CN101709281A - 利用肠杆菌发酵生产2,3-丁二醇的方法 - Google Patents

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朱晨辉
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Abstract

本发明公开了利用肠杆菌Enterobacter sp.Y5发酵生产2，3-丁二醇的方法，其发酵培养基组成为：葡萄糖18～24g/L；胰蛋白胨4～6g/L；牛肉膏2～4g/L；酵母粉1～2g/L；NaCl 3～5g/L；KH2PO41～3g/L；MgSO40.1～0.3g/L；L-半胱氨酸0.3～1.0g/L；微量元素液8～15ml，肠杆菌Enterobacter sp.Y5经过种子培养和发酵培养得到2，3-丁二醇。本发明发酵过程简单，发酵周期短。

Description

利用肠杆菌发酵生产2，3-丁二醇的方法
技术领域
本发明涉及一种利用葡萄糖为底物作为原料进行发酵生产2，3-丁二醇的方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
2，3-丁二醇是一种重要的化工原料，广泛用于化工、食品、药品、原料以及航空航天等领域。2，3-丁二醇是无色至微黄透明稠状液体，其具有很高的价值，常用于增加酒的香气，使之醇甜、浓厚。在我国，2，3-丁二醇常被添加到白酒中，以改善白酒的风味；2，3-丁二醇其有低的凝固点(-60℃)，可以作为防冻剂；2，3-丁二醇和其他的液体燃料相比，其燃烧值高达27198J/g，因此可以作为液体原料来使用；由于2，3-丁二醇有很高的辛烷数，可以用作更高级燃料-航空燃料。除此之外，2，3-丁二醇还有一些特殊的性质：其通过催化脱氢可以转化成二乙酰，而该物质是一种高值的食品添加剂，能够改善食品的风味。酯化后的2，3-丁二醇可作为医药和化妆品的杀菌剂，0.1％的该溶液能够杀死大多数的病毒性细菌。2，3-丁二醇与乙酸反应生成2，3-丁二醇二乙酸酯，此酯类可加到奶油中改善风味。2，3-丁二醇还是一种具有旋光性的手性化合物，常被用来作为药物的载体，因此具有很高的医用和药用价值
2.3-丁二醇结构具有很高的特殊性，因此化学法合成2，3-丁二醇工艺过程复杂，而且成本较高，所以一直难以实现工业化大生产，因此目前生产2，3-丁二醇的方法主要是生物转化法。利用生物发酵方法生产2，3-丁二醇具有很大的优势，微生物在发酵过程中可用的底物十分广泛，即可利用常规底物，还可以利用各种废弃物进行发酵生产2，3-丁二醇。
发明内容
本发明的目的是提供肠杆菌进行厌氧发酵生产2，3-丁二醇的方法，2，3-丁二醇的产生完全是在厌氧或者兼性厌氧的条件下产生的，发酵液经过处理后即可得到纯净的2，3-丁二醇。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
(1)菌种：本发明以河底污泥为菌源，经过多次稀释后，从河底污泥中筛选出了一株能发酵生产2，3-丁二醇的菌种，经过经16S rDNA鉴定，该菌种和Enterobacter sp.Y5的同源性达到100％，应此可以确定该菌种为Enterobacter sp.Y5；
(2)底物：本发明主要采用葡萄糖，其他各种废弃物(如秸秆等)本菌种也可以利用；
(3)种子液体培养基：葡萄糖8～10g/L；蛋白胨3～5g/L；酵母粉2～4g/L；NaCl2～4g/L；K2HPO40.5～1.5g/L；MgCl 0.2～0.4g/L；用浓磷酸将其pH调节到5.4～6.8；固体培养基：液体培养基+1.5％琼脂；
(4)发酵液培养基：葡萄糖18～24g/L；胰蛋白胨4～6g/L；牛肉膏2～4g/L；酵母粉1～2g/L；NaCl 3～5g/L；KH2PO41～3g/L；MgSO40.1～0.3g/L；L-半胱氨酸0.3～1.0g/L；微量元素液(MnSO4.7H2O 0.01g/L，ZnSO4.7H2O0.05g/L，H3BO30.01g/L，CaCl2.2H2O 0.01g/L，NaMoO40.01g/L，AlK(SO4)20.01g/L)8～15mL；
(5)种子的活化：将菌种Enterobacter sp.Y5接一环到固体种子培养基上进行种子的活化，然后将活化好的种子转接到液体种子培养基上进行种子扩大化培养，用封口膜封好培养瓶，将其放置在30～38℃的摇床中进行种子的扩大化培养，摇床的转速为120～220rmp，培养8-10个小时。
(6)将步骤(5)中的种子液按装液量的4％～8％的接入到发酵反应瓶中，用硅胶塞塞好反应瓶。接完种后，向反应瓶中冲入0.2～0.5vvm的惰性气体(氩气或者氮气)，将反应装置放置在摇床中空气浴培养；培养条件为：30～38℃，转速为120～220rmp，培养时间为10～14小时，发酵液即为含有2，3-丁二醇的液体，发酵液经过处理后利用气相色谱FID检测器检测其中2，3-丁二醇的含量；
(7)对步骤(6)培养完后的发酵液进行离心、蒸馏、分离纯化等处理，可得到纯的2，3-丁二醇。
本发明采用的肠杆菌发酵过程简单，反应周期短，具有较高的应有价值和利用前景；本发明发酵培养基使用混合氮源(胰蛋白胨/牛肉膏/酵母粉)，并加入适量L-半胱氨酸，可明显提高2，3-丁二醇的转化率。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
发酵培养基的配方如下：
葡萄糖20g/L；胰蛋白胨4g/L；NaCl 4g/L；KH2PO41.5g/L；MgSO40.3g/L；微量元素液(MnSO4.7H2O 0.01g/L，ZnSO4.7H2O 0.05g/L，H3BO30.01g/L，CaCl2.2H2O 0.01g/L，NaMoO40.01g/L，AlK(SO4)20.01g/L)10mL。pH用磷酸调节到5.8，反应装置采用250mL三角瓶，其装样量为150mL，121℃条件下灭菌20min。
将菌种活化后进行扩大培养，其培养条件为35℃，转速为130rmp。然后将上述种子液按4％的接种量接种到发酵培养基中，采用硅胶塞塞好三角瓶口，用石蜡密封瓶口。然后向反应瓶中冲入0.2vvm氩气。将上述培养装置放置于摇床中培养，其培养条件为35℃，转速为150rmp，发酵过程持续12小时。发酵过程定时检测细胞浓度和2，3-丁二醇的含量。发酵完后细胞浓度达到了4.24(OD600)，150mL培养基发酵液中2，3-丁二醇的产量达到了0.91g。发酵完后2，3-丁二醇的产量达到了6.06g/L，2，3-丁二醇的转化率达到了理论转化率的60.6％。
实施例2：
发酵培养基的配方如下：
葡萄糖20g/L；牛肉膏4g/L；NaCl 4g/L；KH2PO41.5g/L；MgSO40.3g/L；微量元素液(MnSO4.7H2O 0.01g/L，ZnSO4.7H2O 0.05g/L，H3BO30.01g/L，CaCl2.2H2O 0.01g/L，NaMoO40.01g/L，AlK(SO4)20.01g/L)10mL。pH用磷酸调节到5.8，反应装置采用250mL三角瓶，其装样量为150mL，121℃条件下灭菌20min。
培养方式及其检测方式同实例1，发酵完后细胞浓度达到了4.04(OD600)，150mL培养基发酵液中2，3-丁二醇的产量达到了0.90g。发酵完后2，3-丁二醇的产量达到了6.0g/L，2，3-丁二醇的转化率达到了理论转化率的60％。
实施例3：
发酵培养基的配方如下：
葡萄糖20g/L；胰蛋白胨4g/L；牛肉膏4g/L；NaCl 4g/L；KH2PO41.5g/L；MgSO40.3g/L；微量元素液(MnSO4.7H2O 0.01g/L，ZnSO4.7H2O 0.05g/L，H3BO30.01g/L，CaCl2.2H2O 0.01g/L，NaMoO40.01g/L，AlK(SO4)20.01g/L)10mL。pH用磷酸调节到5.8，反应装置采用250mL三角瓶，其装样量为150mL，121℃条件下灭菌20min。
其培养方式及其检测方式同实例1，发酵完后细胞浓度达到了4.27(OD600)，150mL培养基发酵液中2，3-丁二醇的产量达到了0.94g。发酵完后2，3-丁二醇的产量达到了6.27g/L，2，3-丁二醇的转化率达到了理论转化率的62.7％。
实施例4：
发酵培养基的配方如下：
葡萄糖20g/L；胰蛋白胨4g/L；牛肉膏4g/L；酵母粉1g/L；NaCl 4g/L；KH2PO41.5g/L；MgSO40.3g/L；L-cysteine 0.7g/L；微量元素液(MnSO4.7H2O0.01g/L，ZnSO4.7H2O 0.05g/L，H3BO30.01g/L，CaCl2.2H2O 0.01g/L，NaMoO40.01g/L，AlK(SO4)20.01g/L)10mL。pH用磷酸调节到5.8，反应装置采用250mL三角瓶，其装样量为150mL，121℃条件下灭菌20min。
其培养方式及其检测方式同实例1，发酵完后细胞浓度达到了4.26(OD600)，150mL培养基发酵液中2，3-丁二醇的产量达到了1.1g。发酵完后2，3-丁二醇的产量达到了7.33g/L，2，3-丁二醇的转化率达到了理论转化率的73.3％。
实施例5：
与实施例4类似，不同之处在于没有加入L-cysteine。发酵完后细胞浓度达到了4.31(OD600)，150mL培养基发酵液中2，3-丁二醇的产量达到了0.975g。发酵完后2，3-丁二醇的产量达到了6.5g/L，2，3-丁二醇的转化率达到了理论转化率的65％。
实施例6：
具体的培养基成分如下：
葡萄糖24g/L；胰蛋白胨6g/L；牛肉膏4g/L；酵母粉1.5g/L；NaCl 4；KH2PO41.5g/L；MgSO40.3g/L；L-cysteine 0.7g/L；微量元素液(MnSO4.7H2O0.01g/L，ZnSO4.7H2O 0.05g/L，H3BO30.01g/L，CaCl2.2H2O 0.01g/L，NaMoO40.01g/L，AlK(SO4)20.01g/L)10mL；培养基的pH采用浓度为0.2mol/L的柠檬酸缓冲体系(pH＝4.4)调到6.4。培养的装置采用250mL的三角瓶，其装样量为150mL。上述培养基在121℃高温灭菌20min。
其培养方式和检测方法同实例1，发酵完后细胞浓度达到了4.52(OD600)，150mL培养基产生的2，3-丁二醇的量为1.26g。其产率达到了8.4g/L，2，3-丁二醇的转化率达到了理论转化率的70％。

Claims (5)

1.肠杆菌Enterobacter sp.Y5在发酵生产2，3-丁二醇中的应用。
2.根据权利要求1所述用途，其特征在于发酵培养基的组成如下：
葡萄糖18～24g/L；胰蛋白胨4～6g/L；牛肉膏2～4g/L；酵母粉1～2g/L；NaCl 3～5g/L；KH2PO4 1～3g/L；MgSO4 0.1～0.3g/L；L-半胱氨酸0.3～1.0g/L；微量元素液8～15mL。
3.根据权利要求2所述用途，其特征在于：L-半胱氨酸为0.3～1.0g/L。
4.根据权利要求2所述用途，其特征在于微量元素液组成为：MnSO4.7H2O0.01g/L，ZnSO4.7H2O 0.05g/L，H3BO3 0.01g/L，CaCl2.2H2O 0.01g/L，NaMoO4 0.01g/L，AlK(SO4)20.01g/L。
5.根据权利要求1至4任意之一所述用途，其特征在于肠杆菌Enterobactersp.Y5发酵生产2，3-丁二醇步骤如下：
(1)Enterobacter sp.Y5种子的活化
从培养皿中用接种环取一环菌种到平板上进行平板划线，将其放置在36℃下静止培养24小时；
种子液体培养基：葡萄糖8～10g/L；蛋白胨3～5g/L；酵母粉2～4g/L；NaCl 2～4g/L；K2HPO4 0.5～1.5g/L；MgCl 0.2～0.4g/L；用浓磷酸将其pH调节到5.4～6.8；
固体培养基：液体培养基+1.5％琼脂；
(2)将上述步骤(1)中固体培养基上的菌种转接到上述步骤(1)中的液体培养基中进行种子的活化培养，液体种子液的活化采用100mL三角瓶，培养温度为30～38℃，培养时间为8-10小时；
(3)将上述步骤(2)种子液按4％～8％的接种量接入到发酵反应装置中，用硅胶塞塞好反应瓶，然后向反应装置中冲入惰性气体，将其放置于空气浴中培养，培养时间为10～14小时，发酵液即为含有2，3-丁二醇的液体；
(4)提取、分离得到2，3-丁二醇。
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