和储存。
目前，大量的手性化合物的制备是通过化学拆分法完成的。利用生物催化拆分手性化合物比化学拆分法具有明显的优越性：(1)酶催化的反应通常具有高度的立体专一性。因此得到的产物旋光纯度很高，适于作各种生物活性和药理试验。(2)副反应少，产率高，产品分离提纯简单。(3)酶催化的反应大多在很温和的条件下进行，温度区间0～500℃，pH值接近中性。因此没有设备腐蚀问题，生产安全性也高。(4)酶无毒，易降解，不会造成环境污染，适于大规模生产。
根据文献报道，南极假丝酵母脂肪酶和假单胞菌脂肪酶对该农药中间体实现了手性拆分，主要产物构型均为R型。南极假丝酵母脂肪酶催化速率比较高，立体选择性低，eep达到了69.4％，假单胞菌脂肪酶的手性选择性相当好，eep达到了99％，而催化速率比较慢。本发明菌株对该农药中间体，既具有很好的立体选择性，又有很高的催化速率。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种具有较好立体选择性的菌株--反硝化无色杆菌zjut1104(Achromobacter denitrificans)及其在拆分农药中间体--2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)zjut1104，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月19日，保藏编号CCTCCNO：M 2014495，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述反硝化无色杆菌zjut1104在拆分2,6-二甲基苯 基氨基丙酸甲酯中的应用，具体所述的应用以反硝化无色杆菌zjut1104经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后的破碎混合液为催化剂，以2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，以吐温80为助溶剂，以pH＝8.0的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃、180rpm条件下进行催化反应，反应完全后，获得含(S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯和(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。
进一步，所述催化剂用量以湿菌体重量计，所述湿菌体用量为10-80g/L反应体系，所述底物终浓度为48mmol/L反应体系，所述辅助底物的终浓度为20ml/L反应体系。
进一步，所述湿菌体超声破碎的条件为：将湿菌体与磷酸盐缓冲液混合，在冰浴、500w条件下超声破碎10min，获得超声破碎混合液；所述磷酸盐缓冲液的体积用量以湿菌体重量计为25ml/g。
进一步，本发明所述湿菌体的制备方法为：
(1)将反硝化无色杆菌zjut1104接种至斜面培养基，在30℃培养1～2天，获得斜面菌体；所述每升斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂15～20g，自来水1000mL，用NaOH调节pH值为7.0，121℃灭菌20min；
(2)将斜面菌体接种至种子培养基，在30℃培养12h，获得种子液；所述每升种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖10g，K2HPO42g，MgSO40.2g，自来水1000mL，用NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌20min；
(3)将种子液以体积浓度1％～10％的接种量接种至发酵培养基，在30℃、180r/min、体积装液量5％的条件下培养24h，将发酵液离心，弃上清液，获得湿菌体；
每升发酵培养基终浓度组成：蛋白陈5g，酵母粉2.5g，葡萄糖1g，橄榄油10g，K2HPO41g，MgSO40.2g，自来水1000mL，用NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌20min。
进一步，所述混合液分离纯化的方法为：反应结束后，用氢氧化钠调节混合液的pH值至8-11，加入等体积的乙醚萃取(优选萃取1-3次，每次萃取时间10min以上)，分层(优选用分液漏斗进行两相分离)，得到水相a和有机相a；用盐酸调节水相a的pH值为2-5，加入等体积的乙酸乙酯萃取(优选萃取时间10min以上)，分层(优选用分液漏斗进行两相分离)，得到水相b和有机相b；将有机相b在35℃-60℃，转速为50rpm-150rpm条件下旋转蒸发除去乙酸乙酯，取浓缩物，即获得(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明提供一株新菌株--反硝化无色杆菌zjut1104，该菌株对农药中间体(2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯)催化12h，底物转化率达到了29.5％，产物对映体过量值达到了92.5％。
而黄丽琴，杨红等人[2007]用皱褶假丝酵母催化拆分该农药中间体，催化反应120h底物转化率达到31.2％，产物对映体过量值为81.34％。
(四)附图说明
图1为菌株初筛时橄榄油作为唯一碳源，罗丹明B作为显色剂，稀释10-6菌落及荧光照片。
图2为菌株初筛时农药中间体作为唯一碳源，溴甲酚紫作为指示剂，稀释10-6菌落及变色照片。
图3为菌株初筛时农药中间体作为唯一碳源，罗丹明B作为显色剂，稀释10-6菌落及荧光照片。
图4为反硝化无色杆菌zjut1104在LB固体培养基上培养2d的菌落 形态。
图5为反硝化无色杆菌zjut1104经革兰氏染色后的菌落形态。
图6为反硝化无色杆菌zjut1104的不同菌体量催化农药中间体水解反应12h的转化率和ee值，ees和eep分别为酶法拆分反应的底物和产物的对映体过量值，—●—代表底物转化率C(％)，—□—代表产物对映体过量值eep，—■—代表底物对映体过量值ees。
图7为反硝化无色杆菌zjut1104(OD3即是本菌株实验代号)系统发育树。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所述农药中间体或中间体均为式(Ⅰ)所示2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯。
实施例1：菌株筛选
1、反硝化无色杆菌zjut1104(Achromobacter denitrificans zjut1104)的富集培养，初筛和复筛。
(1)富集培养：取活性污泥(采集浙江省某公司)1ml，接入装有49ml(含农药中间体--2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯)有机富集培养基或无机富集培养基中，30℃，摇床转速180r/min下培养，培养5天。移取1ml富集液转接入新鲜的富集培养基中，30℃，摇床转速180r/min下培养5天，取少量富集液用于高相液相分析，对于出现产物的且降解率较高的菌液涂布到筛选培养基上，进行筛菌。对于出现底物降解率比较低的，延迟培养两天，然后进行高效液相分析，根据情况涂布平板。
2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(Ⅰ)结构式为：
无机富集培养基终浓度组成(g/L)：(NH4)2SO42.0，KH2PO41.0，K2HPO41.5，MgSO40.2，NaCl 1.0，中间体10，溶剂为蒸馏水，用NaOH调成pH为7.0。
有机富集培养基终浓度组成(g/L)：酵母膏5.0，(NH4)2SO45.0，NaCl0.5，MgSO40.2，KH2PO41.0，K2HPO41.5，中间体10，溶剂为蒸馏水，用NaOH调成pH为7.0。
(2)初筛：
a)、橄榄油作为唯一碳源，罗丹明B作为显色剂
取1ml富集培养液加入到9ml无菌水中，进行倍比稀释，分别梯度10-5，10-6，10-7，涂布到含终浓度10mg/L罗丹明B(购于上海三爱思试剂)和终浓度120ml/L橄榄油乳化液(质量浓度3％的聚乙烯醇水溶液与橄榄油按体积比3:1混合,匀浆机搅拌)的菌种初筛固体培养基，30℃培养3～5天后，将培养基置于365nm紫外线下观察菌落周围荧光变色圈及大小情况，结果见图1所示。
菌种初筛固体培养基终浓度组成(g/L)：(NH4)2SO42.0，KH2PO41.0，K2HPO41.5，MgSO40.2，NaCl 1.0，琼脂15～20，溶剂为蒸馏水，用NaOH调成pH为7.0，121℃，20min。
b)、农药中间体作为唯一碳源，溴甲酚紫作为指示剂
取1ml富集培养液加入到9ml无菌水中，进行倍比稀释，分别梯度10-5，10-6，10-7，涂布到含终浓度30g/L 2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯和溴甲酚紫(1mg/ml)50ml/L的菌种初筛固体培养基，30℃培养3～5天 后，将培养基置于365nm紫外线下观察菌落周围荧光变色圈及大小情况，结果见图2所示。
c)、农药中间体作为唯一碳源，罗丹明B作为显色剂
取1ml富集培养液加入到9ml无菌水中，进行倍比稀释，分别梯度10-5，10-6，10-7，涂布到含终浓度30g/L 2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯和终浓度10mg/L罗丹明B的菌种初筛固体培养基，30℃培养3～5天后，将培养基置于365nm紫外线下观察菌落周围荧光变色圈及大小情况，结果见图3所示。
经过分离纯化，初步筛选得到27株菌株。
(3)复筛：挑取紫外灯下荧光变色圈明显且溴甲酚紫培养基变黄的菌株接种在LB固体培养基上，30℃培养2～4天进行分离纯化，将分离纯化后的菌株接入种子培养液中，30℃培养，取培养12h的种子悬浮液接入50mL复筛液体培养基，体积浓度接种量为6％，30℃控温摇床中培养，转速180r/min。定时取样进行高效液相分析。得到了一株转化率达到45％和eep达到了81％的菌株，记为菌株zjut1104。
每升LB固体培养基终浓度组成：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂20g，1000ml自来水，用NaOH调成pH为7.0。
每升种子培养液终浓度组成：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖10g，K2HPO42g，MgSO40.2g，自来水1000mL，用NaOH调节pH值为7.0。
每升复筛液体培养基终浓度：蛋白陈5g，酵母粉2.5g，葡萄糖1g，中间体10g，K2HPO41g，MgSO40.2g，自来水1000mL，用NaOH调节pH值为7.0。
2、菌株的鉴定
菌株形态观察：将筛选到的菌株zjut1104划线于LB固体培养基，30℃培养2～4天，观察单菌落形状、大小、颜色和突起等特征。并对其 革兰氏染色(图4)，革兰氏阴性菌，在显微镜下观察(图5)，呈杆状，无芽孢。菌株zjut1104在LB平板上菌落均呈圆形，表面隆起，边缘整齐，湿润，光滑，不透明，乳白色，随着时间的推移逐渐变成微黄色。
生理生化鉴定送至浙江省人民医院。报告显示菌株zjut1104与Achromobacterdenitrificans同属一种可能性达到99％。具体生理生化鉴定指标如表1。
表1菌株jut1104生理生化指标
注：+表示生长或反应阳性或利用，-表示不生长或反应阴性或不利用。
16S rDNA分子生物学鉴定：菌株zjut1104送至生工生物工程(上海)股份有限公司鉴定，16S rDNA的序列长度1434bp(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)，将测定的16S rDNA序列在核糖体数据库(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsubsp)上比对，结果显示：
从比对结果显示，菌株属于Achromobacter属的细菌。在LPSN(http:// www.bacterio.net/)搜索Achromobacter属的模式菌，同时在NCBI上搜索模式菌的16SrDNA。并且菌株zjut110416S rDNA序列与NCBI中保存的数据进行相似性分析，发现一株Achromobacter denitrificans strain 22426，相似性达到了99％，这株菌是在模式菌中没有的菌种。将模式菌和Achromobacter denitrificans strain 22426的16S rDNA与本菌株16S rDNA的进行同源性比对和系统发育分析，进化树如图7所示，菌株zjut1104(即OD3)与Achromobacter denitrificans strain 22426同源性更高。结合菌株形态学和生理生化鉴定结果，菌株zjut1104属于Achromobacter denitrificans，将其命名反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)zjut1104。
实施例2
将反硝化无色杆菌zjut1104接种至斜面培养基，在30℃培养1～2天，获得斜面菌体；所述每升斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂20g，自来水1000mL，用NaOH调节pH值为7.0，121℃灭菌20min。
将斜面菌体接种至种子培养基，在30℃培养12h，获得种子液。所述每升种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖10g，K2HPO42g，MgSO40.2g，自来水1000mL，用NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌20min。
将种子液以体积浓度6％的接种量接种至发酵培养基(体积装液量为50mL/250ml锥形瓶)，30℃、180r/min条件下，于控温摇床中培养24h，发酵液在4℃，8000r/min条件下离心10min，得到湿菌体和发酵上清液。
每升发酵培养基终浓度组成：蛋白陈5g，酵母粉2.5g，葡萄糖1g，橄榄油10g，K2HPO41g，MgSO40.2g，自来水1000mL，用NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌20min。
实施例3
催化反应体系总体积10mL：2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯终浓度48mmol/L，吐温80终浓度20ml/L，以磷酸缓冲液(pH＝8.0，100mM)为反应介质，实施例2制备的湿菌体0.4g或发酵上清液2ml(来自20ml发酵液离心所得)。
催化反应条件：180rpm，37℃的条件下于恒温摇床催化反应，分别在24h和48h取样采用HPLC进行产物测定。结果如表1，可知反硝化无色杆菌zjut1104所产的酶是胞内酶，催化24h，转化率达到了41.5％，eep达到了83.8％。
反相HPLC分析条件：流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝60：40％(加入0.1％三氟乙酸)，流速：1ml/min，检测紫外波长：220nm，柱温：25℃，进样量:10μl，色谱柱：250mm×4mm，C18。
正相HPLC分析条件：流动相：正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝98：2％(加入0.1％的三氟乙酸)，流速:0.5ml/min，检测紫外波长：220，柱温：30℃，进样量:10μl，色谱柱：250mm×4mm，大赛璐手性OD柱。
对映体过量值(ee)和底物总转化率C以及对映体选择率按以下公式计算：
公式1：
公式2：
公式3：
公式4：
式中，[S]s和[S]R分别为HPLC测得样品中S和R型底物对映体的含量，[P]s和[P]R分别是S和R型产物对映体的含量，ees和eep分别为拆分反应的底物和产物对映体过量值，C为转化率，E为对映体选择率。
表2反硝化无色杆菌zjut1104发酵所得菌体及上清液催化中间体水解的结果
实施例4
将实施例3中湿菌体的用量分别改为5mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL的发酵液通过离心得到的菌体(发酵液的湿菌体含量约2mg/mL)，其它操作同实施例3，催化反应12h，对映体过量值(ee)和底物转化率(C)，见图6。ees和C随着菌体量的增加而增加，eep是先增加后减小。20mL发酵液离心的湿菌体(0.4g)催化12h，转化率达到29.5％，eep达到了92.5％，主要产物为(R)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸。
实施例5完整细胞和破碎细胞固液混合物催化农药中间体的对比
将实施例2方法制备的湿菌体0.4g与7ml磷酸盐缓冲液混合，在冰浴，500w条件下超声破碎10min，取超声破碎混合液(即破碎细胞固液混合物：菌体细胞经超声波破碎后，所含有破碎的细胞、未破碎的细胞以及胞内液)作为催化剂。
将实施例3中的湿菌体用量改为0.4g，同时以超声破碎混合液7ml(由0.4g湿菌体制备而成)作为对照，其他操作同实施例3，湿菌体和破碎后的混合液对2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯催化12h，破碎细胞催化的平均转化率(C)比细胞催化平均转化率(相对值)提高了21.0％，ees(相对值)提高26.7％，eep基本不变。如表3。这样的结果说明了细胞破碎后，酶游离在液体中，与细胞未破碎相比，增加了酶与底物的接触机会，提高了催化效率。
表3反硝化无色杆菌zjut1104完整细胞和破碎细胞固液混合物催化结果

Claims (7)

1.反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)zjut1104，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月19日，保藏编号CCTCC NO：M 2014495，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述反硝化无色杆菌zjut1104在拆分2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用以反硝化无色杆菌zjut1104经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后的破碎混合液为催化剂，以2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，以吐温80为助溶剂，以pH＝8.0的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃、180rpm条件下进行催化反应，反应完全后，获得含(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以湿菌体重量计，所述湿菌体用量为10-80g/L反应体系，所述底物终浓度为48mmol/L反应体系，所述助溶剂的终浓度为20ml/L反应体系。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体超声破碎的条件为：将湿菌体与磷酸盐缓冲液混合，在冰浴，500w条件下超声破碎10min，获得超声破碎混合液；所述磷酸盐缓冲液的体积用量以湿菌体重量计为15～25ml/g。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体的制备方法为：
(1)将反硝化无色杆菌zjut1104接种至斜面培养基，在30℃培养1～2天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为自来水，pH值为7.0；
(2)将斜面菌体接种至种子培养基，在30℃培养12h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，K2HPO42g/L，MgSO40.2g/L，溶剂为自来水，pH值为7.0；
(3)将种子液以体积浓度1％-10％接种量接种至发酵培养基，在30℃、180r/min、体积装液量5％的条件下培养24h，将发酵液离心，弃上清液，获得湿菌体；
每升发酵培养基终浓度组成：蛋白陈5g，酵母粉2.5g，葡萄糖1g，橄榄油10g，K2HPO41g，MgSO40.2g，自来水1000mL，pH值为7.0。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述混合液分离纯化的方法为：反应结束后，用氢氧化钠调节混合液的pH值至8-11，加入等体积的乙醚萃取，分层，得到水相a和有机相a；用盐酸调节水相a的pH值为2-5，加入等体积的乙酸乙酯萃取，分层，得到水相b和有机相b；将有机相b在35℃-60℃，转速为50rpm-150rpm条件下旋转蒸发除去乙酸乙酯，获得(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。
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