CN101693906A - 一种静息细胞在浊点系统中转化生产光学活性醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以酵母静息细胞作为生物催化剂，在一种或一种以上表面活性剂组成的浊点系统中进行生物转化的方法。该方法能够在温和的反应条件下对较高浓度的潜手性酮底物进行转化，得到相应的光学活性醇。该方法在很大程度上解除了不溶性底物及产物对反应的抑制作用，可在较高的浓度下进行转化，底物的转化效率高，并可实现细胞的多次循环使用，条件温和，环境友好，具有较高的实际应用价值和开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物转化领域，具体涉及采用酵母静息细胞在浊点系统中进行光学活性醇生物转化的方法。
背景技术
本发明专利为中国专利申请200910008152.5《一种红酵母细胞以及不对称转化生产光学活性醇的方法》的发展。
在中国专利申请200910008152.5中，本发明人公开了一种以红酵母静息或固定化细胞作为生物催化剂，在水-有机溶液两相体系中对多种潜手性酮进行不对称还原获得相应的光学活性醇的方法，转化条件温和，底物转化率高，产物光学活性高。
但是在该两相系统中，由于底物及产物抑制作用明显，使得转化只能在较低的浓度下进行，限制了该方法的进一步推广。
生物转化体系是迄今为止人类所知的最高效和最具有选择性的温和催化体系。酶不仅在生物体内，也能在生物体外促进天然的和人工合成的化学分子的诸多转化反应，并且显示出优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性，同时还具有反应条件温和、副产物少、不造成环境污染和后处理简单等优点。近年来已在小分子化合物的转化、天然化合物的生物合成、药物前体化合物的转化、生物转化的有机化合物不对称合成、活性成分筛选及新药开发、药物代谢研究等领域得到广泛应用。但疏水性化合物的生物转化经常遭遇两个障碍：低水溶性导致的底物与催化剂接触受限，以及底物(及/或产物)对催化剂造成的毒性。近些年来为提高生物转化的效率，介质工程成为研究的热点内容，多种转化体系依次涌现，如水-有机溶剂两相体系、双水相体系、离子液体转化体系、反胶束转化体系等。但这些体系均存在一些问题，使得不溶性有机化合物的生物转化只能在较低的浓度下进行，成为这些不溶性化合物走向工业规模生产的限制因素。
浊点系统(cloud point system，CPS)是近年开发的一种新型转化体系，即利用一种或一种以上非离子表面活性剂组成浊点系统，作为生物转化的介质。它以表面活性剂的浊点现象为基础，所有操作在两水相之间进行，避免了对人体有害的有机溶剂的使用，也避免了挥发性有机溶剂对环境的影响，而且表面活性剂用量小，转化分离速度快，产物富集率最高可达100％，具有经济、安全、高效、操作简便且应用范围广等优点，是高灵敏度、高选择性的“绿色方法”。
浊点是非离子表面活性剂的一种特殊现象，是指非离子表面活性剂超过胶束浓度(CMC)时，变成交替聚集在一起而相互关联的缔合体，形成胶束溶液。当温度超过浊点时，胶束溶液明显分为两相，一相是表面活性剂脱离水相开始下沉，最后沉积为很小的体积(一般为100-200μl)，另一相是以表面活性剂浓度(CMC)为主的水相。溶液中的疏水性物质与表面活性剂的疏水基团结合，被萃取进入表面活性剂相，而亲水性物质仍留在水相中，再经两相分离，就可将样品中的物质分离出来。
手型芳香醇作为合成手性药物的重要中间体，在多种领域具有广泛用途。在众多生产方法中，以芳香族羰基化合物为潜手性底物，利用酶或细胞的催化作用，将其进行不对称还原一获得相应的手性芳香醇的研究最为方便。本发明以3，5-双三氟甲基苯乙酮不对称还原生成(S)-3，5-双三氟甲基苯乙醇为例，介绍浊点系统在疏水性芳香酮的生物转化中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以酵母静息细胞为催化剂，在浊点系统中对较高浓度的潜手性酮进行生物转化，生成高浓度、高纯度的光学活性醇的方法，属于生物转化领域。
本发明所要解决的技术问题在于提供一种采用酵母静息细胞在浊点系统中进行生物转化的方法，使得不溶性底物的转化效率和转化浓度得以提高。
为达到本发明的目的，本发明所采用的技术方案是：采用红酵母静息细胞为生物催化剂，采用一种或一种以上表面活性剂形成浊点系统，并添加至水溶液中作为生物转化的介质，然后加入底物后进行不对称转化还原反应，反应结束后转化液经分离纯化从而得到相应的光学活性醇。
本发明生产光学活性醇的方法，包括：
(1)将酵母进行培养，发酵，获得湿菌体；
(2)以前手性酮3，5-双三氟甲基苯乙酮作为转化底物；
(3)将(1)获得的湿菌体静息细胞直接作为生物催化剂，于浊点系统中，加入转化底物进行转化，生成相应的光学活性醇(S)-3，5-双三氟甲基苯乙醇；
(4)将(3)的转化液，离心除去细胞后，上清置于一定温度的水浴促进系统分层，下层为凝聚层，下层直接取样用于转化率及产率分析。
本发明所述的表面活性剂为Triton X-114或Triton X-114与Triton X-100或Triton X-45按照一定比例混合而成的。
所述酵母静息细胞是将在发酵培养基内培养至一定时间后的细胞悬浮液进行离心洗涤后的微生物细胞，可直接用于浊点转化。
在本发明所述静息细胞培养过程中也可以加入一定浓度的以表面活性剂溶解的底物进行驯化，以加强细胞对底物和产物的耐受性及转化活性，所加入的底物浓度一般为0.02-1％(w/v)之间。
转化用菌株的培养和发酵：
斜面培养：
YPD培养基：酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％，自然pH，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/ml，下同。110℃灭菌15分钟，冷却后制成斜面，接种，30℃培养2-3天。
种子培养和发酵：
YPD培养基：酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％(含或不含以表面活性剂溶解的底物)，自然pH，装液量100ml/500ml三角瓶，110℃灭菌15分钟，冷却后接种，接种量5～10％，30℃，摇瓶转速180rpm，培养24～36小时，分别作为种子及发酵培养液。其中发酵培养液经4000rpm离心收集细胞，无菌水洗涤两遍后离心收集细胞，以收集到的细胞作为生物催化剂。
微生物转化反应：以收集的细胞为催化剂，于浊点系统中进行转化，以潜手性酮为底物，底物浓度2-12/ml，湿菌体用量为0.1g/ml，转化温度30℃，摇床转速180rpm，转化时间24小时。
样品分离：转化结束后，转化液12000rpm离心15min，上清置于水浴中，不断升高水浴温度，至转化液分成界限清晰的两层，上层为稀相，下层凝聚层直接取样20μl进行HPLC检测，计算出底物转化率和产量。
底物潜手性酮和产物光学活性醇的HPLC测定：C18反相色谱柱，流动相：甲醇∶水＝70∶30；进样量20ul；流速1ml/min；柱温25℃；紫外检测波长264nm。底物转化率定义为：X＝[C0/(C0+C)]×100％，式中C0和C分别代表高效液相图谱中产物和底物峰的峰面积。
本发明利用红酵母细胞在浊点系统中不对称催化还原前手性酮，条件温和，环境友好，转化率和产量较单水相或水-有机溶剂两相系统均有较大提高，具有较高的实际应用价值和开发前景。
附图说明
图1为本发明原理图
图2培养基中加入不同浓度底物后得到的湿菌体重量
培养条件：100ml培养基，接种量10％，浊点系统中另外加入10ml Triton X-114，各瓶中分别加入浓度为0.02～1％(v/v)的底物3，5-双三氟甲基苯乙酮。30℃，180rpm，培养30hr，发酵培养液经4000rpm离心并用无菌水洗涤两遍后离心收集细胞并称量。
图3Triton X-114与Triton X-45不同配比对红酵母细胞生长量的影响
培养条件：30ml培养基，另加入不同配比的Triton X-114与Triton X-45混合物，TritonX-114与Triton X-45总体积3ml，接种3ml种子液。30℃，180rpm，培养30hr，发酵培养液经4000rpm离心并用无菌水洗涤两遍后离心收集细胞并称量。
图4Triton X-114与Triton X-100不同配比对红酵母细胞生长量的影响
培养条件：30ml培养基，另加入不同配比的Triton X-114与Triton X-100混合物，TritonX-114与Triton X-100总体积3ml，接种3ml种子液。30℃，180rpm，培养30hr，发酵培养液经4000rpm离心并用无菌水洗涤两遍后离心收集细胞并称量。
图5转化系统中表面活性剂浓度对转化的影响
转化系统条件：1g细胞，10ml纯水，60μl底物。
图6转化系统中表面活性剂Triton X-114与Triton X-100不同配比对转化的影响
转化系统条件：1g细胞，10ml纯水，60μl底物，表面活性剂共1ml。
图7转化系统中表面活性剂Triton X-114与Triton X-45不同配比对转化的影响
转化系统条件：1g细胞，10ml纯水，60μl底物，表面活性剂共1ml。
图8转化系统中底物浓度对转化的影响
转化系统条件：1g细胞，10ml纯水，Triton X-114500μl，Triton X-100μl。
图9细胞循环利用次数对转化的影响
转化系统条件：1g细胞，10ml纯水，Triton X-114500μl，Triton X-100μl，60μl底物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容进行进一步阐明。以下实施例均以本发明技术方案为前提，给出详细的实施方法和具体的操作步骤，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
如图1所示，下述实施例生物转化生成手性芳香醇(S)-3，5-双三氟甲基苯乙醇的原理为：利用本实验室筛选并诱变的红酵母细胞(CGMCC No.2882)体内的羰基还原酶，对底物潜手性酮3，5-双三氟甲基苯乙酮进行不对称还原，实现酮基还原反应，得到手性芳香醇(S)-3，5-双三氟甲基苯乙醇。
下例实施例的具体条件包括：
微生物培养和收获：红酵母细胞接种于YPD发酵培养基，培养基组成为：酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％(含或不含以表面活性剂溶解的底物)，自然pH，110℃灭菌15分钟，冷却后接种，接种量10％，30℃，摇瓶转速180rpm，培养24～36小时，分别作为种子及发酵培养液。其中发酵培养液经4000rpm离心收集细胞，无菌水洗涤两遍后离心收集细胞，以收集到的细胞作为生物催化剂。
微生物转化：将表面活性剂Triton X-114(以下以TX-114表示)和Triton X-45(以下以TX-45表示)或Triton X-100(以下以TX-100表示)以一定比例混合，然后将此混合物按照一定比例加入至纯水中，组成浊点系统。在此系统中加入一定量的细胞作为生物催化剂后，再按照一定比例加入底物3，5-双三氟甲基苯乙酮，构成转化系统。将此转化系统按照10ml/50ml比例装入磨口带塞三角瓶，于30℃，180rpm摇床上进行转化。
产物分离及分析：转化24小时后，取出三角瓶，将转化系统于12000rpm离心15分钟，下层细胞弃去或进行循环转化使用，上清溶液转移至带塞玻璃试管，于水浴中缓慢升高温度，试管中溶液由澄清透明逐渐浑浊，进而分为界限清晰的两层，上层为稀相，下层为富集相。用微量移液器小心吸取上层稀相弃去，下层富集相直接进行HPLC检测。
以下实施例中凡为注明具体实施条件的，均按照以上具体条件实施。
实施例1
YPD发酵培养基100ml中加入底物20μl，混匀后接种已培养24小时的种子液，放入摇床培养36小时后，收获细胞2.1g。
实施例2
YPD发酵培养基100ml中加入底物20μl及TX-11410ml，混匀后接种已培养24小时的种子液，放入摇床培养36小时后，收获细胞4.6g。
实施例3
YPD发酵培养基100ml中加入底物600μl，混匀后接种已培养24小时的种子液，放入摇床培养36小时后，收获细胞1.8g。
实施例4
YPD发酵培养基100ml中加入底物800μl及TX-114 10ml，混匀后接种已培养24小时的种子液，放入摇床培养36小时后，收获细胞3.3g。
实施例5
YPD发酵培养基30ml中加入及TX-114和TX-45共3ml(TX-114∶TX-45＝9∶1)，混匀后接种已培养24小时的种子液，放入摇床培养36小时后，收获细胞0.858g。
实施例6
YPD发酵培养基30ml中加入及TX-114和TX-100共3ml(TX-114∶TX-100＝9∶1)，混匀后接种已培养24小时的种子液，放入摇床培养36小时后，收获细胞1.265g。
实施例7
细胞浓度为1g/10ml转化体系，底物3，5-双三氟甲基苯乙酮浓度为40μl/10ml，表面活性剂TX-114和TX-100的混合物(TX-114∶TX-100＝9∶1)，浓度为10％(v/v)，转化24小时，底物转化率94.5％，产物浓度3.46mg/ml。
实施例8
细胞浓度为1g/10ml转化体系，底物3，5-双三氟甲基苯乙酮浓度为60μl/10ml，表面活性剂TX-114和TX-100的混合物(TX-114∶TX-100＝5∶5)，浓度为10％(v/v)，转化24小时，底物转化率80％，产物浓度3.54mg/ml。
实施例9
细胞浓度为1g/10ml转化体系，底物3，5-双三氟甲基苯乙酮浓度为60μl/10ml，表面活性剂TX-114和TX-100的混合物(TX-114∶TX-100＝5∶5)，浓度为10％(v/v)，转化24小时，底物转化率80％，产物浓度3.54mg/ml。
Claims (6)
1.一种以酵母静息细胞在浊点系统中对潜手性酮进行不对称还原生产光学活性醇的方法，该方法是采用一种或一种以上非离子表面活性剂溶液形成浊点系统，作为生物转化的介质。具体步骤包括：
(1)将酵母细胞进行培养、发酵，获得湿菌体直接作为生物催化剂；
(2)以潜手性酮作为转化底物；
(3)将(1)获得的湿菌体加入浊点系统溶液，再加入底物进行转化，生成相应的光学活性醇；
(4)转化结束后，转化液离心除去细胞，上清置于水浴中，缓慢升高水浴温度直至溶液由均相逐渐浑浊、继而分层并形成稳定共存的两相：上层稀相及下层凝聚相。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(1)中酵母发酵的培养基为YPD培养基，其中可加入浓度为0.02-1％的底物以及1-10％的表面活性剂进行驯化以增强细胞对底物和产物的耐受性及转化活性。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(3)中转化方法采用一种或一种以上表面活性剂形成浊点系统，并添加至转化系统中，作为生物转化的介质。表面活性剂浓度为1-10％，其中表面活性剂为Triton X-114或Triton X-114∶Triton X-100＝9∶1-1∶9，或Triton X-114∶Triton X-45＝9∶1-1∶9。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(3)中转化方法中底物浓度为2-12μl/ml。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(4)凝聚相可直接取样进行HPLC检测。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述的静息细胞在多种底物的转化过程中可进行多次循环使用。
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