CN102168036B - 微生物转化制备r-4-氯-3-羟基丁酸酯和s-3-羟基丁内酯及菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株筛选到的能够催化合成R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯的新菌株——巨大芽孢杆菌WZ009及其应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2010171，保藏日期：2010年7月8日。本发明的有益效果主要体现在：提供了一种具有高立体选择性、高酶活性的新菌株，通过该菌株菌体的不对称转化同时得到R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯两种手性中间体，该反应专一性强，大大降低了生产成本，产物分离简单，环境污染小，适合工业化生产。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种微生物转化制备R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯，以及筛选到的可用于催化该反应的新菌株。
(二)背景技术
4-氯-3-羟基丁酸乙酯是一种重要的有机中间体，分子中有多功能基团，其手性单一对映异构体(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是非常有前景的重要的手性砌块，还可经由氯基的置换、还原等反应，导入其他基团生成所需的手性药物中间体，可用于合成L-肉碱、大内酰亚胺和(R)-γ-氨基-β-丁酸，还可以转化生成(+)-负霉素和手性2，5-环己二烯酮的合成子。
S-3-羟基丁内酯是降血脂药物阿托伐他汀、HIV蛋白酶抑制剂氨普那韦、饱感剂(2S，4S)-2-羟基-4-羟甲基-4-丁内酯、治疗皮肤病药羟基二十碳四烯酸、抗癌药aplysistatin等关键中间体。
R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的化学结构为：
S-3-羟基丁内酯的化学结构为：
这两种手性中间体，已经成研究热点。利用生物催化法制备R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯具有反应条件温和，立体选择性高，环境友好等优点，目前文献报道的手性4-氯-3-羟基丁酸酯制备方法主要有以下几种：
日本Suzuki等(Suzuki T，Idogaki H，Kasai N.Dual production of highlypure methyl(R)-4-chloro-3-hydroxybutyrate and(S)-3-hydroxy-γ-butyrolactone with Enterobacter sp.[J].Enzyme and Microbial Technology，1999，24：13-20)筛选到一株肠杆菌Enterobacter DS-S-75，对外消旋4-氯-3-羟基丁酸甲酯进行不对称转化，可以同时得到e.e.大于99％的(R)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯和e.e.为95.9％的(S)-3-羟基-γ-丁内酯，两个对映体的收率均达到48％。
Hoff等(Hoff B，Anthonsen T.Lipase-catalyzed resolution of esters of4-chloro-3-hydroxybutanoic acid：effects of the alkoxy group and solvent onthe enantiomeric ratio[J].Tetrahedron：Asymmetry，1999，10(7)：1401-1412.)在溶剂苯中，以丙酸乙烯酯为酰基供体，Rhizomucor miehie脂肪酶催化4-氯-3-羟基丁酸乙酯不对称转酯化，较成功地拆分了4-氯-3-羟基丁酸乙酯，两个对映体的光学纯度均大于85％e.e.。
金勇(金勇，吴坚平，徐刚，等.有机相酶催化氨解反应拆分制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[J].有机化学，2006，26(10)：1384-1388.)用商品化的脂肪酶Novazym435，以二氧六环作溶剂，利用氨基甲酸铵缓慢分解持续释放NH3，不对称氨解拆分4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
敬科举等(敬科举.双重组菌耦合不对称还原生产(R)-或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究[D].浙江大学博士论文，2005.)分别从褚色掷抱酵母和木兰假丝酵母中克隆得到醛基还原酶基因(ALR)和碳基还原酶基因(CAR)，并分别将它们构建到大肠杆菌中，获得了重组菌。用这两个重组菌催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原，分别得到单一手性的(R)-和(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，e.e.值均为100％。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一株筛选到的能够催化合成R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯的新菌株——巨大芽孢杆菌WZ009，以及利用该菌株所含的酯水解酶不对称转化外消旋4-氯-3-羟基丁酸酯制备R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯的方法。
本发明采用的技术方案是：
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)WZ009，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCCNO：M 2010171，保藏日期：2010年7月8日。
本发明巨大芽孢杆菌WZ009的菌落特征如下：30℃培养培养2～3d，牛肉膏蛋白胨平板培养基下菌落形态，圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明的白色菌落。显微镜下观察，长约1.5μm-3.0μm，宽0.7μm-1.0μm，短杆状。革兰氏染色呈阳性。
本发明巨大芽孢杆菌WZ009的16S rDNA序列如下：AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAAC
本发明所涉及的微生物是通过以下的程序筛选得到的：
样品采集：脂肪酶具有分解油脂的特性，故从含油脂丰富的地点采集土样。分别从山东、江西、浙江等地含油丰富的地点采集土样采集样品60份。
富集培养：称取土样1g加入20mL蒸馏水中，摇匀，静置，取上层液体1mL于50mL富集培养基中，30℃、200r/min培养2d。取1mL第一次富集液加入50mL新鲜富集培养基中，同样条件进行第二次富集培养。如此重复3次。富集培养基组分：外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯0.5％，酵母浸膏0.2％，K2HPO4 0.1％，MgSO4 0.01％，NaCl 0.15％，pH 7.0。本发明培养基组成均以质量体积百分比(w/v)表示，某组分浓度1％表示100mL培养基中含有1g该组分。
平板初筛：将富集液用无菌水梯度稀释，涂布于选择性平板(每平板含平板初筛培养基约15mL)上，30℃培养2～4d。产脂肪酶或酯酶的菌株会水解CHBE，而使培养基产生黄色透明圈，菌株中酶的活性越高产生的透明圈越大。平板上陆续出现黄色水解圈，将透明圈外径与菌落直径之比相对较大的单菌落挑至斜面保存培养基上，30℃培养2d，保存于4℃冰箱。
将斜面的菌落接种到发酵培养基，其组分如下：牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，蔗糖0.5％，MgSO4 0.05％，pH＝7.0，121℃灭菌20min。30℃发酵24h～48h，离心后悬浮在缓冲液体系中。
按照上述方法得到的湿菌体，悬浮在缓冲液体系中，加入外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯进行转化，反应1h-24h后，用手性气相色谱法检测产物和底物的含量和光学纯度。
4-氯-3-羟基丁酸乙酯对映体过量值的测定条件：
载气：He，柱箱：初始温度75℃，2℃/min升温至155℃进样口：进样量1μL，分流比1∶100，温度220℃，检测器：FID，温度220℃。R型、S型对映体出峰时间分别为36.86min、37.12min。
3-羟基-γ-丁内酯对映体过量值的测定条件：
载气：He，柱箱：初始温度140℃，3℃/min升温至210℃，保温25min，进样口：进样1μL，分流比1∶20，温度220℃，检测器：FID，220℃。R型、S型对映体出峰时间分别为35.77min、34.97min。
本发明还涉及所述的巨大芽孢杆菌WZ009在微生物转化制备R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯中的应用。
具体的，所述应用为：以式(I)所示的外消旋4-氯-3-羟基丁酸酯为底物，以巨大芽孢杆菌WZ009含酶菌体细胞为催化剂，在pH6.5～7.5反应体系中，于20～50℃下反应1～24h，反应结束后反应液经分离纯化得到式(II)所示的R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯(III)；所述催化剂可以巨大芽孢杆菌WZ009湿菌体形式参与反应，也可经冻干制成菌粉参与反应，也可以经纯化制成酶制品后参与反应。
式(I)、(II)中，R为C1～C4的烷基。
优选的，所述反应在pH6.5～7.5的磷酸盐缓冲液中进行。
或者，所述反应在水/正己烷两相反应体系中进行，水和正己烷体积比为1∶1。
或者，所述反应以蒸馏水为反应溶剂，反应过程中用0.01M～0.2M氢氧化钠或氨水滴定调控反应体系保持为pH7.0±0.2。
优选的，所述底物为外消旋4-氯-3-羟基丁酸甲酯或外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
优选的，所述反应体系中：底物初始浓度为10～200mmol/L，催化剂为巨大芽孢杆菌WZ009冻干菌粉、添加量为10～100g/L。。
所述反应优选在25～35℃、摇床转速100～300rpm下进行，反应时间10～24h。
优选的，所述底物为外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯时，所述分离纯化方法如下：反应结束后，离心去除菌体，取上清液用等体积乙酸乙酯萃取分离，得到含有R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和S-3-羟基丁内酯的有机相，无水硫酸钠干燥，过滤后取滤液进行减压蒸馏，先除去溶剂，收集90～100℃(5mmHg)馏分得到R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，剩余的馏分(130～140℃(5mmHg))为S-3-羟基丁内酯。
本发明巨大芽孢杆菌WZ009菌体可反复使用，反复使用达到5次后，酶活力仍然保持原来的80％以上。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种具有高立体选择性、高酶活性的新菌株，通过该菌株菌体的不对称转化同时得到R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯两种手性中间体，该反应专一性强，大大降低了生产成本，产物分离简单，环境污染小，适合工业化生产。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：巨大芽孢杆菌WZ009的培养条件
巨大芽孢杆菌WZ009(CCTCC NO：M 2010171)的发酵培养基组成：葡萄糖0.72％、酵母膏0.70％、CaCl2 0.125％，初始pH6.50。
巨大芽孢杆菌WZ009以此培养基在接种量1.25％、50mL装液量/250mL摇瓶、温度30℃、摇床转速200rpm的条件下培养12小时。将发酵液离心(8000rpm、10min)，弃上清液，用蒸馏水洗2次后，收集菌体。菌体冻干后研磨成细粉制成干菌粉，作为生物催化剂。
酶活力单位定义：在所述的水解反应条件下，每分钟催化生成1μmolS型对映体的酶量，定义为1个酶活力单位(U)。
实施例2：缓冲液类型对巨大芽孢杆菌WZ009拆分外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯的影响
50ml三角瓶中先后加入0.2mol/L pH7.0缓冲液(表1中缓冲液pH和浓度为相同值)20mL、4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)100mmol、巨大芽孢杆菌WZ009冻干菌粉5g/L，放入水浴摇床200rpm，30℃，待反应进行反应12h后，离心除去菌体，得上清液。上清液用20mL乙酸乙酯萃取三次后，合并有相机，有机相加入1g无水NaSO4干燥，过滤后进行气相色谱分析转化率与对映体过量值。由表1得出其中巨大芽孢杆菌WZ009胞内酶在磷酸缓冲液中具有最高的催化活性和对映体选择率。
表1：缓冲液类型对酶活性的影响
| 缓冲液类型 | eep(％) | c(％) |
| 磷酸缓冲液 | 95.1 | 48.5 |
| 巴比妥钠-盐酸缓冲液 | 87.8 | 41.1 |
| Tris-HCl缓冲液 | 85.1 | 45.8 |
| 硼酸缓冲液 | 81.2 | 42.1 |
| 柠檬酸缓冲液 | 85.1 | 46.7 |
实施例3：缓冲液pH对巨大芽孢杆菌WZ009拆分外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯的影响
以100mmol/L浓度添加底物外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯，采用0.2mol/L不同pH磷酸盐缓冲液体系，巨大芽孢杆菌wz009冻干菌粉5g/L，放入水浴摇床200rpm，30℃，待反应进行反应5h后，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取三次后，合并有相机，有机相加入1g无水NaSO4干燥，过滤后进行气相色谱分析转化率与对映体过量值。结果如表2。菌体在pH范围6.8～7.2之间都有较好的立体选择性，因此反应体系的pH优选7.2。
表2：pH对巨大芽孢杆菌WZ009拆分外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯的影响
| 缓冲液pH | eep(％) | c(％) |
| 6.2 | 88.2 | 26.1 |
| 6.4 | 83.6 | 37.6 |
| 6.6 | 90.8 | 41.8 |
| 6.8 | 95.4 | 47.2 |
| 7.0 | 98.2 | 49.2 |
| 7.2 | 99.1 | 50.6 |
| 7.4 | 92.9 | 48.3 |
| 7.6 | 89.1 | 43.5 |
实施例4：不同底物浓度对巨大芽孢杆菌WZ009拆分外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯的影响
加入不同底物浓度，按照实施例2条件进行反应，得出结果表4。由表3得出随着底物浓度的增加，转化逐步降低，导致底物e.e.的下降，因此确定100mmol/L作为底物浓度。
表3：底物浓度对巨大芽孢杆菌WZ009拆分外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯的影响
| 底物浓度 | eep(％) | c(％) |
| (mmol/L) | ||
| 10 | 99.9 | 52.1 |
| 50 | 99.8 | 51.4 |
| 80 | 99.4 | 50.2 |
| 100 | 99.1 | 50.6 |
| 150 | 81.2 | 45.2 |
| 200 | 60.2 | 40.5 |
| 300 | 42.3 | 30.5 |
实施例5：菌体添加量对巨大芽孢杆菌WZ009拆分外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯的影响
加入不同添加量的巨大芽孢杆菌WZ009冻干菌粉，按照实施例2条件进行反应。由表4可知，综合考虑转化率和底物对映体过量值两因素，确定脂肪酶的适宜浓度为5～10g/L。
表4：菌体添加量对巨大芽孢杆菌WZ009拆分外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯的影响
| 菌体添加量(g/L) | eep(％) | c(％) |
| 1 | 49.8 | 35.4 |
| 2 | 80.9 | 45.2 |
| 5 | 99.1 | 50.6 |
| 10 | 99.4 | 50.8 |
| 15 | 99.6 | 51.0 |
| 20 | 99.8 | 51.5 |
实施例6：巨大芽孢杆菌WZ009拆分外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯的反应进程
50ml三角瓶中先后加入磷酸缓冲液(pH7.2)20mL、CHBE 100mmol、巨大芽孢杆菌WZ009冻干菌粉5g/L，放入水浴摇床200rpm，30℃条件下，对反应体系不同时间下取样，进行气相色谱分析转化率与对映体过量值分析。由表5可知，因此确定12h作为适宜反应时间。
表5：反应时间对巨大芽孢杆菌WZ009拆分外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯的影响
| 反应时间(h) | eep(％) | c(％) |
| 1 | 15.8 | 15.4 |
| 2 | 33.9 | 25.2 |
| 5 | 79.1 | 40.6 |
| 10 | 99.0 | 49.8 |
| 12 | 99.6 | 50.6 |
| 15 | 99.5 | 52.4 |
| 24 | 99.8 | 53.5 |
实施例7：巨大芽孢杆菌WZ009反复分批催化拆分外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯
根据上述的实验条件下，用同一批菌体重复进行该水解反应。通过酶的重复利用可以考察酶的失活情况。由表6可知，重复利用8次，具体的酶活力保持80％以上。
表6：巨大芽孢杆菌WZ009重复利用次数对酶活力的影响
实施例8：底物产物的分离提取
50ml三角瓶中先后加入0.2mol/LpH7.2磷酸缓冲液20mL、CHBE100mmol、巨大芽孢杆菌WZ009冻干菌粉5g/L，放入水浴摇床200rpm，30℃条件下，反应12h。反应结束后，通过离心得到上清液，加入等量乙酸乙酯萃取三次后合并有相机，旋转蒸发仪除出溶剂乙酸乙酯，再根据底物R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(沸点：93℃/5mmHg)和产物S-3-羟基-γ-丁内酯(沸点：135℃/5mmHg)的沸点不同，进行减压蒸馏，收集90～100℃(5mmHg)馏分得到R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯e.e.99.5％，收集130～140℃(5mmHg)馏分得到S-3-羟基-γ-丁内酯e.e.95.2％，两者收率90.1％以上。
实施例9：
50ml三角瓶中先后加入0.2mol/LpH7.2磷酸缓冲液20mL、4-氯-3-羟基丁酸甲酯(CHBM)100mmol、巨大芽孢杆菌WZ009冻干菌粉5g/L，放入水浴摇床200rpm，30℃条件下，反应12h。反应结束后，通过离心得到上清液，加入等量乙酸乙酯萃取三次后合并有相机，旋转蒸发仪除出溶剂乙酸乙酯，再根据底物R-4-氯-3-羟基丁酸甲酯(沸点：87℃/5mmHg)和产物S-3-羟基-γ-丁内酯(沸点：135℃/5mmHg)的沸点不同，进行减压蒸馏，收集85～95℃(5mmHg)馏分得到R-4-氯-3-羟基丁酸甲酯e.e.99.8％，收集130～140℃(5mmHg)馏分得到S-3-羟基-γ-丁内酯e.e.95.6％，两者收率91.2％以上。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 微生物转化制备R-4-氯-3-羟基丁酸酯和 S-3-羟基丁内酯及菌株
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 1512
<212> DNA
<213> Bacillus megaterium
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
gaactgatta gaagcttgct tctatgacgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc 120
aacctgcctg taagactggg ataacttcgg gaaaccgaag ctaataccgg ataggatctt 180
ctccttcatg ggagatgatt gaaagatggt ttcggctatc acttacagat gggcccgcgg 240
tgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcatag ccgacctgag 300
agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta 360
gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggct 420
ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa gaacaagtac gagagtaact gctcgtacct 480
tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540
ggtggcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc 600
tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc 660
agaagagaaa agcggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac 720
cagtggcgaa ggcggctttt tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc 780
aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg 840
gtttccgccc tttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg 900
caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960
attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac tctagagata 1020
gagcgttccc cttcggggga cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc 1080
gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattt 1140
agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1200
atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt acaaagggct 1260
gcaagaccgc gaggtcaagc caatcccata aaaccattct cagttcggat tgtaggctgc 1320
aactcgccta catgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata 1380
cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc 1440
ggtggagtaa ccgtaaggag ctagccgcct aaggtgggac agatgattgg ggtgaagtcg 1500
taacaaggta ac 1512
Claims (10)
1.巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)WZ009，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCCNO：M 2010171，保藏日期：2010年7月8日。
2.如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌WZ009在微生物转化制备R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以式(I)所示的外消旋4-氯-3-羟基丁酸酯为底物，以巨大芽孢杆菌WZ009含酶菌体细胞为催化剂，在pH6.5～7.5反应体系中，于20～50℃下反应1～24h，反应结束后反应液经分离纯化得到式(II)所示的R-4-氯-3-羟基丁酸酯和S-3-羟基丁内酯；
式(I)、(II)中，R为C1～C4的烷基。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应在pH6.5～7.5的磷酸盐缓冲液中进行。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应在水/正己烷两相反应体系中进行，水和正己烷体积比为1∶1。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应以蒸馏水为反应溶剂，反应过程中用0.01M～0.2M氢氧化钠或氨水滴定调控反应体系保持为pH7.0±0.2。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物为外消旋4-氯-3-羟基丁酸甲酯或外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应体系中：底物初始浓度为10～200mmol/L，催化剂为巨大芽孢杆菌WZ009冻干菌粉、添加量为10～100g/L。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应在25～35℃、摇床转速100～200r/min下进行，反应时间10～24h。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述底物为外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯，所述分离纯化方法如下：反应结束后，离心去除菌体，取上清液用等体积乙酸乙酯萃取分离，得到含有R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和S-3-羟基丁内酯的有机相，无水硫酸钠干燥，过滤后取滤液进行减压蒸馏，先除去溶剂，收集5mmHg压强下的90～100℃馏分得到R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，收集5mmHg压强下的130～140℃馏分得到S-3-羟基丁内酯。
Priority Applications (1)
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