CN102168041B - 恶臭假单胞菌zjb09102及其在制备环氧氯丙烷中的应用 - Google Patents

恶臭假单胞菌zjb09102及其在制备环氧氯丙烷中的应用 Download PDF

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本发明提供了一株能够催化脱卤反应的恶臭假单胞菌ZJB09102及其在制备环氧氯丙烷中的应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2010273，保藏日期：2010年10月24日。本发明的有益效果主要体现在：本发明微生物菌株恶臭假单胞菌ZJB09102具有很强的脱卤反应的能力；利用该菌株生产环氧氯丙烷，1，3-二氯-2-丙醇的转化率达到50％～90％(即1摩尔的1，3-二氯-2-丙醇能转化为0.50～0.90摩尔的环氧氯丙烷)，；而且生产过程不使用化学催化剂，具有绿色环保的特点，适用于环氧氯丙烷的工业化生产。

Description

恶臭假单胞菌ZJB09102及其在制备环氧氯丙烷中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一株能够催化脱卤反应的恶臭假单胞菌ZJB09102及其在制备环氧氯丙烷中的应用。
(二)背景技术
环氧氯丙烷是一种无色、透明、油状液体，有与氯仿、醚相似的刺激性气味，它易挥发、不稳定的液体，沸点为117.9℃，微溶于水(20℃时溶解度为7.04g)，易溶于酒精，乙醚，苯等有机溶剂，可与多种有机液体形成共沸物，并有毒性和麻醉性。是用于生产环氧树脂、氯醇橡胶、硝化炸药、玻璃钢、电绝缘制品的主要原料；也可用于生产胶黏剂、阳离子交换树脂等、作增塑剂、稳定剂、表面活性剂、医药以及纤维素酯、纤维素醚和树脂的溶剂等。环氧氯丙烷的生产方法主要有丙烯高温氯化法，醋酸丙烯酯法，1，3-二氯-2-丙醇氯化法等方法。虽然化学法是目前环氧氯丙烷的主要生产方法，但是其主要的弊端是环境污染大，对生产设备的要求相对较高。生物法由于具有反应条件温和，污染小等优点，越来越受到人们的重视。目前以1，3-二氯-2-丙醇为底物，采用生物法进行脱卤生产环氧氯丙烷的研究未见文献报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种能够催化脱卤反应的新菌株——恶臭假单胞菌ZJB09102及其在制备环氧氯丙烷中的应用。
本发明采用的技术方案是：
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZJB09102，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo：M 2010273，保藏日期：2010年10月24日。
该菌株菌落形态如下：呈圆形光滑状、湿润、不透明、边缘整齐、浅白色、不易挑取；光学显微镜观察发现细胞形态：短杆状，有鞭毛。生理生化指标为：革兰氏阴性菌，氧化酶反应呈阳性，V-P试验及甲基红试验呈阴性。
根据以上微生物学特征，这新的菌株被鉴定恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，不属于己公开专利菌种的任何一种，该微生物菌株具有将1，3-二氯-2-丙醇转化为环氧氯丙烷的能力，可以用于环氧氯丙烷的生产。
本发明还涉及所述的恶臭假单胞菌ZJB09102在微生物催化1，3-二氯-2-丙醇制备环氧氯丙烷中的应用。1，3-二氯-2-丙醇是一种广泛应用工业化学品原料，经过微生物脱卤酶催化反应，得到环氧氯丙烷。应用时，可将菌种接种至含底物1，3-二氯-2-丙醇的培养基中进行发酵，发酵液经分离纯化获得环氧氯丙烷；或者将菌种接种至不含1，3-二氯-2-丙醇的培养基中进行发酵，在发酵过程中流加灭菌后的1，3-二氯-2-丙醇溶液，发酵产物经分离纯化得到环氧氯丙烷。
具体的，所述应用为：在适用恶臭假单胞菌属的发酵培养基中，添加底物1，3-二氯-2-丙醇进行发酵培养，发酵培养结束后，发酵液进行分离纯化得到所述环氧氯丙烷。
所述底物1，3-二氯-2-丙醇初始添加量为2～20g/L培养基，在发酵培养开始后0～24小时添加，可直接将底物添加到发酵培养基中，也可在发酵进行后往培养基中流加底物溶液。
所述发酵培养在20～40℃下进行，发酵培养总时间48～96小时。优选在28℃～35℃、pH7.0下培养48小时左右。
所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖：1～5％，酵母粉：0.1％～2.5％，蛋白胨：0.1％～2.5％，(NH4)2SO4：0.1％～2.5％，KaH2PO4·2H2O：0.1％～0.5％，MgSO4：0.01％～0.05％，余量为水，pH值4.0～7.0。培养基浓度以质量/体积百分比(w/v)表示，某组分浓度为1％表示每100mL溶液中含有1g该组分。
所述分离纯化方法可按常规方法进行，本领域普通技术人员可根据产物环氧氯丙烷性质进行设定，本发明中产物分离纯化方法如下：将发酵液进行固液分离得到上清液，加入等量乙酸乙酯进行萃取，取有机相进行蒸馏去除溶剂，得到环氧氯丙烷。
具体的，所述应用方法如下：
(1)种子培养基灭菌、接种恶臭假单胞菌ZJB09102，摇床转速150r/min、28℃下培养24小时获得种子液；所述种子培养基终浓度组成：葡萄糖：1～5％，酵母粉：0.1％～2.5％，蛋白胨：0.1％～2.5％，(NH4)2SO4：0.1％～2.5％，KaH2PO4·2H2O：0.1％～0.5％，MgSO4：0.01％～0.05％，余量为水，pH值4.0～7.0；所述种子培养基组成也可与发酵培养基相同；
(2)种子液以1～10％体积比接种至灭菌后的发酵培养基，摇床转速150r/min、28℃下培养72小时获得发酵液；1，3-二氯-2-丙醇：0.2～2％，葡萄糖：1～5％，酵母粉：0.1％～2.5％，蛋白胨：0.1％～2.5％，(NH4)2SO4：0.1％～2.5％，KaH2PO4·2H2O：0.1％～0.5％，MgSO4：0.01％～0.05％，余量为水，pH值4.0～7.0；
(3)发酵液离心，取上清液加入等量乙酸乙酯进行萃取，取有机相进行蒸馏去除溶剂，得到环氧氯丙烷。
本发明中，环氧氯丙烷的分析方法可采用气相色谱进行：
环氧氯丙烷气相色谱分析方法：将一定量发酵液12000rpm，离心10min，取上清液进行微滤，进行GC检测。使用Agilent 6890气相色谱仪，色谱柱为FFAP毛细管柱(30.0m×250μm×0.33μm)。气相色谱条件：前进样口190℃，FID检测器220℃；分流比10∶1；氢气流量40.0ml/min，空气流量400ml/min，尾气(氮气)流量35.0ml/min；升温柱箱初始温度90℃，保持4.5min，15℃/min升到150℃，保持3.5min。
本发明的有益效果主要体现在：本发明微生物菌株恶臭假单胞菌ZJB09102具有很强的脱卤反应的能力；利用该菌株生产环氧氯丙烷，1，3-二氯-2-丙醇的转化率达到50％～90％，(即1摩尔的1，3-二氯-2-丙醇能转化为0.50～0.90摩尔的环氧氯丙烷)；而且生产过程不使用化学催化剂，具有绿色环保的特点，适用于环氧氯丙烷的工业化生产。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
培养基配方(w/v)：1，3-二氯-2-丙醇：0.5％，酵母粉：0.1％，蛋白胨：0.1％，(NH4)2SO4：0.1％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.01％，用自来水配制，用HCl溶液将pH调到5.0，灭菌备用。
取100mL上述培养基，平均分装在2个250mL三角瓶中，灭菌，接入恶臭假单胞菌ZJB09102(CCTCC No：M 2010273)，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养24h作为种子液。
取2L上述培养基，平均分装入40个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，以体积比1.5％的接种量接入种子液，进行培养，培养温度为20℃，摇床转速150r/min，培养时间为72h，1，3-二氯-2-丙醇转化成环氧氯丙烷的转化率为88％。
收集上述发酵液1.5L，经过离心(10000×g，10min)之后，上清液中加入等量的乙酸乙酯，萃取后进行蒸馏去除溶剂，得到3.86g环氧氯丙烷。
实施例2：
培养基配方：1，3-二氯-2-丙醇：0.2％，酵母粉：2.5％，蛋白胨：0.5％，(NH4)2SO4：0.1％，NaH2PO4·2H2O：0.5％，MgSO4：0.05％，用自来水配制，用NaOH溶液将pH调到7.0，灭菌备用。
取500mL培养基，平均分装在10个500mL三角瓶中，灭菌，接入恶臭假单胞菌ZJB09102，进行培养，培养温度为28℃，培养时间为50h，反应在搅拌、通风、振荡条件下进行，摇床转速200r/min。1，3-二氯-2-丙醇转化成环氧氯丙烷的转化率为90％。
收集上述发酵液400mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到0.52克环氧氯丙烷。
实施例3：
发酵培养基配方：1，3-二氯-2-丙醇：2％，酵母粉：2.5％，蛋白胨：2.5％，(NH4)2SO4：2.5％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.05％，用自来水配制，用NaOH溶液将pH调到7.0，灭菌备用。
种子培养基配方：酵母粉：2.5％，蛋白胨：2.5％，(NH4)2SO4：2.5％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.05％，，用自来水配制，用NaOH溶液将pH调到7.0，灭菌备用。
取100mL种子培养基，平均分装在2个500mL三角瓶中，灭菌，接入恶臭假单胞菌ZJB09102，培养菌体，摇床转速200r/min，在30℃摇床培养24h作为种子液，备用。
取4L发酵培养基，平均分装在80个500mL三角瓶中，灭菌。接入种子液，以体积比2.0％的接种量接入种子液，进行培养，培养温度为30℃，培养时间为72h，反应在搅拌、通风、振荡条件下进行，摇床转速200r/min。1，3-二氯-2-丙醇转化成环氧氯丙烷的转化率为50％。
收集上述发酵液3.5L，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到36.1g环氧氯丙烷。
实施例4
培养基配方：1，3-二氯-2-丙醇：1.0％，酵母粉：0.5％，蛋白胨1.0％，(NH4)2SO4：1.0％，NaH2PO4·2H2O：0.5％，MgSO4：0.03％，用自来水配制，pH 7.0，灭菌备用。
取200mL上述培养基，平均分装在4个250mL三角瓶中，灭菌，接入恶臭假单胞菌ZJB09102，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养24h作为种子液，备用。
在10L发酵罐中加入上述培养基7.0L，灭菌，接入种子液100mL，28℃下进行发酵培养。
在接种后，随即开始流加1，3-二氯-2-丙醇，流加速度0.04mL/min，总共流加140mL1，3-二氯-2-丙醇(浓度为98％，v/v)。在培养温度30℃，通气量5L/min，搅拌速度300r/min，培养72h结束。1，3-二氯-2-丙醇转化成环氧氯丙烷的转化率为90％。
收集上述发酵液6L，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到69.3克环氧氯丙烷。
实施例5：
培养基配方：1，3-二氯-2-丙醇：2.0％，酵母粉：2.5％，蛋白胨：1.0％，(NH4)2SO4：1.0％，NaH2PO4·2H2O：0.5％，MgSO4：0.03％，用自来水配制，pH6.5，灭菌备用。
取200mL上述培养基，平均分装在4个500mL三角瓶中，灭菌，接入恶臭假单胞菌ZJB09102，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养24h作为种子液，备用。
在10L发酵罐中加入上述培养基7L，灭菌，接入种子液100mL，28℃下进行发酵培养。
在菌体发酵24h后，进行流加1，3-二氯-2-丙醇，流加速度0.07mL/min；总共流加1，3-二氯-2-丙醇180mL(浓度为98％，v/v)，培养温度28℃，通气量5L/min，搅拌速度300r/min，共培养72h。1，3-二氯-2-丙醇转化成环氧氯丙烷的转化率为82％。
收集上述发酵液7L，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到140.7g环氧氯丙烷。

Claims (8)

1.恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZJB09102，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2010273，保藏日期：2010年10月24日。
2.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌ZJB09102在微生物催化1，3-二氯-2-丙醇制备环氧氯丙烷中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：在适用恶臭假单胞菌属的发酵培养基中，添加底物1，3-二氯-2-丙醇进行发酵培养，发酵培养结束后，发酵液进行分离纯化得到所述环氧氯丙烷。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物1，3-二氯-2-丙醇初始添加量为2～20g/L培养基，在发酵培养开始后0～24小时添加。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养在20～40℃下进行，发酵培养总时间48～96小时。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖：1～5％，酵母粉：0.1％～2.5％，蛋白胨：0.1％～2.5％，(NH4)2SO4：0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O：0.1％～0.5％，MgSO4：0.01％～0.05％，余量为水，pH值4.0～7.0。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述分离纯化为：将发酵液进行固液分离得到上清液，加入等量乙酸乙酯进行萃取，取有机相进行蒸馏去除溶剂，得到环氧氯丙烷。
8.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：
(1)种子培养基灭菌、接种恶臭假单胞菌ZJB09102，摇床转速 150r/min、28℃下培养24小时获得种子液；所述种子培养基终浓度组成：葡萄糖：1～5％，酵母粉：0.1％～2.5％，蛋白胨：0.1％～2.5％，(NH4)2SO4：0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O：0.1％～0.5％，MgSO4：0.01％～0.05％，余量为水，pH值4.0～7.0；
(2)种子液以1～10％体积比接种至灭菌后的发酵培养基，摇床转速150r/min、28℃下培养72小时获得发酵液；1，3-二氯-2-丙醇：0.2～2％，葡萄糖：1～5％，酵母粉：0.1％～2.5％，蛋白胨：0.1％～2.5％，(NH4)2SO4：0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O：0.1％～0.5％，MgSO4：0.01％～0.05％，余量为水，pH值4.0～7.0；
(3)发酵液离心，取上清液加入等量乙酸乙酯进行萃取，取有机相进行蒸馏去除溶剂，得到环氧氯丙烷。 
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