CN102199546B

CN102199546B - 壤霉菌及其在水解制备（s）-环氧氯丙烷中的应用

Info

Publication number: CN102199546B
Application number: CN 201110075174
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 金火喜; 胡忠策; 壮晓健; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2011-03-28
Filing date: 2011-03-28
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2031-03-28
Also published as: CN102199546A

Abstract

本发明提供了一株用于手性环氧氯丙烷生产的新菌株——壤霉菌ZJB09106及其在微生物水解外消旋环氧氯丙烷制备(S)-环氧氯丙烷中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2010274，保藏日期：2010年10月24日。本发明的有益效果主要体现在：提供了一株新的手性环氧氯丙烷产生菌，利用该菌株生产手性环氧氯丙烷，生产过程不使用化学催化剂，具有绿色环保的特点，适用于环氧氯丙烷的工业化生产。

Description

壤霉菌及其在水解制备(S)-环氧氯丙烷中的应用

(一)技术领域

本发明涉及可用于手性环氧氯丙烷生产的新菌株——壤霉菌ZJB09106及其在微生物水解外消旋环氧氯丙烷制备(S)-环氧氯丙烷中的应用。

(二)背景技术

手性环氧氯丙烷是一种重要的有机合成关键中间体，用以制备多种高光学纯度药物中间体，如芳氧丙醇胺类药物、环戊酮的衍生物、抗真菌药(S)-霉康灵、阿伐他汀、L-肉碱等。手性环氧氯丙烷的生产方法有化学法和生物法。传统的化学合成法生产手性环氧氯丙烷因其反应剧烈、耗能大、设备贵、对映体过量值(e.e值)和得率低等缺点已基本被舍弃；新型化学合成法虽然在e.e值和得率上都取得重大成就，但仍然面临污染大，设备贵等缺点。生物催化转化合成手性环氧氯丙烷选择性较好，且环境友好，其途径主要有：(1)单加氧酶催化的烯烃直接不对称环化；(2)卤醇脱卤酶催化的邻氯醇脱卤反应；(3)亲核试剂介导，卤醇脱卤酶催化的外消旋环氧氯丙烷的非水解型动力学拆分；(4)环氧化物水解酶催化的外消旋环氧氯丙烷的水解型动力学拆分。

环氧化物水解酶(epoxide hydrolases，EHs)又称环氧化物水合酶(epoxide hydratase)，是一类在水分子存在下，能立体选择性拆分外消旋的环氧化物生成手性环氧化物和相应的1，2-二醇的酶。环氧化物水解酶由于其来源广泛，在动物、植物、微生物等生物体中都有存在；且其优良的对映体选择性和区域选择性以及不需要辅酶等特点使得环氧化物水解酶生产手性环氧氯丙烷途径得到很高的重视。

环氧氯丙烷是一类单取代型环氧化物，用环氧化物水解酶对其拆分的研究起步较晚。上世纪90年代初，Weijers等人成功利用来自Nocardia sp.的环氧化物水解酶立体选择性水解外消旋环氧氯丙烷。随后十几年，有大批学者相继用不同来源的环氧化物水解酶来拆分外消旋环氧氯丙烷，到目前为止，报道的能手性拆分外消旋环氧氯丙烷的菌株主要有Nocardia sp.、Xanthobacter、Rhodoturolaglutinis、Aspergillus niger、Agrobacteriunradiobacter、Bacillus megaterinm和Trichosporon loubierii。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株从土壤中筛选到能对映体选择性拆分外消旋环氧氯丙烷获得手性环氧氯丙烷的新的微生物菌株——壤霉菌(Agromyces sp.)ZJB09106及其在制备手性环氧氯丙烷中的应用。

本发明采用的技术方案是：

壤霉菌(Agromyces sp.)ZJB09106，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2010274，保藏日期：2010年10月24日。

该菌株菌落形态为：单菌落呈圆形，直径约1.5mm，边缘齿状，表面凸起，乳白色，透明，表面光滑，湿润；光学显微镜下观察细胞杆状，革兰氏染色呈阴性；接触酶阴性，氧化酶阴性，不还原硝酸盐，吲哚阴性，β-葡萄糖苷酶，L-脯氨酸芳胺酶，酪氨酸芳胺酶阳性。

该菌株16S-RNA鉴定结果为：

TGCTTACACATGCAAGTCGAACGATGAACTTGGAGCTTGCTCTGGGGGATTAG

TGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTGGACTCTGGGATAACT

TCGAGAAATCGGAGCTAATACCGGATAGGACCTTGCACCGCATGGTGTGGGGT

GGAAAGTTTTTCGGTTTGGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGT

AATGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCAC

ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATA

TTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGCGGGATGACGGCC

TTCGGGTTGTAAACCGCTTTTAGTAGGGAAGAAGCCTTCGGGTGACGGTACCT

GCAGAAAAAGGACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGG

TCCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGC

GTCTGCTGTGAAAACTAGAGGCTCAACCTCTAGCCTGCAGTGGGTACGGGCAG

ACTTGAGTGGTGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCA

GATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCACTTACTGACG

CTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA

CGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGATGTGGGGACCTTTCCACGGTTTCCGTGTCGT

AGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTC

AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGA

TGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACGAGAACGGGCCAGAA

ATGGTCAATTCTTTGGACACTCGTGAACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTC

GTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCGCATG

TTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCATGTGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGA

GGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCNCCTTATGTCTTGGGCTTCACG

CATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGTCGTAAGGCGGAGCGAATC

CCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGT

CGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGG

CCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGT

GGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGTGATTAGGACTA

AGTCGTAACA。

根据以上微生物学特征及16S-RNA分子鉴定结果，这新的菌株被鉴定为壤霉菌(Agromyces sp.)。这株微生物不属于上述已报道过的菌种中的任何一种，该微生物菌株具有手性拆分外消旋环氧氯丙烷的能力，可用于手性环氧氯丙烷的生产。

本发明还涉及所述的壤霉菌ZJB09106在微生物水解外消旋环氧氯丙烷制备(S)-环氧氯丙烷中的应用。在获得本发明菌株的前提下，可按本领域常规方法，利用该菌株产生的环氧化物水解酶催化外消旋环氧氯丙烷的水解反应，制备所述(S)-环氧氯丙烷。

具体的，所述应用为：以外消旋环氧氯丙烷为底物，加入壤霉菌ZJB09106经发酵获得的含酶菌体细胞作为催化剂，于28～35℃下进行水解反应2～10小时，反应结束后反应液分离纯化得到所述(S)-环氧氯丙烷。

优选的，所述水解反应在pH7.0～7.5的磷酸盐缓冲液中进行。或者，所述水解反应在环己烷(以环己烷为溶剂时，添加少量水即可)中进行。

具体的，所述含酶菌体细胞由如下方法获得：

(1)将壤霉菌ZJB09106接种至斜面培养基中，在30℃下培养至长出菌落，作为斜面种子；所述的斜面培养基按如下组成配制：牛肉膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，NaCl 5～15g/L，琼脂10～30g/L，溶剂为水，pH 6.0～7.0；

(2)将斜面菌种接种至摇瓶液体种子培养基，30℃、150rpm振荡培养20h，得到种子液；所述液体种子培养基组成如下：牛肉膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，NaCl 5～15g/L，溶剂为水，pH6.0～7.0；

(3)种子液以1～5％体积比接种至液体发酵培养基，25～37℃培养30～50h，培养液离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述液体发酵培养基组成如下：淀粉5～15g/L，酵母浸膏粉5～20g/L，牛肉膏5～20g/L，柠檬酸钠5～30g/L，溶剂为水，pH 5.0～7.0。

所述分离纯化方法可按本领域常规方法进行，具体如下：反应结束后反应液用等量乙酸乙酯萃取，取上清液蒸馏即可以得到手性纯的环氧氯丙烷。

所述水解反应具体过程列举如下：

取0.2g收集到的壤霉菌ZJB09106湿菌体，加入到10ml、0.1M的磷酸盐缓冲液中，加入20mM外消旋环氧氯丙烷，150r/min，30℃反应2h后用等量乙酸乙酯萃取，上清液蒸馏即可以得到手性纯的环氧氯丙烷。

或者将上述离心获得的壤霉菌ZJB09106湿菌体置于-20℃下，真空冷冻干燥2天后，取20mg干菌体于10ml环己烷中，加入200μl水和20mM外消旋环氧氯丙烷，150r/min，30℃反应5h后，取出反应液蒸馏可得手性纯的环氧氯丙烷。

又或者将上述离心获得的壤霉菌ZJB09106湿菌体置于-20℃下，真空冷冻干燥2天后，取2g干菌体于1L环己烷体系中，加20ml的水，再流加外消旋环氧氯丙烷，流加速度5mM/min，30℃，在磁力搅拌下反应10h，反应液直接蒸馏得到手性纯的环氧氯丙烷。

本发明中，环氧氯丙烷的分析方法可采用气相色谱进行：

取1mL转化液加适量无水硫酸钠，振荡后离心(12000RPM，5min)，取上清液进行手性毛细管气相分析。气相色谱为GC-14(岛津)；手性毛细管柱为BGB-175(柱长30m，内径0.25mm，液膜厚度0.25μm，填料14％氰基丙基苯基和86％甲基聚硅氧烷溶解50％2，3-二乙酰基-6-叔丁基二甲基硅烷基-γ-环糊精)；载气为高纯氦气，流量为1.6mL/min；分流比为40∶1；检测器及进样口温度均为220℃；柱温条件为：初始温度90℃，保持7min。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一株新的手性环氧氯丙烷产生菌，利用该菌株生产手性环氧氯丙烷，生产过程不使用化学催化剂，具有绿色环保的特点，适用于环氧氯丙烷的工业化生产。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

斜面培养基配方：牛肉膏：10g/L，蛋白胨：10g/L，NaCl：10g/L，琼脂20g/L，用蒸馏水配制，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH溶液将pH调到7.0，加热溶解琼脂，121℃灭菌20min后，摆置成斜面，冷却后得到斜面培养基备用。

摇瓶液体种子培养基的配方：牛肉膏：10g/L，蛋白胨：10g/L，NaCl：10g/L，用蒸馏水配制，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH溶液将pH调到7.0。

将保藏在4℃冰箱中斜面菌株壤霉菌ZJB09106(CCTCC No：M2010274)取出，接种到新配制的斜面培养基中，30℃下，培养24h，将作为斜面种子备用。

取250mL摇瓶液体种子培养基，装到5个250mL三角瓶中，每个摇瓶装50mL，121℃灭菌20min，将斜面种子接种至500mL三角瓶，30℃、150rpm振荡培养20h，得到种子液，待用。

发酵培养基的配方：淀粉5g/L，酵母浸膏粉5g/L，牛肉膏5g/L，柠檬酸钠5g/L，蒸馏水配制，用0.1mol/L HCl或NaOH调pH至5.0。

按上述发酵培养基配方制备发酵培养基4L，装入40个500ml三角瓶中，每个摇瓶装100mL，121℃灭菌20min后。每瓶接入种子液1mL，进行菌体培养，培养条件如下：温度25℃，转速150rpm，培养30h。收集发酵液，10000r/min离心10分钟，收集菌体。

将0.2g上述收集的湿菌体，加入到10ml、0.1M的磷酸盐缓冲液中，加入20mM外消旋环氧氯丙烷，150r/min，30℃反应2h，然加入等量的乙酸乙酯进行萃取操作，上清液蒸馏即可以得到ee值大于60％的(S)-环氧氯丙烷，收率25％。

实施例2：

将保藏在4℃冰箱中斜面菌株壤霉菌ZJB09106取出，接种到新配制的斜面培养基中，30℃下，培养24h，将作为斜面种子备用。

取250mL摇瓶液体种子培养基，装到5个250mL三角瓶中，每个摇瓶装50mL，121℃灭菌20min，将斜面种子接种至500mL三角瓶，30℃、150rpm振荡培养24h，得到种子液，待用。

发酵培养基的配方：淀粉10g/L，酵母浸膏粉5g/L，牛肉膏20g/L，柠檬酸钠15g/L，蒸馏水配制，用0.1mol/L HCl或NaOH调pH至6.0。

按上述发酵培养基配方制备发酵培养基4L，装入40个500ml三角瓶中，每个摇瓶装100mL，121℃灭菌20min后。每瓶接入种子液1mL，进行菌体培养，培养条件如下：温度35℃，转速150rpm，培养48h。收集发酵液，10000r/min离心10分钟，收集菌体。

将0.2g上述收集的菌体，加入到10ml 0.1M的磷酸盐缓冲液中，加入20mM外消旋环氧氯丙烷，150r/min，30℃反应3h后用等量乙酸乙酯萃取，上清液蒸馏即可以得到ee值大于70％的(S)-环氧氯丙烷，收率24％。

实施例3：

发酵培养基的配方：淀粉12g/L，酵母浸膏粉20g/L，牛肉膏10g/L，柠檬酸钠30g/L，蒸馏水配制，用0.1mol/L HCl或NaOH调pH至7.0。

按上述发酵培养基配方制备发酵培养基4L，装入40个500ml三角瓶中，每个摇瓶装100mL，121℃灭菌20min后。每瓶接入种子液1mL，进行菌体培养，培养条件如下：温度30℃，转速150rpm，培养50h。收集发酵液，10000r/min离心10分钟，收集菌体。

将0.2g上述收集的菌体，加入到10ml 0.1M的磷酸盐缓冲液中，加入20mM外消旋环氧氯丙烷，150r/min，30℃反应10h后，用等量乙酸乙酯萃取，上清液蒸馏即可以得到ee值大于80％的(S)-环氧氯丙烷，收率25％。

实施例4：

摇瓶液体种子培养基的配方：牛肉膏：10g/L，蛋白胨：10g/L，NaCl：10g/L，，用蒸馏水配制，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/LNaOH溶液将pH调到7.0。

发酵培养基的配方：淀粉10g/L，酵母浸膏粉10g/L，牛肉膏10g/L，柠檬酸钠15g/L，蒸馏水配制，用0.1mol/L HCl或NaOH调pH至6.0。

按上述发酵培养基配方制备发酵培养基4L，装入40个500ml三角瓶中，每个摇瓶装100mL，121℃灭菌20min后。每瓶接入种子液1mL，进行菌体培养，培养条件如下：温度25℃，转速150rpm，培养48h。收集发酵液，10000r/min离心10分钟，收集菌体。

将上述离心获得的湿菌体置于-20℃下，真空冷冻干燥2天后，取20mg干菌体于10ml环己烷中，加200μl的水和20mM外消旋环氧氯丙烷，150r/min，30℃反应5h后，取出反应液蒸馏可得ee值大于70％的(S)-环氧氯丙烷，收率为30％。

实施例5：

发酵培养基的配方：淀粉15g/L，酵母浸膏粉15g/L，牛肉膏10g/L，柠檬酸钠30g/L，蒸馏水配制，用0.1mol/L HCl或NaOH调pH至7.0。

按上述发酵培养基配方制备发酵培养基4L，装入40个500ml三角瓶中，每个摇瓶装100mL，121℃灭菌20min后。每瓶接入种子液1mL，进行菌体培养，培养条件如下：温度37℃，转速150rpm，培养36h。收集发酵液，10000r/min离心10分钟，收集菌体。

将上述离心获得的湿菌体置于-20℃下，真空冷冻干燥2天后，取20mg干菌体于10ml环己烷中，加200μl的水和20mM外消旋环氧氯丙烷，150r/min，30℃反应5h后，取出反应液蒸馏可得ee值大于80％的(S)-环氧氯丙烷，收率为30％。

实施例6：

摇瓶液体种子培养基的配方：牛肉膏：10g/L，蛋白胨：10g/L，NaCl：10g/L，琼脂20g/L，用蒸馏水配制，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH溶液将pH调到7.0。

发酵培养基的配方：淀粉15g/L，酵母浸膏粉20g/L，牛肉膏20g/L，柠檬酸钠20g/L，蒸馏水配制，用0.1mol/L HCl或NaOH调pH至7.0。

按上述发酵培养基配方制备发酵培养基4L，装入40个500ml三角瓶中，每个摇瓶装100mL，121℃灭菌20min后。每瓶接入种子液1mL，进行菌体培养，培养条件如下：温度30℃，转速150rpm，培养48h。收集发酵液，10000r/min离心10分钟，收集菌体。

将上述离心获得的湿菌体置于-20℃下，真空冷冻干燥2天后，取2g干菌体于1L环己烷体系中，加20ml的水，再流加外消旋环氧氯丙烷，流加速度5mM/min，30℃，在磁力搅拌下反应10h。反应液蒸馏可得ee值大于78％的(S)-环氧氯丙烷，收率为17％。

实施例7：

发酵培养基的配方：淀粉15g/L，酵母浸膏粉10g/L，牛肉膏20g/L，柠檬酸钠10g/L，蒸馏水配制，用0.1mol/L HCl或NaOH调pH至6.0。

将上述离心获得的湿菌体置于-20℃下，真空冷冻干燥2天后，取2g干菌体于1L环己烷体系中，加20ml的水，再流加外消旋环氧氯丙烷，流加速度5mM/min，30℃，在磁力搅拌下反应6h。反应液蒸馏可得ee值大于80％的(S)-环氧氯丙烷，收率为15％。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 壤霉菌ZJB09106及其在水解制备（S）-环氧氯丙烷中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> Agromyces sp.

<220>

<221> misc_feature

<222> (1144)..(1144)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

tgcttacaca tgcaagtcga acgatgaact tggagcttgc tctgggggat tagtggcgaa 60

cgggtgagta acacgtgagt aacctgccct ggactctggg ataacttcga gaaatcggag 120

ctaataccgg ataggacctt gcaccgcatg gtgtggggtg gaaagttttt cggtttggga 180

tggactcgcg gcctatcagc ttgttggtga ggtaatggct caccaaggcg tcgacgggta 240

gccggcctga gagggtgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagcaac gccgcgtgcg 360

ggatgacggc cttcgggttg taaaccgctt ttagtaggga agaagccttc gggtgacggt 420

acctgcagaa aaaggaccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtccg 480

agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggtttgtcgc gtctgctgtg 540

aaaactagag gctcaacctc tagcctgcag tgggtacggg cagacttgag tggtgtaggg 600

gagactggaa ttcctggtgt agcggtggaa tgcgcagata tcaggaggaa caccgatggc 660

gaaggcaggt ctctgggcac ttactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg 720

attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgttgggcgc tagatgtggg gacctttcca 780

cggtttccgt gtcgtagcta acgcattaag cgccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc 840

taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggcg gagcatgcgg attaattcga 900

tgcaacgcga agaaccttac caaggcttga catacacgag aacgggccag aaatggtcaa 960

ttctttggac actcgtgaac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020

tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct cgtcgcatgt tgccagcacg ttatggtggg 1080

gactcatgtg agactgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca 1140

tgcnccttat gtcttgggct tcacgcatgc tacaatggcc ggtacaaagg gctgcgatgt 1200

cgtaaggcgg agcgaatccc aaaaagccgg tctcagttcg gattgaggtc tgcaactcga 1260

cctcatgaag tcggagtcgc tagtaatcgc agatcagcaa cgctgcggtg aatacgttcc 1320

cgggccttgt acacaccgcc cgtcaagtca tgaaagtcgg taacacccga agccggtggc 1380

ctaacccttg tggagggagc cgtcgaaggt gggatcggtg attaggacta agtcgtaaca 1440

Claims

1.壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB09106，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2010274，保藏日期：2010年10月24日。

2.如权利要求1所述的壤霉菌ZJB09106在微生物水解外消旋环氧氯丙烷制备（S）-环氧氯丙烷中的应用，所述应用为：以外消旋环氧氯丙烷为底物，加入壤霉菌ZJB09106的含酶菌体细胞作为催化剂，于28~35℃下进行水解反应2~10小时，反应结束后反应液分离纯化得到所述（S）-环氧氯丙烷，所述水解反应在pH7.0~7.5的磷酸盐缓冲液或环己烷中进行。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述含酶菌体细胞由如下方法获得：

（1）将壤霉菌ZJB09106接种至斜面培养基中，在30℃下培养至长出菌落，作为斜面种子；所述的斜面培养基按如下组成配制：牛肉膏5~15g/L，蛋白胨5~15g/L，NaCl 5~15 g/L，琼脂10~30g/L，溶剂为水，pH 6.0~7.0；

（2）将斜面菌种接种至摇瓶液体种子培养基，30℃、150rpm振荡培养20h，得到种子液；所述液体种子培养基组成如下：牛肉膏5~15g/L，蛋白胨5~15g/L，NaCl 5~15 g/L，溶剂为水，pH6.0~ 7.0；

（3）种子液以1~5%体积比接种至液体发酵培养基，25~37℃培养30~50h，培养液离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述液体发酵培养基组成如下：淀粉5~15 g/L，酵母浸膏粉5~20 g/L，牛肉膏5~20 g/L，柠檬酸钠 5~30g/L，溶剂为水，pH 5.0~7.0。